Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tuumorinekroositekijä-α (TNFa) aktivoi sekä solukuoleman ja solujen selviytymisreittejä. Aktivointi selviytymisreittiin tekee useimmat syöpäsolujen resistenttejä TNF-aiheuttamaa sytotoksisuutta. Huomasimme, että esikäsittely digitoflavone, kasvi flavonoidi, huomattavasti herkistynyt TNFa aiheuttama apoptoottista solukuolemaa useissa ihmisen haimasyövän soluja. Etsimään molekyyli perusteella herkistymistä vaikutuksen digitoflavone, digitoflavone havaittiin inhiboivan TNFa-indusoitua aktivaatiota tumatranskriptiotekijä-kappa B (NF-KB), joka on tärkein selviytymisen tekijä TNFa signalointia. NF-KB tukahduttaminen tapahtui estämällä IκBα kinaasiaktivaatiota, IκBα fosforylaatio, IκBα hajoamista, ja NF-KB tumaansiirtymiseen. Tämä inhibitio korreloi tukahduttaminen NF-KB-riippuvaisia ​​osallistuvien geenien antiapoptosis (MCL-1, BCL-2, Bcl-x L, c-iap1, c-iap2, flip, ja surviviini), proliferaation (c-myc, sykliini d1 ), ja angiogeneesiä (VEGF, cox-2, ja MMP-9). Lisäksi digitoflavone voi aktivoida JNK estämällä NF-KB: n signalointia, saadaan jatkuva saarto palautteen estävä mekanismi JNK aiheuttama NF-KB: n aktivoitumisen. Tämä tutkimus löytäneet uuden toiminnon digitoflavone ja tehostetun arvo digitoflavone syöpälääkkeenä.

Citation: Cai X, Lu W, Yang Y, Yang J, Ye J, Gu Z, et al. (2013) Digitoflavone Estää IκBα Kinase ja parantaa indusoiman apoptoosin TNFa kautta alassäätely Expression of Nuclear Factor KB: n säätelemät geenituotteet in Human haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (10): e77126. doi: 10,1371 /journal.pone.0077126

Editor: Wenhui Hu, Temple University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 elokuu 2012; Hyväksytty: 08 syyskuu 2013; Julkaistu: 11 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Cai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (nro. 30701098, 30873410 ja 81073101), Natural Science Foundation of Zhejiang (nro Y2090676) ja Jiangsu erinomaisena Leader Program perinteisen kiinalaisen lääketieteen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi yleisin kuolinsyy syöpäpotilaiden Yhdysvalloissa ja on maailmanlaajuinen syövän hoito ongelma [1]. Perinteinen hoitomuotoja varten voida leikata haimasyövän kuuluvat säteily yksin, kemoterapia yksinään tai yhdistettynä chemoradiation. Kuitenkin yhden vuoden ja viiden vuoden eloonjäämisluvut ovat vain 15% ja 5%, vastaavasti [2], [3]. Pääasiallinen huume käytetään tällä hetkellä hoidettaessa potilaita, joilla on haimasyöpä on gemsitabiini, joka on objektiivinen vaste oli ainoastaan ​​5% [4]. Chemoresistance kasvainsolujen on ilmeisesti merkittävä vika tavanomaisen kemoterapian hoidossa haimasyöpä. Nuclear tekijä-KB (NF-KB) on yksi vaikuttavia tekijöitä mukana vastustuskyky kemoterapia [5], [6]. Yli 90% haimasyöpäsoluissa satama mutatoitunut K-ras [7], ja NF-KB on alavirtavaikuttajainhibiittorit tämän onkogeenisten Ras [8], [9], [10]. NF-KB on konstitutiivisesti aktivoidaan ensisijainen haiman adenokarsinooma ja haimasyövän solulinjoissa [8], ja vaimentua NF-KB muodostaa biologiset perusteet tehokasta hoitoa potilaille, joilla haimakarsinooma- käyttäen myrkytöntä phytochemical [11]. Lisäksi tulehdus on ehdotettu olevan tärkeä osa, haimasyövän [12], ja NF-KB: n aktivaatio on välttämätöntä, että tulehduksellinen prosessi [13]. Siten yhdisteiden kehittäminen, jotka on kohdistettu NF-KB: n on ehdotettu lähestymistapa hoitoon potilailla, joilla on haimasyöpä [6], [14], [15].

Nuclear transkriptiotekijän-kappa B (NF -κB) on ratkaisevan tärkeää tuumorin solujen selviytymisen, kasvun, angiogeneesin ja metastaasin. Normaaleissa olosuhteissa, NF-KB: n, joka koostuu p50, p65, ja IκBα, on lokalisoitu sytoplasmassa. Kuitenkin, kun aktivoitu, tämä transkriptiotekijän siirtyy tumaan. Vastauksena aktivointisignaalin, inhiboiva IκBα alayksikön läpi fosforylaation, ubikitinaation ja hajoamista, mikä altistaa tumalokalisaatio signaalien p50-p65-heterodimeeri. P65 on sitten fosforyloituu, mikä johtaa sen tumaansiirtymiseen ja sitoutuminen tiettyyn järjestyksessä DNA, mikä puolestaan ​​johtaa geenitranskriptiossa [16], [17]. NF-KB: n on osoitettu säätelevän ilmentymistä useita geenejä, joiden tuotteet ovat osallisina kasvainten synnyssä [17], [18], [19], [20], [21]. Näitä ovat antiapoptoottisten geenien (esim, CIAP, surviviini, lii, cflip, BFL-1, BCL-2, ja Bcl-x L), tulehduksellinen geenit (cox-2, MMP-9, ja VEGF: n), ja geenit, jotka koodaavat adheesiomolekyylien , kemokiinit, ja solusyklin säätelygeenit (esim sykliini d1 ja c-myc). Siten aineet, jotka tukahduttaa NF-KB on terapeuttista potentiaalia haimakarsinooma- [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28].

Digitoflavone (Dig) on ​​yleinen flavonoidi joka on läsnä monenlaisia ​​kasveja kuten hedelmiä, vihanneksia, ja lääkekasvit. Kasvit runsaasti digitoflavone on käytetty perinteinen kiinalainen lääketiede hoidettaessa erilaisia ​​sairauksia, kuten kohonnut verenpaine, tulehdukselliset sairaudet ja syöpä. Digitoflavone: n syövän vastainen ominaisuus liittyy apoptoosin ja soluproliferaation inhibointi, etäpesäke, ja angiogeneesiä [29]. Digitoflavone merkittävästi herkistyneet TNFa-indusoitua apoptoosia useissa ihmisen haimasyövän solulinjoissa, vaikutus, joka havaittiin ensimmäistä kertaa tässä tutkimuksessa. Tällainen herkistyminen liittyy läheisesti digitoflavone n estävä vaikutus NF-KB: n aktivoitumisen, mikä vaimentua joitakin keskeisiä antiapoptoottisten geenejä, kuten c-iap1 ja VEGF. Digitoflavone voisi aktivoida JNK, kriittinen prosessi herkistymistä digitoflavone TNFa: n indusoiman apoptoosin. Tämän tutkimuksen tulokset kehittynyt ymmärrystämme molekyylitason mekanismi, joka osallistuu syövän vastaisen aktiivisuuden digitoflavone.

Materiaalit ja menetelmät

2,1 Materiaalit

Digitoflavone ostettiin Nanjing TCM Institute of Kiinan Materia Medica, Kiina. Se liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), kuten 20 mmol /L-kantaliuosta ja säilytettiin -20 ° C: ssa.

Escherichia coli

-johdannainen ihmisen tuumorinekroositekijä-α (TNF-α), joka on sopiva soluviljelmä, saatiin Sigma, Inc. trypsiini ja MTT saatiin Sigma, USA. Lyysipuskuria ostettiin Beyotime, Kiina. Vasta-aineet (kaspaasi-3, kaspaasi-8, vuohen anti-hiiri-IgG-HRP: tä ja vuohen anti-kani-lgG-HRP) saatiin Santa Cruz, USA. Vasta-aineet Cycle D1, COX-2, MMP-9, VEGF, Mcl-1, Bcl-2, Bcl-X

L, c-IAP1, c-IAP2, FLIP, surviviinia, PARP, IKKα /β, p- IKKα, p-IKKβ, IκBα, p- IκBα, JNK, ja p-JNK ostettiin Cell Signaling Technology, USA. Monoklonaalinen hiiren anti-glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) saatiin Kangchen, Kiina. P65 ekspressiovektori pCMV-p65, oli ystävällinen lahjoitus tri Fang Wang, Harvard Medical School, Boston.

2.2 Cell Culture

Ihmisen haiman solulinjat PANC-1, Colo-357 ja BxPC-3 ostettiin Cell Bank of Shanghai Institute Biokemian ja solubiologian. -Soluja viljeltiin DMEM-alustassa (ja PANC-1, Colo-357-solut) tai RPMI-1640 (for BxPC-3-soluja), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (kaikki saatavissa Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Kaikkia viljelmiä pidettiin kosteutetussa ympäristössä, jossa on 5% CO

2 37 ° C: ssa.

2,3 anneksiini-V /PI Double Värjäys Pitoisuus

haimasyöpä soluja käsiteltiin digitoflavone ( 40 uM), TNFa: n (20 ng /ml), yksin tai yhdessä 37 ° C: ssa 24 tuntia. Sitten solut kerättiin, pestiin ja suspendoitiin uudelleen PBS: llä. Apoptoottiset solut määritettiin käyttäen FITC anneksiini V Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, USA) valmistajan protokollan. Solut pestiin lyhyesti ja sen jälkeen inkuboitiin 15 min 100 ul: aan 1 x sitomispuskurissa, joka sisältää 5 ui anneksiini V-FITC ja 5 ui PI, pimeässä huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen, apoptoosi analysoitiin FACScan-laser virtaussytometrillä (FACSCalibur, Becton Dickinson, USA). Aineisto analysoitiin käyttämällä ohjelmistoa CellQuest-.

2,4 NF-KB Luciferase Reporter Assay

PANC-1-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti NF-KB-riippuvaisia ​​tulikärpäsen lusiferaasi reportterikonstruktio ja konstitutiivisesti ilmentävien Renilla lusiferaasia rakentaa (40:1) käyttäen Lipofectamine 2000 mukaisesti valmistajan protokollan (Invitrogen, USA). Tulikärpäsen lusiferaasi-aktiivisuus määritettiin ja normalisoitiin ohjaus Renilla tasolla, käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega USA).

2,5 NF-KB: n aktivaatio

DNA: ta sitova aktiivisuus NF KB määritettiin elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA) ja sen jälkeen ohjeita LightShift Kemiluminesenssiin EMSA Kit (Pierce, USA). Tumauutteita valmistettiin käyttäen NE-PER ydin- ja sytoplasmisia Extraction Kit (Pierce, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tumauutteet inkuboitiin biotiinilla end-leimatun, kaksijuosteinen NF-KB: n (5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG-3 ’) tai Oct-1 (5′-TGTCGAATGCAAATCACTAGA A-3’) (Beyotime, Kiina) 20 minuutin ajan huonelämpötila. DNA-proteiini-kompleksi on muodostettu erotettiin 5%: n natiivi polyakryyliamidigeelillä. Sitten DNA siirretään nopeasti positiivinen nailonkalvolle, UV silloitettu, tutkittiin streptavidiini-HRP-konjugaattia, inkuboitiin substraatin ja altistettiin röntgenfilmille.

2,6 IκBα hajoaminen ja fosforylaatio

sen vaikutuksen määrittämiseksi digitoflavone TNFa-riippuvainen IκBα hajoamista ja fosforylaatio, sytoplasman uutteet valmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [30] haiman syöpäsoluja esikäsitelty digitoflavone 7 tuntia ja sitten altistettiin 20 ng /ml TNFa: 5, 10, ja 20 min. Sitten uutteet eroteltiin 13% SDS-polyakryyliamidigeeleillä. Elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin sähköllä PVDF-membraaneille (Millipore, USA), tutkittiin vasta-aineiden IκBα ja fosforyloitu IκBα, ja havaittiin käyttäen kemiluminesenssi (Luminata Crescendo Western HRP-substraattia, Millipore, USA).

2,7 Sidonta teho digitoflavone ATP Binding site of IKK

sitoutumisen määrittämiseksi teho digitoflavone ATP sitoutumiskohta IKK, teimme kinaasin sitoutumisen määrityksessä KINOMEscan (LeadHunter Discovery Services). Lyhyesti, kinaasi-koodattu T7-faagin kannat valmistettiin

E. coli

isäntä peräisin BL21 kannasta.

E. coli

kasvatettiin log-vaiheeseen, ja infektoitiin T7-faagin ja inkuboitiin ravistellen 32 ° C: ssa, kunnes lyysi. Lysaatit sentrifugoidaan ja suodatetaan solujätteen poistamiseksi. Loput kinaasit tuotettiin HEK-293-soluihin ja sen jälkeen koodattu DNA qPCR havaitsemiseen. Streptavidiinilla päällystettyjä magneettisia helmiä käsiteltiin biotinyloidulla pienimolekyylisiä ligandeja 30 minuuttia huoneen lämpötilassa tuottaa affiniteettihartseilla kinaasien määrityksissä. Ligandoidun helmet blokattiin yli biotiinin ja pestiin blokkauspuskurilla (SeaBlock (Pierce), 1% BSA, 0,05% Tween 20, 1 mM DTT) poistamaan sitoutumaton ligandi ja epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi. Sitovat reaktiot koottiin yhdistämällä kinaasien, ligandoidun affiniteetti helmiä, ja testiyhdisteiden 1 × sitomispuskuriin (20% SeaBlock, 0,17 x PBS: llä, 0,05% Tween 20, 6 mM DTT: tä). Kaikki reaktiot suoritettiin polystyreeni 96-kuoppaisissa levyissä lopullisessa tilavuudessa 0,135 ml. Koelevyjä inkuboitiin huoneenlämpötilassa ravistellen 1 tunnin ajan ja affiniteetti helmet pestiin pesupuskurilla (1 x PBS, 0,05% Tween 20). Sitten helmet suspensoitiin uudelleen eluutiopuskuria (1 x PBS, 0,05% Tween 20: tä, 0,5 uM ei-biotinyloitu affiniteettiligandi) ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa ravistellen 30 minuuttia. Kinaasin pitoisuus eluaatit mitattiin qPCR.

2,8 JNK aktivointi Pitoisuus

vaikutuksen määrittämiseksi digitoflavone TNFa-indusoitua JNK aktivointi, Western blot käytetään suorittamaan JNK-määritystä. Lyhyesti, sytoplasminen uutteet valmistettiin haimasyövän soluja käsiteltiin 40 uM digitoflavone 7 tuntia ja sitten käsiteltiin 20 ng /ml TNFa: 5, 10, ja 20 min. Sitten uutteet eroteltiin 13% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja analysoitiin Western blot käyttämällä vasta-ainetta vastaan, JNK ja p-JNK.

2,9 transfektio p65

Transfektio suoritettiin 6- kuoppalevyille käyttäen Lipofec- tamin’ia 2000 reagenssia (Invitrogen, Paisley, UK) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä ja transfektoitiin Sopivan vektorin (2 ug) seuraavana päivänä. 4 tunnin kuluttua transfektion seos poistettiin ja korvattiin täydellistä elatusainetta. Cell käsittelyt suoritettiin sitten 24 h transfektion jälkeen, kuten on ilmoitettu.

2,10 NF-KB: n kohdistettua Gene Expression Analysis

vaikutuksen määrittämiseksi digitoflavone TNFa-indusoidun NF-KB: n kohdegeenin ilmentymisen Western blot käytettiin suorittamaan proteiinin ilmentymisen määritystä. Lyhyesti, sytoplasminen uutteet valmistettiin haimasyövän soluja käsittelemättömiä tai esikäsiteltyjä 40 uM digitoflavone 7 tuntia ja sitten käsiteltiin 20 ng /ml TNFa: 2, 4, 8, 12, ja 24 h.

2.11 reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (qPCR) B

Yhteensä-RNA uutettiin käyttäen Trizol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. 2 ug kokonais-RNA: ta käytettiin cDNA-synteesiä varten, joissa satunnaisia ​​heksameerialukkeita. qPCR suoritettiin käyttäen ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Reaktiot toteutettiin kohti SYBR Green ohjeet (Thermo tieteellinen, USA) kolmena kappaleena kolmen erillisen kokeen. Alukkeen sekvenssit annetaan taulukossa 1. ΔΔC

T menetelmää käytettiin qPCR määrittämiseen. GAPDH käytettiin taloudenhoito geeni normalisoida vaihtelua ekspressiotasoja.

2,12 VEGF Detection ELISA

VEGF pitoisuus väliaine ihmisen haimakarsinooma- soluja mitattiin käyttämällä kaupallisesti saatavilla ELISA-kittiä (R 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

3.1 digitoflavone voimisti apoptoottiset vaikutukset TNFa

vaikutukset digitoflavone apoptoottiseen vaikutuksia TNFa tutkittiin. TNFa yksinään ei aiheuttanut merkittävää määrää apoptoosin; kuitenkin, kun se yhdistetään digitoflavone, sytotoksisia vaikutuksia TNFa tehostettiin (Fig. 1). Digitoflavone yhdistettynä TNFa kasvoi noin 180-240% apoptoosin korko kuin TNFa yksinään.

Solun apoptoosia määritettiin anneksiini V FITC Apoptosis Kit. *

P

0,05 verrataan hoitamattomiin ohjaus; ja #

P

0,05 verrataan ryhmään TNFcclla vain.

3,2 Digitoflavone Tukahdetut NF-KB-riippuvaista reportterigeeniekspressiota indusoiman TNFa

tutki estävä vaikutus digitoflavone on NF-KB: n transkriptionaalista aktiivisuutta PANC-1-soluissa käyttäen NF-KB: n lusiferaasireportterilla määrityksessä. Kuten kuviossa 2 on esitetty, hoito TNFa tehostaa merkittävästi NF-KB: n transkriptionaalisen aktiivisuuden ja digitoflavone esikäsittely merkittävästi tukahdutti transaktivaatiota NF-KB: n indusoiman TNFa: n. Pelkistetty lusiferaasiaktiivisuutta digitoflavone voi koska sen suoran estoa lusiferaasientsyymi aktiivisuutta. Jotta tällaisen mahdollisuuden pois sulkemiseksi, digitoflavone jälkikäsittelyä suoritettiin. Soluja käsitellään ensin TNFa (20 ng /ml) 2 h, mitä seurasi digitoflavone (40 uM) hoitoa vielä 2 tuntia. On melko mielenkiintoista havaita, että digitoflavone jälkikäsittelyä eivät estäneet transaktivaatiota NF-KB: n indusoiman TNFa: n, mikä viittaa siihen, että digitoflavone ei tukahduttaa NF-KB: n aktivoitumista transkription jälkeen ja aiheuta mitään suoraa eston lusiferaasientsyymin aktiivisuuden.

PANC-1-solut kotransfektoitiin NF-KB riippuvainen tulikärpäsen lusiferaasi reportterikonstruktio ja konstitutiivisesti ilmentävien Renilla lusiferaarikonstrukti. Solut käsiteltiin sitten digitoflavone (40 uM) eri aikoina (1 h, 3 h, 5 h, 7 h). Toinen ryhmä soluja (esikäsittely- ryhmä) käsiteltiin digitoflavone (40 uM) eri aikoina (1 h, 3 h, 5 h, 7 h), jonka jälkeen TNFa (20 ng /ml) 2 tuntia. Jälkikäsittely-ryhmä käsiteltiin TNFa: n (20 ng /ml) 2 h, jonka jälkeen digitoflavone (40 uM) eri aikoina (1 h, 3 h, 5 h, 7 h). Lusiferaasiaktiivisuudeksi ilmaistiin kertaisesti lisääntynyt ohjaus jälkeen normalisoitu Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Tiedot esitetään keskiarvoina ± S.D. vähintään kolmen erillisen kokeen. *

P

0,05 verrattaessa TNFa-käsittelemätön kontrolli (0 h);

#

P

0,05 verrataan ryhmään, jossa TNFa vain, ja

△

P

0,05 verrataan ryhmään TNFa-käsittelemätön Dig hoidettuun kontrolliryhmään (7 h).

3,3 Digitoflavone Inhibioitu Inducible NF-KB: n aktivaatio TNFa

TNFa on aktivaattori, NF-KB: n, ja mekanismi NF-KB: n induktion tiettävästi vaihtelee eri solu- tyypit. [31] Siten, tutkimme, onko digitoflavone oli tehokas estämään NF-KB: n aktivaatiota ihmisen kolmesta haimasyövän solulinjoissa. Tulosten mukaan, digitoflavone estivät täysin TNFa-indusoidun NF-KB: n aktivoitumisen kaikissa kolmessa solulinjoissa (Fig. 3), mikä osoittaa, että digitoflavone oli tehokas inhiboimaan TNFa-indusoituvaa NF-KB: n haimasyövän solulinjoissa vaihtelevan erilaistumista.

haimasyöpä soluja esi-inkuboitiin digitoflavone (40 uM) 7 tuntia ja sitten käsiteltiin 20 ng /ml TNFa: aa 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Nuclear uutteet valmistettiin ja testattiin sitten NF-KB: n aktivaation EMSA. Pohja, EMSA käyttäen Oct-1 koetin latauskontrollina.

3,4 Digitoflavone Inhibioitu TNFa-riippuvainen IκBα fosforylaatio ja Hajoaminen

IκBα fosforylaatiota tarvitaan NF-KB: n aktivaation. Siksi pyrimme onko digitoflavone vaikuttaa TNFa aiheuttamaa IκBα fosforylaatio, joka on toinen edellytys NF-KB translokaatio. Mukaan Western blot-analyysi, joka käyttää vasta-ainetta, joka tunnistaa vain seriini-fosforyloitu muoto IκBα, digitoflavone täysin tukahdutetaan TNFa aiheuttama IκBα fosforylaatiota (kuvio. 4A). IκBα hajoaminen tarvitaan tyypillisesti translokaatio NF-KB: n tumaan. Siksi pyrimme määrittämään, onko inhibitio TNFa-indusoidun NF-KB: n aktivaatio digitoflavone johtui inhibitio IκBα hajoamista. Huomasimme, että TNFa indusoi IκBα hajoamista ohjaus soluissa ja digitoflavone viivästynyt TNFa aiheuttama IκBα huononemisen PANC-1 ja Colo-357-solut (Fig. 4A). Toisaalta, digitoflavone esikäsittely inhiboi osittain ilmentymistä IκBα (ajankohtana 0).

A, digitoflavone inhiboi TNFa-indusoitua fosforylaatiota IKKα /β ja IκBα. Haimasyövän soluja inkuboitiin 40 uM digitoflavone 7 tuntia ennen altistamista TNFa eri aikoina, ja sitten testattiin fosforyloidun IKKα /β ja IκBα soluliman jakeet Western blotting -analyysi. B, digitoflavone oli hyvä sitova teho ATP sitoutumiskohta IKK, jossa Kd 7,3 uM ja 5,2 uM IKKα ja IKKβ vastaavasti.

3.5 Digitoflavone Inhibioitu TNFa aiheuttama IKK Activation

IKK aktivointi on kriittinen TNFa-indusoidun NF-KB: n aktivaation. Digitoflavone tukahdutti täydellisesti TNFa-indusoidun aktivaation IKK. Kumpikaan TNFa eikä digitoflavone kohdistama minkäänlaista suoraa vaikutusta ilmaisun IKK proteiinien (Fig. 4A). Tulokset KINOMEscan määritys paljasti, että digitoflavone oli hyvä sitova teho ATP sitoutumiskohta IKK, jossa Kd 7,3 uM ja 5,2 uM IKKα ja IKKβ vastaavasti (Fig. 4B). Nämä tulokset osoittivat, että digitoflavone hyvin todennäköisesti vaimentua ilmentymistä NF-KB-säänneltyjä geenituotteet estämällä IKK.

3,6 Digitoflavone voitu Aktiivinen JNK ja tämä vaikutus estyi yli-ilmentyminen p65

tutkittiin, mikä vaikutus digitoflavone esikäsittely TNFa-indusoidun JNK aktivointia. TNFa yksinään aiheutti nopean ja tilapäisen JNK aktivointi haiman syöpäsoluja, kuten on osoitettu lisääntynyt JNK fosforylaatio. Digitoflavone voisi aktivoida JNK sekä TNFa: n, ja aktivointi vaikutusta ei ole heikentynyt, kun niitä käytetään yhdessä (Fig. 5). Vaikutusten määrittämiseksi yliekspressiosta p65 on JNK aktivointia, me transfektoitiin lyhytaikaisesti PANC-1-solujen p65 tai tyhjän vektorin ja arvioitiin koko solun lysaatit digitoflavone käsiteltyjä soluja Western blotting-analyysi käyttäen vasta-ainetta, joka tunnistaa spesifisesti fosforyloitua muotoa JNK . Kuten kuviossa 6 on esitetty, digitoflavone hoito johti jatkuvaa fosforylaatioon sekä p46 ja p54-isoformien JNK. Yli-ilmentyminen p65 estetty digitoflavone indusoimaa JNK: n aktivaatiota.

haimasyöpä soluja inkuboitiin 40 uM digitoflavone 7 h ajan 37 ° C: ssa, ja sitten testattiin fosforyloitu JNK solulimafraktiot Western blotting -analyysi.

PANC-1 transfektoitiin pCMV-p65 tai tyhjän vektorin ja käsiteltiin digitoflavone (40 uM) 3 tuntia tai 7 tuntia. JNK-aktiivisuus määritettiin western-blottauksella kokonaan-solulysaateista.

3,7 Digitoflavone Inhibioitu NF-KB-säädellään Gene Products Expression

COX-2, MMP-9, ja verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF) tiedetään säätelevän NF-KB: n. Sykliini D1 ja c-Myc säätelevät solujen lisääntymistä ja säätelevät NF-KB. NF-KB säätelee lisäävästi ilmentymisen määrä geenit helpottaa kasvainsolun eloonjäämistä, kuten Mcl-1, Bcl-2, Bcl-X

L, c-IAP1, c-IAP2, FLIP ja surviviini. Näin ollen, vaikutusta digitoflavone ekspressioon näiden NF-KB: n geenien ja geenituotteiden tutkittiin. TNFa hoito indusoi MMP-9, sykliini D1, Mcl-1, Bcl-2, c-IAP1, c-IAP2, FLIP ja elossa geenituotteita, ja digitoflavone poistetaan TNFa-indusoitua ilmentymistä näiden geenituotteiden (Fig. 7A -C). Tuloksemme osoittivat myös, että digitoflavone poistetaan TNFa-indusoidun mRNA-tasolla ja COX-2, MMP-9, VEGF, sykliini-D1, c-Myc, Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-X

L (Fig. 7D) .

Haimasyöpä solut jätetään hoitamatta tai inkuboidaan 40 uM digitoflavone 7 tuntia ja sitten altistettiin TNFa eri aikoina. Koko solu-uutteet valmistettiin ja analysoitiin Western blottauksella (kuvio. 7A-C) tai qPCR (Fig. 7D).

3,8 Digitoflavone esto VEGF eritystä haiman karsinooma Solut

VEGF joka on aktiivisesti erittyy hypoksisia kasvainsoluja voisi laukaista kasvaimen angiogeneesiä. Vähentäminen VEGF heikentää sen kykyä stimuloida kasvaimen angiogeneesiä. Siksi tutkittiin, mikä vaikutus digitoflavone VEGF eritystä haiman syöpäsoluissa käyttäen ELISA-analyysiä. Tulokset osoittivat, että digitoflavone hoitoa 24 tuntia vähenivät VEGF erityksen verrattuna hikkelikontrolliryhmään (

P

0,05). Stimulaatio TNFa lisääntynyt VEGF eritys verrattuna hikkelikontrolliryhmään (

P

0,05). Kuitenkin esikäsittely digitoflavone tukossa stimuloivan vaikutuksen TNFa (Fig. 8).

edustajan tiedot osoitettiin kolmesta itsenäisestä kokeesta kanssa identtiset tulokset. VEGF ilmaistiin pikogramma VEGF proteiinia millilitraa kohti keskipitkän ja kohti 10

5 solua. *

P

0,05 verrataan hoitamattomiin ohjaus; ja #

P

0,05 verrataan ryhmään TNFcclla vain.

Keskustelu

Haiman adenokarsinooma on aggressiivinen ja erittäin tappava maligniteetti. Tällä hetkellä, gemsitabiini käytetään yleisesti potilailla, joilla on haimasyöpä. Kuitenkin elinajanodote haimasyövän potilaista on edelleen heikko. Tsutom on raportoitu, että kasvaimeen rekombi- nantti ihmisen TNFa käyttökelvottoman tapauksissa haimasyövän aikaan kasvaimen taantumisen tai lasku kasvainmerkkiaineet [32]. Kuitenkin täydellinen vaste ei ollut päästy missään näistä tapauksista, ja kokonaistulos ei ollut riittävä, mahdollisesti koska cytoprotecting tekijät, kuten enTNF ja MnSOD on runsaasti haimasyöpäsoluissa [33], tai koska TNF-reseptoreihin oli tuskin ilmaistaan. Tämä vastareaktioita TNFa voidaan voittaa yhdessä matalia sytotoksisen yhdisteen, joka voi herkistää vaikutus TNFa.

Digitoflavone on yleinen kasvi flavonoidi jolla syövän vastaisia ​​ominaisuuksia, jotka osoittavat aikaisemmissa tutkimuksissa [29]. Digitoflavone löytyy suuri määrä kasveja ja elintarvikkeet, kuten punajuurta, kaalia, kukkakaali, selleri, vihreä paprika, perilla lehtiä, oliiviöljy, ja teen [34]. Solujen tutkimuksissa, digitoflavone on havaittu olevan antioksidantti, tulehdusta /anti-allerginen, anti-tuumorigeeninen, ja radikaali toiminta [35], [36], [37]. Digitoflavone on raportoitu estävän kehittämistä useita kiinteitä kasvaimia [38], [39], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46], [ ,,,0],47]. Tässä tutkimuksessa olemme esittänyt todisteita siitä, että digitoflavone herkistää TNFa aiheuttaman apoptoosin ihmisen haimasyövän soluja. Tällainen herkistyminen saavutetaan kautta estävä vaikutus NF-KB: n aktivoitumisen, mikä puolestaan ​​johtaa pienentää ilmentymisen antiapoptoottisten NF-KB: n kohdegeenien. Tästä tutkimuksesta kävi ilmi, uusi toiminto digitoflavone ja arvon lisäämiseksi digitoflavone hyödyllisenä syöpälääke.

NF-KB: n aktivaatio johtaa geenien ilmentymisen, jotka osallistuvat lisääntymisen ja etäpesäkkeiden syövän. Tässä raportissa, osoitimme että digitoflavone estää ilmentymistä sykliini D1, joka säätelee NF-KB. Lisäksi tuloksemme osoittavat, että digitoflavone downregulates ilmentymisen COX-2, MMP-9, ja VEGF: n, jotka kaikki säätelevät NF-KB: n. Nämä tulokset edelleen hiljaista, että digitoflavone käyttänyt syövän vastaisia ​​ominaisuuksia avulla NF-KB esto. NF-KB: n säädellä ilmentymistä Mcl-1, Bcl-2, Bcl-X

L, c-IAP1, c-IAP2, FLIP, ja surviviini, ja niiden yli-ilmentyminen useissa kasvaimissa on liitetty kasvainsolun eloonjäämistä, chemoresistance, ja radioresistance. Tuloksemme osoittavat, että digitoflavone hoito downregulates kaikki nämä geenituotteet. Digitoflavone on osoitettu estävän kasvua erilaisia ​​tuumorisolujen, kuten leukemiasolujen ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä soluihin [30]. Tämä kasvun inhibitio voidaan välittyvän downregulation erilaisia ​​geenejä. Downregulation eri antiapoptoottisten geenituotteiden digitoflavone myös herkistyneet solujen apoptoottisen vaikutusten TNFa. Lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet, että digitoflavone oli hyvä sitova teho ATP sitoutumiskohta IKK, joka osoitti, että digitoflavone hyvin todennäköisesti inhiboivat NF-KB-reitin kautta estämällä IKK. Digitoflavone voisi aktiivisen JNK ja yli-ilmentyminen p65 esti digitoflavone-indusoidun JNK-aktivaation. Dig voisi olla uusi lääke antamaan jatkuva saarto palautteen estävä mekanismi JNK aiheuttama NF-kB aktivaation. Tämä voi olla mekanismi, miksi digitoflavone voi herkistää TNFa. Tietenkin enemmän kokeellista todentamisinfrastruktuuri

in vivo

tutkimuksessa tarvittiin.