Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Vaikka on osoitettu, että aktivoitu makrofagit toimivat tulehduksellinen mikroympäristön edistää mahalaukun tuumorigeneesiin kautta β- kateniinin signalointi, vaikutukset β-kateniinin signalointi mahalaukun syöpäsolumetastaasi ja suhde näiden solujen ympäröivien kasvaimeen liittyvät makrofagit ei ole suoraan tutkittu.

Methods

immunohistokemiallinen värjäys palkattiin analysoida 103 potilasta. Invaasio määritystä käytettiin arvioimaan suhdetta makrofagien ja mahalaukun syöpäsoluja. p-kateniinin voitto-of-function ja menettämisestä toiminnon lähestymistapoja tehtiin. Arvioida β-kateniinin sääntelyn mekanismi mahasyövässä soluissa, Western blotting ja reverse-transkriptio polymeraasiketjureaktio käytettiin.

Tulokset

Lisääntynyt tiheys makrofagien liittyi pitkälle ja huono selviytyminen . Mahasyöpä solulinjoja viljeltiin yhdessä makrofagien väliaine oli kohonnut ydin- kertymistä β-kateniinin ja lisääntynyt tunkeutuvat kyky. AKT mutta ei ERK säänneltyä β-kateniinin translokaatio. MMP7 ja CD44, sekä β-kateniinin loppupään geenejä, olivat mukana makrofagin aktivoitu mahalaukun syöpäsoluinvaasiota.

Päätelmät (t) B

Kokonaisuutena kliiniset tiedot viittaavat siihen, että makrofagien tunkeutuminen korreloi lisääntynyt asteen ja huono ennuste mahasyövän potilailla, joille tehtiin radikaali resektio. Makrofagit voivat aiheuttaa invasiivisuudesta aktivoimalla β-kateniinin reitin.

Citation: Wu MH, Lee WJ, Hua KT, Kuo ML, Lin MT (2015) makrofaagianalyysi Soluttautuminen indusoi mahasyövän invasiivisuutta aktivoiminen β-kateniinin Pathway . PLoS ONE 10 (7): e0134122. doi: 10,1371 /journal.pone.0134122

Editor: Fabrizio Mattei, Instituto Superiore di Sanità, ITALIA

vastaanotettu: 16 syyskuu 2014; Hyväksytty: 06 heinäkuu 2015; Julkaistu: 30 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia National Science Council, Taiwan (NSC 98-2314-B-002-055-My2).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on yksi yleisimmistä syövistä maailmanlaajuisesti ja lähes kaksi kolmasosaa tällaiset potilaat kuolevat heidän sairautensa. [1] GC liittyy läheisesti

Helicobacter pylori

infektio, joka johtaa krooniseen tulehdukseen. [2] Tämä tulehduksellinen mikroympäristölle on ominaista läsnäolo isännän leukosyyttien kanssa pääasiassa makrofagien sekä tuki- strooman ja tuumorikudoksia. [3] Tutkimusten mukaan tuotteen kasvaimeen liittyvän tulehdusreaktioita, sekä paikallisesti että systeemisesti, ovat tärkeitä riippumattomia tekijöitä kasvainprogression ja etäpesäkkeitä. [4, 5] kuitenkin, miten nämä molekyyli välittäjiä ja krooninen tulehdus ei täysin ymmärretä .

aktivointi Wnt reitti on tärkeä askel syövän synnyn. Mutaatiot pitkin Wnt-β-kateniinin reitin esiintyy noin 90% paksusuolen ja peräsuolen ja hepatosellulaaristen karsinoomien ja noin 30% GC. [6, 7] Lisäksi, tuumorinekroositekijä-α (TNF-α) on johdettu aktivoitua makrofagien edistää β-kateniinin aktiivisuuden GC soluissa. [8, 9] huolimatta näyttöä siitä, että aktivoitu makrofagit toimivat tulehduksellinen mikroympäristön edistää mahalaukun kasvaimien syntyyn kautta β-kateniinin signaloinnin vaikutukset aktivoitua β-kateniinin signalointi GC solujen etäpesäke ja suhde näiden solujen ympäröivien kasvaimeen liittyvät makrofagit (TAM) ei ole suoraan tutkittu.

Perustuen edellä havaintojen me arveltu, että β-kateniinin reitti voi myös olla mukana säätelyssä makrofagien aiheuttama GC etäpesäke. Tässä tutkimuksessa, ensin tarkasteltiin tiheys soluttautuneet makrofagien ja ilmentymistä β-kateniinin mahakarsinoo- kudoksissa käyttäen immunohistokemia (IHC). Kliinis ominaisuudet mahakarsinooman ja ennusteen osoitettiin. Lisäksi olemme havainneet, että makrofagit indusoivat tumaansiirtymiseen ja β-kateniinin ja parantaa hyökkäyksen kykyä GC soluja. Meidän havainnot osoittavat, ja tukee edelleen tärkeä yhteys TAM ja sen loppupään signalointi sovittelija, β-kateniinin, säätelyssä GC etäpesäkkeitä.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board and Human eettisen komitean National Taiwan University Hospital. Kirjallinen lupa käyttää näytteiden tutkimustarkoituksiin saatiin kaikille potilaille ennen leikkausta. Potilaan tiedot nimettömiksi ja tunnistamattomiksi ennen analyysiä.

Tutkimus jälkikäteen osallistui 205 potilasta diagnosoitu GC jotka saivat radikaali kirurginen resektio laitoksella General Surgery, National Taiwan University tammikuusta 1998 ja tammikuun 2002 Of näistä 102 potilasta, joilla ei ollut seurantatiedot tai jotka kuolivat leikkaussalin komplikaatioihin jätettiin ja loput 103 potilasta osallistui analyyseihin. Kliinis muuttujat luokiteltiin TNM luokituksen (5. painos, 1997) ja ominaisuudet on koottu taulukkoon 1. Yleinen (OS) määriteltiin väli leikkauksen ja kuoleman välillä tai leikkauksen ja viimeisen seuranta elossa potilaille.

Monoclonal Antibodies ja IHC

resektoitiin näytteet GC kiinnitettiin formaliiniin ja upotettiin parafiiniin. Osiot tutkittiin TAM tunkeutumisen ja β-kateniinin käyttäen monoklonaalisia anti-CD68-vasta-ainetta (klooni KP1, DakoCytomation, Glostrup, Tanska) ja monoklonaalinen β-kateniinin-vasta-ainetta (klooni 15B8, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), vastaavasti.

arviointi immunovärjäys

arvioimiseksi tiheys kudoksen infiltroituneen CD68 + makrofagien, kudosleikkeiden seulottiin hallituksen sertifioitu patologi (CI Jan) alhaisella teholla (100 x) ja viiden edustavin kentät valittiin 400-kertainen suurennus. Tulokset laskettiin käsin ja ilmaistiin summa solujen lukumäärä viidessä 400 × mikroskooppikentäs- kunkin alueen jokaisen näytteen.

Cell Culture

GC soluja AGS, N87 (ostettu American Type Culture Collection (Manassas, VA)), MKN45 (hankittu Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japani)) ja TSGH (ostettu Bioresource Collection ja Research Center (Hsinchu, Taiwan)) ja ihmisen monosyyttisolulinjassa THP-1 (hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA)) soluja kasvatettiin RPMI-1640-alustassa (Life Technologies, Inc., Rockville, MD), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Life Technologies, Inc. ) ja 2 mM L-glutamiinia (Life Technologies, Inc.).

THP-1-solut ympättiin viljelyastioihin ja indusoida erilaistumaan makrofagien inkuboimalla 100 ng /ml 12-O-tetradekanoyyliforboli-13 asetaattia (TPA, Sigma-Aldrich) 24 tuntia. Makrofagit pestiin kolme kertaa RPMI-väliaineella, joka sisälsi 10% FBS: ää, inkuboitiin tässä alustassa vielä 24 h vaikutuksen poistamiseksi TPA ja inkuboitiin seerumittomassa alustassa vielä 24 tuntia. Korjatut ja yhdistettiin supernatantit käytettiin makrofagi väliaine (CM), kuten aiemmin on kuvattu. [5, 10]

proliferaatio /elinkyvyn

GC-solut ympättiin 96-kuoppalevyille ja viljeltiin yhdessä tai ilman makrofagin CM. Leviämisen /elinkelpoisuus määritettiin kolorimetrisellä määrityksellä käyttäen 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) (Sigma-Aldrich).

In vitro Invasion määritys

invaasiomääritys suoritettiin käyttäen siirtokuoppaan soluviljelmässä kammiot (Millipore Corp., Billerica, MA). Hyökkääviä solut laskettiin 400 x suurennus 10 eri alojen kunkin insertin. Koe toistettiin kolme kertaa.

RNA uuttaminen ja RT-PCR-

stimulaation jälkeen tai ilman makrofagin CM: ssa 6 tuntia, GC-solut kerättiin ja kokonais-RNA eristettiin käyttäen Trizol-reagenssipakkausta ( Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA monistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) käyttäen alukkeita MMP7 (eteenpäin: 5’AGTCAATCCTGCCTTCTTAGCC, käänteinen: 5’GCTCCCACCTTCCCTCTTGG), CD44 (eteenpäin: 5’TGCCGCTTTGCAGGTGTAT, käänteinen: 5’TCCCATGTGAGTGTCTGGTAGC), sykliini D1 ( eteenpäin: 5’CCCAGCCATGGAACACCA, käänteinen: 5’GGAGGGCGGATTGGAAATGA), c-myc (eteenpäin: 5’AAAGAAGGTGTTGGGGTCGG, käänteinen: 5′- TGGCTCCCCCTGTTATTTGG) ja GAPDH (eteenpäin: 5’GGGTGATGCAGGTGCTACTT, käänteinen: 5’GGCAGGTTTCTCAAGACGGA) .

Nuclear ja Sytoplasmiset fraktiointi

Kun stimulaation tai ilman makrofagin CM 6 tuntia, GC solut hajotettiin 300 ul lyysipuskuria jäissä ja sentrifugoi 5400 rpm. Supernatantti kerättiin sytosolifraktio. Nuclear fraktiot kerättiin, sitten ajaa natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja Western blot-analyysi.

Western-blottaus-analyysi

stimulaation jälkeen makrofagien CM, solut pestiin PBS: llä , raaputettiin RIPA-puskurilla ja sentrifugoitiin. Solulysaatit altistettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) (Millipore Corp.) Kalvo tutkittiin käyttämällä ensisijaista vasta-β-kateniinin, AKT, ERK, JNK (SC1496, SC8312, SC154, SC474, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA, USA), MMP7 (MAB3322, Chemicon, Temecula, CA, USA), CD44 (ab51037, Abcam, Cambridge, MA, USA), c-myc (GTX103436, GeneTex, Hsinchu City , Taiwan), sykliini D1 (SC246, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA), β-aktiini (ab8226, Abcam), HDAC1, p-AKT, p-ERK, p-JNK (SC7872, SC7985-R, SC7383, SC6254, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA), ja sekundaarista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology).

Immunosytokemia

Anti-yhteensä β-kateniinin vasta-ainetta käytettiin primaarisena vasta-aineena, ja anti- hiiren immunoglobuliini G (IgG) Alexa 594 käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Pääliliuskat Sitten asennetaan käyttäen kiinnitysväliaine sisältäviä DAPI varten tumavärjäystä.

Lentivirusvektorikonstruktit tuotanto ja infektio

Short hiusneula-RNA: iden (shRNAs) hankittiin National RNAi ydin Facility Academic Sinica (Taipei, Taiwan). Kohdesekvenssi on β-kateniinin shRNA 1 oli 5’CCGGTCTAACCTCACTTGCAATAATCTCGAGATTATTGCAAGTGAGGTTAGATTTTTG-3 ’; että β-kateniinin shRNA 2 oli 5’-CCGGTTGTTATCAGAGGACT-AAATACTCGAGTATTTAGTCCTCTGATAACAATTTTTG-3 ’. Lentivirusvektorin ja sen pakkauksen vektorit transfektoitiin 293T-pakkaus-soluihin kalsiumfosfaatti transfektiolla. Lyhyesti, 293T-solut jaettiin (10

6) 10 cm

2 astiat 1 vrk ennen transfektiota. Sitten solut transfektoitiin 10 ug: shRNA vektoreita ja 10 ug pCMVΔR8.91 (pakkauksen vektori) ja 1 ug pMD.G (kirjekuoren vektori). 5 tunnin jälkeen inkubaation, transfektion väliaine korvattiin tuoreella viljelyalustalla. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin, lentivirus sisältävä väliaine kerättiin transfektiosta ja sentrifugoitiin 1500 rpm 5 minuutin pelletoimiseksi solujätteiden, supernatantti suodatettiin 0,45 um suodattimen, ja kohde-solut infektoitiin tuoreita lentivirus- sisältävän keskipitkän (täydennetty 8 ug /ml polybreeniä) 24 tuntia.

tilastollinen analyysi

tilastollinen analyysi kliiniset piirteet tehtiin käyttäen χ

2 testiä ja aste soluttautumisen välillä kaksi ryhmää verrattiin käyttämällä t-testiä. Survival konstruoitiin käyttäen Kaplan-Meier menetelmällä ja tilastollinen merkitsevyys analysoitiin käyttäen log-rank-testi. P-arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

korrelaatio immunohistokemiallinen muuttujien kanssa viittaavia tekijöitä GC Potilaat

immunohistokemiallinen analyysi osoitti solulimapa- CD68 värjäyskuvion varten makrofagit. CD68 + makrofagit jaettiin koko peritumoraalista ja kasvaimensisäisenä kudoksissa, mutta vain harvaan hajallaan normaalissa limakalvo (kuvio 1A-1C). Tiheys CD68 + makrofagien oli erityisen korkea patologinen kasvaimen vaiheessa 4 (pT4) tuumorileesioissa verrattuna pT1 vaurioita (kuvio 1 D). Voit selvittää yhdistyksen välillä kliinisiä piirteitä ja CD68 + makrofagien tiheyden, laskee CD68 + makrofagien jaettiin näitä ylä- ja alapuolella mediaaniarvot. Määrä CD68 + makrofagien havaittiin liittyvän kasvaimen syvyyteen ja vaiheessa (p = 0,001 ja p = 0,043, vastaavasti) (taulukko 1). Tämä havainto viittaa siihen, että CD68 + makrofagit saattavat olla merkittäviä edistettäessä kasvaimen invaasio. Lisäanalyysiä, Kaplan-Meier selviytymisen käyrät piirrettiin määrittämään yhdistyksen makrofagien kanssa selviytymisen (kuvio 2). Tiheys CD68 + makrofagien kasvainkudoksessa oli negatiivisesti yhteydessä kokonaiselinaikaa (p = 0,0073). Potilaat, joilla on suuri määrä kasvaimen CD68 + makrofagien oli lyhyempi kokonaiselossaoloaikaa kuin ne, joilla on alhainen määrä CD68 + makrofagien.

immuunivärjäytyminen vastaan ​​CD68 suoritettiin kudoksen diat mahalaukun syöpäpotilailla. CD68 + makrofagien värjäys oli harvassa normaalissa mahan limakalvon (A). CD68 + soluja havaittiin sekä strooman ja kasvaimen pesä (B 0,05), joka ei liity niiden leviäminen kyky (kuvio 4B-4D ).

(A) Migration aktiivisuus THP-1 monosyytti viljeltiin yhdessä eri mahasyövän solulinjoissa (AGS, N87, MKN-45 ja TSGH). THP-1 monosyyttien rekrytoidaan eri mahasyövässä solulinjoissa ja rekrytointi kyky on riippuvainen siitä, missä määrin maligniteetti. (B) Invasion kyky GC solujen käsitelty makrofagien CM. Neljä erilaista GC-solujen (AGS, MKN45, N87 ja TSGH) ympättiin Boyden kammion ja viljeltiin yhdessä tai ilman makrofagisoluina tai makrofagin CM 24 tuntia. Invasion kyvyt kunkin solulinjan mitattiin

in vitro

24 tuntia. Kaikki tiedot ovat aritmeettinen keskiarvo ± SEM. * P 0,05, ** p 0,01. (C) vaikutus makrofagien CM viljeltiin yhdessä soluissa. N87 ja AGS soluja viljeltiin yhdessä makrofagi CM vastaavasti 24 tuntia ja solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT: llä.

Nuclear translokaatio β-kateniinin GC soluissa Aktivoidut makrofagit

Teimme kokeilu vitro ymmärtämään onko β-kateniinin signalointi oli mukana makrofagi-aktivoidun GC soluinvaasiota. Kuten kuviossa 5A, β-kateniinin immunoreaktiivisuus havaittiin ydin- osa N87 solujen jo 15 minuutin kuluttua makrofagi CM hoidon, ja määrä ydin- β-kateniinin proteiinin lisääntyminen on ajasta riippuva tavalla. Mukaisesti Näiden havaintojen immunofluoresenssi osoitti keskittymisen ja ydinvoiman lokalisointi β-kateniinin GC soluissa viljeltiin yhdessä makrofagi CM verrattuna kontrolleihin yhteisviljellään N87 (kuvio 5B). Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että liukoisen tekijät johdettu makrofagien auttaa välittäjänä kertymistä ja ydinvoiman translokaation β-kateniinin GC soluissa. Me ohimenevästi pudotti β-kateniinin by shRNA ja löysi laski β-kateniinin proteiinin ilmentymisen 24 tunnin sisällä. Geneettinen ablaatio β-kateniinin N87 soluissa ei lisätä niiden invasiivisen kyvyn jälkeen makrofagien CM hoidon. Sen sijaan ei-transfektoituja ja ohjaus shRNA ollut muutosta invasiivisia valmiudet N87 soluja makrofagin CM käsittely (kuvio 5C). Voimalaitosjätettä β-kateniinin proteiini lisääntyi myös AGS ja MKN45 solujen jälkeen makrofagi CM hoidon (S1 Kuva).

(A) β-kateniinin kerääntyy tumaan hoidon jälkeen makrofagien CM 30 minuuttia N87-soluja. (B) Immunofiuorescent kuvia havaittiin konfokaalisella mikroskoopilla. β-kateniinin positiiviset solut analysoitiin käyttämällä anti-β-kateniinin vasta-aine, joka tunnistaa sekundaarinen kaniinin vasta-aine konjugoituna FITC, kuvattu vihreän fluoresenssin; Tumavärjäystä havaittiin counterstaining soluja 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI), edustettuina sininen fluoresenssi. Co-viljeleminen kanssa makrofagien CM, immunofiuorescence värjäys osoitti β-kateniinin-FITC kompleksit siirtämisellä osaksi tumaan. (C) Invasion kyky GC solujen käsitelty makrofagien CM.

Effects of makrofaagianalyysi on Expression of β-kateniinin ja alavirran geenien N87 Cells

Arvioimme perinteisen Wnt /β-kateniinin alavirran geenien MMP7, CD44, c-myc ja sykliini D1 kartoitettiin jos ne aktivoidaan makrofagit. MRNA ja proteiini tasoilla MMP7, CD44 ja c-myc-geenit olivat kaikki merkittävästi lisääntynyt N87 soluja inkuboitiin makrofagien CM ja tasot sykliini D1 kasvoi hieman (kuvio 6A). Kehotuksesta laski invaasio aktiivisuutta kaatamalla β-kateniinin, MMP7, CD44 ja sykliini D1 mutta ei c-myc osoittivat proteiini alassäätöä (kuvio 6B). Vahvista suhde hyökkäyksen kykyä ja MMP7 ja CD44, testasimme kykyä neutralisoivien vasta estää MMP7 ja CD44 toimintaa. Invasion kyky merkittävästi heikentää esikäsittely 2,5 ug /ml anti-MMP7 ja 10 ug /ml anti-CD44 (kuvio 6C), vastaavasti, mikä viittaa siihen, molempien geenien makrofagi-aktivoidun GC solujen invaasiota. Löysimme proteiinin tasot CD44 ja sykliini D1 geenit lisättiin toisessa GC solulinjat (AGS ja MKN45) inkuboitiin makrofagien CM mutta MMP7 ja c-myc ei merkittävästi muuttunut (S2 Kuva).

( A) vaikutus makrofagien CM-RNA: lla ja proteiinin ilmentymistä β-kateniinin alavirtaan geenejä. N87 soluja viljeltiin läsnä ollessa tai ilman makrofagien CM. RNA ja proteiini tasolla, solut kerättiin 6 tunnin jälkeen ja 24 tunnin hoito vastaavasti. (B) N87-solujen kanssa tai ilman knock-down of β-kateniinin käyttäen shRNA-2 oli co-käsitelty läsnä tai poissa makrofagien CM. N87 solut kerättiin 24 tunnin kuluttua hoidon ja analysoitiin western blot. (C) vaikutus MMP7 neutraloitua vasta-GC solujen invaasio. N87-solujen läsnä ollessa makrofagien CM 24 tunnin esi-käsiteltiin eri annoksilla MMP7 neutraloitiin vasta-ainetta (0, 0,625, 1,25 ja 2,5 ug /ml) 1 tunnin ajan Isotyypin IgG käytettiin esto-ohjaus. (D) vaikutus CD44 neutraloitua vasta-GC soluinvaasiota. N87-solujen läsnä ollessa makrofagien CM 24 tunnin esi-käsiteltiin eri annoksilla CD44 neutraloitiin vasta-ainetta (0, 1,25, 2,5, 5 ja 10 ug /ml) 1 tunnin ajan. Isotyyppiä IgG käytettiin esto-ohjaus. Kaikki tiedot ovat aritmeettinen keskiarvo ± SEM. *

p

0.05.

Muut ovat raportoineet mahdollisen leikkauspisteessä MAPK-reitin kanssa Wnt /β-kateniinin signalointireitin. [12, 13] Siksi suoritti ajan myötä tutkimuksen ja totesi, että vain fosfo-AKT ja fosfo-ERK ilmentyminen oli ylössäädellään hoidetuilla makrofagin CM (S3A kuvio). Vahvistaa vuorovaikutus AKT /ERK-reitin ja β-kateniinin, me esikäsitelty solut joko ERK-inhibiittoria (U0126) tai AKT-estäjällä (LY294002). Väheneminen β-kateniinin translokaation tumaan löydetty vain soluissa, joita käsiteltiin kanssa AKT-estäjällä, mutta ei ERK-inhibiittoria, mikä osoittaa, makrofagi-avtivated Wnt /β-kateniinin signalointireitin voidaan säädellä AKT (S3B kuvio). GC soluissa AKT vaikutus näyttää olevan hallitseva makrofagi aktivoida Wnt /β-kateniinin signalointireitin. Aiemmat tutkimukset ehdotti myös, että TNF-α tuottama makrofagit on keskeinen välittäjänä tulehduksen ja saattavat edistää β-kateniinin aktiivisuutta kasvainsoluissa. Olemme havainneet, että käyttämällä neutraloivaa vasta-ainetta vastaan ​​TNF-α in N87 tukahduttaa β-kateniinin aktivointi alle altistuminen makrofagien CM (S4 kuvio).

Keskustelu

microenvironment kasvain on ratkaisevan tärkeää määritettäessä leukosyyttien toiminto ja fenotyypin. Ristiriitaiset tiedot ovat osoittaneet antitumorigenic tai protumorigenic toimintoja makrofagien erityisesti, mutta meidän tiedot osoittavat makrofagien olla protumorigenic rooli GC potilailla. Useimmissa kasvainten, TAM tuottaa lukemattomia tekijöitä, jotka edistävät kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä. [14, 15] aste makrofagin tunkeutumisen syöpäsolun pesä on myös merkittävä ennustaja selviytymisen GC potilailla. [16-18] IHC havainnot tässä tutkimuksessa osoittavat selvästi, että tiheys makrofagien GC kudosta korreloi aste kliinisen vaiheen (erityisesti kasvaimeen [T] vaihe) ja eloonjäämisen potilailla. Nykyinen tutkimukset myös sitä, että makrofagit voivat pelata haitallisia rooleja kehittynyt GC. Tämä havainto on sopusoinnussa tutkimuksia, viittaavat siihen, että immuunijärjestelmä microenvironment voi olla protumoral sijaan kasvaimen kasvua estävä, huolimatta ristiriitaisia ​​tietoja. [19, 20]

Nuclear kertymistä β-kateniinin on raportoitu noin yksi kolmasosa mahalaukun adenokarsinoomat, sekä suolen ja hajanainen tyyppejä. [18] β-kateniinin on 92 kDa: n proteiini, joka toimii suoraan solu-soluadheesion. [21] mutaatiot β-kateniinin ja poikkeava ekspressio sen proteiinin on osoitettu olevan osallisena tuumorin invaasio ja metastaasi. [22, 23] meidän IHC havainnot, β-kateniinin sijaitsi tumassa leviämisrintamassa kasvainsolujen, mutta ei keskeisin alue primaaristen kasvainten, jossa se paikantuu plasmamembraanin . Tällaisia ​​havaintoja löytyy myös peräsuolen kasvaimen yksilöitä. [24] Wnt /β-kateniinin aktivaation syöpäsoluissa sijaitsevat leviämisrintamassa on oletettu olevan tärkeä askel kasvaimen kasvua ja etenemistä. [25]

Kiinnostavaa kyllä, löysimme myös β-kateniinin tumassa syöpäsolujen makrofageihin sijaitsevat vierekkäin, mikä viittaa mahdolliseen suhde makrofageja ja tumaansiirtymiseen of β-kateniinin kasvainsoluissa. β-kateniinin leviämisrintamassa GC selittyy osittain vuorovaikutuksista kasvain microenvironment. Olemme vahvistaneet

in vitro

että makrofagit lisäämään hyökkäyksen kykyä GC soluja. Käyttämällä immunofluoresenssilla konfokaalimikroskopia, päätimme lokalisointi ja kertymistä β-kateniinin tumassa hoidetuissa makrofageissa. Niinpä epäillä, että sytokiinejä, joita makrofagit aiheuttaa β-kateniinin tumaansiirtymiseen GC soluissa, mikä lisää niiden hyökkäystä kyky. Invasiivista edessä kasvaimia edustaa mikroympäristön jossa makrofageissa vuorovaikutuksessa parenkymaalisolut tuottamalla soluväliaineen ja erittämällä sytokiineja ja kasvutekijöitä, jotka paikallisesti edistävät solujen lisääntymistä ja invaasiota. [26, 27] Kuitenkin Tutkimuksessamme lisääntynyt β-kateniinin ilmaisun

in vitro

ei muuttanut proliferaatiota, mikä osoittaa, että sinänsä ei ole riittävä lisäämään kasvaimen pahanlaatuisuuden. Tämä havainto osoittaa myös aikaisemmin, että β-kateniinin vain edistää tarttumista sivustoja muodostaa fokaalisesti ja stimuloi suunnattuun vaellukseen ja invaasion koolonkarsinoomasoluissa mutta ei osallistunut leviämisen mahalaukun ja syöpäsolujen. [28-30] Kuitenkin stroomasolujen parakriinisen modulaatio Wnt signaloinnin epiteelisoluissa on todennäköisesti koordinoi monimutkaisempi verkosto edistää ja estämällä erityksen tekijöistä. Alavirran vaikutukset eri Wnt /β-kateniinin signalointi (ja erityisesti ne, jotka vaikuttavat solujen lisääntymistä, EMT ja paikallinen invaasio) ovat vielä huonosti. β-kateniinin siirtyy tumaan, jossa se sitoutuu transkriptiotekijät T-solun tekijän /lymfosyyttien tehostajana tekijä (TCF /LEF) perheen ja aloittaa transkription kohdegeenien, kuten

sykliini D1

,

c- myc

ja

MMP-7

[31, 32] mukana leviämisen, kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden. [33, 34] Tulosten perusteella näyttää, että signalointi polkuja joka makrofageja aiheuttaa β-kateniinin myös indusoivan ilmentymisen kohdegeenien. Vastaa meidän aikaisemmista töistä, [5] MMP-7 ja CD44 oli kaksi PCR paneelit yksilöi yhteisviljelmä makrofageihin niin ilmentyvät eri liittyviä geenejä etäpesäke GC soluja. Hajoaminen soluväliaineen välittävät matriksin metalloproteinaasien (MMP: t) on ratkaiseva mekanismi aikana kasvaimen invaasion ja metastaasin. Tällainen hajoaminen on välttämätöntä luoda mikroympäristön joka tukee kasvua primaarikasvainten ja etäpesäkkeitä. Β-kateniinin /TCF kompleksin myöhemmin aktivoi useita onkogeenien, mukaan lukien VEGF, c-myc, c-jun, fra-1 ja gastriini, jotka voivat myös olla mukana makrofagin aktivoitu β-kateniinin alavirran tapahtumia. [35]

erilaisia ​​reittejä todennäköisesti moduloida Wnt /β-kateniinin reitin ja sääntely β-kateniinin signalointi voi olla samalla tavalla monimutkainen. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että makrofagi CM laukaisee ERK-reitin ja Wnt aktivoi ERK endoteelisolujen. [36, 37] Tässä, huomasimme, että makrofagit aiheuttaa fosforylaatio sekä ERK ja AKT GC soluissa. Olemme osoittaneet, että hoito AKT-estäjällä muttei ERK estäjä vähentää β-kateniinin translokaatio. Nämä tulokset osoittavat, että Akt soittaa rooleja makrofagi aktivoitu β-kateniinin signalointi mahalaukun solutyypeissä.

Johtopäätökset

Kokonaisuutena kliiniset tiedot viittaavat siihen, että makrofagien tunkeutuminen korreloi lisääntyneeseen laatu ja huonompi ennusteen GC potilasta joille tehtiin radikaali resektio. Makrofagit voivat aiheuttaa GC invasiivisuudesta aktivoimalla β-kateniinin reitin. Näin ollen tukahduttaminen makrofagien infiltraatiota ja tukahduttaminen aktivointi β-kateniinin reitin edustavat mahdollisia strategioita hoitoon GC.

tukeminen Information

S1 Kuva. Vaikutus makrofagien CM on β-kateniinin reitin.

Β-kateniinin kerääntyy tumaan hoidon jälkeen makrofagien CM 30 minuuttia AGS ja MKN45 soluja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0134122.s001

(TIFF)

S2 Kuva. Vaikutus makrofagin CM proteiinin ilmentymistä β-kateniinin alavirtaan geenejä AGS ja MKN45 soluja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0134122.s002

(TIFF)

S3 Fig. (A) makrofaagianalyysi CM aiheuttama AKT ja ERK aktivaatio N87 soluissa. (B) N87-soluja esi-käsiteltiin 10 uM β-kateniinin estäjät: LY294002 tai U0126 1 tunti ja sitten viljeltiin makrofagien CM vielä 1 tunnin ajan.

AKT, ERK ja β-kateniinin proteiinin ekspressiota määritettiin Western blot.

doi: 10,1371 /journal.pone.0134122.s003

(TIFF)

S4 Fig. Neutraloivien vasta-ainetta TNF-α.

N87-solujen läsnä ollessa, makrofagien CM 24 tuntia oli esikäsitelty tai ilman TNF-α-estäjän 1 tunnin ajan.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0134122.s004

(TIFF) B