Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vav1 on signaalinmuuntajana proteiini, joka toimii guaniininukleotidiä vaihto tekijä Rho /Rac-GTPaasit on hematopoieettisen järjestelmän, jossa se on ainoastaan ​​ilmaistu. Äskettäin Vav1 oli osoitettu olevan osallisena useissa ihmisen maligniteettien kuten neuroblastooma, keuhkosyöpä, ja haiman adenokarsinooma (PDA). Vaikka joitakin tekijöitä, jotka vaikuttavat

vav1

ilmaus tunnetaan, ei fysiologinen tai patologinen sääntely

vav

1 ilme on täysin ymmärretty. Osoitamme tässä, että mutaatiot otaksuttu transkriptiotekijän sitoutumiskohdista on

vav

1 promoottori vaikuttaa sen transkription soluissa eri histologisia alkuperää. Näistä sivustoja on konsensus-c-Myb, hematopoieettinen-erityinen transkriptiotekijä, joka esiintyy myös Vav1 ilmentävä keuhkosyövän solulinjoja. Ehtyminen c-Myb käyttämällä siRNA johti dramaattiseen vähenemiseen

vav

1 ilmentymisen näissä soluissa. Tämän mukaisesti kotransfektion c-Myb aktivoitua transkriptiota

vav1

promoottori-lusiferaasireportterigeenin konstruktin keuhkosyövän soluja vailla Vav1 ilmaisun. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että c-Myb osallistuu

vav

1 ilmentymistä keuhkosyövässä soluissa. Olemme myös tutkineet metylaatiostatuksen

vav

1 promoottori. Bisulfiitti sekvensointi paljasti, että

vav

1 promoottori oli täysin metyloitumaton ihmisen lymfosyyteissä, mutta metyloituja eriasteisina kudoksissa, jotka eivät yleensä ilmaista

vav

1.

vav

1 promoottori ei sisällä CpG saarten läheisyydessä transkription aloituskohdasta; kuitenkin, osoitimme, että metylaatio on CpG yksimielisyyteen SP1 sidoskohdan

vav

1 promoottori häiritsee proteiineihin sitoutumisen

in vitro

. Tuloksemme tunnistaa kaksi sääntelymenetelmistä

vav

1 ilmaus: sitoutuminen c-Myb ja CpG metylaation 5 ’säätelysekvenssejä. Mutaatio Muiden otaksutun transkriptiotekijän sitoutumiskohtia ehdottaa, että ylimääräinen säätelevät

vav1

ilme samoin.

Citation: Ilan L, Katzav S (2012) Human Vav1 ilmentäminen Hematopoieettiset ja Cancer Cell Lines Is säätelee c-Myb ja CpG metylointi. PLoS ONE 7 (1): e29939. doi: 10,1371 /journal.pone.0029939

Editor: Pierre-Antoine Defossez, Université Paris-Diderot, Ranska

vastaanotettu: 16 elokuu 2011; Hyväksytty: 7. joulukuuta 2011; Julkaistu: 11 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Ilan, Katzav. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tuettu avustuksia Israel Academy of Sciences, Israel Cancer Research Foundation, Israelin Cancer Association ja Hubert H. Humphrey Center for Experimental Medicine ja Cancer Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

erittely ja ylläpito kudosten on olennainen osa kehitystä, välittämän osittain hierarkkinen verkostoja transkriptiotekijöiden ja

cis

sääntelyvälineitä elementtejä, jotka kontrolloivat geenin ilmentymistä. Lisäksi somaattiset epigeneettiset perintö, erityisesti DNA: n metylaation ja chromatin remodeling, on keskeisessä asemassa säätelyssä kehittämisessä monisoluisten eukaryoottisten organismien [1].

Hematopoieesia on yksi parhaiten tutkittu esimerkkejä kehitystä ja erilaistumista kantasolujen huolto sukuperää sitoutumista ja erilaistuminen [2].

Vav

1 ilmaisua, joka on puhtaasti hematopoieesijärjestelmän [3] määrä lisääntyy aorttaan-sukurauhasten-mesonefros (AGM) alue alkion aikana siirtyminen primitiivinen lopullisesti hematopoieesin [4] ja sen jälkeen ilmaistaan ​​vain soluissa aikuisten hematopoieettisen järjestelmän [3]. Yhtiökokous on tärkeä intraembryonaalisessa lähde hematopoieettisten kantasolujen ja ulkonäkö näiden kantasolujen korreloi säätelyä

vav

1 ilme. Lopulliset Veren kantasolut näyttävät erottamaan vatsanpuoleisesta hemogenic endoteelin että selkä aortan ja anna kehittää verenkiertoelimistön siemeniä sikiön maksassa [5], jossa punasolujen, myelooinen, ja lymfaattisen suvusta kehittyä. Vastasyntyneillä ja aikuisissa hiirissä,

vav

1 ilmentyy erityisesti hematopoieettisten solujen kateenkorvassa, imusolmuke, luuydin, ja perna [5]. Vav1 ensin tunnistettiin näyttö onkogeenien jossa NIH3T3-solut transfektoitiin DNA useista ruokatorven karsinoomat [3]. Nukleotidisekvenssin analyysi paljasti, että Vav1 onkogeeni aktivoitiin

in vitro

ja eristetty mutantti muoto ei ollut läsnä alkuperäisessä kasvain näytteen [3].

Useat ominaista rakenteellisten motiivien mahdollistaa Vav1 signaalin anturin toiminto [6] – [8]. Tunnetuin funktio Vav1 on kuin bruttokansantuote /GTP vaihto tekijä Rho /Rac, funktio valvottava tiukasti tyrosiinifosforylaa- [6] – [8]. Rho /Rac n aktivoituminen johtaa solun tukirangan uudelleenjärjestelyn aikana T-solujen aktivaation [6] – [8]. On myös yhä enemmän näyttöä siitä, että Vav1 on muita vaikutuksia, jotka ovat riippumattomia sen vaihto toimintaa, kuten moduloiva JNK, ERK, Ras, NF-kB, ja NFAT polkuja. Nämä vaikutukset ovat todennäköisesti välittävät Vav1 modulaarisen verkkotunnuksia kautta vuorovaikutus muiden proteiinien, kuten Shc, NCK, SLP-76, Grb2, ja Crk [6] – [8].

aluksi ominaista

vav

1 promoottori 20 vuotta sitten [9]. Analyysi promoottorialueen määritti transkription aloituspaikkoja ja ilmoitti, että promoottori puuttuu tunnistettavissa ytimen promoottori elementtejä, kuten TATA tai initiaattorin. Kuitenkin se sisältää useita konsensus sitoutumiskohtia molemmille läsnä (esim SP1, AP-1, ja AP-2) ja kudosten vapaan (GATA, Myb, OCT, ja ETS proteiinit) transkriptiotekijöitä [9]. Hiiren promoottori kloonattiin tämän jälkeen [10], [11]. RNaasisuojaus- kokeet suoritettiin mRNA: n solu- linjojen edustavat erilaisia ​​hematopoieettisten suvusta. Kaikki nämä RNA-näytteet tuottivat kuvion fragmentit, jotka vastaavat klusterin suurten ja pienten aloituspaikat 95-133 emäsparia ylävirtaan translaation aloituskodonista, lähellä useita aloituspaikat kartoitettu ihmisen

vav

1 mRNA [10 ], [11]. Siten yksittäinen

vav

1 promoottori näyttää olevan operatiivinen koko hematopoieettinen osastoon. Kuten odotettua, promoottori

vav

1 osoitettiin ajamaan ilmentymistä multipotentteihin Veren kantasolut asuvat luuytimessä aikuisten hiirten sekä monet erilaiset hematopoieettiset elimissä [12] – [14]. Esimerkiksi useita itsenäisiä riviä ihmisen NPM-ALK hiiret luotu käyttämällä hematopoieettisten soluspesifisestä

vav

1 promoottori. Tämä uusi siirtogeenisiä malli aikaansaatu järjestelmä tutkii onkogeenisel- tapahtumista välittämien NPM-ALK in situ [14]. Myös Lentivirusvektoreita ilmentävät yhteistä sytokiinireseptorien gamma-ketjun valvonnassa proksimaalisen

vav

1-geenin promoottorin on osoitettu olevan tehokas korjaaminen signaloinnin viat ja X-sidottu sekamuotoinen immuunipuutos (SCID-X1) sairausfenotyyppi hiirimallissa [13].

Vaikka

vav

1 promoottoria on käytetty ajaa erityismääräys hematopoieesijärjestelmän, vähän tiedetään transkriptioon, joka säätelee sen toimintaa. Sarjassa tutkimuksia, Denkinger

et al.

Osoittivat, että PU.1 on välttämätön transkription aktiivisuutta

vav

1 promoottori valkosoluissa, mutta ei muissa hematopoieettisten solujen [15] . Lisäksi Vav1 ja PU.1 rekrytoidaan CD11b promoottori APL-johdettu promyelosyyttejä, mikä viittaa siihen, että ATRA aiheuttama lisäys Vav1 ilmaisun ja tyrosiinifosforylaatiota voi olla mukana rekrytoinnissa PU.1 sen konsensussekvenssin on CD11-promoottorin ja, lopulta, säätelyssä CD11b ilme aikana loppuvaiheissa neutrofiilien erilaistumisen APL johdetun promyelosyyttejä [16].

Vav1 mutaatioita ei ole havaittu tähän mennessä ihmisen syövässä. Siten vaikka typistettyjä versioita Vav1 puuttuu aminopään muunnos NIH3T3-fibroblasteissa [9], [17] ja synergoida aktiivinen Ras muutosta [18], [19], niiden roolia ihmisen kasvainten synnyssä on kiistetty [20]. Useat ryhmät, kuten meidän, ovat havainneet kohdunulkoinen ilmaus Vav1 neuroblastoomakasvaimissa [21], haimatiehyen adenokarsinoomat (PDA) [22] ja keuhkosyövän [23]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että kohdunulkoisen Vav1 ilmentyminen olla hieman yleisempi ilmiö, joka vaikuttaa kasvaimen ylimääräinen tyyppejä. Määritettäessä mikä ohjaa poikkeava Vav1 ilmentymistä kudoksissa ulkopuolella hematopoieesijärjestelmän on tärkeää ymmärtää Vav1 osallistumista ihmisen syövän.

Nykyinen tutkimus paljastaa osallistuminen hematopoieettisen transkriptiotekijän c-Myb ilmaisemisessa

vav

1 keuhkojen syöpäsoluja. Osoitamme myös panos CpG metylaation

vav

1 promoottori sen ilmentymistä hematopoieettisten ja syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

Jurkat (akuutti T-solujen leukemian, ystävällisesti antanut meille Dr. Weiss [24]), U937 (monosyytit, histiosyyttistä lymfooma [25]), H441 (keuhko papillaarilihaksessa adenokarsinooma, ystävällisesti antanut meille Drs. Gazdar ja Minna [ ,,,0],26]), H460 (iso keuhkosyöpä ystävällisesti antanut meille Drs. Gazdar ja Minna [26]) ja H358 (bronchioalveolar Non-Small keuhkosyöpä, ystävällisesti antanut meille Drs. Gazdar ja Minna [26]) soluja kasvatettiin RPMI väliaineessa. Panc1 (haiman kanava epithelioid syöpä, ystävällisesti antanut meille Dr. Billadeau [22]) ja A549 (keuhko epiteelikarsinooman, ystävällisesti antanut meille Drs. Gazdar ja Minna [26]) soluja kasvatettiin DMEM-alustassa (Sigma). Kaikki media on täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliiniä-streptomysiiniä ja L-glutamiinia (Biological Industries, Israel) ja soluja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

promoottori-reportteri rakentaa ja mutageneesin

tulikärpäsen lusiferaasi pGL3-perus- ja

Renilla

sivektorissa PRL-CMV (Promega, USA) käytettiin tässä tutkimuksessa. Proksimaalinen 5′-alue ihmisen

vav

1-geeni [-287-301 suhteessa transkription aloituskohdasta (TSS)] kloonattiin käyttäen alukkeita lil30 ja lil32 (taulukko 1) ja lisätään lukukehyksessä pGL3 -laimentamaton toimittaja vektori käyttämällä Sacl ja Xhol restriktiokohdat luoda konstruktin LE2. LE2 käytettiin sitten templaattina tuottaa useita pistemutaatioita ja deleetioita (taulukko 1). PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen Pfu-X-polymeraasia (Jena Bioscience, Saksa), seuraavissa olosuhteissa: 94 ° C, 5 min; 35 sykliä (94 ° C 15 sekuntia, 55-62 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, 72 ° C 1 min lil30 ja lil31, ja 4 min muiden alukeparia, kuten on kuvattu taulukossa 1). PCR-tuotteet puhdistettiin 1% agaroosigeelistä käyttäen Wizard SV Gel ja PCR Clean-Up System (Promega, USA). Lil30-32 fragmentti digestoitiin Sacl ja Xhol-restriktioentsyymeillä ja ligoitiin pGL3 vektoriin käyttäen Fast-Link DNA ligation kit (Epicentre, USA). PCR-tuotteiden site-suunnassa mutageneesi tehtiin liitettiin self-ligaatiolla.

Transient transfektiot ja lusiferaasireportterigeenin määritys

Solut ympättiin ja transfektoitiin 24 tunnin kuluttua olosuhteissa esitetään taulukossa 2. Soluja kerättiin 24 tai 48 tunnin kuluttua transfektion. Lusiferaasireportteri- määritykset suoritettiin Dual-Luciferase Reporter System (Promega, USA) käyttäen Luminometer Mithras (Berthold Technologies, Saksa). C-Myb yliekspressio kokeissa 1 ug c-Myb ilmentävät plasmidi (Open Biosystems, USA # 6069320) on ko-transfektoitiin LE2 reportteri-konstrukti ja

Renilla

osaksi H460-soluissa. Solut kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen. Metyloitua LE2 plasmidi valmistettiin käyttämällä CpG-metyylitransferaasin (M.SssI) (New England Biolabs, USA).

bisulfiittimodifiointi sekvensointi

DNA normaaleista ihmisen kudoksista saatiin BioChain (USA) . Bisulfiitin reaktio suoritettiin käyttäen EZ DNA Metylointi-Direct Kit (Zymo Research, USA). Sekvenssit kiinnostavia monistettiin PCR: llä alukkeilla lil11 (ACACACCTAAACCCCATC) ja lil53 (GGGTTGGATTAGATAGAGGA) käyttäen 2 ui 10 ul: n kokonaistilavuudessa ja bisulfitization reaktion, Tm = 55 ° C, 35 sykliä. PCR-tuotteet puhdistettiin ja kloonattiin pGEMT plasmidiin (Promega, USA). Ligoitiin plasmideja käytettiin transformoimaan kompetentteihin DH5a-soluihin. PCR suoritettiin sitten bakteerikolonioista standardin alukkeita T7 ja SP6 promoottorit. PCR-tuotteet oikean pituisten sekvensoitiin Macrogen (Korea).

elektroforeettinen liikkuvuus shift (EMSA) B

Tumauutteet eristettiin kuvatulla [15]. Saadakseen lyhyt kaksijuosteisen DNA-koettimia, yksijuosteisia oligonukleotideja (IDT, USA) (taulukko 3) juotettiin ja sitten leimattiin Digoxigenin Oligonukleotidi 3′-End Labeling Kit (Roche, Sveitsi). Pitkän villityypin LE2 koetin luotiin PCR: llä Digoxigenin leimattuja alukkeita lil46 (5′-GCTGCAGGTGCTCC-3 ’) ja lil47 (5′-CCTGCTCGCCTGTG-3’) käyttäen LE2 plasmidia DNA-templaatista. Koettimia, jotka sisältävät mutaatioita, samoja alukkeita käytettiin, ja vastaavat mutatoitu plasmidia käytettiin templaattina. DNA-proteiini-sitoutumisen reaktiot suoritettiin huoneenlämmössä 15 min: n kokonaistilavuudessa 20 ui. Reaktio sisälsi 60 fmol leimattu DNA-koetin, 4 ug tumauutetta, 2 ug poly (dl • dC) ja sitomispuskuria (1 mM Tris, pH 7,5, 7,5 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 mM DTT: tä, 0,7% glyserolia). Kilpailun määrityksiä, 1- 10-kertaisesti leimaamattoman kaksijuosteisen DNA lisättiin reaktioseokseen 10 min ennen leimatun koettimen lisäystä. Sitten reaktioseokset erotettiin 4% ei-denaturoivalla polyakryyliamidigeelillä. Elektroforeesi suoritettiin 0,5 x TBE-puskurissa huoneenlämpötilassa 60 voltin 1 tunnin ajan. DNA-proteiini-komplekseja siirrettiin positiivisesti varatulle nailonkalvolle (Roche, Sveitsi), silloitettu UV UV Stratalinker 2400 (Stratagene, USA). Digoksigeniini-leimattu DNA havaittiin DIG Gel Shift Kit, 2

toisen sukupolven, käyttäen CDP-Star substraattia (Roche, Switzerland). Kuvat altistettiin X-ray elokuvien 15-20 min.

Hehkutus

kylmäkuivattuja komplementaaristen oligonukleotidien laimennettiin 100 uM, ja sitten sekoitetaan ekvimolaariset pitoisuudet hybridisointipuskuriliuosta (10 mM Tris, pH 7,5-8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) lopulliseen pitoisuuteen 3 uM kutakin. Hehkutus seos kuumennettiin 100 ° C: ssa 5 minuuttia ja jäähdytettiin hitaasti 30 ° C 1 tunnin ajan.

RNA: n eristys ja käänteinen transkriptio

RNA eristettiin TRIzol reagenssia (Invitrogen, USA). Kokonais-RNA (2 ug) käänteiskopioitu M-MLV-polymeraasilla ja satunnaisen heksameerin aluketta (Promega, USA) kanssa reaktion kokonaistilavuus 20 pl. PCR suoritettiin GoTaq Green Master Mix (Promega, USA) ja 1 ui cDNA: n; aktiinin havaitseminen cDNA laimennettiin kymmenkertaisesti. Alukkeet eri geenit on lueteltu taulukossa 4.

immunoblottaustesti

Jurkat, H441 ja H460-solulinjoja käsiteltiin proteiinin uutto- ja Western-blottauksella käyttäen standardimenetelmiä. Lyhyesti, solut pestiin kahdesti PBS: ssä ja lyysattiin lyysipuskurissa (50 mM Tris pH 7,6, 150 mM NaCl 5 mM EDTA, 0,5% NP40), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (0,1 mM fenyyli-metyyli sulfonyyli fluoria; Pysäytetään proteaasiestäjäseostabletit (Thermo Scientific), 5 mM EDTA), pidettiin 4 ° C: ssa 15 min, sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 12000 g ja supernatantit kerättiin. Kaksikymmentäviisi ug proteiinia lysaatit erotettiin 8% SDS-PAGE. Erotetut proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Kun nopea pesu TBST (50 mM Tris.HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,2% Tween), kalvot blokattiin 3% BSA: ssa 1 tunti ja sitten inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla c-Myb (Santa Cruz), Vav1 (Upstate Biotechnology Inc, USA), ja β-aktiini (Santa Cruz) (laimennettu 1% BSA TBST: ssä) yli yön 4 ° C: ssa. Membraani pestiin sitten (3 x 10 min) TBST huoneenlämpötilassa ja tutkittiin 1:10000 laimennettiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-hiiri tai anti-kani-vasta-aineita 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja pestiin 3 x 10 min TBST . Signaali havaittiin ECL chemiluminescence (Pierce, USA).

Tulokset

minimaalinen promoottorialue ihmisen vav1 ja sen spesifistä ekspressiota

sekvenssit minimaalinen promoottori alueella ihmisen ja hiiren

vav

1 on julkaistu (Gene ID: 7409 ja Gene ID: 22324, tässä järjestyksessä). Analyysi ihmisen

vav

1 promoottorin kanssa TESS (Transcription Element hakujärjestelmä; https://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess) paljastaa lukuisia otaksuttu sitoutumiskohtia transkriptiotekijöitä kuten ETF, SP1 E2F, NF-e, c-Myb, TCFα, PU.1 ja ELF-1 (kuvio 1, boxed). Lisäksi promoottori sisältää 8 potentiaali CpG metylaatiokohtia (kuvio 1, korostettu punaisella ja numeroitu mielivaltaisesti 1-8).

Laatikot osoittavat otaksuttu sitoutumiskohtia eri transkriptiotekijöiden kuten ennusti bioinformatiikan. Niiden sijainti on osoitettu suhteessa transkription aloituskohdasta (+1 asentoon). Mahdollista aluetta CpG metylaation on korostettu punaisella, niiden mielivaltaisia ​​sarjanumeroita ympyröity vihreällä.

Kudosspesifinen geenien ilmentymistä voidaan saavuttaa aktiivisuutta kudosspesifisiä transkriptiotekijöiden sekä asetuksella n välisen affiniteetin DNA: ta sitovan tekijöitä ja promoottorisekvenssit. Säätelevien sekvenssien tunnistamiseen tarvittavan ekspression rajoittuminen

vav

1, olemme tuottaneet pGL3-

vav

1 reportteri-konstrukti (LE2), joka sisältää minimaalisen säätelysekvenssien

vav

1 proksimaalinen promoottorialue [nukleotidista (nt) -287-301 suhteessa transkription aloituskohdasta (TSS)] ylävirtaan lusiferaasireportterigeeniin. Vahvistaa, että ilmentymisen LE2 vastaa endogeenisen ilmentymisen

vav

1 soluissa eri histologisia alkuperiä, plasmidi transfektoitiin Jurkat-T-solujen ja U937-monosyyttien solut, joissa

vav

1 ilmaistaan ​​fysiologisesti, ja osaksi H441 keuhkosyövän soluja, joissa se on poikkeavasti yliekspressoitu [23]. LE2 myös transfektoitiin

VAV

1-negatiivisia solulinjoja: keuhkosyöpä solut H460- ja A549 [23]) ja haimasyövän solulinja Panc1 [22] (Fig. 2A). Transfektion jälkeen lusiferaasin ilmentyi korkealla tasolla Vav1 ilmentävien solujen (Jurkat, U937 ja H441), mutta sen ekspressiotaso oli hyvin alhainen

VAV

1-negatiivisia solulinjoja (H460, A549 ja Panc1 ) lusiferaasin ilmentyminen H441 keuhkosyövän soluja oli jopa korkeampi kuin Jurkat-T-soluissa (kuvio. 2A).

(A) ilmentyminen villin tyypin (wt) lusiferaasireportterigeeniin (LE2) solulinjoissa eri kudoksista peräisin. LE2 transfektoitiin solulinjoissa, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät, ja lusiferaasin aktiivisuus mitattiin 24 tuntia myöhemmin. Tiedot osoittavat, lusiferaasiaktiivisuus normalisoitu

Renilla

transfektiotehokkuutta ohjaus ja lasketaan suhteessa lusiferaasiaktiivisuutta tyhjän vektorin ilmentymisen, pGL3. Kokeet toistettiin viisi kertaa. (B) Kaaviokuva kartta 5 ’säätelyalue ihmisen

vav

1-geenin. Kolmen oletetun transkriptiotekijän sitoutumiskohtia on korostettu laatikoita. Tehtyjen muutosten näillä alueilla ovat seuraavat: nukleotidisubstituutioita (punainen) ja poistot (vino linjat). (C) vaikutus Näiden mutaatioiden /poistot analysoitiin Jurkat-T-soluissa, U937 myeloidisoluissa ja H441 keuhkosyövän soluja. Transfektion jälkeen plasmideilla, jotka sisältävät lusiferaasia paino- (LE2) tai mutatoituja

vav

1-promoottorin, lusiferaasiaktiivisuus mitattiin ja käännä induktio aktiivisuus laskettiin suhteessa aktiivisuuteen LE2. Kokeet toistettiin viisi kertaa. Tilastot suoritettiin käyttäen paritonta opiskelija T testi. (**) Tarkoittaa, p 0,05 arvon ja (***) osoittaa p 0,01.

Luonnehtia promoottorialueiden mukana

vav

1 ilme, loimme useita pisteen mutaatioita ja deleetioita ennustetun transkriptiotekijän sitoutumiskohtia (osoitettu kuviossa 2B), ja testattiin ekspressiota reportteri konstruktien joissa nämä mutaatiot erilaisissa solulinjoissa (kuvio 2C). Tuloksemme osoittavat selvästi, että kunkin nukleotidin substituution tai deleetion oletetun transkriptiotekijää sitovia sekvenssejä vähentää promoottorin aktiivisuus verrattuna villityypin konstrukti, LE2 (Fig. 2C). Joillekin mutantit, myös havaittu merkittäviä eroja niiden ilmentymistä Jurkat, U937 ja H441-soluissa. Esimerkiksi LE12, Le15 ja Le17 paremmin ilmaistu Jurkat T-soluissa kuin U937-soluissa, mikä osoittaa, että jopa kesken hematopoieettista alkuperää olevien solujen, on eroja sääntelyssä

vav

1 ilme. Le15 ja Le17 kuljettaa mutaatioita PU.1 sitoutumiskohdassa, joka tukee tarvetta PU.1 sitoutuminen U937-soluissa. Tämä on yhdenmukaista aikaisempien raporttien ero vaatimuksista PU.1 varten Vav1 sen erilaisissa hematopoieettisten solujen [15]. LE7 ja LE12, joilla on emäsparisubstituutiot on otaksuttu E2F /NF-e /c-Myb sitoutumiskohdan, näyttelytila ​​vähensi lusiferaasiekspressio hematopoeettisissa soluissa; kuitenkin, nämä mutaatiot on vain vähäinen vaikutus lusiferaasin ilmentyminen H441 keuhkosyövän soluja. Poistaminen koko E2F /NF-e /c-Myb site (Le13) poistetaan lusiferaasiekspressio kaikissa solulinjoissa tässä tutkimuksessa käytetyt. Pistemutaatio ETF /SP1 sitoutumiskohta (Le19) on pienempi vaikutus reportterigeenin ilmentymistä hematopoieettisten solulinjojen kuin keuhkosyövän solulinjassa, mutta jälleen, poistetaan koko sitoutumiskohta (LE20) poistetaan lusiferaasin ilmentyminen kaikki solulinjat tutkittiin tässä tutkimuksessa. Mutageneesi on TCFα /PU.1 /ELF-1 sitoutumiskohta (Le15 ja Le17) hidastuu lusiferaasin ilmentymistä samalla tavalla kaikissa solulinjoissa. Siten tuloksemme viittaavat mukana useita transkriptiotekijöitä säätelyssä Vav1 ilmentymistä soluissa eri histologisia alkuperää.

Voit selvittää nämä mutaatiot muuttavat sitoutumisen ydinaseiden proteiinien

vav

1 promoottori teimme elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA). Digoksigeniiniperoksidaasia leimattu kaksijuosteisia oligonukleotideja käsittää nukleotidin -98-25 (lil 46-47) on

vav

1 promoottori (Fig. 3) käytettiin koettimina läsnä ydinvoiman otteita Jurkat ja H441 solut. Villityypin oligonukleotidi ja oligonukleotidit, joissa on mutaatioita, jotka vastaavat mutaatioita reportterikonstrukteja (Fig. 2B), käytettiin. Proteiini kompleksit, jotka kokoavat annetun villityyppisen DNA-sekvenssin tumauutteen näkyvät viisi päävyöhykettä (merkitty 1-5) molemmissa solulinjoissa; kuitenkin, intensiteetti näillä taajuuksilla vaihtelee välillä (Fig. 3 alhaalla). Siten band 5 näyttelyitä suurempi intensiteetti ydinaseiden uutetta H441 soluissa kuin tumauutteesta Jurkat T-soluja (19,2% vs. 4,9%). Sitovan proteiinin kompleksi, jota kuvaa kaista 5 on osittain tai täysin menetetty joitakin muuttuneita sekvenssejä käytettiin tässä tutkimuksessa (Fig. 3). Tämä bändi täysin kadonnut GA AC ja poistetaan (-25-38) mutantit Jurkat-T-soluissa, kun taas H441- se katosi vain -25-38 deleetiomutantin, siten mahdollisesti vastaa menetys promoottorin aktiivisuuden poisto mutaatio H441-soluissa (kuvio. 2C). Lisäksi intensiteetti bändi 4 on pienempi GA AC ja poistetaan (-25-38) mutanttien Jurkat-T-soluissa, vaikka se ei muutu H441-soluissa (Fig. 3). Nämä tulokset osoittavat selvästi eroja proteiinia komplekseja kootaan promoottorialue soluissa eri alkuperää. Tuloksemme osoittavat, että alueella

vav

1 promottorista -98 ja +25 on kriittinen

vav

1 ilmentymistä erilaisissa solulinjoissa ja koodaa otaksuttu sitoutumiskohtia useille transkriptiotekijät.

Elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA) ja Jurkat ja H441 tumaekstrakteilla suoritettiin, kun läsnä oli lil46-47 digoksigeeni-leimattu koetin (nukleotidit -98-28 on

vav1

promoottori). Tuottaa mutantti oligonukleotidit, vastaava mutatoitunut plasmidit (esitetty kuviossa. 2B kaavio) käytettiin templaattina PCR: ssä. Kaavio

vav

1 5 ’säätelysekvenssejä, eksoni 1 ja suhteellinen oligonukleotidi asema näkyy alareunassa. Sitoutuneen proteiinin kompleksit on numeroitu 1 5 Nuoli osoittaa asemaa kompleksin 5, raskain kompleksi, joka on herkkä mutaatiot tuoda oligonukleotidisekvenssi. Pohja paneelit Kuvion esittävät kaavamaisesti suhteellinen intensiteetti bändejä 1-5 EMSA kokeen määritettynä densitometrillä (ImageJ ohjelmisto).

c-Myb osallistuu säätelyyn vav1 ilmentymisen hematopoieettiset ja keuhkosyövän soluja

Vaikka PU.1 osoittaa spesifisyyttä myeloidisolu- solulinjaan, kuten on raportoitu aiemmin [27] – [29], useimmat muut transkriptiotekijöiden näyttävät ilmentyvän, vaikkakin eri tasoilla. Yksi transkriptiotekijä, joka voi vaikuttaa tasoon

vav

1 ilmentyminen keuhkosyöpäsoluissa on c-Myb. c-Myb ilmenee vahvasti epäkypsiä hematopoieettisten solujen ja säätyy alas erilaistumisen aikana [30], [31]. Sen määrittämiseksi, onko c-Myb sitova sivusto

vav

1 promoottori osallistuu sukupolven proteiinia komplekseja, käytimme kaksijuosteinen oligonukleotidi käsittää sitoutumiskohdat transkriptiofaktoreiden E2F /NF1-e /c-Myb ja TCFα /PU.1 /ELF1 (lil 157-158, taulukko 3). Mutaatiot c-Myb sitoutumiskohdan (TT AA) vaikuttaa affiniteetti Jurkat-T-solujen proteiini-kompleksin määritettynä kompetitiomäärityksessä (Fig. 4A), kun taas vaikutus mutaatio E2F sitoutumiskohdan (GA AC ) oli pienempi vaikutus (Fig. 4A). Käyttämällä lyhyempää oligonukleotidi, joka sisältää vain C-Myb /E2F sitoutumiskohta (taulukko 3, lil87-88); huomasimme, että vain yksi proteiinikompleksi muodostetaan tumaekstrakteilla Jurkat T-soluja (kuvio. 4B). Tämä proteiini kompleksi on täysin häiriintyy, kun TT AA-mutaatio (c-Myb sitoutumiskohta) käytetään, kun GA AC-mutaatio (E2F sitoutumiskohta) muodostaa edelleen samanlaisen kaistan villityypin oligonukleotidi (WT), joskin alemmalla tasolla (Fig. 4B). Kanssa tulosten kuvion 4A, mutaatio c-Myb heikentää kykyä proteiinin monimutkainen sitoa DNA ja GA AC korvaaminen on pienempi, mutta merkittävä vaikutus.

(A) elektroforeettisen liikkuvuuden shift määritys (EMSA) ja Jurkat-tumauutteiden suoritettiin, kun läsnä oli digoksigeeni-leimatun koettimen nukleotidit -45-0 on

vav1

-promoottorin ja E2F /NF-e /c-Myb ja TCFα /PU.1 /ELF1 sitoutumiskohtia (lil157-158; taulukko 3). Kilpailun määritys suoritettiin leimatun oligonukleotidin ja leimaamattoman kilpailijan oligonukleotidien pistemutaatioita, kuten taulukossa 3 on moolisuhteessa 01:01 ja 01:05. Nuoli osoittaa asemaa kompleksin, joka osoittaa herkkyyttä käyttöön mutaatioita. (B) EMSA suoritettiin leimatun oligonukleotidin, joka sisältää ainoastaan ​​E2F /NF-e /c-Myb sitoutumiskohdan (lil 87-88; taulukko 3).

edelleen selvittää C-

myb

on mukana Vav1 ilmaisun, analysoimme sen ilmentymistä soluissa eri histologisia alkuperiä ja totesi, että

c-myb

mRNA ja proteiini on läsnä Jurkat T-soluissa ja alemmilla tasoilla H441 keuhkosyövän soluja, mutta on tuskin havaittavissa H460 keuhkosyövän solut, jotka eivät ekspressoi

vav

1 (Fig. 5A). Sen tutkimiseksi, onko c-Myb osallistuu säätelyssä

vav

1 ilme, me kotransfektoidaan c-Myb ekspressiovektoriin joko tyhjän vektorin tai LE2 osaksi H460-soluissa (kuvio. 5B). Co-trasnfection on

c-myb

kanssa LE2 lisää merkittävästi ilmentymistä reportterigeeni verrattuna ilmentymisen LE2 yksinään (ylempi paneeli). Olemme myös tason määrittämiseksi

c-myb

mRNA ja proteiinin ilmentyminen transfektoiduissa soluissa (alempi kuva). Down-regulation

c-myb

transfektoimalla siRNA osaksi H441 keuhkosyöpäsoluissa merkittävästi vähentynyt

vav

1 ilme (Fig. 5C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että c-Myb on rooli säätelyssä

vav

1 ilmentyminen epiteelin keuhkosyövän soluja.

(A) Endogeeninen ilmentymä

c-myb

mRNA: n Jurkat T-soluissa, H441 (

vav

1-positiivinen) ja H460 (

vav

1-negatiivinen) keuhkosyövän solulinjat havaittiin RT-PCR: llä ja western-blottauksella. (B) Tyhjä pGL3 tai LE2 paino- reportteri-konstrukti transfektoitiin joko yksinään tai yhdessä c-Myb-ilmentävien plasmidin H460 keuhkosyövän soluja (kuten materiaalit ja menetelmät). Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin 24 tunnin kuluttua transfektion (yläpaneeli). Lusiferaasiaktiivisuus ilmaistaan ​​kertainen induktio suhteessa perus- pGL3 ilmentymisen. Arvot ovat keskiarvo viiden riippumattoman kokeen; merkitsevyys määritettiin käyttämällä paritonta Studentin t-testi. (***) Osoittaa p 0,01. Alapaneeli esittää tason

c-myb

ja aktiinin mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen transfektoiduissa soluissa määritettiin RT-PCR: llä ja Western blot vastaavasti. (C) H441 keuhkosyövän soluja transfektoitiin joko salattu DNA: n (-) tai siRNA vastaan ​​c-Myb. Seitsemänkymmentä kaksi tuntia myöhemmin, mRNA tasot

c-myb

,

vav1

ja

aktiini

havaittiin RT-PCR: llä.

metylointi yksittäisten CpG sivustojen ihmisen vav1 promoottori on tärkeää sääntelyn sen ilmaisun

muutoksia DNA saavutettavuutta DNA: ta sitovien tekijät osallistuvat myös geenin ilmentymisen säätelemiseksi. Yksi mekanismi, joka vaikuttaa DNA: n saavutettavuus on metylaation CpG dinukleotidit tiettyyn proteiiniin sitoutumiskohdista [32]. On osoitettu, että epigeneettiset muutokset, kuten metylaatio, on tärkeä rooli poikkeavien

vav

1 ilmentymistä haimasyövän solulinjoissa [22]. Kuitenkin tässä tutkimuksessa ei tulkita mekanismi perusteellinen. Alkaa roolin arvioimiseksi metylaation säätelyssä Vav1 ilmaisun, analysoimme metylaatio

vav

1 promoottori näytteissä eri normaalista ihmisen kudoksissa (taulukko 5). Noin 600 ep

vav

1 promoottorisekvenssejä ylävirtaan ja alavirtaan TSS analysoitiin bisulfiitti sekvensoimalla. Silmiinpistävän, lymfosyyteissä, havaitsimme ei metylaatio tahansa oletetun CpG metylaatiokohtia sekvensoitiin. Sitä vastoin DNA-kudoksista, jotka eivät normaalisti ekspressoivat Vav1, havaitsimme eriasteista metylaation sivustoja

vav

1-promoottori (taulukko 5). Esimerkiksi metylointi taso haimassa on 48-100%, keuhkoissa taso on välillä 22-50%, kun taas paksusuolen prosenttiosuus metylaation on hyvin pieni (välillä 4-15 prosenttia). 2A.