Krooninen sairaus

tiivistelmä

Adhesion of metastasizing eturauhaskarsinoomasolujen solut kvantifioitiin kahdesta kohdunkaulan mallin solulinjoista LNCaP (imusolmuke-spesifinen) ja PC3 (luuytimestä erityinen). By Aikaintervallitallennuksen mikroskopia ja voima spektroskopia löysimme PC3-solut kiinnittyvät valikoivasti luuytimestä peräisin mesenkymaaliset kantasolut (SCP1 solulinja). Käyttäen atomivoimamikroskoopilla (AFM), joka voima-spektroskopia, mekaaninen malli tarttuvuus SCP1 soluihin tunnettu sekä eturauhassyövän solulinjoissa, ja verrattuna substraattiin, joka koostuu puhtaasta tyypin kollageenia I PC3-soluja häviää enemmän energiaa (27,6 Aj) aikana pakko de-tartunta AFM kokeiluja ja verrokkeja enemmän liimaa ja vahvempi joukkovelkakirjojen verrattuna LNCaP (20,1 Aj). Ominaisuus allekirjoitukset irrotusvoima jälkiä paljasti, että toisin kuin LNCaP-solut, PC3-solut näyttävät hyödyntää filopodia lisäksi luoda liimasidosten. Yhdessä Tutkimuksemme osoittaa selvästi, että PC3-solut ovat parempia liima affiniteetti luuytimen mesenkymaalisten kantasolujen verrattuna LNCaP. Semi-kvantitatiivinen PCR molemmilla eturauhaskarsinoomasolulinjaa linjat paljasti ilmentymisen kaksi Col-I sitova integriini reseptoreihin, α1β1 ja α2β1 PC3-soluissa, mikä viittaa niiden mahdollinen osallistuminen erityisiä vuorovaikutus alustoihin. Edelleen käsitys tarkkaa mekanismia tämän ilmiön taustalla saattaa johtaa optimoitu terapeuttisia sovelluksia kohdistaminen metastaattisen käyttäytymistä tiettyjen syöpäsolujen kohti luukudosta.

Citation: Sariisik E, Docheva D, Padula D, Popov C, Opfer J , Schieker M, et al. (2013) Kosketus Interaction Forces eturauhassyöpäsolujen Kollageeni I ja luuytimen kantasoluja Yhtenäistä solutasolla. PLoS ONE 8 (3): e57706. doi: 10,1371 /journal.pone.0057706

Toimittaja: Daniel J. Muller, Swiss Federal Institute of Technology Zurich, Sveitsi

vastaanotettu: 13 elokuu 2012; Hyväksytty: 28 tammikuu 2013; Julkaistu 5 maaliskuuta 2013

Copyright: © 2013 Sariisik et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoitus Ministry of National Education Turkin (https://egitek.meb.gov.tr), saksalainen Excellence Initiative kautta ”Nanosystems Initiative Munich” (https://www.nano-initiative-munich.de/de/research -alueet /) ja Saksan tutkimussäätiön (https://www.dfg.de/gefoerderte_projekte/informationssysteme/index.jsp). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisten kasvainten ja johtava syöpäkuolemien syy miehillä Euroopassa. Melkein kaikilla potilailla, joilla on edennyt eturauhassyöpä osoittavat etäpesäkkeitä luussa, joka on usein ainoa havaittava paikalle syövän leviämistä [1]. Lisäksi eturauhassyövän luuhun diagnosoidaan usein ennen havaitsemista ensisijainen tauti ja kun eturauhassyövän solut Siirto tehty luustoon, parantavaa hoitoa ei ole enää mahdollista ja lievittävän hoidon tulee ainoa vaihtoehto [2]. Vaikka tutkijat ovat nyt alkaneet ymmärtää mekanismeja syövän kasvua luun, alkuvaiheet kasvain solu-luun vuorovaikutukset, jotka edistävät laajeneminen metastaattisen talletus ei vielä täysin ymmärretä. Näin ollen on olemassa selvä tarve valaista tekijöitä leviäminen eturauhassyöpä erityisesti luustoon.

On ehdotettu, että syövän etäpesäke luu on tulosta monimutkaisesta vuorovaikutuksesta eturauhassyövän solut luumatriisia proteiinien kanssa ja solutyyppien asuvat luukudoksen kuten osteoblastien ja osteoklastien [3] – [5]. Me ja muut ovat osoittaneet, että eturauhasen syöpä solulinja PC3, eristetty luuytimestä, on merkittävästi suurempi tarttuvuus suuri luun proteiinin kollageenin tyypin I (Col-I) kuin eturauhasen adenokarsinooma LNCaP, joka on peräisin ei- luu metastaattinen sivustolla [6], [7]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että affiniteetti Col-I saattaa olla yksi molekyyli tekijät etenemisen joidenkin syöpäsolujen luuhun.

Mitä tulee solun tekijöitä, lukuun ottamatta osteoblastien ja osteoklastien, toinen mielenkiintoinen osallistuja, joka on hiljattain raportoitu on solupopulaation asuvat luuytimessä, nimeltään mesenkymaaliset kantasolut (MSC). MSC: t ovat varhainen esisolujen osteoblastien ja niitä voidaan edelleen laajentaa ja erilaistuneet erikoistunut mesenkyymisolujen kuten rasvasolut, kondrosyyttien tai osteoblastien in vitro [8]. Cross et al., 2007, ovat ehdottaneet, että MSC: voi olla merkittävä rooli tukemisessa eturauhassyövän kasvua ja selviytymistä luun [9].

Alkuperäisestä toimipaikka myöhemmin laajentumista luun, eturauhasen syöpäsolut vaativat invasiivisia ominaisuus. Nabha et al., 2008 todettiin, että MSC: t stimuloitiin invasiivinen kyky PC3-solujen kautta Col-I indusoimalla eritystä proteaasin MMP-12 päässä PC3-soluja [10]. Lisäksi äskettäin artikkelin osoitti, että mesenkymaaliset fibroblastit voivat johtaa kollektiivinen syövän hyökkäystä remontin niitä ympäröivä matriisi, ja mikä luo fyysistä tilaa, jonka läpi syöpäsolut voivat yksinkertaisesti seurata [11].

Nämä tiedot antavat ymmärtää, erityisiä cross-talk välillä eturauhasen syöpäsolujen ja MSC, mutta silti ei ole selvää, missä määrin ja miten vahva nämä kaksi solutyypit voivat olla vuorovaikutuksessa ja mikä voisi olla taustalla olevia mekanismeja tämän vuorovaikutuksen. Molekyylejä solun pinnalla, voi välittää solujen vuorovaikutuksia. Tällaisia ​​molekyylivuorovaikutusten on mitattu mekaanisesti jäljittämällä tarvittava voima erottamaan reseptori-ligandiparien tai vuorovaikutuksessa solujen optinen pinseteillä, The biomembrane voima anturi tai atomivoimamikroskooppi [12] – [14]. Tällaiset kokeilut eivät vain voi mitata molekyylien irtoamisen tapahtumia vaan myös koetin mekaanista upottamisen ja ankkurointiin mitatun molekyylien solujen [15] – [17]. Niinpä tärkein Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli saada uusia oivalluksia eturauhassyövän soluinteraktiot MSC: t painottaen mekaaniset voimat esiintyvät molekyylitasolla. Erityisesti määrällisesti liima väliset voimat syöpäsolujen ja matriisin proteiini Col-I näytti olevan olennaista, koska aiemmat tutkimukset tutkivat affiniteetti syöpäsolujen eri matriisin proteiineja ei määritellä niiden vuorovaikutusta voimassa.

eturauhasen syöpäsoluja, käytimme PC3-soluja, jotka ovat peräisin luuytimen etäpesäke ja kontrolleina, LNCaP-solut, jotka eristettiin imusolmukkeen etäpesäke. Kuten mesenkymaalisten kantasolujen käytimme kuolemattomaksi MSC solulinja nimeltään SCP1 [18], jolla tyypillinen MSC ominaisuuksia, kuten itseuudistumiseen ja multipotenttisuus ja mahdollistaa pitkän aikavälin standardoitu analyysi. Ensin visualisoida tarttuvuutta ja etenemisnopeus eturauhassyövän solut MSC yksisolukerrosten mennessä Viivästys fluoresenssimikroskopialla on monisoluisten tasolla. Sitten me tunnettu varsinaista fyysistä voimia yhden solusta-alustaan ​​yhteyksiä väkisin mikroskopiaan AFM: molemmat syöpäsolujen linjat immobilisoitiin AFM ulokkeen ja saatetaan kosketukseen Col-I päällystetyn alustan. Lopuksi mitataan solu-solu-liima väliset voimat PC3 tai LNCaP-eturauhas- syöpäsolujen, jotka ovat kiinnittyneet AFM ulokkeen, ja mesenkymaalisen kantasolun (SCP1) yksikerroksinen.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture Time-lapse Microscopy

PC3 (johdettu luumetastaasin) ja LNCaP-soluja (peräisin imusolmuke etäpesäke) hankittiin ATCC (Wesel, Saksa). PC3-soluja ylläpidettiin RPMI-1640 soluviljelyaineessa (PAA, Cölbe, Saksa) ja 10% FBS: ää (Sigma-Aldrich, Munchen, Saksa). SCP1 solulinja on immortalisoitu ihmisen mesenkymaalisten kantasolujen linjan täysin kuvattu Böker et al. 2008 [18]. LNCaP ja SCP1 soluja viljeltiin MEM Alpha GlutaMAX elatusaineet (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Aikana rutiini soluviljelmissä, kaikki solutyypit kasvatettiin jopa 80% konfluenssiin T-25 tai T-75 viljelypulloihin ja pidettiin 37 ° C: ssa 5% kostutetussa CO

2. Viljelyväliaine vaihdettiin kolme kertaa viikossa ja solujen siirrostamalla solut irrotettiin käsittelemällä 1x trypsiini /EDTA-liuosta (PAA). Valmistelu solujen ennen AFM mittaukset on kuvattu palje kappaleessa ”Cell capture”.

Aikaväli Microscopy ja kvantifiointi Cell Adhesion

SCP1 soluja (10

6 solua ) kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä täyteen konfluenssiin (kuten on esitetty kuviossa. 1C). PC3 ja LNCaP-solut leimattiin 10 uM vihreän fluoresoivan CFDA väriainetta (karboksifluoreseiini diasetaatti, asetoksimetyyliesteri, Invitrogen), ja maljattiin sitten muodostunut SCP1 yksisolukerrokset (5 x 10

5 syövän solua /kuoppa). Heti, mikroskopia kuvat kerättiin 25 minuutin välein vähintään 12 tuntia. Tänä aikana soluja säilytetään bio-kammio, joka tarjoaa vakaan 37 ° C: ssa ja 5% kostutetussa CO2 ilmakehässä (Pecon, Erbach, Germnay), joka on asennettu ylösalaisin optisella mikroskoopilla (Axiovert 100, Carl Zeiss Hallbergmoos, Saksa). Kuvat on otettu kanssa AxioCam MRM CCD-kamera (Carl Zeiss) ja käyttämällä manuaalisesti solu laskuri väline Image J version1.40 ohjelmisto (National Institute of Health, USA) lukumäärä kiinnittyneet solut arvioitiin ja esitetty prosenttiosuutta alustavan solun tulo 4 ja 12 tuntia.

(A) Vaihe kontrastin ja fluoresenssimikroskopialla CFDA-leimattuja PC3 ja LNCaP maljattiin SCP1 yksittäiskerroksina 6-kuopan astioihin. Kuvat on otettu 4 h. (B) kvantifiointi tarttuu PC3 ja LNCaP jälkeen 4 ja 12 h viljelyn SCP1 yksisolukerrosten. Prosenttiosuus kiinnittyneet solut kvantitoitiin ensin käsin laskenta CFDA-leimattuja soluja solun laskuri työkalun Image J ohjelmisto ja toinen, vertaamalla alkuperäiseen lukumäärä päällystetty soluja (5 x 10

5 solua /kuoppa ). Kuvissa myös hieman tausta CFDA väriaineen hiukkasia on näkyvissä (selvemmin LNCaP kuva). Analyysit paljastivat, että jo 4 tunnin PC3-solut täysin tarttunut SPC1 soluissa taas LNCaP oli huomattavasti alhaisempi tarttuvuus nopeudella 4 h ja 12 h. Kaavion palkit osoittavat keskiarvoja ± SD neljästä itsenäisestä kokeesta (p 0,0001, pariton t-testi). (C) PC ja LNCaP-soluja (2 x 10

5 solua /kuoppa) kasvatettiin SCP1 yksittäiskerroksina 6-kuopan astioihin jopa 8 päivää. Faasikontrasti- kuvat osoittivat muodostumista ja leviämistä PC3 pesäkkeiden (hahmoteltu) päälle SCP1 solujen välillä päivä 1 ja 8. Sen sijaan LNCaP muodostivat pieniä soluklustereita (nuolet), jotka eivät laajenna vaan taantunut päivällä 8. (D) kvantifiointi PC ja LNCaP solujen määrä jälkeen 1, 5 ja 8 päivän viljelyn SCP1 yksisolukerrosten. Lisääntyminen PC3 ja LNCaP laskettiin vähentämällä SCP1 ohjaus yksisolukerrosten kokonaismäärästä solujen määrän osalta yhteistyössä kulttuuri. Samoin kuin mikroskoopilla tiedot, määrällinen analyysi vahvisti, että PC3-soluissa, mutta ei LNCaP pystyivät jakamaan ja edelleen laajentaa SCP1 soluissa. Käyrä osoittaa keskiarvo ± SD kolmen erillisen kokeen kunakin ajankohtana (p 0,0001, pariton t-testi).

Cell Proliferation Analysis

SCP1 yksikerrokset muodostettiin edellä kuvatulla tavalla ja 2 x 10

5 PC3 ja LNCaP-soluja lisättiin ja jätettiin laajentaa sivulle SPC1 solujen ajaksi 8 päivää. Lisäksi useat kulttuuri kuopat säilytti vain SCP1 soluja (

SCP1

mono

), jotta voidaan käyttää valvontaa kvantifiointiin analyysiä. Yhteistyössä viljelmät (

PC3

+ SCP1, LNCaP

+ SCP1

) seurattiin mikroskooppisesti ja valokuvattiin kanssa AxioCam MRM kamera (Zeiss). Päivänä 1, 5 ja 8 co-viljelmät trypsinoitiin ja käyttämällä Neubauer solu laskenta kammio, solujen kokonaismäärästä arvioitiin. Lisääntyminen PC3 ja LNCaP solujen SCP1 yksikerroksista (

PC3

mono

,

LNCaP

mono

) laskettiin seuraavasti:

Immunosytokemia

Ennen proteiinia pinnoite, lasiliuskat puhdistettiin 70% etanolilla ja sitten autoklavoitiin. Sen tarkistamiseksi kollageenin tyypin I (Col-I) -coating lasin dioja ja kollageeni I ilme SCP1, dioja ja SCP1 yksikerroksia valmistettiin seuraavasti. SCP1 soluja kasvatettiin objektilaseille kaksi päivää, jotta saadaan konfluentteja yksisolukerrokset, kun taas Col-I – pinnoitettu lasilevyille valmistettiin lisäämällä 1 mg /ml Col-I-liuosta 4 ° C: ssa yön yli. Seuraavaksi SCP1 yksisolukerrokset ja Col-I-päällystetyt levyt kiinnitettiin puhdasta asetonia 20 minuutin ajan -20 ° C: ssa, huuhdeltiin PBS: lla. Image-IT FX Signal Enhancer (Invitrogenin tuote tausta vähentämiseen ja signaalin tehostuminen Alexa Jauhot sekundäärisiä vasta-aineita) levitettiin 30 min ja pysäytettiin 10% BSA: ssa 1 tunti. Ensisijainen hiiren monoklonaalinen anti-kollageeni-I-vasta-ainetta (Sigma) käytettiin yön yli 4 ° C: ssa. Tämä vaihe seurasi inkubaatio sekundaari- anti-hiiri-vasta-aine konjugoituna Alexa Jauhot 488 1 tunnin ajan, ja tumaväriä DAPI 5 minuuttia. Samanaikaisesti, negatiiviset kontrollit tehtiin jättämällä primaarisen vasta-aineen. Mikrovalokuvista otettiin kanssa AxioCam MRM kameraa Axioskope 2 mikroskooppia (Carl Zeiss) käyttämällä 40x tavoite.

AFM Setup

Force Spectroscopy kokeet tehtiin käyttämällä NanoWizard II yhdessä CellHesion moduuli ( JPK Instuments, Berliini, Saksa), joka on asennettu Zeiss Axiovert 200 M (Carl Zeiss, Göttingen, Saksa), jossa on mittatilaustyönä lämpötila yksikkö 37 ° C. Alennettua vaikutus ympäröivä melu, Axiovert sijoitettiin aktiivinen eristäminen taulukko (Micro 60, Halcyonics, Göttingen, Saksa) vastaan ​​tärinää ja koko kooste sijoitettiin 1 m

3 äänieristetty laatikko myös vakauttaa lämpötila koko koe.

voima-anturit käytettävä voiman spektroskopia olivat tipless piinitridin ulokkeita, jonka nimellinen jousivakio 0,01 N /m (tipless, MLCT-O10, Veeco, USA). Nämä voima-anturit, joilla on alhainen jousivakio osoittautui parhaiten sopii soluadheesion mittauksiin. Erityisesti tipless tasopinnan tarjoaa tartunta-alue yhden solun. Päällystämällä tämä pinta solun liimoja, kuten lektiinit (e. G. Konkavalliini A) tai positiivisesti varautuneita polymeerejä (esim. Polylysiini) eri solutyyppejä voidaan lujasti ja nopeasti kiinni anturin [16], [19], [20]. Syöpäsolujen osoittautui vakaasti kiinni lysiiniä sähköstaattisesti ja lisäksi pitävät pallomainen muoto koko mittaus prosessi eikä leviää kuin Col-I päällystetyt pinnat. Ennen soluadheesion spektroskopia kokeissa voima-anturit siis päällystettiin poly-D-lysiini (PDL, Millipore, USA) liuoksessa, jossa oli 100 ug /ml PDL yön yli. PDL sijasta PLL, koska se on vähemmän hajoavaa ja solut eivät yleensä levittää. Jousi vakioita voima-anturit määritettiin erikseen terminen kohina menetelmä [21].

Force matkan käyrät tallennettiin samalla piezo matkusti suljetun silmukan korkeintaan 20 um lähestymistapaa nopeudella 7 pm /s, kunnes liipaisin voima 100pN saavutettiin, ja takaisinveto nopeus 3 um /s.

Materiaalin valmisteet

Olemme käyttäneet kollageenia tyyppi-I (Col-I): llä päällystetyille lasia kattavat luistaa ja SCP1 yksisolukerrokset substraatteina AFM voima spektroskopian kokeissa saman viljelymaljalla kansi. Muodostamiseksi SCP1 monokerrokset, SCP1 soluja kasvatettiin käsittelemättömien viljelymaljalle kannet (petrimaljaan 35 x 10 mm, Nunc A /S, Roskilde, Tanska) kahden päivän ajan 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Ennen käyttöä, ne pestiin, ja jotka kuuluvat 1,5 ml: lla tuoretta seerumitonta MEM-alfa-alustassa (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa), jota oli täydennetty 15 mM Hepes (Sigma-Aldrich, Saksa) tuloksena on CO

2 riippumatonta mittausta välineellä. Solun Col-I-mittaukset lasipeitelevyihin (Ø 15 mm pestiin 70% etanolilla ja tislattua vettä) päällystettiin Col-I (100 ug /ml) 4 ° C: ssa yön yli. Ennen soluadheesion mittaukset, Col-I-päällystetyt peitinlasit pantiin päälle SCP1 yksikerroksessa viljelymaljasta kannet (kuten on kuvattu kuviossa. 2B). Ylimääräinen lasipäällyslevyn päällystetty BSA (0,5% w /v) 4 ° C: ssa yön sijoitettiin päällekkäin osassa SCP1 yksikerroksisen ja sitä käytettiin solujen talteenotto (katso seuraava kohta). Viljelmä astia kannen, joka sisältää kaikki kolme alustoilla (BSA, Col-I ja SCP-1 yksikerroksisen) oli sitten asennettu lämpötilaohjattu vaiheessa AFM ja se jäi tasaantua 10 min ilmassa 37 ° C.

(a) Faasikontrasti- kuvia eturauhasen syöpäsolun kiinnitetty ulokkeen (nuolet) yläpuolelle SCP1 yksikerroksisen (vasemmalla) ja Col-I-pinnoitettu dia (oikealla). Asteikko palkit osoittavat 10 um. Alemmassa vasemman alakulman immunofluoresenssilla kuvat lisätään. Col-I, leimattu AlexaFluor488 fluoresenssiväriä näkyy vihreänä ja solutumissa, värjättiin DAPI sinisellä. (B) Single soluja kahdesta eri eturauhassyövän solulinjoissa (PC3 ja LNCaP) on immobilisoitu tipless AFM ulokkeen (voima-anturi), jotta voidaan tutkia niiden vuorovaikutusta voimansa apikaalisella pinnalla SCP-1 yksikerroksista (edustaa mesenkyymikantasoluista ) tai Col-I (eli luuta). (C) Kaaviokuva yläkuva viljelymaljasta kannen kanssa BSA-pinnoitettu lasipäällyslevyn (substraattina kalastukseen kevyesti pistetään eturauhassyövän solu) ja Col-I pinnoitettu lasipäällyslevyn molemmat päälle yhden kerroksen mesenkymaalisten kantasolujen . Kalibrointiin ja kalastavat solu, voima-anturi vierailee BSA dia, että kokeilu kollageeni Col-I dia ja kokeilu mesenkymaalisten solujen SCP1 yksikerroksista.

Soluviljely ja Cell Capture Force spektroskopia

Solut (LNCaP tai PC3) kasvatettiin 80% konfluenssiin, inkuboitiin trypsiini /EDTA-liuosta (0,02%) 5 min 10 min kunnes se vapautetaan alustasta pesun jälkeen PBS: llä, josta puuttuu kalsiumin ja magnesiumin . Tämä menettely olisi poistaa matriisin proteiinien mahdollisesti kattaa solupinnoil- vaikuttamatta integriini reseptoreihin [22], [23]. Sitten solut siirrettiin ylimääräisiä MEM-alfa väliaineessa sentrifugiputkeen. Sitten solut sentrifugoitiin (1000 rpm, 3 min), ennen kuin se sekoitetaan pelletti tuoretta MEM-alfa-väliaineessa. Solut jätettiin inkubaattoriin 37 ° C: ssa 15 min., Jotta ne voidaan mukauttaa mittaus 37 ° C AFM.

Joko PC3 tai LNCaP-soluja (n. 2 μ

l

sisältävien 100-300 solua) sitten varovasti injisoitiin tarttumaton BSA-päällystetyt kannen slip jotta myöhemmin kaapata yksi niistä, joiden liima PDL-pinnoitettu konsoli: liima konsoli oli sijoitettu yli yksi ilmeisesti terveitä soluja (keskikokoiset, pyöreä normaalilla vastoin ei blebs, ei muita epänormaaleja merkkejä kunnossa) on BSA-päällystetyt kansi luistaa, ja alensi vaiheittain, kunnes se oli lähellä tämän solun pintaan. Sitten ulokkeen oli varovasti held kosketuksessa solun muutaman sekunnin ajan ennen kuin ulokkeen sidottu solu nostettiin pystysuoraan noin 100 pm [24]. Solu annettiin vankkoja kiinnittymistä ulokkeen pari minuuttia. Jotkut solut (n. 10%) kieltäytyi kulkemaan vakaasti vivun melko roikkuu löysästi määritettynä ravistamalla mikroskoopin ja katsella solun liikkua kanssa aiheuttamaa sekoittaen. Tässä tapauksessa solu pestiin pois ulokkeen nostamalla se pois nesteestä ja takaisin, jotta kaapata uuteen soluun. Kun kyseessä on luja liitos, solu käytettiin tarttuvuuden kokeita ja valvoo kokeen kautta valomikroskoopilla kuvan koko sen ajan mittausten.

Cell Adhesion Force Mittaukset

Solu immobilisoitu on voima-anturi työnnettiin vastaan ​​joko SCP1 yksikerroksista tai Col-I-pinnoitettu dia kosketusvoima 100 pN. Välisen kontaktiajan anturin solun ja sen alustan asetettiin arvoon 0 tuloksena on pakko kontakti tehokkaasti 0,3 s, jotta voidaan rajoittaa tarttumista hinnat (prosentteina käyrät liimalla tapahtumat) on valikoima mahdollisimman alhainen. Tarttuvuus alhaisempi 30% tarjoavat korkean löytymisen todennäköisyys yhden molekyylivuorovaikutusten [24]. Suuremmilla tartunta hinnat yksittäisten sitoutumatonta vaiheet ovat yleensä seurausta useista sidosten toimivat rinnakkain. Määrällisesti eroja solulinjojen ja pintoja, tämä lyhyt kosketusaika ja alhaisen kosketusvoiman 100pN levitettiin koko kokeiluja. Sisäänvetoarvoa nopeus asetettiin 3 um /s kompromissina hydrodynaaminen vetää, joka kasvaa nopeuden (tässä noin 5 PN) ja Lämpöryömintä vaikutuksia, jotka vähentävät nopeudella. Takaisin vetäytymisen etäisyyden asetettiin 20 pm tilille pitkään kytkyitä (Fig. 2A) ja vakuuttaa solu oli erotettu alustasta täysin jokaisen syklin jälkeen. Force mittauksia SCP1 yksikerroksista ja Col-I suoritettiin samassa viljelymaljalla, kun taas jokainen solu immobilisoidaan ulokkeen uusi ruokalaji on valmistettu. Tämä johti kahteen kokeissa per viljelymaljalla: Joko LNCaP soluun ulokkeen vs. Col-I-pinnoitettu lasi ja sen jälkeen vs. apikaalisella pinta-ala SCP1 yksikerroksista tai PC3 soluun ulokkeen vs. Col-I ja sitten vs. SCP1 yksikerroksista (Fig. 2B). Järjestys substraattien myös korjautui PC3 kokeita, jotka osoittavat samanlaisia ​​tuloksia. Kussakin kokeessa (hyvää yhden tyypin solun yhden tyypin substraatti) vähintään 80 voima käyrät tehtiin yhden solun ulokkeen ja yhden substraatin tyyppi. Kaikkiaan vähintään 10 itsenäisen kokeen kullekin yhdistelmä solu-alustan vuorovaikutusten (LNCaP vs. Col-I; LNCaP vs. SCP1; PC3 vs. Col-I; PC3 vs. SCP1) tehtiin, jolloin saatiin vähintään 800 voima käyrät per luokka vuorovaikutuksen. Aikana koko kokeen, käytimme optisella mikroskoopilla seurata pallomainen muoto ja yrityksen kiinnitys solun immobilisoitu PDL päällystetty voima-anturi (Fig. 2A). Lisäksi osoitimme pitkäaikainen solu koskettimien 1 min 500 Pn Col-I että solu immobilisoida voima-anturi voi ylläpitää adheesiovoimille vähintään 8,5 nN irrottamatta anturista.

Cell Adhesion Force arviointi

tietojen analysointi vain takaisinveto osat lähestymistapa-sisään-sykliä arvioitiin. Saadakseen ominaisuus kvantitatiivista tietoa voimasta matkan käyrät, mittatilaustyönä tietojen arviointia ja askel havaitsemisohjelmisto [25] käytettiin vesileiman signaalin (mustat viivat kuvassa. 3), löytää perustason (katkoviivat kuvassa . 3), oikea hydrodynaamisena vedä ja mahdolliset ajelehtia ja poimimaan seuraavat parametrit:

alin datapisteen vasemmalle merkitsee kosketusvoiman 100 pN; valkoinen pisteviiva perustason leikkaa Paluun käyrän musta ympyrä määritellään solun pinnalla; musta viiva on de-noised signaalia ja punainen ristit osoittavat havaittu de-tartunta vaiheita, joissa tartunta voima arviointi tapahtuu. (A) Force käyrä peräisin PC3-solujen vuorovaikutuksessa Col-I, joka havainnollistaa adheesiovoima arviointi: punainen nuoli # 1: vaihe korkeus ensin poistettava tarttuvuutta tapahtuma sisäänveto käyrä. Irtoaminen voima on absoluuttisen punaisesta risti alas pohjaan linja; # 2: vaihe korkeus toisen de-tartunta tapahtuma jälkeen voima tasanteella 0,9 mikrometriä pitkiä; # 3: vaihe asento ensimmäisen de-tartunta tapahtuma; # 4: vaihe asento toisen de-tartunta tapahtuma. (Määritelmät katso Cell Adhesion Force arviointi Materiaalit ja menetelmät -osiossa). Ominaiskäyrät kustakin neljästä eri kokeet ovat edustettuina: (B) PC3 on Col-I, (C) PC3 on SCP1 yksikerroksista, (D) LNCaP on Col-I ja (E) LNCaP on SCP1 yksikerroksista.

askelkorkeuden [pN] kuvaavat eroa voimassa mitattiin ennen ja jälkeen yksittäisen irrotuksen tapahtuma, näkyvä voimana askel. Algoritmi todetaan tällainen askel maksimit derivaatta denoised signaalin, joka voittaa tietyn kynnysarvon ja merkitsee sen pieni punainen risti (katso myös Fig. 3). Viimeinen vaihe on voimassa käyrä on luotettavin yksi koska toisin kuin kaikki muut (väli) vaiheet mitään muuta yhteyden solun ja alustan jatkuu. Siksi viimeinen vaihe ei ole mahdollisesti vähennä muiden joukkovelkakirjojen nykyisten rinnalle.

tarttumista korko [%] kuvaavat osa käyrät ainakin yhdellä havaittu voima askel.

vaiheiden määrää kuvaava keskimäärin askelta havaittujen per käyrä (vain laskenta käyrät ainakin yhdellä havaitaan voiman vaihe).

vaihe asennossa [pm] kuvaavat etäisyys yhteyspiste (musta ympyrä risteyksessä lähtötilanteen ja paluun ajan käyrä) ja voima askel.

työ irrallisuus [aj] kuvaavat energia hajautettava tuona voima kokeilun integroimalla välisellä alueella perustason (nolla voima) ja vetäytyy käyrä. (Huom: tämä ei ole vähäpätöinen suhteessa tarttumista energiaa. Itse asiassa nopeuden riippuvainen viskoosi ja plastinen muodonmuutos solun ja solukalvon itse voimakkaasti panostettava irtoamisesta kaukana termodynaamisen tasapainon).

irrotusvoimamit- [pN] kuvaavat korkeinta mitattua tarttuvuus (globaali maksimi) per käyrä.

huippukohdan [nm] kuvaavat etäisyys yhteyspiste ja jossa irtoaminen adheesiovoima havaittiin.

Kaikki voimat mitataan ovat suhteellisia voimia ja siten riippumaton vakio voiman offset (of 5PN) johtuen hydrodynaamisen kiihdyttävä voima-anturi kulkee jatkuvasti nopeudella 3 um /s.

plateau vaiheita, sillä tämä joukko tietoja näyttävät jälkeen voima tasanne vähintään 500 nm pituuden lastaus on vähemmän kuin 2.7pN /s (katso vaihe 2 kuviossa. 3A).

at lastaus välillä 2,7 ja 4,0 pN /s kriteeri ei ollut riittävän selkeä, jotta vältetään vääriä positiivisia tai negatiivisia askel syrjintään.

jyrkkiä toimia näin tapahdu kasvun jälkeen voimassa vähintään 4,0 pN /s.

Semikvantitatiivisilla polymeraasiketjureaktio (PCR)

semi-kvantitatiivinen PCR suoritettiin, kuten on kuvattu Popov et ai, 2011 [26]. Lyhyesti, kokonais-RNA uutettiin PC3 ja LNCaP-solujen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) ja 1 ug RNA: ta käytettiin cDNA-synteesin AMV-First-Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen). PCR integriinin α1, α2, β1 ja GAPDH (käytetään normalisoimiseksi cDNA input) suoritettiin Taq DNA Polymerase (Invitrogen) kanssa MGResearch väline (BioRad, Munich, Saksa). Alukesekvensseissä ja PCR-olosuhteita kuvataan Popov et al, 2011. Kaikki PCR tulokset on toistettu kolme kertaa itsenäisesti.

Tilastollinen analyysi

Jotta voidaan ottaa huomioon heterogeeninen tietomäärien kaksi Tilastolliset analyysit sovellettu:

Ensimmäinen, Studentin t-testi olettaen epätasainen varianssien analysoimiseksi käytettiin tarttumista korko, keskimäärin vaiheita tai osa kytkyen kaltaisesta filopodia kaltaisia ​​vaiheita verrataan keinot kerätty yksittäisiä soluja välillä PC3 ja LNCaP. Jokainen keskiarvo solun on merkitty punaisella ristillä; keskiarvo näistä keinoista on merkitty baari keskivirhe on esitetty. 4 A B ja Fig. 5. Toiseksi nonparametric Kolmogorov-Smirnov testi ilman oletuksia levitettiin vertailla askelkorkeuden, vaihe asema, irrotusvoimamit- ja työstä irrottautuminen kaikista voimassa käyrät välillä PC3 ja LNCaP. Mediaanit merkitty baareja kvartiiliin. Jokainen mediaani solun edustaa punainen risti kuvassa. 4 C ja D. Tulokset joiden p-arvo on pienempi kuin 0,05 on merkitty merkittävä tähdellä.

(A) Prosenttiosuudet ylivoimaisen käyrät ainakin yhden de-tartunta tapahtuma. (B) määrä de-tartunta tapahtumien kuluessa liiman käyrä. Virhepylväät vastaavat standardin keskivirhe. Merkittävä p-arvo parittomalla t-testi PC3 datan suhteen LNCaP data on merkitty * (p 0,05). Keskimääräinen kunkin yksittäisen solun antama punainen risti. (C) mediaanit korkeus yksittäisten de-adheesion vaiheet. (D) mediaanit asemaa näiden de-tartunta tapahtumia. (E) mediaanit irrotusvoimamit-. (F) mediaanit työtä irtoaminen. Kvartiileja on merkitty kaksinkertainen liput ja mediaani kunkin yksittäisen solun antama punainen risti. Soluadheesion voimatiedot hankittiin 16 PC3 tai 10 LNCaP vuorovaikutuksessa Col-I (1485 ja 760 voimaa käyrät vastaavasti), ja 17 PC3 tai 11 LNCaP vuorovaikutuksessa SCP1 monokerrokset (1526 ja 878 voimaa käyriä vastaavasti).

Keinot prosenttiosuus yksittäisten de-tartunta vaiheita edustavat tyypillistä voima mallia filopodia kaltaisia ​​vaiheita (kiinteä) ja lieka kaltaiset vaiheet (raidallinen) kahden solulinjoista PC3 ja LNCaP. Jokainen keskiarvo solun edustaa punainen risti. Virhepylväät vastaavat standardin keskivirhe. Merkittävä p-arvo t-testi eri vaiheiden sisällä eturauhaskarsinoomasolulinjaa rivi on merkitty * (p 0,05).

Tulokset

PC3 ja LNCaP Adhesion ja proliferaatio Co-kulttuuri SCP1

Ensimmäinen soluadheesiota analysoitiin nopeutus kuvantamisen jopa 12 tuntia. CFDA esileimattu PC3 ja LNCaP-soluja seurataan SCP1 yksikerroksinen ja sen jälkeen 4 tuntia, suurin osa PC3-solujen ilmestyi levittää SCP1 yksikerroksista kun taas LNCaP-solut näyttivät pieni ja pyöreä (Fig. 1A). Kuten on esitetty kuviossa. S1, PC3-solut kasvatetaan lasi- tai Col-I-pinnoitettu lasi on pienempi tasaisuus muotokerroin kuin LNCaP-soluja, mikä viittaa suuremman kapasiteetin levitä. Kuitenkin muoto analyysi molempien solutyyppien viljellyistä SCP1 yksisolukerrosten ei ole suoritettu, koska riski epätarkkojen mittausten alueen halkaisija ja tilavuuden takia taustalla solun elinten SCP1 soluja. Lisäksi suorittamalla kvantitatiivinen analyysi 4 ja 12 h, voisimme osoittaa, että n. 90% PC3 solujen pystyivät kiinni SCP1 yksikerroksista jo kuluttua 4 h ja että niiden tarttuvuus myös pysyi lähes 90%, kun 12 h (Fig. 1 B). Sen sijaan, LNCaP oli pienempi tarttuvuus SCP1 (n. 25%), joka ei kasvanut huomattavasti sen jälkeen enää viljelyn ajan.

Tutkiakseen PC3 ja LNCaP-solujen lisääntymisen on SCP1 yksisolukerrosten teimme yhteistyötä kulttuuri kokeissa jopa 8 päivää. Faasikontrastimikroskopiaan päivänä 1 ja 8 osoittivat muodostumista ja leviämistä PC3 pesäkkeiden päälle SCP1cells, kun taas LNCaP muodostivat pieniä soluklustereita, jotka eivät laajenna vaan taantunut tänä aikana (Fig. 1 C).

Kuva. Kuva.