Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kliiniset todisteet osoittavat, että lymfangiogeneesiä ja imusuonten etäpesäke ovat tärkeitä vaiheita etenemisen eturauhassyöpä. Verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) -C osoitettiin olevan keskeinen säädin näissä prosesseissa. Meidän aikaisemmat tutkimukset osoittivat, että lysofosfatidihappo (LPA), alhaisen molekyylipainon lipidi kasvutekijä, parantaa VEGF-C ilmentymistä ihmisen endoteelisoluja. Olemme aiemmin osoittaneet, että LPA-reseptori on tärkeä rooli imusuonten kehitykseen seeprakalan alkioiden. Kuitenkin vaikutukset LPA on VEGF-C-ilmentyminen eturauhassyövässä ei tunneta. Tässä osoitamme, että LPA säädelty VEGF-C ilmentyminen kolmessa eri ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa. PC-3 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen parantavia vaikutuksia LPA oli kautta välittyvän sekä LPA1 ja LpA3. Lisäksi reaktiivisen hapen (ROS) tuotanto ja linssin epiteelin kasvutekijä (LEDGF) ekspressio olivat mukana LPA

1/3 riippuvainen VEGF-C ilmentymisen. Lisäksi autotaxin (ATX), entsyymiä vastaava LPA synteesiin, osallistuu myös säännellä VEGF-C ilme. Keskeyttämällä LPA

1/3 PC-3, väliaine (CM) aiheuttama ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC) lymfaattinen merkkiaineiden ilmentyminen oli myös estetty. Yhteenvetona, olemme huomanneet, että LPA parantaa VEGF-C ilmaisun aktivoimalla LPA

1/3, ROS- ja LEDGF riippuva reittejä. Nämä uudet havainnot saattavat valaista kehittää uusia strategioita estämään imusuonten etäpesäke eturauhassyövän.

Citation: Lin C-E, Chen S-U, Lin C-C, Chang C-H, Lin Y-C Tai Y-L, et al. (2012) Lysofosfatidihappo Parantaa endoteelikasvutekijä-C Expression in Human Prostate Cancer PC-3 soluja. PLoS ONE 7 (7): e41096. doi: 10,1371 /journal.pone.0041096

Editor: Masuko Ushio-Fukai, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 21 kesäkuu 2012 Julkaistu: 20 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat avustuksia (NSC97-2311-B-002-002-MY3, NSC 99-2120-M-002-004 ja NHRI 101-EX101-10130BI) National Science neuvoston ja National Health Research Institutes of Kiinan tasavalta . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yksi useimmin esiintyvistä syövistä miehillä. Etenemistä erittäin metastaattinen eturauhassyöpä sisältää prosessit, kuten menetys soluadheesion, parannettu paikallinen invaasio, angiogeneesi, ja imusuonten [1]. Lymfangiogeneesiä hiljattain todettu olevan tärkeä rooli eturauhassyövän etäpesäkkeiden, ja endoteelikasvutekijä (VEGF) -C on merkittävä imusuoniston säädin. VEGF-C sitoutuu VEGF-reseptori (VEGFR) -3 ja aktivoi imusuonten liittyvä signaalin polkuja [2]. Paljon kliinistä näyttöä paljasti korrelaatiota VEGF-C ilmaisun ja alueelliset imusolmuke etäpesäke eturauhassyövässä [3], [4]. Yli-ilmentävät VEGF-C: n LAPC-9-eturauhassyöpäsolujen parantaa kasvaimen lymfaattinen etäpesäkkeiden [5]. Vuonna CWR22Rv-1 eturauhassyöpä-solulinjaa, solut yli-ilmentävät VEGF-C useammin etäpesäkkeitä imusolmukkeissa ja keuhkoissa. Kuitenkin kasvaimen kasvunopeus ja angiogeeninen toiminta ei vaikuttanut yli-ilmentyminen VEGF-C [6]. Wu et ai. vuonna 2008 osoitti myös, että VEGF-C-ligandin trap ja VEGFR-3-vasta-aine vähensi merkittävästi eturauhassyövän lymfangiogeneesiä ja etäpesäkkeiden imusolmukkeisiin ja distaalinen elimiä. Kaikki nämä tulokset osoittavat, että imusuonten välittää eturauhassyövän etäpesäkkeiden.

Lysofosfatidihappo (LPA) on alhaisen molekyylipainon lipidi kasvutekijä, joka sitoutuu Edg perheen G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t) ja säätelee useiden solujen toiminnot [7], [8]. LPA syntetisoidaan entsymaattisesti kalvon fosfatidihappoa. Kun inflammatorinen vaste on lauennut, LPA vapautuu verihiutaleiden ja indusoi useiden soluvasteita, kuten solumigraation, lisääntymistä, ja haavan paranemista [9]. Lisäksi syöpäsoluja yli-ilmentävät LPA reseptorit ilmeni kohonneita kasvaimen invaasion ja metastaasin [10]. Kytkinlaite ilmentyminen LPA

1 ja LPA

3-reseptorien on havaittu liittyvän eturauhassyöpään kehittämiseen [11]. Eturauhassyövän solulinjaa, LPA stimuloi PC-3-solujen liikkuvuuden kautta LPA

1 [12]. Lisäksi LPA suojaa PC-3 nälkään johdettuja apoptoosin kautta ydin- tekijä (NF) -κB-riippuvaisen reitin [13]. Kaikki nämä tulokset viittaavat siihen, että LPA on merkittäviä rooleja kehityksen ja etenemisen eturauhasen syöpä.

Autotaxin (ATX) on 125 kDa: n glykoproteiini, joka kuuluu ectonucleotide pyrofosfataasin /fosfodiesteraasi (ENPP) perhe, jolla on kyky hydrolysoida fosfodiesterisidoksil-

in vitro

. Lisäksi, ATX on myös raportoitu olevan lysofosfolipaasin D (LysoPLD) entsymaattista toimintaa, joka hydrolysoi lysofosfatidyylikoliini (LPC) tuottaa LPA [14], [15]. In ATX-over-ilmentäviä siirtogeenisiä hiiriä, rintaepiteelin on riittävä aloittamaan tuumorigeneesiin ja tuottaa erittäin metastaattinen [16]. Lisäksi kliinisissä eturauhassyöpä tutkimuksissa korkeat ekspressiotasot ATX liittyivät sekä pahanlaatuiset mahdollisuudet ja huono tulokset [17].

Kerrottiin, että seerumideprivaation, VEGF-C messenger (m) RNA lauseke syöpäsolujen tehostettiin käsittelemällä 10% seerumia. Nämä tulokset viittaavat siihen, että on olemassa seerumin tekijä ekspressiota sääteleviä VEGF-C [18]. Lisäksi jälkeen kaatamalla zLPA

1 seeprakala, alkion rintatiehyt kehitys oli puutteellinen [19]. Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC), LPA voi aiheuttaa putken muodostumiseen ja imusuonten merkki ilmaisun LPA

1/3 [20], [21]

. Nämä tulokset viittaavat siihen, että LPA johdetut signaalit ovat välttämättömiä imusuonien kehittämiseen. Kuitenkin roolit LPA lymfangiogeneesiä aiheuttama syöpäsoluja edelleen epävarmat.

Meidän nykyinen tulokset, osoitamme, että LPA sääteli VEGF-C mRNA eri ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa. Käyttämällä LPA

1/3 antagonisti, osoitimme, että nämä lisäävät vaikutukset in PC-3-soluja LPA

1 ja LPA

3 riippuvainen. Lisäksi, ROS: n syntyminen ja transkriptiotekijä, linssin epiteelin-kasvutekijä (LEDGF), oli mukana LPA: n asetus VEGF-C-ilmentymisen. ATX, entsyymiä vastaava LPA sukupolvi, myös säädellä VEGF-C ilmentymisen ja erityksen. Käyttäen HUVEC, me osoitamme, että elatusaineessa (CM) PC-3-solujen parannettu ilmaus imusuonten markkereita, kuten Prox-1 ja Lyve-1. Lisäksi esikäsittely Ki16425, LPA

1/3 antagonisti esti parantavia vaikutuksia näiden CM. Tuloksemme viittaavat siihen, että LPA ja ATX säädellä VEGF-C ilmentyminen eturauhassyövässä soluissa ja se saattaa aiheuttaa imusuonten etäpesäkkeitä. Siksi saarto LPA ja VEGF-C signaloinnin saattaa olla tehokas strategia eturauhassyövän hoitoon.

Tulokset

LPA stimuloi VEGF-C sen erilaisissa Eturauhassyöpäsolulinjat

sen tutkimiseksi, LPA on stimulaattori VEGF-C ilmentyminen eturauhassyövässä, valitsimme LNCaP, DU145, ja PC-3 ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa testata mahdollisuutta. LNCaP on androgeeniriippuvaisen ja matalan metastaattinen eturauhassyöpä solulinja. Sen sijaan DU145 ja PC-3 ovat molemmat androgen-riippumaton ja erittäin metastaattinen. Kaikki kolme solulinjaa käsiteltiin eri pitoisuuksilla LPA, ja RNA-näytteet kerättiin. Alkaen reaaliaikainen PCR-analyysi, havaittiin, että LPA stimuloitu VEGF-C transkription annoksesta riippuvalla tavalla kaikissa kolmessa eturauhassyöpäsolulinjoissa (Fig. 1A-C). Käytimme PC-3-solut edelleen analysoida, LPA parantaa VEGF-C-proteiinin ilmentymisen ja myöhemmin eritystä. Määrittää translaation tasolla VEGF-C, PC-3-soluja käsiteltiin LPA, ja solulysaatit kerättiin RIPA-puskuria. Solulysaatit eroteltiin SDS-PAGE: lla ja havaittiin VEGF-C-vasta-aine. Solunsisäinen VEGF-C-proteiinin tasot tehostettiin 1 ja 5 uM LPA hoitoja (Fig. 1 D). Määrittämiseksi VEGF-C eritystä, PC-3-soluja käsiteltiin 5 uM LPA: ssa 12 h, ja esikäsitellystä väliaineesta talteen. Esikäsitelty väliaine analysoitiin VEGF-C-ELISA-kitillä. Huomasimme, että LPA myös stimuloi VEGF-C eritystä (Fig. 1 E).

LPA-tehostettu VEGF-C Expression välittyy LPA

1 ja LPA

3 PC-3 Cells

eturauhasen syöpäsoluja, LPA reseptorit 1-3 ilmaisun profiilit ovat hyvin tutkittu ja niiden ajatellaan yhdistää eturauhassyövän kehitykseen ja etenemiseen. Kuitenkin eri eturauhassyövän solulinjoissa, profiilit eri LPA reseptoreihin ovat erilaisia. PC-3-solut ilmentävät korkeimmat LPA

1 ekspressiotason ja alin LPA

3 ilmentymistason samalla verrattuna LNCaP ja DU145. Sen sijaan, LNCaP-solut ilmentävät korkeimmat LPA

3 ja alhaisin LPA

1 kolmesta eturauhassyövän solulinjoissa [11]. Edellisessä tutkimuksessa LPA

1/3 vastaa LPA tehostettu VEGF-C ilmentymistä HUVEC-soluissa [20]. Niinpä ensimmäinen käytetty Ki16425, antagonistina LPA

1 ja LPA

3, onko nämä kaksi lysophosphatidic reseptorit ovat vastuussa LPA vaikutus VEGF-C ilmentymistä eturauhasen syöpäsoluja. Aiemmissa tutkimuksessa, Ki16425 on jo osoittautunut voi estää ATX indusoidun liikkuvuuden PC-3-soluja [12]. Jälkeen Ki16425 hoito, tehostajavaikutuksen LPA VEGF-C-ekspressio väheni merkittävästi LNCaP, DU145 ja PC-3-solut (Fig. 2A). Edelleen vahvistaa havainto, PC-3-solut transfektoitiin väliaikaisesti joko LPA

1 tai LPA

3 siRNA. LPA1-3 mentymisprofiili testattiin LPA1 ja LpA3 ohimenevästi pudotus soluja. Tuloksemme ehdotti siRNA-sekvenssin valitsimme voisi erityinen tavoite LPA

1 ja LPA

3-reseptori keskeyttämättä kahta muuta reseptoreihin (Fig. 2B). Alle 10% FBS RPMI kulttuuri, pohjapinta mRNA-tasoja VEGF-C Melan

1 tai LPA

3 Knockdown solut sekä vähennettiin 51% ja 37% erikseen. RPMI vain kulttuurin, pohjapinta mRNA-tasoja VEGF-C Melan

1 tai LPA

3 Knockdown solut sekä vähennettiin 58% ja 36% verrattuna salattu siRNA transfektion ohjaus soluja (Fig. 2C). Tämä merkitsee sitä, että LPA on merkittävä indusoija VEGF-C-seerumin. Lisäksi soluissa tuotettu LPA voi olla säädin VEGF-C in PC-3-solut. Suoralla hoidon LPA, meillä on myös havaittu, että LPA-tehostettu VEGF-C ilmentyminen väheni PC-3-solut transfektoitiin joko LPA

1 tai LPA

3 siRNA (Fig. 2D). Tulokset viittasivat siihen, että molemmat LPA

1 ja LPA

3 ovat mukana ja kriittinen valvontaan VEGF-C ilmaisun

. Lisäksi on olemassa merkittäviä eroja kasvuvauhti LPA

1, LPA

3 Knockdown solut ja ohjaus soluja LPA ja seerumihoito (Fig. S1).

(A, B ja C ) LNCaP, DU145, ja PC-3 ihmisen eturauhassyövän solulinjaa käsiteltiin eri LPA annoksina 2 tuntia. mRNA käänteistranskriboitiin ja analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä. Suhteellinen taso VEGF-C normalisoida GAPDH on esitetty. (D) PC-3-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla LPA: ssa 4 tuntia. Solulysaatit erotettiin 12% SDS-PAGE: lla ja analysoitiin Western-blottauksella käyttäen anti-VEGF-C-vasta-aine. GAPDH toimi latauskontrollina. (E) PC-3-soluja käsiteltiin 5 uM LPA: ssa 12 h. Esikäsitelty väliaine kerättiin ja mitattiin VEGF-C-ELISA-kitillä. * Tilastollisesti erilainen verrattuna ajoneuvon-inkuboitu näyte käsiteltiin LPA (*

p

0,05).

(A) LNCaP, DU-145 ja PC-3-soluja käsiteltiin 10 uM Ki16425, antagonisti LPA

1 ja LPA

3, jonka jälkeen 5 uM LPA 2 h (L5: 5 uM LPA). Suhteellinen VEGF-C-mRNA-tasot mitattiin. (B) PC-3-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti LPA

1 ja LPA

3 siRNA. (C) pohjapinta-VEGF-C-mRNA: n ilmentyminen PC-3-solut transfektoitiin LPA

1 tai LPA

3 siRNA mitattiin 10% FBS: ää, ja seerumia ilmastoitu soluviljelmässä. (D) PC-3-solut transfektoitu LPA

1 ja LPA

3 siRNA hoidettiin LPA, ja VEGF-C-mRNA mitattiin. mRNA käänteistranskriboitiin ja analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä. Suhteellisia tasoja VEGF-C normalisoitu GAPDH ja β-aktiini on esitetty. * Tilastollisesti erilainen verrattuna ajoneuvon-inkuboitu näyte käsiteltiin LPA (*

p

0,05; **

p

0,01; ***

p

0,05).

LPA

1/3 välittää VEGF-C Expression kautta indusoiva LEDGF

Lens epiteelin-kasvutekijä (LEDGF /p75) tunnistettiin jännityksen vaste-proteiinin indusoima seerumin vailla nälkään, lämpörasitusta, ja oksidatiivisen stressin [24], [25]. Eturauhasen syöpä, LEDGF edelleen todettu lääkeaineen resistenssigeenin vaimentaa Doketakseli aiheuttamaa kaspaasi ja lysosomaalisen polkuja [26]. Äskettäin oxidative- ja lämpö stressin aiheuttama VEGF-C transkription havaittiin välittyvän LEDGF on keuhkosyöpä [22]. Lisäksi gonadotropiinin säännelty imusuonten välittävät myös LEDGF aiheuttama VEGF-C ilmentymisen munasarjasyöpä [27]. Niinpä olemme arveltu, että LPA aiheuttama VEGF-C ilmentyminen välittyy läpi LEDGF. Tuloksemme osoittivat, että LPA indusoi LEDGF mRNA ja proteiinin ilmentymisen (Fig. 4A, 4B). Lisäksi tuloksemme osoittivat, että LPA aiheuttama LEDGF mRNA on ohimenevä ja nopeasti vähentynyt. Tulokset viittasivat vahvasti siihen, että jälkeistä transkriptiomekanismia saattaa myös olla mukana ylläpitämiseen LPA aiheuttama LEDGF ekspressiotaso. Esikäsittely Ki16425 ja NAC esti täysin parantavia vaikutuksia LPA on LEDGF lauseke (Fig. 4C, 4D), mikä viittaa osallistuminen LPA

1/3 reseptoreita ja ROS. Lisäksi LEDGF siRNA transfektoitiin PC-3-solujen vahvistamaan, LEDGF osallistuu LPA aiheuttama VEGF-C ilmentymisen (Fig. 4E). Tulokset osoittivat selvästi, että LEDGF tarvitaan parantamiseksi vaikutusta LPA VEGF-C-ilmentymisen (Fig. 4F).

PC-3-soluja käsiteltiin LPA ja mRNA: n (A) ja proteiini (B) ekspressiotasot ja LEDGF määritettiin. LEDGF proteinm kerättiin kuluttua 2 h LPA hoitoa. Esikäsittely 10 uM Ki16425 ja 10 mM NAC: ssa 1 h tukahdutti vaikutuksia LPA (L5: 5 uM LPA) on LEDGF ilmaisun (C ja D). LEDGF siRNA transfektoitiin PC-3-solut (E) ja tukahdutetaan LPA: n vaikutus VEGF-C-ilmentymisen (F). mRNA käänteistranskriboitiin ja analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä. Suhteelliset tasot LEDGF ja VEGF-C-normalisoida GAPDH on esitetty. * Tilastollisesti erilainen verrattuna apuaineella inkuboitu näytteitä käsiteltiin LPA (*

p

0,05; **

p

0,01; ***

p

0,001).

estyminen LPA

1/3 Receptor ja knockdovvn ATX Expression Vähennä VEGF-C transkriptio ja eritys PC-3 solujen

LPA on hyvin rikastettu seerumin ja verihiutaleet; mutta monet raportit osoittivat, että rintasyöpä, gliooma, ja eturauhasen syöpä voi itse koota LPA ja edistää kasvaimen etenemiseen [28], [29], [30]. ATX on lysoPLD-hydrolyysireagenssia LPC joka luo LPA. LPA erittämä ATX kasvattaa invasiivisuus ja etenemistä rintasyöpä. Glioomis-, lysoPLD aktiivisuus ATX edistää myös syöpäsolujen tarttumista ja invasiivisuus. Perustuen noista aiemmista raporteista, olimme myös yrittää selvittää syöpäsolujen syntetisoitiin ATX voisivat itse säädellä VEGF-C ilme. Näin ollen PC-3-soluja viljeltiin RPMI-1640-ainoana välttää seerumin vaikutus. Estämällä LPA

1/3 Ki16425, pohjapinta VEGF-C mRNA (Fig. 5A) ja eritys (kuvio. 5B) PC-3-solut huomattavasti. Nämä tulokset viittaavat siihen, LPA erittämän PC-3-solut aktivoituvat LPA

1/3 ja siksi säännellään VEGF-C ilme. Lisäksi ATX siRNA ja sen estäjä, S32826 [31] (Fig. 5C, 5D), käytettiin sen määrittämiseksi, onko ATX on mukana säätelyssä VEGF-C. Tulokset osoittivat, että alas-säätely ATX-geenin ilmentymisen ja toiminnan vähentynyt VEGF-C mRNA (kuvio. 5C, 5D) ja eritys (kuvio. 5E). Tulokset viittaavat siihen, että ATX on mukana itsesäätyvä VEGF-C ilmentymisen eturauhassyöpäsoluissa.

16 tunnin kuluttua nälkään, PC-3-soluja käsiteltiin 10 uM Ki16425 RPMI1640 0,005% rasvahapon BSA 8, 12, 24, ja 48 h. Suhteellinen taso (A) ja erityksen pitoisuus VEGF-C-mRNA: n (B) näytteissä määritettiin. Lisäksi PC-3-solut transfektoitiin ATX siRNA 24 tuntia kaataa ATX-geenin. PC-3-soluja viljeltiin RPMI-1640: 0,005% rasvahapotonta BSA vielä 24 tuntia, ja näytteen RNA kerättiin. Lisäksi inhibiittori, S32826, käytettiin myös inaktivoida ATX aktiivisuus 12 tuntia. ATX: n ja VEGF-C-mRNA: n lausekkeita (C ja D) mitattiin. Seuraavat samaa protokollaa, PC-3-solut transfektoitiin ATX siRNA ja käsiteltiin S32826 oli ruokittu ja viljeltiin RPMI-1640: 0,005% rasvahapotonta BSA: ssa 48 tuntia. VEGF-C eritystä pitoisuudet (E) näytteitä määritettiin. Näyte mRNA käänteistranskriboitiin ja analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä. Suhteellinen taso geenien normalisoida p-aktiini on esitetty. VEGF-C-eritys mitattiin ELISA. * Tilastollisesti erilainen verrattuna ajoneuvon hautomakoneessa käsitelty näyte ja transfektoidaan Ki16425 ja ATX siRNA (*

p

0,05; **

p

0,01; ***

p

0,001).

keskeyttämällä LPA

1/3 PC-3, kunnostettu alusta (CM) aiheuttama HUVEC lymfaattiset Marker Expression estettiin

jäljittelemiseksi mikroympäristön välillä eturauhassyövän ja endoteelisolujen, käytimme HUVEC mallina tutkimaan mekanismeja, joilla eturauhassyövän solut indusoivat imusuonten. HUVEC-solut käsiteltiin laimennosten PC-3 CM. Ilmaisu tasot imusuonten markkereita, mukaan lukien Prox-1 ja Lyve-1 oli säädellään ylöspäin HUVEC (Fig. 6A) jälkeen CM hoidon. Sen määrittämiseksi, onko VEGF-C erittämä syöpäsolujen tarvitaan edistää imusuonten markkereita, PC-3-solut transfektoitiin stabiilisti VEGF-C shRNA valittiin (Fig. 6B). Käyttämällä CM peräisin VEGF-C Knockdown PC-3-solut hoitoon HUVEC, imusuonten merkki ilmentyminen HUVEC väheni merkittävästi verrattuna vektori kontrolliryhmään CM (Fig. 6C). Tämä tulos osoittaa, että VEGF-C on välttämätön laukaisemiseksi imusuonten merkki ilmentymistä PC-3-solut. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen että VEGF-C on keskeinen rooli eturauhassyövän aiheuttaman imusuonten. Lisäksi me esikäsitellyt PC-3-solujen Ki16425 ennen keräämällä CM (Fig. 6D). Tulokset osoittivat, että keskeyttämällä Melan

1/3, kapasiteetti PC-3 CM aiheuttaa imusuonten merkki ilmentyminen väheni 32% verrattuna kontrolliryhmään. Kuitenkin esikäsittely HUVEC kanssa Ki16425 ei vaikuttanut induktio imusuonten merkki ilmaisun (Fig. 6D), mikä viittaa siihen, että indusoiva kyky CM johtuu todennäköisesti VEGF-C. Tarkempia selkiyttää LPA

1 ja LPA

3 PC-3

, keräsimme väliaine LPA

1 tai LPA

3 lyhytaikaisesti pudotus solu hoitoon HUVEC-soluihin. Meidän tulokset, väliaine alkaen LPA

1 tai LPA

3 Knockdown soluilla oli rajallinen kyky indusoida imusuonten merkki ilmentymistä HUVEC (Fig. 6E).

(A) PC-3-soluja viljeltiin RPMI vain väliaine 24 h kuluttua 16 h nälkään. 24 h CM kerättiin ja laimennettiin hoitoon HUVEC: ssa 4 tuntia. Hoidon jälkeen HUVEC imusuonten markkeri ilmentymistä havaittiin. (B) PC-3-solut transfektoitiin stabiilisti VEGF-C shRNA testattiin VEGF-C-mRNA: n ja eritystä ilmaisun. (C) VEGF-C pudotus PC-3 CM käytettiin hoitoon HUVEC seuraten edellä kuvattua menettelyä. (D) PC-3-soluja käsiteltiin 10 uM Ki16425 ollessaan viljeltiin RPMI vain väliaineessa 24 h ennen CM käytettiin hoitoon HUVEC. Ki16425 käytettiin myös testaamaan onko LPA olemassa PC-3 CM on ratkaisevaa HUVEC imusuonten merkki sääntelyä. Ki16425 (10 uM) esikäsiteltiin 1 tunti, ennen kuin PC-3 CM hoitoon HUVEC. (E) CM PC-3-solut transfektoitiin LPA

1 tai LPA

3 siRNA käytettiin hoitoon HUVEC-soluissa, kuten yllä kuvattuja menetelmiä. Näyte mRNA käänteistranskriboitiin ja analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä. Suhteelliset tasot geenien normalisoitiin GAPDH ja β-aktiini on esitetty. * Tilastollisesti erilainen verrattuna ajoneuvoon-inkuboitu näytteitä ja näytteet käsiteltiin PC-3 CM (*

p

0,05; **

p

0,01; ***

p

0,001).

keskustelu

tässä tutkimuksessa selvitimme roolit LPA säätelyssä VEGF-C ilmentyminen eturauhassyövässä. Tuloksemme osoittivat selvästi, että LPA indusoi VEGF-C ilmentymisen eri eturauhassyövän solulinjoissa. LPA

1 ja LPA

3 molemmat tunnistaa näiden mukana LPA aiheuttama VEGF-C signalointireitin. Loppupään signaaleja, LPA aiheuttama ROS tuotanto ja LEDGF ilmaisun todettiin osallistuvat säätelyyn VEGF-C. Lisäksi ATX geeni knockdown vähensi pohjapinta VEGF-C ilme. Tämä osoittaa, että LPA ja ATX ovat välttämättömiä sääntelyn VEGF-C ilmentymistä eturauhasen syöpäsoluja.

Lysofosfolipidejä ehdotettiin edistää eturauhassyövän etenemistä. LPA indusoi PC3 solujen vaeltamiseen läpi Melan

1, p42 ja p38 alfa- polkuja ja edistää myös matrigeelin hyökkäys [32]. Viime aikoina myös osoittavat, että CD97 heterodimerisoitu ja toiminnallisesti synergized kanssa LPA

1 sotkea syövän etenemisessä [33]. Lisäksi LPA aiheuttama eturauhassyöpä selviytymisen ja hyökkäys on osoitettu liittyvän calpain välittämää proteolyysiä FAK [34]. Lisäksi VEGF: n ilmentyminen aktivoituu LPA aktivoimalla hypoksia-indusoivan tekijän (HIF) -1α ilmentymistä PC-3-soluja [35]. Kuitenkin rooli LPA eturauhassyövässä aiheuttama lymfangiogeneesiä on edelleen huonosti.

VEGF-C pidetään keskeisenä imusuoniston tekijä aloittamista lymfangiogeneesiä ja imusuonten etäpesäkkeitä eturauhasen syöpiä. LNCaP-solut, VEGF-C havaittiin olevan säätelee negatiivisesti androgeenin kautta insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 -reseptorin (IGF-IR) ja FOXO reitti [36]. Lisäksi, Androgeeniablaatio-, RALA stimuloi VEGF-C-synteesiä lisäämällä ROS [23]. Koska RALA aktivointi laukaisee LPA

1 HEK293-soluissa [37], suhde LPA-reseptorin aktivaation ja androgen vaikutuksista sääntelyyn VEGF-C ansaitsee lisätutkimuksia. Tuloksemme ehdotti, että molemmat LPA

1 ja LPA

3 vastaavat LPA aiheuttama VEGF-C ilme. Lisäksi LPA

1 ja LPA

3 vakaasti tippuu alas PC-3-solut, pohjapinta VEGF-C-geenin ilmentyminen osoitettiin laskeneen. Meidän Äskettäin julkaistussa tutkimuksessa, LPA aiheuttama VEGF-C ja imusuonten in HUVEC olivat myös LPA

1 ja LPA

3 riippuvainen [38]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että aktivaatio LPA

1 ja LPA

3 säätelee VEGF-C ilmentymistä sekä syövän ja endoteelisolujen.

eturauhassyöpä, VEGF-C ylössäätöä osoitettiin liittyvän kanssa ROS sukupolvi [22], [23]. Tulokset ehdotti roolia ROS LPA aiheuttama VEGF-C ilme. Tuloksemme osoittivat, että ROS sukupolvi aiheutettiin LPA ja osallistuu LPA aiheuttama VEGF-C transkriptio. Lisäksi LEDGF, transkriptiotekijä aktivoituu ROS, on mukana LPA-indusoidun VEGF-C ilmentymisen. Kliiniseen tutkimukseen, LEDGF ekspressio kohosi 93% kliinisistä eturauhaskasvainnäytteissä, ja se vaimennetaan docetaxal solukuolema [39]. Tässä olemme osoittaneet, että LEDGF indusoitiin LPA Käsittelemällä LPA

1/3-riippuvaisella tavalla. Nämä tulokset tukevat edelleen LPA on tärkeä säätelijä eturauhassyövän etenemiseen.

Expression tasoilla ATX, joka on LPA tuottavat entsyymiä, ovat suurempia androgeeni-riippumaton eturauhassyöpä soluihin [40]. Lisäksi kliininen data paljasti, että noin 50% eturauhassyövän potilailla havaittiin vahva ilmaus ATX. Lisäksi ATX ekspressiotaso korreloi merkitsevästi ensisijainen Gleason arvosana syövän pesäkkeitä ja läsnäolo eturauhasen Kapselipolysakkaridiantigeenin invaasion [17]. Tuloksemme viittaavat siihen, että VEGF-C säätelevät ATX ilmentymistä PC-3-solut. Siksi eturauhassyövän-syntetisointi LPA voi muodostaa autokriini silmukan stimuloida VEGF-C ilmaisun ja edistää syövän etenemisen. Näiden tulosten perusteella, ATX estäjä voisi olla potentiaalinen ehdokas estää imusuonten aiheuttama etäpesäke eturauhassyöpää.

elatusaine kerättiin syöpäsolujen käytetään laajalti matkia paikallisten microenvironmental vuorovaikutukset isännät ja kasvaimia. Käyttämällä HUVEC in vitro mallissa, syöpäsolut osoitettiin salainen interleukiini (IL) -1α stimuloida IL-8 eritystä endoteelisolujen [41]. Lisäksi väliaine A549 keuhkosyövän solulinjassa säätelee endoteelisolun verihiutaleiden kasvutekijä (PDGF) ilmaisu, joka on VEGF riippuvainen [42]. Kaikki nämä tulokset viittaavat siihen, että HUVEC solu on oikea

in vitro

malli tutkia aktiivisia komponentteja kunnostetussa alustassa syövän soluviljelmissä. PC-3-väliaine imusuonten endoteelisolujen (LEC) leviämisen, putken muodostumiseen, ja haavan paranemista. Lisäksi VEGFR-2 signalointi tunnistettiin myös olevan keskeinen rooli LEC ”hoitovasteen PC-3-väliaine [43]. Tässä olemme osoittaneet, että VEGF-C on tärkeä indusoi ilmentymistä HUVEC imusuonten merkkiaineiden PC-3-vakioitu väliaine. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten että PC-3-solut, jotka ilmentävät stabiilisti VEGF-C siRNA vähensi kasvaimensisäisenä lymfangiogeneesiä [44]. Lisäksi tutkimuksemme osoitti lisäksi, että aktivointi LPA

1/3 säätelee PC-3 VEGF-C ilmentymisen, ja väliaine PC-3-oli, joka kykenee indusoimaan ilmentyminen endoteelisolujen imusuonten markkereita.

Yhteenvetona, me osoitamme, että parantava vaikutus LPA ja ATX akseli VEGF-C-ilmentymisen eturauhassyöpäsoluissa. Siksi antagonistit LPA

1/3 ja ATX voi olla mahdollista hoitostrategioita estämiseksi eturauhassyövän aiheuttamaa lymfangiogeneesiä ja siksi estää etäpesäkkeiden liittyviä syöpäkuolemista.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

PC-3, DU145, ja LNCaP ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa saatiin ATCC: stä viljeltiin RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliiniä ( 100 U /ml), ja streptomysiinillä (100 U /ml) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO2: ta. Ihmisen napanuorasta ystävällisesti toimittanut National Taiwan University Hospital (Institutional Review Board hyväksyntä no. 9561709146). HUVEC-soluja viljeltiin 1% gelatiinilla päällystetyille (Sigma, St. Louis, MO, USA) 10-cm: n maljoilla 60% M199 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), jota oli täydennetty 100 U /ml penisilliiniä, 100 mg /ml streptomysiiniä, 20% FBS, ja 20% endoteelisolujen kasvualusta (EGM). Solut tehtiin yksi passage viikoittain. Soluja osa-viljeltiin jälkeen trypsinisaatiolla ja käytettiin kokeissa, kunnes kanavan 4. PC-3 on stabiilisti transfektoitu VEGF-C: pieni-hiusneula (sh) RNA säilytettiin ja monistettiin täydellisessä elatusaineessa, johon oli lisätty puromysiinin (0,25 ug /ml) ja 6 viikkoa ennen koetta suoritettiin.

LPA Stimulation

LPA (Sigma, St. Louis, MO, USA) valmistettiin kloroformin ja metanolin (01:09), ja varastoitiin -20 ° C. Satatuhatta soluja viljeltiin 3,5 cm halkaisijaltaan levyt täydellistä elatusainetta. 24 tunnin kuluttua implantaatiosta, PC-3-soluja nälkiinnytettiin seerumittomalla RPMI-1640: ssa 16 tuntia. Jälkeen nälkään, LPA lisättiin seerumitonta RPMI 0,005% rasvahappo-vapaata naudan seerumin albumiinia (BSA) kantajana. Melan

1/3 antagonisti, Ki16425 (Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA) ja ATX-estäjä, S32826 (Echelon, Salt Lake City, UT, USA) sekä liuotetaan DMSO. Working pitoisuus Ki16425 ja S32826 oli 10 uM ja 200 nM.

Western blot -analyysi

Käsittelyn jälkeen solut pestiin jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja hajotettiin jäällä RIPA-puskurilla (50 mM Tris pH: ssa 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoksikolaatti ja 0,1% natriumdodekyylisulfaattia (SDS)). Lysaatit sentrifugoitiin 4 ° C: ssa ja 14000 rpm: llä 15 minuutin ajan, ja selkeytetty supernatantit kerättiin. Yhtä suuret määrät näytteitä erotettiin 12% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE) ja siirrettiin sitten polyvinylideenifluoridia kalvoja (Millipore, Bellerica, MA, USA). Seuraavia vasta-aineita käytettiin blotting: vuohen monoklonaalista anti-hVEGF-C-vasta-aine (AF752; R Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA,