Krooninen sairaus

tiivistelmä

Fytokemikaalit ovat rikas lähde kemopreventiossa aineita, mutta niiden vaikutuksia moduloimalla Wnt /β-kateniinin signalointireitin ovat pysyneet pitkälti tutkimatta jääneissä. Poikkeavasti aktivoitu Wnt signalointi voi johtaa epänormaaliin vakauttamiseen β-kateniinin, joka on keskeinen aiheuttava vaihe laaja syöpiä. Kirjoittajat raportoivat modulaatio litiumkloridin aktivoituvan kanoninen Wnt /β-kateniinin opastinjärjestelmillä phytochemicals jotka ovat antioksidantti, tulehduksia tai chemopreventive ominaisuuksia. Yhdisteet ensin seuloa kohdunkaulan syöpä johdettu vakaa Wnt signalointia toimittaja HeLa-solulinjassa. Positiiviset osumaa myöhemmin arvioitiin β-kateniinin hajoamiseen, tukahduttaminen β-kateniinin ydinvoiman lokalisointi ja alas-säätely alavirtaan onkogeenisiä tavoitteet Wnt /β-kateniinin reitin. Tutkimuksemme osoittaa uusi hajoamista polku β-kateniinin proteiinin HeLa-soluissa Avenanthramide 2p (a polyfenolien) ja Triptolide (a diterpeenin triepoxide), vastaavasti kaurasta ja kiinalainen lääkekasvi. Havainnot läsnä Avenanthramide 2p mahdollisena chemopreventive ravinnon yhdiste, joka ansaitsee lisätutkimuksia käyttäen

in vivo

malleja syöpien; ne myös tarjoavat uuden näkökulman vaikutusmekanismin Triptolide.

Citation: Wang D, Wise ML, Li F, Dey M (2012) Fytokemikaalit lieventävänä Poikkeava aktivointi β-kateniinin syöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (12): e50508. doi: 10,1371 /journal.pone.0050508

Editor: Yuntao Wu, George Mason University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 syyskuu 2012; Hyväksytty 22 lokakuuta 2012 Julkaistu: 03 joulukuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: työ tukee National Institutes of Health myöntää R00AT4245 (MD), USDA /SD-AES apurahan 328100/318000 (kohteeseen MD), SDSU AES Fund 3AH203 (FL) ja NIH avustus AI076125 (FL). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

jäsenet Wnt perheen erittyvän kasvutekijöiden tärkeitä rooleja alkionkehityksen aikana säätelemällä solujen lisääntymisen, migraation, kudosten napaisuus, ja organogeneesiin, ja edistää kehitystä Virtsa-. Vuonna kanoninen Wnt-reitin, β-kateniinin toimii keskeinen komponentti [1]. Sitoutumisen Wnt sen reseptorin (frizzled) ja co-reseptori (low density lipoprotein LRP5: stä /6) inhiboi proteiinin kompleksin, joka sisältää ak- siini, glykogeenisyntaasikinaasi-3 (GSK-3), ja adenomatoottisen polypoosin coli ( APC). Tämä inhibitio johtaa kertyminen β-kateniinin sytoplasmassa joka myöhemmin siirtyy tumaan, [2]. Tumaan β-kateniinin sitoutuu T-solun tekijä (TCF), jotka johtavat transkription Wnt kohdegeenien [3]. Tämä poikkeava β-kateniinin signalointi on havaittu monissa eri ihmisen syövissä, mukaan lukien suurin ja peräsuolen syöpiä, noin puoli eturauhasen syöpien ja kolmasosa ihosyövän [4].

β-kateniinin kiihdyttää myös ihmisen papilloomavirus tyyppi-16 välitteisen kohdunkaulan syövän syntymistä siirtogeenisiä hiiriä

[

5

]

.

Kiinnostavaa β-kateniinin uskotaan vaikuttavan metastaattisen mahdolliset kasvainsolujen vaikuttamalla kromatiinin remodeling [6], sekä moduloivat oksidatiivisen stressin vasteen soluissa [7]. Näin ollen vaimennus konstitutiivisen aktivaation β-kateniinin signalointireitin on tullut houkutteleva kohde syövän hoitoon ja ehkäisyyn.

Luonnollisesti esiintyviä yhdisteitä ovat houkuttelevia ehdokkaita kehityksen kemopreventiivisten aineina, kun siihen yhdistetään näyttöön perustuva havaintojen ja mekanistinen tutkimus. Erityisesti ruokavalion aineet kiertää tarvitaan lisää käyttöön ulko yhdisteiden terveitä oireettomia henkilöitä. Ruokavalion aineet ovat myös yleensä vähemmän myrkyllisiä, helpommin biologisesti, helpommin ja vähemmän kalliita verrattuna synteettisiä aineita. Viime vuosina useat laboratoriot ovat tunnistaneet useita phytochemicals jotka ovat potentiaalisesti hyödyllisiä biologisia ominaisuuksia; Kuitenkin vain harvat ryhmät ovat suoraan arvioitiin kyky näiden aineiden häiritä β-kateniinin-välitteisen Wnt signalointia [4]. Tässä tutkimuksessa me raportoimme modulaatio litiumkloridia (LiCl) aktivoitujen Wnt /β-kateniinin opastinjärjestelmillä phytochemicals joilla tiedetään antioksidantti, tulehdusta ja chemopreventive ominaisuuksia. On ehdotettu, että krooninen pysyvä tulehdus on aiheuttava tekijä ihmisen erilaisten syöpien. Vaikka hävittämistä ja /tai rokotus ovat kohtuullisia strategioita, tällaiset pyrkimykset voivat epäonnistua estää syövän tapauksissa, joihin liittyy jatkuva tulehdus kudosten uudelleenjärjestely ja epigeneettiset muutokset. Koska ylös-Wnt-perheen ligandit ja alas-säätely endogeenisten Wnt estäjien tapahtua alkuvaiheessa Karsinogeneesin tulehduskipulääkkeet kanssa kyky estää kanoninen Wnt-signalointireitin ovat ehdokasaineille kemopreventiolle [8].

Avenanthramides (Avns) ovat ryhmä luonnossa esiintyviä polyfenolit löytyy ainutlaatuisen, joukossa elintarviketuotantoon, kaura, suosittu terveellinen vilja [9], [10]. AVN 2p, 2f, ja 2c ovat kolme päätyyppiä, jotka ovat intensiivisesti tutkittu ja osoitettu olevan ylivoimainen anti-ärsyttävä ja antioksidanttisia ominaisuuksia [11], [12], [13], [14]. Hyötyosuutta Avns on perustettu eläimillä ja ihmisillä [11], [15]. Kolme AVN yhdisteiden näyttävät otetaan ylös ja jaetaan kudoksiin differentiaalisesti. Sijoitus järjestys plasman mukaan AVN tyypin on 2p 2 f 2c [16]. Inhibitio

in vitro

paksusuolen syövän solujen proliferaatiota ja NFKB-aktivaation endoteelisoluissa näiden yhdisteiden on osoitettu [9], [17]. Täällä tutkimme mahdollisia

in vitro

antiproliferatiivista aktiivisuutta ja solujen mekanismien Avns ihmisen kohdunkaulan syöpäsoluja.

Phenethylisothiocyanate (PEITC) on hyvin tutkittu isotiosyanaatti, joita esiintyy luontaisesti muodossa sen glukosinolaattipitoisuus esiaste, gluconasturtiin, vuonna Brassicaceae perheen vihannekset, kuten kaali, kukkakaali, vesikrassi ja parsakaali. PEITC osoitti chemopreventive potentiaalia monenlaisia ​​syöpiä [18] ja mitään ilmeistä toksisuutta edes kun sitä annetaan suurina annoksina rotille ja koirille määritettynä NOEL (no-havaittu haitallinen-taso) huumeiden turvallisuustutkimuksissa [19]. Olemme raportoitiin sen anti-inflammatoriset vaikutukset ja niihin liittyvät solun mekanismeja, [20], [21]. Lisäksi ehdotetaan, että PEITC voi tukahduttaa syövän etäpesäkkeiden [22]. Koska β-kateniinin uskotaan vaikuttavan metastaattisen potentiaalin kasvainsolujen [6], arvioimme mahdolliset vaikutukset PEITC on β-kateniinin signalointia.

Triptolide, joka on diterpeeni triepoxide, on tärkeä aktiivinen komponentti uutteet johdettu lääkekasvi

Tripterygium wilfordii

Hook F. Triptolide on useita farmakologisia toimintoja kuten tulehdusta, immuuni modulaatio, antiproliferatiivisia ja pro-apoptoottista aktiivisuutta [23], [24], [25]. Triptolide on laajalti käytetty vuosituhansia vanha lääketieteen perinteiden harjoiteltu Kiinassa tulehdus- ja autoimmuunisairauksien, ja viime aikoina elinsiirtojen ja kasvaimia [26]. Triptolide voi indusoida tuumorisolujen apoptoosia suoraan, sekä parantaa indusoiman apoptoosin sytotoksisten aineiden, kuten TNF-α, ja kemoterapeuttisten aineiden estämällä NFKB aktivaatioon. Äskettäin solun tavoitteet Triptolide, kuten MAP kinaasi fosfataasi-1, Heat shock proteiini, 5-lipoksigenaasin, RNA-polymeraasi ja histoni metyyli-transferaasien, oli osoitettu [23]. Kuitenkin parhaan tietomme mukaan tämä hyvin tutkittu ja laajalti käytetty yhdiste ei ole arvioitu β-kateniinin signalointi. Siksi olemme mukana Triptolide nykyisissä tutkimuksessa.

Yleinen tavoite nykyisen tutkimuksen oli selvittää mekanistinen oivalluksia valitun phytocompounds liittyvät Wnt /β-kateniinin signalointi, jotka voivat olla merkityksellisiä monenlaisia ​​syöpiä. Kaikki kokeet suoritettiin käyttäen HeLa soluja ihmisen kohdunkaulan syövän alkuperä (ATCC, Manassas, VA). HeLa-solut -infektio kanssa papilloomavirus viruksia, jotka edistävät pysyviä tulehdusvasteen solujen sisällä. Papilloomavirukset uskotaan olevan aiheuttavat tekijät ihmisen kohdunkaulan syöpiä. Hela-genomi on ollut huomattavan vakaana vuosien jälkeen jatkuva viljely; siksi geneettiset muutokset havaitaan ehkä ollut läsnä primaarikasvaimen ja heijastavat tapahtumia, jotka ovat olennaisia ​​kehittämiseen kohdunkaulan ja muiden ihmisen syövän [27]. Vakaa toimittaja, joka ilmentää tulikärpäsen lusiferaasi vaikutuksen alaisena TCF-promoottorin tuotettiin ja optimoitu seurata transkription aktivointi β-kateniinin /TCF-kompleksin vastauksena interventioon testiyhdisteitä. Jatkotutkimusten sisältyvät yhdisteiden vaikutukset soluproliferaatioon, soluliman β-kateniinin hajoamiseen, ydin- β-kateniinin lokalisointi ja loppupään ilmentyminen c-Myc transkriptiotekijä. Myc-proto-onkogeenin koodaa c-Myc-transkriptiotekijää, mutaatio, joka myötävaikuttaa genesis monien ihmisen syöpien. Yhtenä tärkeimmistä loppupään tavoitteita β-kateniinin-TCF kompleksi, c-Myc avainasemassa muuttuneessa solujen aineenvaihduntaan aikana tuumorigeneesin [28]. Kaikkien kokeissa β-kateniinin stabilointi ja kanonisen Wnt signalointia aktivoitiin käyttämällä LiCl. GSK-3 on kinaasi, joka fosforyloi β-kateniinin sytoplasmassa jolloin induktion kanoninen Wnt signaloinnin [29]. LiCI: aktivoi kanoninen Wnt /β-kateniinin-reitin GSK-3 [30], [31], joka on riippumaton reseptorin /co-reseptorin aktiivisuutta. FH535 (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) on pieni molekyyli estäjä Wnt /β-kateniinin signalointi [32], [33]. FH535 käytettiin kaikissa kokeissa tunnettu Wnt-estäjä.

Materiaalit ja menetelmät

Plasmidit, kemikaalit, Cell Lines, ja vasta-aineet

Plasmidit 7TFP (Addgene plasmidi 24308), pCMVdR8.2 (Addgene plasmidi 8455), ja pCMV-VSV-G (Addgene plasmidi 8454) ostettiin Addgene (Cambridge, MA). P7TFP vektori [34] on replikaatioon kykenemätön, self-inaktivoivan sisältävä lentivirusvektori 7XTCF promoottori, Firefly lusiferaasireportterigeenillä ja puromysiiniresistenssin kasetin valinta [34]. Plasmidi pCMV dR8.2 [35] ja pCMV-VSV-G [35], joka koodaa VSV-G-vaippaproteiini, käytettiin lentiviruksen pakkausjärjestelmän valmistamiseksi tarttuvan 7XTFP lentivirukset. PGL4.75 ilmentävää Renilla lusiferaasi-geeni hankittiin Promega Inc. (Madison, WI). Triptolide, FH535, PEITC LiCl, Hoechst ja polybreeni saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Puromysiini, muita antibiootteja ja soluviljelyaineessa ostettiin Invitrogen (Grand Island, NY). Reagenssit, joita käytetään kvantitatiivisella PCR: llä, mukaan lukien entsyymit toimitti Applied Biosystems (Foster City, CA). HeLa-solulinja (CCL-2) ja HEK293 T-solulinjaa (CRL-11268) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Anti-ihmis β-kateniinin ja anti-ihmis β-aktiini-vasta-aineet hankittiin valmistajalta Millipore (Bedford, MA). Dylight 680 anti-hiiri ja Dylight 800 anti-kani-vasta-aineita saatiin Li-Cor Biosciences (Lincoln, NE).

Chemical Synthesis of Avns 2p, 2f ja 2c välillä Oats

Avns 2p, 2f ja 2c syntetisoitiin menetelmillä raportoitu aiemmin [36]. Lyhyesti, 5 mmol sopivan fenyylipropanoidimetabolian (

p

-coumaric, ferulic tai kofeiinihapon) pyridiinissä asetyloitiin ylimäärällä etikkahappoanhydridiä. Reaktion jälkeen lisättiin kylmää vettä, ja sakka otettiin talteen ja kuivattiin yön yli. Että asetyloitu fenyylipropanoidimetabolian dimetyyliformamidissa, jossa on pieni määrä trietyyliamiinia, lisättiin tipoittain ekvimolaarinen määrä bentsotriatsol-1-yylioksi) tris- (dimetyyliamino) fosfoniumheksafluorifosfaattia liuotettiin CH

2CI

2. Seuraavat 5-hydroksi-antraniilihappoa (ekvimolaarinen) dimetyyliformamidissa lisättiin tipoittain. Reaktio pysäytettiin 0,5 M HCI: lla. Louhinnan jälkeen acetoxyavenanthramide etyyliasetaattiin ja pyöröhaihduttimella kuiviin, suojaava asetyyliryhmät poistettiin lisäämällä 5% pyrrolidiini CH

2CI

2. De-suoja reaktio pysäytettiin 1 M HCl: lla ja AVN uutettiin etyyliasetaattiin. Puhdistus AVN saatiin aikaan LH-20-pylväskromatografialla.

Cell Culture

Ihmisen kohdunkaulan syövän solulinja HeLa (ATCC, CCL-2) ja ihmisen alkion munuais- 293T-solut (ATCC , CRL-11268) ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, jota oli täydennetty 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia. HeLa 7TFP vakaa toimittaja solulinjaa ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, jota oli täydennetty 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 0,5 ug /ml puromysiiniä, ja 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa inkubaattorissa 5% CO2. Soluja jatkoviljeltiin jälkeen trypsinaatiolla kun 90% konfluentteja kanssa 01:05 jakosuhde. Sillä soluproleferaatiomäärityksessä vain, soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, jota oli täydennetty 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 5% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, ja 50 uM 2-merkaptoetanolia. Solut ympättiin eri tiheyksillä, kuten on kuvattu kussakin kokeessa. Elävien solujen laskenta suoritettiin trypaanisini värjäyksen hemosytometrillä.

Lentivirusvektorikonstruktit Tuotanto ja Stable Reportteri Cell Line Development

Lentivirusvektorikonstruktit tuotanto toteutettiin seuraavat modifioidun protokollan Stewardin

et. al.

[35]. Käytimme HeLa-solulinjan pysyvästi kantaa lentiviruksen 7TFP toimittaja kasetti, joka sisältää tulikärpäsen lusiferaasi reportterigeeni ohjataan TCF-geenin promoottori [34]. Lentiviruksen toimitetaan kasetti sisältää myös SV40-promoottori-ajettu puromysiiniresistenssigeenin [34]. VSV-G-pseudo- lentivirus ilmentävät 7TFP valmistettiin HEK293T-soluissa kotransfektiolla pCMV VSV-G, p7TFP, ja pCMV dR8.2. HeLa-solut infektoitiin lentivirukset inkuboitiin puromysiiniä 2 vk. Solut elossa antibioottiselektiosta kasvatettiin ja karakterisoitu Wnt reportteriaktiivisuutta. Lentiviruksen transdusoidut HeLa 7TFP vakaa toimittaja solut olivat stabiileja Wnt reportteri aktiivisuus vähintään 20 kohdissa (tuloksia ei ole esitetty), kun ylläpidetään viljelyväliaineessa, joka sisälsi 0,5 ug /ml puromysiiniä.

Wnt Reporter Assay

dual lusiferaasin määritystä käytettiin määrittämään, missä määrin Wnt signaloinnin aktivointi mittaamalla β-kateniinin välitteisen TCF transkription HeLa 7TFP vakaa toimittaja solut vasteena hoitoja yhdisteiden. Ensimmäinen, ohimenevä transfektio suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [37]. HeLa 7TFP toimittaja soluja kasvatettiin 6 cm: n viljelyastioihin (2 x 10

6 solua kuhunkin maljaan). Jälkeen 1d, kunkin astian, 1 ug pGL4.75 sekoitettiin transfektio, joka sisälsi 3 ui TransIT LT1 (Mirus Bio LLC, Madison, WI) ja lisättiin viljelmään. 24 h transfektion jälkeen, solut trypsinoitiin, suspendoitiin uudelleen ja ympättiin kuoppiin 96-kuoppaisella levyllä (2 x 10

4 solua per kuoppa). Kuusi tuntia myöhemmin, media korvattiin uuden median sisältävien hoitojen tai ajoneuvon sekä dimetyylisulfoksidi (DMSO). Seuraavat 4 tunnin inkuboinnin 50 mM LiCl: a lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin vielä 8 tuntia.

Wnt aktivoinnin eri näytteissä määritettiin mittaamalla tulikärpäsen lusiferaasi, jossa käytetään Dual Glo lusiferaasianalyysissä kit ( Promega, Madison, WI). Tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuus mitattiin luminesenssi käyttäen Synergy H4 hybridi Reader (BioTek, Winooski, VT) soluekstrakteissa, normalisoidaan Renilla lusiferaasiaktiivisuuden, ja ilmaistaan ​​prosentuaalinen muutos verrattuna LiCl käsitelty positiivisena kontrollina. Pitoisuuksia testiyhdisteitä ja niiden hoito itämisaika oli joko ennalta määrätty käyttämällä erillistä optimointia kokeissa (tietoja ei ole esitetty), tai jotka on saatu aiemmissa raporteissa [9], [20], [24], [32]. Merkitys Yhdisteen toimintaa verrattiin yksi-on-one perusteella suhteessa LiCl ohjaus (positiivinen kontrolli). Solut, joita käsiteltiin vehikkelillä (DMSO vain) ja ei aktivoida LiCl-toimi negatiivisena kontrollina normalisointia tausta signaalin. Tiedot on ilmaistu prosentteina Wnt transkription toimittaja aktiivisuus verrattuna LiCl.

proliferaatiomääritystä

kyky HeLa-solujen lisääntyvän vasteena erilaisiin hoitoihin mitattiin käyttämällä CellTiter 96® vesikerros Solution Cell Proliferation Assay (Promega Inc., Madison, WI), joka on kolorimetrinen menetelmä, jolla määritetään elinkykyisten solujen lisääntymistä. Määritys käyttää tetratsoliumyhdiste [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium, sisäinen suola; MTS] ja elektroneja kytkentäreagenssia (fenatsiinietosulfaatti, PES). Valmistajan ohjeiden seurattiin ja hoitoja verrattiin ajoneuvon ohjaus (DMSO-käsitellyissä soluissa) lukemalla absorbanssi 490 nm: ssä BioTek Synergy H4 multimode levynlukijaa (BioTek, Winooski, VT). Kaikki esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± S.E. neljästä itsenäisestä kokeesta.

immunoblottauksella

HeLa-soluja (CCL-2, ATCC, Manassas, VA) ympättiin 6-kuoppaisille levyille tiheytenä 1 x 10

6 kuhunkin kuoppaan . Seuraavana päivänä väliaine poistettiin ja uusi media sisältävät osoitetut pitoisuudet testiyhdisteiden (AVN 2p, FH535 tai Triptolide) tai DMSO: ta (ajoneuvon hallinnan) lisättiin takaisin. 4 tunnin kuluttua, LiCl: ää lopulliseen konsentraatioon 50 mM, lisättiin kuoppiin vielä 8 tunnin inkuboinnin. Immunoblottaus suoritettiin jälkeen kuvanneet

Gao et. al.

[38]. Lyhyesti, solut hajotettiin jääkylmässä RIPA [150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8,0, 0,4 mM EDTA, 10% glyserolia, 1% Nonident P-40 (NP-40)], jota seurasi lyhyt vorteksoimalla ja kierto 30 min 4 ° C: ssa. Supernatantti siirrettiin, ja kirkastetaan sentrifugoimalla. Yhtä suuret määrät (v /v) solulysaateista erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin nitroselluloosalle, tukossa ja kaksinkertainen koetettiin yön hiiren anti-ihmis β-kateniinin (1:2000 v /v) ja kanin anti-ihmisen β-aktiinin ( 1:5000 v /v) vasta-aineet, ja inkuboitiin sitten Dylight 680 anti-hiiri (1:5000 v /v) ja Dylight 800 anti-kanin (1:5000 v /v) vasta-aineet. Täplät kuvattiin kanssa LI-COR Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE).

Immunofluoresenssi- ja Nuclear lokalisointi Pitoisuus

HeLa-solut ympättiin 12 kuoppalevylle tiheydellä 2 x 10

5 kuhunkin kuoppaan. Seuraavana päivänä elatusaineet poistettiin ja ilmoitetun pitoisuuden kunkin yhdisteen (AVN 2p, FH535 tai Triptolide) tai DMSO: ta, lisätään takaisin. Optimoitu Kunkin yhdisteen konsentraatio, on ennalta määrätty Wnt reportterimääritys. 4 tunnin kuluttua inkuboinnin 50 mM LiCl: a lisättiin kuoppiin vielä 8 tunnin inkuboinnin. Immunofluoresenssi mitattiin kuten aiemmin on kuvattu [37]. Solut immunovärjättiin hiiren anti β-kateniinin (1:1000 v /v) ja vuohen anti-hiiri Dylight 488 (1:2000 v /v) vasta-aineet peräkkäin. Tumat värjättiin Hoechst dye (0,1 ug /ml). Kuvat kerättiin

Evos FL epifluorescent mikroskooppi (AMG, Bothell, WA) B

.

Kuvatiedon ilmaistiin Dylight 488 (osoittaa β-kateniinin lokalisointi), Hoechst (osoittaen nucleus) ja yhdistäminen (päällekkäin Dylight 488 ja Hoechst värjäyksen samaa mieltä). Nucleus lokalisaatio β-kateniinin määritettiin Dylight 488 värjäyksen tumassa. Solut läsnäolo β-kateniinin tumaan laskettiin joukossa 100 solua kullekin käsittelylle.

Kokonais-RNA uuttaminen, puhdistus, ja cDNA: n synteesi

Yhteensä RNA, puhdistus ja cDNA-synteesi oli suoritettiin kuten ovat kuvanneet Dey

et. al

. aiemmin [21]. Kokonais-RNA uutettiin HeLa-soluista käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Grand Island, NY) seuraten valmistajan ohjeita. RNA käsiteltiin sitten DNaseI (Invitrogen, Grand Island, NY) ja poistaa jälkiä DNA-kontaminaation mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA kvantitoitiin spektrofotometrisesti absorption mittauksia 260 ja 280 nm: ssä käyttämällä Nanodrop 2000 järjestelmä (Thermo Fisher Scientifics, Waltham, MA). CDNA: t syntetisoitiin käyttämällä 3 ug RNA: ta kustakin näytteestä käyttäen MultiScribe käänteistranskriptaasia (Applied Biosystems, Foster City, CA), seuraten valmistajan protokollaa.

Real Time Kvantitatiivinen PCR

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [21]. Syntetisoitu cDNA: t laimennettiin 2,5-kertaisesti. Kaksi mikrolitraa kutakin laimennettua näytettä lisättiin 0,5 ui geenispesifisiä alukkeita (6 uM; oligot syntetisoitiin IDT Inc., Coralville, IA) ja 12,5 ui Brilliant SYBR green PCR master mix (2X) (Applied Biosystems, Foster City, CA). ROX käytettiin sisäisenä väriainetta. Häiriöiden välttämiseksi johtuen genomista DNA saastuminen, vain intronin päällekkäiset alukkeet valitaan käyttäen Primer Express versio 2.0-ohjelmisto (Applied Biosystems, Foster City, CA) seuraavasti (eteen ja taakse paria alukkeita on merkitty ”F” ja ” R ”, tässä järjestyksessä): c-Myc (Genbank ID: NM_002467), F: 5′-caccagcagcgactctga-3 ’, R: 5′-gatccagactctgaccttttgc-3′; β-aktiinin (Genbank ID: NM_007393), F: 5’-ccaaccgcgagaagatga-3 ’, R: 5′-ccagaggcgtacagggatag-3’. PCR-monistukset suoritettiin MX3005p järjestelmä (Stratagene, Santa Clara, CA). Ei mallin ohjaus sisällytettiin PCR ohjelmaa laadunvalvonta askel. Standard ΔΔCt menetelmää käytettiin suhteessa mRNA: n määrän laskennan suhteen LiCl-aikaansaama ohjaus (positiivinen kontrolli), joka on normalisoitu arvoon 1,0, kuten on kuvattu Dey

et. al

. [21]. Jos arvo on alle 1,0 osoittaa transkription säätely alaspäin (esto geenin ilmentymisen) verrattuna LiCl positiivinen kontrolli, joka osoittaa maksimi geneettinen induktio (1,0). Siksi alemmat arvot osoittavat suurempaa Wnt estävää vaikutusta. Amplification spesifisten kopioiden vahvistettiin edelleen saada sulamiskäyräanalyysillä profiileja. Kaikki näytteet ajettiin kahtena.

Tilastollinen analyysi

Kokeelliset havainnot ilmoitetaan keskiarvona ± S.E. Kaikissa kuvioissa merkitys mitään hoitoa yli käsittelemätön kontrolli (DMEM varten Fig. 1 C, LiCl varten Fig. 2, DMSO Fig. 3, ja LiCl kuvioille. 4B, 5B ja 6) määritettiin Studentin

t

testi. Hoidot katsottiin merkittävästi erilainen, jos p 0,05 *, erittäin merkittävä, jos p 0,01 * *, tai erittäin merkittävä, jos p 0,001 * * *.

. Lentivirusvektori 7TFP sisältää 7XTCF promoottorin, tulikärpäsen lusiferaasi, ja puromysiiniresistenssigeenin alla SV40-promoottorin säätelyn. LTR, pitkä terminaalinen toisto; RRE, Rev reagoiva elementti; FFluc, Firefly lusiferaasi; SV40, Simian vakuoleja virus 40; PuroR, puromysiiniresistenssin; WPRE, metsämurmelin hepatiittivirus posttranskriptionaalisella säätelyelementti; SYNTI; self inaktivoiva. B. kaavamaisia ​​7TFP lentiviruksen tuotanto transfektiolla, lentiviruksen infektio, ja vakaa toimittaja solu- linjan valinnan. C. validointi pitoisuudesta riippuva Wnt reportteri vastausta vakaa tuottajasolulinjalle seuraavat LiCl induktion (8 h) mitattiin käyttämällä Lusiferaasiaktiivisuutta. Poimuihin Wnt reportteri toimintaa suhteessa negatiiviseen kontrolliin (ajoneuvo-käsitelty) näytetään keskimääräisenä ± SE

Tulokset

tuotanto ja optimointi Stable Reporter HeLa 7TFP Cell Line High Content Screening phytochemicals varten Syövän Properties

tunnistaa luonnossa esiintyvä kemiallinen modulaattorit Wnt signaloinnin kehitimme korkean pitoisuus määrityksessä mittaamaan aktivaation, tumaansiirtymiseen ja myöhemmin sitoutumisen β-kateniinin, että TCF transkription monimutkainen HeLa-soluissa. Esto GSK-3-kompleksin sytoplasmaan johtaa tuotannon poikkeavan β-kateniinin, joka myöhemmin siirtyy tumaan, sitoutumaan TCF-kompleksin liipaisu alavirran aktivaation Wnt-reitin geenejä. Käytimme HeLa-solulinjasta vakaasti kuljettaa lentiviraalinen 7TFP toimittaja kasetti sisältää Firefly lusiferaasireportterigeenillä ohjataan TCF-geenin promoottori (Fig. 1A). Sen osoittamiseksi, toiminnallinen merkitys HeLa 7TFP reportteri-solulinjaa, käytettiin LiCl-, farmakologinen estäjä GSK-3 [31], [39], kuten Wnt aktivaattori. Kuten on esitetty kuviossa. 1C, 8 h kuluttua LiCl-hoidon 7TFP soluista osoitti annoksesta riippuvaista stimulaation Wnt signaloinnin vasteen kuin ne ovat tulikärpäsen lusiferaasi toimintaa. 50 mM LiCl herättänyt lähes 1000-kertaisesti toimittaja induktio verrattuna negatiivisen kontrollin (DMEM). Siksi kaikki myöhemmät kokeet LiCl käytettiin 50 mM pitoisuutena. Olemme edelleen vahvistettu kykyä määritysjärjestelmä yhdisteiden tunnistamiseksi, jotka vaikuttavat Wnt signalointia käyttäen tunnettua inhibiittoria Wnt signalointia, synteettinen pieni molekyyli FH535 hankittiin Sigma Chemicals (St. Louis, MO) (itsenäinen validointi tietoja ei ole esitetty). Siksi FH535 käytettiin viite-ohjaus kaikkiin myöhempiin kokeisiin, kuten on esitetty kuvioissa. 2-6.

Reporter ja Renilla lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual Glo lusiferaasianalyysissä kit. Normalisoitu prosenttiosuus arvot suhteessa LiCl-ohjaus on esitetty keskiarvona ± S.E., (n = 4). Tähdet osoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja yhdisteen

–

käsiteltyjä soluja ja LiCl aiheuttama ohjaus: *** p≤0.001, ** p≤0.01, * p≤0.05.

Selection yhdisteiden niiden kyky estää transkription induktio Wnt Signaling

tunnistaa luonnollinen modulaattorit kanonisen Wnt signalointia ja edelleen vahvistaa meidän reportteri koejärjestelmässä, teimme lentäjä ja keskittyi seulonta viisi yhdisteiden meidän laboratorio luonnollinen tuote kokoelma. Käyttämällä enemmän kuin 25%: n inhibitio suurimmalla testattu pitoisuus yhdistettynä pitoisuudesta riippuvaista estokäyrältä verrattuna LiCI: positiivinen kontrolli, olemme määrittäneet kolme yhdisteitä, jotka vaimentua TCF välitteisen Wnt signaloinnin aktivaatiota (Fig. 2). Avns 2p ja 2 f heikennettyjä 30% aktivoinnin 40 uM pitoisuuksina, kun samalla vaimentavan päästiin 22,24 nM Triptolide. Synteettinen FH535 saavutti suuremman Wnt signalointi vaimennus 10 uM. Se ei osoittanut mitään aktiivisuutta nanomolaarisella tasolla (tuloksia ei ole esitetty). On syytä mainita, että ei ole selvää solujen sytopaattisia vaikutuksia havaittiin käyttäen faasikontrastimikroskooppia aikana 12 h solujen altistaminen kaikkia testattuja yhdisteitä. Emme havainneet merkittäviä muutoksia transkription aktivointitasoa vastauksena AVN 2p tai Triptolide pitkittynyt inkubaatiot (12 h) verrattuna 8 h hoitoja.

vaimennus HeLa soluproliferaation Test Agents

Wnt signalointia aktivointi on yhdistetty kontrolloimattoman soluproliferaation aikana syövän synnyn [3]. Meidän seulonta kokeessa, stabiili Wnt reportteri HeLa-solut, 2p, 2f ja Triptolide tukahdutetaan LiCI: n aktivoitu TCF-välitteisen transkription pitoisuutena riippuvaisella tavalla. Koska vapautuneilla soluproliferaatiota on tunnusmerkki syöpäsoluja, antiproliferatiivinen vaikutus kolmen yhdisteiden testaus positiivinen seulonta-analyysissä (Fig. 2) määritettiin. Sekä Triptolide ja AVN 2p oli merkittävä, pitoisuudesta riippuvainen antiproliferatiivinen aktiivisuus (Fig. 3). AVN 2f ei osoittanut antiproliferatiivinen aktiivisuus aikana 24 h kulttuuri siten vain 2p ja Triptolide tutkittiin seuraavissa kokeissa.

Hela-solua viljeltiin MTS elatusaineeseen. Absorbanssi luettiin 490 nm ja data ilmaistiin prosenttia solujen elinkelpoisuus verrattuna DMSO-kontrollin (ajoneuvo). Normalisoitu prosenttiosuus arvot suhteessa DMSO-kontrollin esitetään keskiarvona ± S.E., (n = 4). Tähdet osoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja yhdisteen

–

käsiteltyjä soluja ja ohjaus: *** p≤0.001, ** p≤0.01, * p≤0.05.

AVN 2p ja Triptolide edistänyt Cellular

β-kateniinin

proteiinien hajoaminen

Lisätietoja mekanistinen tutkimus Wnt signaloinnin häiriön mukaan Triptolide ja 2p tehtiin. Koska Wnt aktivaatiota, joka tukahdutettiin yhdisteet, vaatii solujen tuotanto β-kateniinin ja sen sitoutumisen TCF transkription kompleksin tumaan [3], tutkimme yhdisteiden kyky parantaa solujen β-kateniinin proteiinien hajoaminen. Pitoisuus riippuvainen LiCl aiheuttama β-kateniinin proteiinien hajoaminen havaittiin vastauksena 2p ja Triptolide HeLa-soluissa (kuvio. 4B). Vähentynyt ilmentyminen β-kateniinin havaittiin myös FH535-käsitellyissä soluissa (Fig. 4B). Erityisesti, endogeeninen aktiinin ilmentyminen ei muuttunut käsitellyissä soluissa 2p tai FH535, mikä osoittaa, että havaittu väheneminen β-kateniinin ei johtunut lääkkeen myrkyllisyyden (Fig. 4A).

. β-kateniinin proteiinin ekspressiota: Western blot oli kaksinkertainen tutkitun hiiren anti-ihmis β-kateniinin (1:2000 v /v) ja kanin anti-ihmis β-aktiini (1:5000 v /v) vasta-aineet, pestiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa, ja inkuboitiin edelleen Dylight 680 anti-hiiri (1:5000 v /v) ja Dylight 800 anti-kanin (1:5000 v /v) vasta-aineet. LI-COR Odyssey Infrared Imaging System käytettiin immunoblottaus signaalin havaitseminen. B. densitometrinen analyysi β-kateniinin proteiinin tasot (keskiarvo ± SE, n = 3): p-aktiini käytettiin housekeeping ohjaus normalisointi. Tähti osoittaa ekspressiotasot β-kateniinin yhdisteiden käsiteltyjä soluja, jotka ovat merkittävästi erilaiset kuin LiCl: n indusoiman ohjaus: *** p≤0.001, ** p≤0.01, * p≤0.05.

AVN 2p ja Triptolide kumottu Nuclear sijainnilla

β-kateniinin

Wnt signalointi vastaus riippuu ydinvoiman lokalisoinnin β-kateniinin missä se vaikuttaa TCF /LEF perheen transkriptiotekijöitä aktivoida Wnt-reitin. Siksi halusimme vahvistaa, jos solun hajoamista β-kateniinin by 2p ja Triptolide (Fig. 4) loogisesti johtaa vähenemiseen ydinvoiman lokalisointi β-kateniinin.

Kuten osoitettu kuvassa. 5A, tumalokalisaatio on β-kateniinin estyi merkittävästi HeLa-soluissa on käsitelty sekä yhdisteillä verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Kvantitatiivinen analyysi solujen määrä, joilla ydin- β-kateniinin värjäys pois 100 satunnaisesti lasketaan soluja käsitellään tai LiCl ohjaus tukee myös havaintomme (kuvio. 5B). Noin 30% käsittelemättömien solujen hallussaan tumaansiirtymiseen of β-kateniinin toisin kuin 14% 2p- ja 8% Triptolide-käsitellyissä soluissa.

. Mikroskooppinen havaitseminen β-kateniinin lokalisointi immunofluoresenssilla: HeLa-soluja käsiteltiin ajoneuvon vain (DMSO, yläpaneeli), 15 uM FH535 (toinen ylhäältä), 80 uM AVN 2p (kolmas ylhäältä) tai 22 nM Triptolide (alhaalla) ennen 50 mM LiCl induktio kullekin.