Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sädehoito on tärkeä hoito valinta voida leikata kehittynyt ihmisen keuhkosyöpätapauksista, ja kriittinen apuaine hoitoa leikkausta. Kuitenkin säteily kuten keuhkosyöpä hoito on edelleen kaukana tyydyttävästä takia ongelmia, jotka liittyvät säteilyn kestävyys syöpäsoluissa ja vakavia sytotoksisuus ei-syöpäsoluja, jotka syntyvät annoksilla tavallisesti annetaan potilaille. Olemme äskettäin tunnistaneet lupaava uusi estäjä β-kateniinin /TCF4 vuorovaikutus, nimeltään BC-23 (C

21H

14ClN

3 O

4S), joka toimii voimakas solukuoleman tehostajaa käytettynä yhdistettynä säteilyn. Peräkkäinen altistuminen ihmisen p53-null ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) H1299 solujen pieniä annoksia röntgensäteily, jota seurasi 1 tuntia myöhemmin antamalla minimaalisesti solumyrkyllisyyspitoisuutta BC-23, johti erittäin synergistisen induktion klonogeeniset solukuolemaa (yhdistelmäindeksiä 1,0). Samanaikainen käyttö BC-23 pieninä pitoisuuksina estää tehokkaasti Wnt /β-kateniinin signalointi ja alas-säätelee c-Myc ja sykliini D1 ilme. S-vaiheessa pidätyksen ja ROS osallistuvat myös parantamiseksi säteilyn tehokkuutta välittämien BC-23. BC-23 edustaa siksi lupaava uusi luokka säteilyn tehostajana.

Citation: Zhang Q, Gao M, Luo G, Han X, Bao W, Cheng Y. et al. (2016) Enhancement Säteilyn Herkkyys Lung Cancer Cells jonka Novel pienmolekyylisalpaaja- että tavoitteet β-kateniinin /TCF4 välinen yhteys. PLoS ONE 11 (3): e0152407. doi: 10,1371 /journal.pone.0152407

Editor: Chunming Liu, University of Kentucky, Yhdysvallat |

vastaanotettu 16. lokakuuta 2015 Hyväksytty: 14 maaliskuu 2016; Julkaistu 25 maaliskuuta 2016

Copyright: © 2016 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukee osittain avustusta Connolly Endowment /Hendricks Fund ja LUNGevity Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

huolimatta viimeaikainen edistys toimituksen sädehoidon ja kemoterapia paikallisesti edennyt keuhkosyöpä, useimmat potilaat relapsi ja periksi heidän sairautensa [1-3]. Tämä voi johtua, suurelta osin, läsnäolon keuhkosyövän kantasolujen: solupopulaatio, joka kykenee itseuudistumisen, leviämisen, ja etäpesäkkeiden ja joka osoittaa huomattavaa radioresistance [4-6]. Sisplatiini ja Paclitaxol ovat kaksi lääkettä yleisimmin käytetty potilailla herkistää keuhkosyöpäsolua sädehoitoa [7]. Kuitenkin sivuvaikutukset ja resistenssin näille huumeita yhä läsnä esteitä parantaa terapeuttisen indeksit.

Ei-pienisoluinen keuhkosyövässä (NSCLCs) osuus 85% ihmisen keuhkosyöpää [8]. Tutkimukset ovat käynnissä useita uusia luokkia pienimolekyylisiä säteilyherkistimet ja niiden säteily tehostaa vaikutuksia NSCLCs ja muita ihmisen syöpiin [9-12]. Tällä hetkellä kriittinen tarve jää löytämisen ja kehittämisen uusia säteilyn parantajia, jotka osoittavat korkea hyötysuhde ja alhainen myrkyllisyys.

Aberrant aktivointien Wnt /β-kateniinin signalointi, jotka johtavat ylös-säätely itse- uusiminen ja leviämisen keuhkosyövän soluista, ovat kriittisiä keuhkosyövän tuumorigeneesiprosessin etenemiseen ja kemo- ja radioresistance [13-15]. Wnt /beeta-kateniinin -systeemi aktivoituu 75% kaikista kliinisistä NSCLC testataan ja sillä on kriittinen rooli solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen [16, 17]. Tämä polku on liian aktivoituu NSCLC ja monet muut syövät johtuen yli-ilmentymisen TCF4, Wnt1 ja Wnt2 ja johtaa kohonnut kertyminen β-kateniinin ytimet [18-20]. β-kateniinin sitoutuu jäsenille Tcf /Lef perhe, ekspressiota säätelevät kohdegeenien, kuten c-Myc ja sykliini D1 [21-23]. Esto yli-ilmentyminen Wnt 1, Wnt 2, ja β-kateniinin johtaa

in vitro

NSCLC apoptoosia ja vähentynyt

in vivo

kasvain massa [20].

Kehittyvät todisteet syytöksiä Wnt /β-kateniinin väylän radioresistance syöpäsolujen [22, 24]. Nuclear β-kateniinin ja TCF4 kertymät tai Wnt /β-kateniinin reitin hyper-aktivointi ovat tärkeitä syitä radioresistance [25]. Hiljentäminen TCF4 aiheuttaa merkittävän herkistymistä syöpäsolujen pieniä annoksia säteilyn [26]. Estäjä Wnt /β-kateniinin signalointireitin, GDK-100017, on raportoitu parantaa radioherkkyyttä NSCLC-solujen estämällä β-kateniinin-Tcf /Lef vuorovaikutus [24].

Cancer kantasolujen tai käynnistää solujen jotka ovat kohonneet ydin- β-kateniinin voi kiertää solukuolemaa normaalisti aiheuttama säteily. Tämä on osittain syyttää toiminnan β-kateniinin, yhdessä alavirran geenien, c-Myc ja sykliini D1, jotka välittävät säätelyä itseuudistumisen ja ylläpito syövän kantasolujen /esisolujen vastaan ​​lähes tappavia tai tappavaa ärsykkeiden [22, 27 ]. Inhibitio Wnt /β-kateniinin signalointi vähentää c-Myc ja sykliini D1 tasolla, mikä parantaa radioherkkyyttä syöpäsolujen [24, 28, 29], mutta tarkka sääntely välisiä suhteita β-kateniinin, c-Myc, sykliini D1, reaktiiviset happiradikaaleja (ROS), ja solusyklin pysähtymisen /eteneminen vaativat lisäselvityksiä. Kuitenkin erityinen häiriöitä vuorovaikutusta ydin- β-kateniinin ja TCF4 seuraavat valikoiva sädehoitoa edustaa erityisen lupaava strategia estää proliferaatiota ja eloonjäämistä syöpäsoluja. Tämä strategia säilyttää myös hyödyllistä toimintaa β-kateniinin vuorovaikutukset muiden fysiologisten ligandien [30].

Tässä tutkimuksessa raportoimme uudesta ja voimakas säteily tehostajana, BC-23 (C

21H

14ClN

3 O

4S), joka kohdentaa β-kateniinin /TCF4 vuorovaikutuksen ja signalointi. 3 uM, joka on annos, joka aiheuttaa vain vähän sytotoksisuus, BC-23 hoito aiheuttaa voimakkaita synergistisiä parantaminen syöpäsolun kuoleman aiheuttama pieniä annoksia säteilyä (eli 2 log parantamiseksi syöpäsolun kuoleman jälkeen yhdessä säteily). Alassäätö c-Myc ilme, säätely ylöspäin ROS tuotanto, ja kumota G2 /M pidätys ovat molekyylitason mekanismit säteilyn lisäävistä vaikutuksista BC-23. Tämä raportti on ensimmäinen kuvata voittamiseen radioresistance ihmisen NSCLC-soluissa käyttäen pienmolekyylisalpaaja- of β-kateniinin /TCF4. Nämä tiedot ehdotti potentiaalinen käyttökelpoisuus ja soveltaminen tätä yhdistettä hoitoon keuhkosyöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja soluviljelmissä

BC-23 (NSC45382) oli saatu NCI tietokannasta. ICRT14, N-asetyylikysteiini (NAC), ja H

2DCFDA, ostettiin Santa Cruz Biotechnology, Sigma-Aldrich, ja Cayman Chemical, vastaavasti. H1299 ja H1975 solut hankittiin ATCC. Soluja viljeltiin ja pidettiin kosteutetussa, 5% CO

2-ilmakehässä 37 ° C: ssa RPMI 1640 (Hyclone, Thermal Scientific), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä.

fluoresenssipolarisaatiota perustuva kompetitiivinen sitoutumismääritys

fluoresenssipolarisaatiota (FP) suoritettiin aiemmat raportit, vähäisin muutoksin [31]. Lyhyesti, 20 nM merkkiaineen [FITC-leimatut TCF4

(8-30) koetin] ja 500 nM β-kateniinin sekoitettiin ja inkuboitiin /ilman BC-23 100 ui PBS: ää (joka sisälsi 0,01% Triton X-100). 3 tunnin huoneenlämpötilassa inkuboinnin, FP-arvot rekisteröitiin käyttämällä Synergy 2 mikrolevylukijalla (BioTek) viritysaallonpituudella /emissio 485 /528nm.

TOP-flash lusiferaasiksi reportterigeenimäärityksessä

H1299 soluja 1 x 10

4 solua /kuoppa transfektoitiin nt /β-kateniinin reportterigeeni TOP-salama, satamat TCF4 sitoutumiskohdat β-kateniinin ja PRL-CMV Renilla-lusiferaasin ohjaus reportteri vektorin (Promega, E2261). Neljä tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla BC-23 tai ICRT14. Lusiferaasin aktiivisuus määritettiin 24 h käsittelyn jälkeen käyttäen Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, E1910). TOP lusiferaasiaktiivisuudeksi normalisoitui ohjaus PRL-CMV Renillaa Lusiferaasiaktiivisuutta.

In silico

virtuaaliseulonnan

valmistaa reseptori rakenteen kiderakenne β-kateniinin /TCF4 kompleksi (ATE koodi 1JPW) ja suorittanut

in silico

virtuaaliseulonnan käyttäen Autodock4 kuten aiemmin raportoitu [30].

Real-Time PCR

H1299 soluja käsiteltiin eri pitoisuuksia BC-23: ssa 16 tuntia. Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Kit (Qiagen). CDNA syntetisoitiin käyttäen korkean kapasiteetin cDNA käänteistranskriptio Kit (Invitrogen). Reaaliaikainen PCR suoritettiin LightCycler

® 480 Järjestelmän avulla LightCyclerTM

® 480 SYBR Green I Master (Roche). Kynnyssykli (C

t) arvot normalisoitiin p-aktiini sisäinen viite. Käytetyt alukkeet reaaliajassa PCR olivat seuraavat: β-aktiini, eteenpäin 5′-AGAAAATCTGGCACCACACC-3 ’; reverse 5’-AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3 ’; c-myc, eteenpäin 5’-TCAAGAGGCGAACACACAAC-3 ’; reverse 5’-GGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3 ’; sykliini D1, eteenpäin 5’-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3 ’; reverse 5’-GGGGATGGTCTCCTTCATCT-3 ’.

Sytotoksisuusmääritvs

H1299-soluissa, jotka maljattiin 96-kuoppalevyille 1×10

3 solua /kuoppa käsiteltiin halutut pitoisuudet BC- 23 100 ui väliaineessa, ja inkuboitiin 1 päivä tai 3 päivää. Solujen elinkelpoisuus määritettiin lisäämällä 20 ui CellTiter-Blue (Promega, G8081) kuhunkin kuoppaan. Sen jälkeen 4 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa, fluoresenssi määritettiin käyttäen Synergy 2 mikrolevylukijalla (BioTek) viritysaallonpituudella /emissio 550 nm /600 nm.

klonogeeninen määritys

H1299-soluja säteilytettiin 0-10 Gy säteilyä (RS-2000 Biological Research losäteilyttimen, Rad Source). Yksi tunti myöhemmin solut käsiteltiin DMSO: ssa tai 3 uM BC-23, ja inkuboitiin vielä 24 tunnin ajan. Sitten solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille 500-2000 solua per kuoppa, ja inkuboitiin 12 päivää, jotta pesäkkeiden muodostumista. Pesäkkeitä, jotka sisälsivät 50 tai enemmän solut laskettiin mikroskoopin alla. Maljaustehokkuus (PE) laskettiin jakamalla pesäkkeiden määrä että solujen määrä ympättiin. Elossa fraktio laskettiin jakamalla PE-arvot säteilyn ryhmien, että vastaavan ei-säteilytetyn ryhmiä. Vaikutus antioksidantti NAC BC-23-indusoidun sytotoksisuuden ja kasvun esto H1299-soluissa määritettiin sen jälkeen lisäämällä 1 mM NAC, yhdessä eri pitoisuuksien BC-23, soluihin. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, sytotoksisuus ja pesäkkeiden muodostuminen määritettiin edellä kuvatulla tavalla.

Transient transfektion CTNNB1 siRNA

H1299-solut maljattiin kuuden kuoppalevyillä. Päästyään 50%: sta 60% konfluenssiin, solut transfektoitiin validoitu ihmisen b-kateniinin (CTNNB1) siRNA tai negatiivinen kontrolli siRNA 1 (Ambion, Inc.), jonka lopullinen konsentraatio oli 100 nM kanssa JetPRIME reagenssilla (Polyplus transfektio, NY USA ), kohti valmistajan ohjeiden. Jälkeen 24 tunnin transfektion jälkeen solut jaettiin 2 ryhmään, joista toinen western blotit ja toinen säteilyn herkkyysanalyysi. Länsi blotit, elatusaine korvattiin vasta valmistettua väliaineen ja soluja inkuboitiin vielä 24 h ennen proteiinin valmistamiseksi. Säteilyn Herkkyysanalyysien solut käsiteltiin tai ilman 6 Gy säteilyä. Sen jälkeen, kun säteily, soluja käsiteltiin 3 uM BC-23 tai DMSO ajoneuvon ja kerättiin 48 h transfektion jälkeen ja klonogeenisten määrityksissä.

Proteiinin uutto ja western blot-analyysi

Solut kerättiin ja hajotettiin hajotuspuskuriin (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% natriumdodekyylisulfaattia (SDS), 1% deoksikoolihappo, 2 mM ortovanadaatti, 100 mM NaF, 1% Triton X-100, 0,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia), joka sisältää proteaasi-inhibiittori ja fosfataasinestäjällä cocktail (Sigma-Aldrich). Proteiinipitoisuus kvantitoitiin BCA-menetelmällä. Proteiininäytteet (20 ug) ajettiin elektroforeesilla 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Millipore, Bedford, MA, USA). Membraanit blokattiin ja inkuboitiin yön yli 4 ℃ monoklonaalisella kanin anti-β-kateniinin (1: 1000, Cell Signaling Technology, MA, USA) primaarisen vasta-aineen, tai monoklonaalinen hiiren anti-β-aktiini (1: 2000, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) primaarisen vasta-aineen latauskontrollina. Pesun jälkeen blotteja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa vastaavien piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundaarisia vasta-aineita (1: 5000; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), visualisoitiin ECL-liuosta (Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce, Rockford, IL, USA), ja valotettiin käyttämällä ChemiDoc ™ MP System (Bio-Rad).

Solusyklianalyysiä

H1299-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja säteilytetään 4 Gy säteilyä. Tunnin kuluttua soluja käsiteltiin 5 uM BC-23, ja inkuboitiin 24 tuntia. Sen jälkeen pestiin PBS: llä, solut kiinnitettiin 70% kylmällä etanolilla 15 minuuttia -20 ° C: ssa, ja sitten niihin lisätään PBS: ssä vielä 15 minuuttia. Solupelletit suspendoitiin uudelleen ja värjättiin 3 uM propidiumjodidilla (PI, Life Technologies, P3566) 0,5 ml: ssa puskuria (100 mM Tris, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl

2, 0,5 mM MgCl

2, 0,1% Nonidet P-40) 1 ug /ml RNaasi A: soluja inkuboitiin 40 minuuttia huoneen lämpötilassa. Virtaussytometria-analyysi suoritettiin viritysaallonpituudella 488 nm ja emissio aallonpituudella 576 nm. Solusyklin analysoitiin FlowJo (versio 9.7.5) analyysi-ohjelmisto.

määrittäminen ROS

sukupolven ROS määritettiin käyttämällä H

2DCFDA perustuva määritys, mukaan menetelmät julkaistu aiemmin [32, 33]. Lyhyesti, H1299-solut maljattiin 96-kuoppalevyille 2,5 x 10

4 solua /kuoppa ja viljeltiin 24 tuntia. Pestään kahdesti PBS: llä, soluja inkuboitiin 20 uM H

2DCFDA (Cayman Chemical) 37 ° C: ssa 45 min ja käsiteltiin sitten BC-23, säteilyä tai yhdistelmä BC-23 plus säteilyä. Fluoresenssin intensiteetti (viritys /emissio = 485/535 nm) rekisteröitiin 2 tuntia käyttäen Synergy H1 mikrolevylukijalla (BioTek).

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi tehtiin käyttämällä One -way ANOVA seurasi Tukeyn monivertailutesti (Prism 5.0, GraphPad Software).

P

arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Keskimääräiset arvot ilmaistiin keskiarvoina ± S.D. Yhdistetty syöpää ehkäisevistä vaikutuksista BC-23 ja röntgensäteilyn määritettiin käyttämällä Chou ja Talalay menetelmä: CI (yhdistelmä index) = [(D)

1 /(Dx)

1] + [(D)

2 /(Dx)

2] + (D)

1 (D)

2 /(Dx)

1 (Dx)

2, jossa (D)

1 ja (D)

2 edustavat annokset hoidon 1 (BC-23) ja 2 (säteily), jotka tuottavat x vaikutusta, kun käytetään yhdessä, (Dx)

1 ja (Dx)

2 ovat annoksia hoitojen 1 ja 2, jotka tuottavat saman x vaikutus yksin käytettynä.

tulokset

BC-23 inhiboi välillä β-kateniinin ja TCF4 ja Wnt /β-kateniinin signalointi

määrittää suoraan estovaikutus valittujen yhdisteiden välisen vuorovaikutuksen β-kateniinin ja TCF4 käyttämällä äskettäin kehitetty cell-free-kompetitiivinen sitoutumismääritys, joka perustuu fluoresenssin polarisaation (FP). Niistä yhdisteistä testattiin, BC-23 osoitti voimakasta aktiivisuutta (IC

50-arvo 1,7 uM) vastaan ​​välinen sitoutuminen β-kateniinin ja FITC-leimatun TCF4

(8-30) koetin (kuvio 1). BC-21, joka on raportoitu ryhmämme estäjänä Wnt /β-kateniinin polku, käytettiin positiivisena kontrollina FP määrityksissä. BC-21 hoito esti β-kateniinin /Tcf-4 vuorovaikutus IC

50 arvo 5uM [31]. Lusiferaasi-pohjainen TOP (kätkeminen TCF /LEF sitoutumiskohta) reportterimääritys (käytettiin testaamaan estävä vaikutus BC-23 transkriptionaalista aktiivisuutta Wnt /β-kateniinin polku β-kateniinin yliekspressoivassa syöpäsoluja) paljasti, että BC- 23 annoksesta riippuvalla tavalla inhiboivat TOP-lusiferaasiaktiivisuuden H1299-soluissa, ja IC

50-arvo 2,3 uM (kuvio 2). Tämä ehdottaa, että BC-23 kohdistettu vuorovaikutusta β-kateniinin ja TCF4 ja esti niiden välittämän transkription aktiivisuutta. Käytimme PRL Renilla-lusiferaasireportteri sisäisenä kontrollina määrityksessä ja ICRT14 (estäjä β-kateniinin reagoiva transkriptio) positiivisena kontrollina. ICRT14 1 uM inhiboi 38% TOP-lusiferaasiaktiivisuus.

Seosta, jossa oli 500 nM β-kateniinin ja 20 nM FITC-TCF4

(8-30) inkuboitiin puuttuessa tai läsnä on osoitettujen konsentraatioiden BC-23. Fluoresenssipolarisaatiota (FP) arvot mitattiin 3 tunnin kuluttua. Suhteellisen sitoutumisen laskettiin (mP

T-MP

f) /(mP

C-MP

f) x 100. Pisteet edustavat keskiarvoa ± S.D. 3 itsenäisen kokeen.

H1299-solut kotransfektoitiin reportteri TOP-salama ja valvontaa Renilla plasmidit. Neljä tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla BC-23: ssa 24 tuntia. TOP Lusiferaasiaktiivisuudet määritettiin ja normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuudet. BC-23 osoitti annoksesta riippuvaista estävää vaikutusta TOP lusiferaasin H1299 soluissa, joiden IC

50-arvo 2,3 uM. Pylväät edustavat keskiarvoa ± S.D. 3 itsenäisen kokeen.

BC-23 estää rakenteellista vuorovaikutusta β-kateniinin kanssa TCF4

Analysoimme sitoutumiskonformaation BC-23 ja β-kateniinin käyttäen molekyyli telakointi ( kuvio 3A). Vuorovaikutus TCF4 Asp16 kanssa β-kateniinin Lys435 on kriittinen niiden sitoutumista. Meidän kiderakenne analyysi osoitti, että Asp16 on TCF4 muodostettu vetysidoksen β-kateniinin Lys435, kun taas Glu17 ja TCF4, joka oli lähellä Asp16, muodostivat suolan, silta Lys508. Kuten on esitetty kuviossa 3B, BC-23 miehitetty kannan Asp16 ja Glu17, joka muodostaa vetysidoksen Asn430 sivuketjun päässä 3,08 Å. Tämä oletettavasti estää vuorovaikutusta TCF4 ja β-kateniinin kautta Asp16 on TCF4. Lisäksi, β-kateniinin Lys508 muodostettu toinen vetysidoksen kanssa happiatomi naftokinoni ryhmä BC-23, jossa on etäisyydellä 2,90 Å. Naftokinonin ryhmä BC-23 tehtiin myös hydrofobisia vuorovaikutuksia alifaattisen osien β-kateniinin Pro505. Tämä estää vuorovaikutusta β-kateniinin kanssa TCF4 Glu17.

sitovia malleja kertyi AUTODOCK ja PyMol.

BC-23 parantaa merkittävästi säteilyn aiheuttamien klonogeeniset solukuoleman H1299 NSCLC-solut

H1299-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla BC-23 24-72 tuntia. Lopussa kunkin käsittelyn, solujen elinkelpoisuus määritettiin CellTiter Blue määrityksessä. BC-23 yksinään kohtalainen sytotoksisuutta kohti H1299 soluja, IC

50-arvot 7,6 ja 4,5 uM 1 vrk ja 3 päivän hoitoa, vastaavasti (kuvio 4A). Kuitenkin peräkkäinen hoito H1299 soluja 2-10 Gy säteilyn ja 3 uM BC-23 johti 2-log kasvu klonogeeniset kuoleman H1299 solujen verrattuna 10 Gy säteilyllä yksin (kuvio 4B). Indeksi yhdistelmä klonogeenisten solukuolema oli alle 1. Tämä merkittävä parannus klonogeenisten solukuoleman H1299-soluissa yhdistelmä BC-23 ja sädehoidot osoittaa säteilyn lisäävä vaikutus BC-23.

A. H1299-soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla BC-23 yksin 1 (○) ja 3 (●) päivää. Solujen elinkyky määritettiin CellTiter Blue-määritystä. B. peräkkäinen altistuminen H1299 solujen 2-10 Gy säteilylle, jota seurasi 1 h myöhemmin käsittelemällä 3 uM BC-23 (■), kasvanut dramaattisesti induktio klonogeeniset solukuoleman verrattuna sädehoitoa yksin (●). Jokainen piste edustaa keskiarvoa kolmen erillisen kokeen.

yhdistäminen BC-23 sädehoitoa tehostaa ROS sukupolvi H1299 soluissa

aste koko oksidatiivisen stressin määritettiin seuraamalla ROS käyttämällä H

2DCFDA. Tutkimme solunsisäisiä tasoja ROS syntyy ajan mittaan. ROS pitoisuus 2 jälkikäsittely oli 2-kertainen soluissa käsitelty yhdistetty antaminen 10 Gy säteilyn ja 3 uM BC-23 kuin soluissa annettiin joko hoito yksinään (kuvio 5A). Mahdollinen rooli ROS BC-23-välitteisen solun tappaminen ja inhibitio pesäkkeiden muodostumisen testattiin edelleen käyttämällä NAC (antioksidantti) sitomiseksi ROS soluissa. NAC huomattavasti poisti sytotoksisia ja kasvua estäviä vaikutuksia BC-23 H1299-soluissa (kuvio 5B-5D).

. Yhdistämällä 3 uM BC-23 10 Gy säteilyä (x) kasvanut dramaattisesti ROS sukupolvi, verrattuna yksittäisiin hoitoihin yksin: auton ohjaus (●), 3 uM BC-23 (■), ja 10 Gy säteily (▲). Kukin arvo on keskiarvo ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. B-D, ROS riippuva sytotoksisia vaikutuksia BC-23. NAC vaimentaa solukuolemaa altistamalla H1299-solujen osoitettuihin konsentraatioihin BC-23 sytotoksisuuden (B) ja colongenic määritykset (C, edustaja ruokia klonogeenisten määrityksissä ja D, analyysit prosenttiosuus eloonjääneiden solujen). *, P 0,05 verrokkiin nähden.

BC-23 indusoi S-vaiheessa pidätyksen H1299 soluissa

solusyklin pysähtymiseen on S ja G2 /M vaiheissa on tärkeä mekanismi, joka aiheuttaa solukuolemaa nähdään hoitovasteen yhdistelmä säteilyn ja syöpälääkkeiden, mukaan lukien Wnt /β-kateniinin reitin estäjiä. 24 h hoito 5 uM BC-23 yksinään lisäsi merkittävästi solujen prosenttiosuus (45%) S-vaiheessa, verrattuna kontrollisoluihin (25%). Hoito yhdistelmällä 4 Gy säteilyn ja 5 uM BC-23 johti samankaltaiseen prosenttiosuus H1299 soluja S-vaiheessa, mutta soluja estetty myös G2 /M-vaiheessa sädehoitoa (kuvio 6).

H1299-soluja käsiteltiin ajoneuvon ohjaus (A), 5 uM BC-23 (B), 4 Gy säteily (C), ja 4 Gy säteilyn plus 5 uM BC-23 (D). Solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa solusyklin määritettiin propidiumjodidi (PI) värjäystä ja FACS-analyysiä. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

BC-23 alas-säätelee ilmentymistä c-Myc ja sykliini D1 ja β-kateniinin pudotus by CTNNB1 siRNA merkittävästi estänyt sädeherkistävä vaikutus BC-23

Olemme suorittaneet lisäkokeita vaikutuksista BC-23 Wnt /β-kateniinin /TCF4 signalointireittiä määrittämällä sen vaikutuksia ilmentymisen c-Myc ja sykliini D1, jotka ovat kaksi tärkeää erityistä kohdegeenien p-kateniinin /TCF4 signalointia. Sen jälkeen, kun 16 tunnin käsittely 20 ja 40 uM BC-23 mRNA: n ilmentymisen tasot c-Myc ja sykliini D1 vähensi merkittävästi H1229-soluja (kuvio 7). Tutkimme ilmaisua muiden geenien (esim β-aktiini), jotka eivät liity sääntelyn p-kateniinin /TCF4 vuorovaikutus ja niiden ilmaisua ei vaikuttanut BC-23. Kynnyssyklinä arvot kuviossa 7 normalisoitiin β-aktiini sisäisenä vertailuna. Nämä tiedot lisänäyttöä, että BC-23 down-regulation sekä sykliini D1 ja c-Myc, joita yli-ilmennetään monissa syöpäsolut, mukaan lukien H1229 soluja. Käytimme myös CTNNB1 siRNA vähentää β-kateniinin ilmentymistä H1299-soluissa, jotta voidaan määrittää, onko sädeherkistävä vaikutus BC-23 riippuu β-kateniinin kautta. Kuvio 8A esittää, että CTNNB1 siRNA vähensi β-kateniinin ilmentymisen verrattuna ohjaus siRNA. Hiljentäminen komponenttien Wnt /β-kateniinin reitti on tiedetään lisäävän radioherkkyyttä syöpäsoluja. Kuten odotettua, knockdovvn β-kateniinin by CTNNB1 siRNA paransi merkittävästi radioherkkyyttä of H1299 soluja, kun taas transfektio ohjaus siRNA ei muuttanut radioherkkyyttä verrattuna 6 Gy säteilyn yksin, kuten kuvassa 8B. BC-23 lisäsi radioherkkyyttä of H1299 käsiteltyjen solujen ohjaus siRNA. Kuitenkin säätelyä alaspäin β-kateniinin ilmaisutapoja CTNNB1 siRNA esti sädeherkistävä vaikutus BC-23 verrattuna kontrolliryhmään siRNA ryhmä, mikä viittaa siihen, että sädeherkistävä vaikutus BC-23 riippuu ainakin osittain, on Wnt /β- kateniinin kautta.

H1299-soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla BC-23. Kokonais-RNA ja cDNA valmistettiin kuluttua 16 h hoito. CDNA wuantified reaaliaikaisella PCR: llä ja normalisoitu vastaan ​​ajoneuvon hallinnan. BC-23 hoito esti merkitsevästi ilmentymistä sekä Wnt /β-kateniinin kohdegeenien c-Myc, ja sykliini D1 mRNA-tasolla. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. *, P 0,05 ja **, p 0,01 verrokkiin nähden.

H1299 solut käsiteltiin CTNNB1 tai ohjaus siRNA. Proteiini valmistettiin osan solujen Western blot ja loput solut käytettiin radioherkkyyttä määrityksissä 6 Gy säteilyn kanssa /ilman BC-23. A, CTNNB1 siRNA vähensi β-kateniinin ilme. B, CTNNB1 siRNA merkittävästi estänyt sädeherkistävä vaikutus BC-23. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. ****, P 0,001 verrokkiin nähden; ###, P 0,001 vs. 6 Gy + ohjaus siRNA; , p 0,01 vs. 6 Gy + ohjaus siRNA + BC-23.

Keskustelu

Selvitimme suoraan estäviä vaikutuksia valittujen yhdisteiden NCI vuorovaikutuksesta β-kateniinin ja TCF4 käyttämällä äskettäin kehitetty cell-free-kompetitiivinen sitoutumismääritys perustuu FP [31]. Niistä yhdisteistä testattiin, BC-23 osoitti voimakasta aktiivisuutta (IC

50-arvo 1,7 uM) vastaan ​​vuorovaikutusta β-kateniinin ja FITC-leimatun TCF4

(8-30) koetin (kuvio 1). Käytimme myös solupohjaisessa TOP (kätkeminen Tef /Lef sitoutumiskohta) lusiferaasianalyysissä testata vaikutusta BC-23 transkriptionaalista aktiivisuutta Wnt /β-kateniinin kautta. BC-23 annoksesta riippuvalla tavalla inhiboivat TOP aktivaation H1299-soluissa, ja IC

50-arvo 2,3 uM (kuvio 2). Nämä tiedot viittaavat siihen, että BC-23 tavoitteita, joihin β-kateniinin /TCF4 vuorovaikutusta. Analyysi sitoutumisen konformaation BC-23 molekyyli telakointi paljasti, että BC-23 miehitetty kannan Asp16 ja Glu17 ja TCF4, muodostaen kaksi vetysidoksia Asn430 ja Lys508 ja hydrofobiset vuorovaikutukset Pro505 on β-kateniinin (kuvio 3B). Tämä osoitti, että BC-23 estää vuorovaikutusta TCF4 ja β-kateniinin on Asp16 ja Glu17 ja TCF4 (kuvio 3A & 3B).

Testasimme potentiaalia BC-23, joka toimii säteilyllä tehostajana NSCLC H1299 soluja. Korkea ydin- β-kateniinin on havaittu monissa ihmisen keuhkosyövän soluja [16]. Läsnäolo keuhkosyövän kantasolujen (LCSCs), jotka pystyvät itseuudistumisen, leviämisen, ja etäpesäkkeiden voi antaa kasvain Säteilynsietotestin [4-6]. Oletimme, että anto BC-23 voisi parantaa toiminnan sädehoidon keuhkosyöpään solujen kautta eston β-kateniinin /TCF4 vuorovaikutuksen ja signalointi. Ensin määritetään sytotoksisuus BC-23 yksin H1299-soluissa CellTiter-Blue Assay. BC-23 yksinään kohtalainen sytotoksisuutta kohti H1299 soluja, IC

50-arvot 7,6 ja 4,5 uM 1 vrk ja 3 päivän hoitoa vastaavasti kuten kuviossa 4A. Hoito H1975 solujen (p53 villityypin NSCLC) BC-23 1 ja 3 päivää johti IC

50-arvot BC-23 7,9 ja 5,2 uM, tässä järjestyksessä, jotka olivat arvot verrattavissa saatu H1299 soluja . Tämä viittaa siihen, että sytotoksista vaikutusta BC-23 on riippumaton p53. Peräkkäinen hoito soluja 2-10 Gy säteilyä, jota seurasi 1 tuntia myöhemmin antamalla 3 uM BC-23, merkittävästi parannettu säteilyn välittämä klonogeenisten solujen tappaminen vaikutus H1299-soluissa (kuvio 4B). BC-23, yhdessä 10 Gy säteilyn aiheuttama 2-log kasvu klonogeenisten kuoleman H1299-solujen verrattuna 10 Gy säteilyn yksin.

mahdollisia mekanismeja, joilla BC-23 parantaa kuoleman NSCLC solut altistuvat säteilylle oli tutkittava tarkemmin analysoimalla solusyklin ja ROS tuotanto H1299 soluissa käsitelty BC-23 ja säteily, yksin tai yhdessä. Edellinen tutkimus viittaa siihen, että Wnt /β-kateniinin signalointireitin on rooli säätelyssä solukierron ja tuma-lokalisoitu β-kateniinin-Tcf monimutkainen kasvaa aikana S-G

2 [34, 35]. Β-kateniinin aktivointi liittyy selviytymisen solujen vaurioitunut DNA (aiheuttama ROS) ja DNA korjata virheet [36]. BC-23, joko yksin tai yhdistettynä säteilyn pidätettiin H1299 soluja S-vaiheessa (kuvio 6), verrattuna vehikkelikontrolliin ja säteilyn yksin. Yhdistetty hoito BC23 ja säteilyn tuotetaan S-vaiheessa pidätyksen ja samanaikainen säteilyn aiheuttamien G2 /M solusyklin lohko. Nämä havainnot viittaavat siihen, että viivästyminen tapahtuu solusyklin siirtyminen tai /ja DNA kaksinkertainen lohkon murtuma käsittely H1299 soluissa jälkeen yhteistyössä hoidon BC-23 ja säteily. Viive DNA-synteesissä aiheuttama BC-23 voi pahentaa eloonjäämisen solujen käynnissä G

2 /M pidätys (kuvio 6) aiheuttama altistuminen säteilylle ja tuloksena ROS (kuvio 5). BC-23 indusoituu merkittävästi ROS sukupolven H1299-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 5A). Mahdollinen rooli ROS BC-23-välitteisen solun tappaminen ja klonogeeniset solukuolema varmistettiin lisäksi käyttämällä antioksidantti NAC sitomiseksi ROS soluissa. NAC hoito merkitsevästi poisti sytotoksista vaikutusta BC-23 sekä sytotoksisuuden ja pesäkekokeissa (kuvio 5B-5D). Lisääntynyt ROS aiheuttama BC-23 voi lisäksi estää β-kateniinin /TCF4 reitin koska ROS moduloivat negatiivisesti Wnt /β-kateniinin signaalireitin kautta säätelyä alaspäin β-kateniinin [37].

saatuja vahvistus spesifinen vaikutus BC-23 Wnt /β-kateniinin /TCF4 signaloinnin tutkimalla mRNA: n ekspressio c-Myc ja sykliini D1, kaksi kriittistä alavirran geenien Wnt /β-kateniinin kautta. Merkittävää ekspressiota inhiboivan sekä c-Myc ja sykliini D1 H1299-soluissa ei havaittu sen jälkeen, kun 16 tunnin käsittely 20 ja 40 uM BC-23 (kuvio 7). Lisänäyttöä se havainto, että CTNNB1 siRNA vähensi β-kateniinin ilmaisun ja merkittävästi esti sädeherkistävä vaikutus BC-23 H1299-soluissa (kuvio 8). Yhteenvetona todettakoon, että ligandin ja reitti-specific cell-free ja solupohjaiset määritykset, samoin kuin

in silico

molekyyli telakka tulokset osoittivat, että BC-23 on uusi inhibiittori β-kateniinin /TCF4, että kohdistuu erityisesti β-kateniinin /TCF4 vuorovaikutuksen ja estää niiden transkriptioaktiviteettia [38].

Johtopäätös

Olemme tunnistaneet ja ominaista uusi pienimolekyylinen BC-23, joka kohdistuu vuorovaikutusta β- kateniinin /TCF4 ja estää niiden transkription aktiivisuutta. BC-23 alas säätelee kaksi tärkeää Wnt /β-kateniinin reitin geeneistä: c-Myc ja sykliini D1.