Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

dihydroartemisiniini (DHA), puolisynteettinen johdannainen artemisiinipohjaisten, on viime aikoina osoittanut antituumorivaikutus erilaisissa syöpäsoluissa. Apo2-ligandin tai tuumorinekroositekijä-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (Apo2L /TRAIL) pidetään lupaavana syöpälääke, mutta chemoresistance vaikuttaa sen tehoon näiden hoitostrategia. Aiheuttamaa apoptoosia yhdistelmä DHA ja Apo2L /TRAIL ei ole hyvin dokumentoitu, ja niihin liittyvistä mekanismeista ovat edelleen epäselviä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Täällä raportoimme että DHA parantaa tehoa Apo2L /TRAIL hoitoon haimasyöpä. Huomasimme, että yhdistelmähoidon avulla DHA ja Apo2L /TRAIL tehostaa merkittävästi apoptoosin BxPC-3 ja PANC-1-soluissa verrattuna yhden aineella

in vitro

. Vaikutus DHA välittyy reaktiivisten hapen lajien, induktio kuoleman reseptori 5 (DR5), ja modulaatio apoptoosiin liittyviä proteiineja. Kuitenkin N-asetyylikysteiini vähensi merkittävästi parannettu apoptoosia yhdistelmällä havaittu DHA: n ja Apo2L /TRAIL. Lisäksi knockdovvn DR5 mukaan Sirna myös merkittävästi vähentänyt indusoiman apoptoosin DHA ja Apo2L /TRAIL.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä tulokset viittaavat siihen, että DHA parantaa Apo2L /perävaunu välittämää apoptoosia ihmisen haimasyövän soluja kautta reaktiivisia happiradikaaleja välittämä lisäävä säätely DR5.

Citation: Kong R, Jia G, Cheng Zx, Wang YW, Mu M, Wang Sj, et al. (2012) dihydroartemisiniini Parantaa Apo2L /TRAIL-välitteistä apoptoosia in haimasyöpäsoluissa kautta ROS-välitteisen Up-asetus Death Receptor 5. PLoS ONE 7 (5): e37222. doi: 10,1371 /journal.pone.0037222

Editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 15 huhtikuu 2012; Julkaistu: toukokuu 30, 2012

Copyright: © 2012 Kong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustuksia säätiön ensimmäisen Affiliated sairaala Harbin Medical University (2011BS007), National Science Foundation for Post-doc tutkijat Kiinassa (20110491109) ja Research Foundation of Education Bureau of Heilongjiangin maakunnassa, Kiina ( 12511246). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on yksi kaikkein vaarallisin ruoansulatuskanavan pahanlaatuisten kasvainten, ja on erittäin huono ennuste [1], [2]. Tavanomainen kemoterapia on osoittanut rajallinen eloonjäämishyötyä yhdistettynä kirurginen resektio [3]. Siten tehokas hoito strategiaa haimasyöpä tarvitaan kiireesti.

Artemisiinipohjaisten (vaikuttava aine Kiinan lääkkeiden yrtti, Artemisia annua [4], [5]) ja sen johdannaiset ovat erittäin tehokkaita malarialääkkeitä muutamaa haitallisia sivuvaikutuksia [6]. Dihydroartemisiniini (DHA), johdannainen artemisiinin, on enemmän vesiliukoinen ja tehokas malarian kuin artemisiniinin [7]. Viime aikoina on osoitettu, että DHA tappaa tehokkaasti erityyppisiä syöpäsoluja [8] – [13]. Lisäksi olemme päättäneet, että DHA voi merkittävästi estävät solujen kasvua ja indusoivat apoptoosin haiman syöpäsoluissa ja ajasta riippuvaisella tavalla, mutta on olennaisesti myrkytön normaaleihin soluihin [9]. Aiemmissa tutkimuksissa, Agtmael [14] ja O’Neill PM [5] osoitti, että artemisiinipohjaisten sisältää endoperoxide silta, joka on välttämätön reaktion raudan kanssa muodostaen reaktiivisen hapen (ROS). Lisäksi on osoitettu, että syöpäsolut vievät lisääntynyt määriä rautaa tuottamaan suurempia solunsisäisen ROS kuin löytyy normaaleissa soluissa [15]. Näin ollen on todennäköistä, että teho DHA syöpäsoluja vastaan ​​liittyy sukupolven ROS [16], mutta varsinainen mekanismi DHA vaikutusmekanismi on tuntematon.

Apo2-ligandin tai tuumorinekroositekijä-sukuinen apoptoosia aiheuttavien ligandi (Apo2L /TRAIL) on jäsen TNF-superperheen, joka toimii tehokkaana syöpälääke johtuen sen syöpäsolun erityispiirteet ja voimakas antituumorivaikutus. Apo2L /TRAIL indusoi apoptoosin syöpäsoluissa vuorovaikutusten kautta kuolema reseptorin 4 (DR4) ja DR5, jotka muodostavat kuoleman aiheuttavia signaalin kompleksi (DISC) sitoutumalla FADD ja kaspaasi-8 tai kaspaasi 10 [17] – [19] . Levy ja puolestaan ​​aloittaa proteaasin kaskadi, joka aktivoi alavirtavaikuttajainhibiittorit caspases, kuten kaspaasi-3. Lisäksi monet apoptoosiin liittyviä proteiineja alavirtaan syöttämällä reseptorien, kuten kaspaasi-6, kaspaasi-7, ja kaspaasi-9, osallistuvat Apo2L /TRAIL: n indusoiman apoptoosin [20]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että terpenoids voi ajan säätelemään DR4 ja /tai DR5: n ihmisen syöpäsoluja [12], [20], [21]. Siten aineet, jotka voivat säätää ylös Apo2L /TRAIL-reseptorien ja alas-säädellä antiapoptoottisten proteiinit on mahdollisuuksia parantaa apoptoottista vaikutusta Apo2L /TRAIL. Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet vaikutuksen määrittämiseksi DHA Apo2L /TRAIL: n indusoiman apoptoosin haiman syöpäsoluissa. Tuloksemme osoittavat, että DHA voi voimistaa apoptoottisen vaikutuksia Apo2L /TRAIL kautta lisäävä säätely DR5 ilmentymisen ihmisen haimasyövän soluja.

Tulokset

DHA ja Apo2L /TRAIL synergistisesti kasvua estäviä haimasyöpäsoluissa

Voit selvittää, DHA ja Apo2L /TRAIL vaikuttavat synergistisesti kasvua estäviä haimasyöpäsoluissa mittasimme solujen elinkykyä in BxPC-3 ja PANC-1 solulinjojen vastauksena eri hoito-ohjelmia. Annoksesta riippuvaa kasvun estämistä ei havaittu, kun BxPC-3-soluja käsiteltiin joko DHA (0-100 umol /l) tai Apo2L /TRAIL (0-200 ng /ml) yksinään (kuvio 1A vasemmalla). Kuitenkin hoito suuremmilla annoksilla DHA ja Apo2L /TRAIL yhdistettynä (50 mikromol /l ja 100 ng /ml, vastaavasti ja 6 umol /l ja 200 ng /ml, vastaavasti) johti voimakkaampi kasvu esto kuin hoito joko yhdisteen yksinään (kuvio 1A vasemmalla). Määrittämiseksi tarkemmin vaikutukset yhdistelmähoitoa, data tutkittiin käyttämällä mediaanivaikutus analyysi määrittää tyypin vuorovaikutusten tapahtuneen, so antagonismia (CI 1), additiivisuuteen (CI = 1) tai synergiaa (CI 1). Synergistinen vaikutus (CI 1) havaittiin yhdistelmähoito (kuvio 1A oikealla). Samoin viittaavia synergistinen vaikutus DHA: n ja Apo2L /TRAIL solun kasvuun havaittiin PANC-1-soluissa (tietoja ei esitetty).

(A) Soluja käsiteltiin DHA yksin, Apo2L /TRAIL yksinään tai näiden kahden yhdistelmä aineita ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 72 tuntia. Elinkelpoisuuden solujen arvioitiin käyttäen MTT-menetelmällä. Yhdistelmä-indeksi (CI) vs. fraktion (Fa) tontteja saatu mediaani-vaikutus analyysin Chou-talalay. CI 1 osoittaa antagonismia, = 1 osoittaa additiivisuuteen, ja 1 tarkoittaa synergiaa. (B) toinen klonogeeniset määritys suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Solut käsiteltiin DHA (50 umol /l) yksinään, Apo2L /TRAIL (100 ng /ml) yksinään tai näiden kahden yhdistelmä lääkkeiden 24 tuntia ja pestiin PBS: llä. Sitten soluja inkuboitiin vielä 7 vrk, ja värjättiin kristallivioletilla. (C) klonogeeninen eloonjääminen on esitetty prosentteina elossa muodostuneiden pesäkkeiden huumeiden-käsitellyissä soluissa suhteessa käsittelemättömiin soluihin.

Seuraavaksi teimme klonogeenisten sen määrittämiseksi, onko DHA parantaa vaikutusta Apo2L /TRAIL pitkän aikavälin pesäkkeiden muodostumista. Solut käsiteltiin DHA (50 umol /l) ja Apo2L /TRAIL (100 ng /ml) joko yksinään tai yhdessä 24 tuntia. Sitten solut pestiin PBS: llä, inkuboitiin tuoreessa elatusaineessa ja seitsemän päivää myöhemmin, värjättiin kristallivioletilla. Klonogeeniset määritys osoitti, että elossa olevien pesäkkeiden määrä ryhmässä, joka sai samanaikaisesti DHA ja Apo2L /TRAIL oli huomattavasti pienempi kuin potilailla, joita hoidettiin DHA tai Apo2L /TRAIL yksinään. Nämä tulokset osoittavat, että yhdistetty hoito DHA ja Apo2L /TRAIL vähensi merkittävästi sukusolujen (kuvio 1 B ja 1 C).

DHA parantaa Apo2L /TRAIL: n indusoiman apoptoosin riippuvainen reaktiivisia happiradikaaleja

sen määrittämiseksi, kyky DHA parantaa sytotoksisuuden Apo2L /TRAIL välitti ROS: n indusoiman apoptoosin, käytimme virtaussytometrillä ja laser skannaus konfokaalimikroskopialla mitata apoptoosin ja solunsisäisten ROS BxPC-3 ja PANC- 1-soluissa.

BxPC-3 ja PANC-1-soluja käsiteltiin DHA (50 umol /l) ja /tai Apo2L /TRAIL (100 ng /ml). Seuraavat 72 h hoidon jälkeen solut värjättiin anneksiini V: n ja propidiumjodidin (PI), suoritettiin virtaussytometria ja tarkastella laserkeilauksella konfokaalimikroskopialla mitata apoptoosin. Edustavia histogrammit päässä virtaussytometrialla kokeet osoittavat, että hinnat apoptoosin hallinnan BxPC-3 soluja ja soluja käsiteltiin DHA, Apo2L /TRAIL tai molempia oli 5,1%, 29,4%, 15,5% ja 47,8%, tässä järjestyksessä (kuva 2A ). Mitä tulee PANC-1-soluissa, hinnat apoptoosin oli 6,7%, 18,6%, 11,9% ja 45,8%, tässä järjestyksessä. Siten käsittely DHA tai Apo2L /TRAIL yksinään merkittävästi nopeuttanut apoptoosin BxPC-3-soluissa kontrolleihin verrattuna (molemmat

P

0,05). Lisäksi hoito yhdistelmällä DHA ja Apo2L /TRAIL johti edelleen määrää on lisättävä apoptoosin verrattuna hoidon DHA tai Apo2L /TRAIL yksinään (molemmat

P

0,01). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin PANC-1-soluja. Laajuus apoptoosin, havaittuna anneksiini V merkintöjä, approksimoi väheneminen solujen elinkelpoisuuden hoidon jälkeen DHA, Apo2L /TRAIL tai molempia, mikä viittaa siihen, että apoptoosin käytetään useimmissa havaitun sytotoksisuuden. Kuitenkin, esikäsittely N-asetyylikysteiini (NAC, 10 mM), kykeni merkittävästi vähentää aiheuttaman apoptoosin yhdistetty hoito DHA: n ja Apo2L /TRAIL BxPC-3 ja PANC-1-soluja (molemmat

P

0,01). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että ROS välittää kyky DHA parantaa Apo2L /TRAIL: n indusoiman apoptoosin. Laserin skannaus konfokaalimikroskopialla vahvisti lisääntynyttä apoptoosia mitattuna virtaussytometrialla, kuten on esitetty tyypillinen valokuvat (kuvio 2B). BxPC-3 ja PANC-1-soluja käsiteltiin DHA ja Apo2L /TRAIL näkyy enemmän lukuisia varhaisen ja myöhäisen vaiheen apoptoottiset solut kuin kontrollit, joka oli hyvin vähän alkuvaiheen apoptoottisia soluja.

(A) Apoptosis haiman syöpäsoluja. BxPC-3 ja PANC-1-soluja käsiteltiin DHA (50 umol /l) ja Apo2L /TRAIL (100 ng /ml), kuten on osoitettu. Virtaussytometria suoritettiin apoptoosin mittaamiseksi hinnat (%). Merkittävä kasvu apoptoosin nopeus verrattuna kontrolliryhmään merkitään ”*” (

P

0,05), merkittävää kasvua verrattuna DHA- tai Apo2L /TRAIL-käsitellyissä soluissa merkitään ”†” (

P

0,01), ja merkittävä lasku verrattuna DHA + Apo2L /TRAIL-käsitellyissä soluissa merkitään ”‡” (

P

0,01). Edustavia histogrammit alkaen cytometrically analysoidaan BxPC-3 ja PANC-1-solut käsiteltiin kontrolli, DHA, Apo2L /TRAIL, DHA + Apo2L /TRAIL tai NAC (10 mM). (B) Laserskannaus konfokaalimikroskopialla soluja. Edustavia valokuvia otettiin valvonnan BxPC-3 ja PANC-1-soluja ja BxPC-3 ja PANC-1-solut käsiteltiin DHA + Apo2L /TRAIL: n ja DHA + Apo2L /TRAIL + NAC. (C) Solunsisäiset ROS mitattuna in vitro. BxPC-3 ja PANC-1-soluja käsiteltiin DHA (50 umol /l), Apo2L /TRAIL (100 ng /ml), DHA + Apo2L /TRAIL, tai esikäsitelty NAC (10 mM), ja sitten käsiteltiin DHA + Apo2L /TRAIL 6 tuntia. Käsittelemättömät solut toimi kontrollina. Soluja inkuboitiin DCFHDA ja alistetaan sitten virtaussytometrialla mitata Solunsisäiset ROS, jota edustaa DCF fluoresenssi. Merkittävä kasvu DCF fluoresenssi verrattuna kontrolliryhmään merkitään ”*” (

P

0,05), joka on erittäin merkittävä ero verrattuna kontrolliryhmään merkitään ”**” (

P

0,01), ja vähennetään merkittävästi verrattuna DHA + Apo2L /TRAIL hoitoa merkitään ”†” (

P

0,05). (D) edustaja valokuvat näkyvät DCFHDA-värjättyjen solujen havaittiin Laserskannauksella konfokaalimikroskopia. Vihreä fluoresenssi edustaa solunsisäisen ROS. (E) keskimääräinen fluoresenssi-intensiteetti mitattiin varten DCFHDA-värjättyjen solujen ja vastaavat 3-ulotteinen vaakatasossa kuvat tuotettiin laserkeilauksella konfokaalimikroskopialla. Merkittävä ero valvonta merkitään ”*” (

P

0,01), ja merkittävä ero DHA + Apo2L /TRAIL hoitoa merkitään ”†” (

P

0,05).

BxPC-3 ja PANC-1-soluja inkuboitiin DHA (50 umol /l), Apo2L /TRAIL (100 ng /ml) tai molempia 12 h, ja DCF fluoresenssi kirjattiin mittana solunsisäisten ROS tasoilla. Kuten kuviossa 2C on esitetty, tasot solunsisäisen ROS olivat merkitsevästi (

P

0,01) korkeampi soluissa, jotka oli käsitelty DHA ja yhdistelmä DHA: n ja Apo2L /TRAIL kuin kontrollisoluissa. Kuitenkin, Apo2L /TRAIL hoito yksinään oli vähäinen vaikutus solunsisäisten ROS tasoilla BxPC-3 ja PANC-1-soluja. Sen vahvistamiseksi, että ROS: n syntyminen on vastuussa parantaa Apo2L /TRAIL: n indusoiman apoptoosin, soluja esikäsiteltiin 10 mM NAC, tunnettu inhibiittori ROS, 6 tuntia ja sitten inkuboitiin yhdistelmä DHA ja Apo2L /TRAIL. Laserkeilaus tulokset osoittavat, että esikäsittely NAC merkitsevästi (

P

0,05) alensi solunsisäisten ROS kaikissa solutyypeissä verrattuna soluihin käsitelty DHA ja Apo2L /TRAIL yksinään. Konfokaalimikroskopia yhdistettynä DCFHDA värjäystä, jossa vihreän fluoresenssin edustaa solunsisäisen ROS (kuvio 2D), osoitti, että solunsisäinen ROS oli merkitsevästi (

P

0,01) korkeampi DHA-käsitellyissä soluissa kuin verrokeilla soluissa. Kuitenkin, esikäsittely NAC merkitsevästi (

P

0,05) alensi keskimääräistä fluoresenssi-intensiteetti on DHA- ja Apo2L /TRAIL-käsitellyissä soluissa (kuvio 2E).

DHA säätelee apoptoosia liittyviä geenin ilmentymisen

Seuraavaksi analysoimme ilmentyminen apoptoosin liittyvien geenien välittämää ROS-hoidon jälkeen DHA. BxPC-3 ja PANC-1-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla DHA (0, 25, 50 ja 100 umol /l) tai esikäsiteltiin NAC (10 mM), minkä jälkeen lisättiin DHA (100 umol /l) 72 tuntia ja ekspressiotasot Bcl-2, Bax, elossa, kaspaasi-3, kaspaasi-8 ja kaspaasi-9 havaittiin western blot -analyysillä. Vastauksena DHA, ilmentymistasojen Bax, kaspaasi-3, kaspaasi-8 ja kaspaasi-9 olivat merkittävästi säädelty, kun taas Bcl-2: n ilmentymisen väheni annoksesta riippuvaisella tavalla, ja surviviinin ilmentymiseen pysyi muuttumattomana BxPC-3 ja PANC-1-soluja. Mielenkiintoista on, että esikäsittely NAC (10 mM) esti kyky DHA ajan säätelemään kaspaasin 8, Bax, kaspaasi-9 ja kaspaasi-3. Todettiin myös, että DHA merkittävästi parannettu Apo2L /TRAIL-välitteistä apoptoosia sekä solulinjoissa, ja tämä korreloi lisääntyneeseen kaspaasi-8, Bax, kaspaasi-9 ja kaspaasi-3 (kuvio 3).

BxPC-3 ja PANC-1-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla DHA (0, 25, 50, 100 umol /l) ja esikäsitelty NAC seurasi DHA (100 umol /l) 72 tuntia. Koko solu-uutteet valmistettiin ja analysoitiin western-blottauksella käyttämällä vasta-aineita vastaan, Bcl-2, Bax, elossa, kaspaasi-3, kaspaasi-8 ja kaspaasi-9. DHA merkittävästi sääteli ilmaisua Bax, kaspaasi-3, kaspaasi-8 ja kaspaasi-9, ja alassäädetty ilmaus Bcl-2. Kuitenkin DHA oli vähän vaikutusta surviviinin ilmentymiseen. DHA NAC (10 mM), esikäsittelyä ei ole ajan säätelemään kaspaasin 8, Bax, kaspaasi-9, ja kaspaasi-3. β-aktiini toimi sisäisenä kontrollina.

DHA aiheuttama säätely ylöspäin DR5 riippuu reaktiivisia happiradikaaleja

seuraava tutki ROS oli mukana DHA aiheuttaman DR5 ilmaisu. BxPC-3 ja PANC-1-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla DHA: ta, 48 h, koko solu-uutteet valmistettiin ja DR5-proteiinin tutkittiin. Olemme havainneet, että DHA oli annoksesta riippuvainen vaikutuksia DR5 (kuvio 4A). Niinpä pyrittiin määrittämään, onko sukupolven ROS liittyy suoraan kyky DHA aiheuttaa DR5 ilmentymisen. FACS havaitseminen osoitti, että hoito BxPC-3 ja PANC-1 DHA solunsisäinen ROS-tasojen annoksesta riippuvaisella tavalla, ja DHA-indusoitu kasvu ROS tasoilla merkittävästi estetty esikäsittely 10 mM NAC (kuvio 4B). Tärkeää on, esikäsittely NAC merkittävästi esti DHA-indusoidun up-regulation of DR5 ilmentymisen (kuvio 4A).

(A) BxPC-3 ja PANC-1-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella DHA: ta, 48 h . Koko solu-uutteet valmistettiin ja analysoitiin DR5 ilmentymistä käyttäen western-blottauksella. DHA oli annoksesta riippuvaa vaikutuksia DR5. DHA-indusoitu kasvu DR5 tasojen merkittävästi estetty esikäsittely 10 mM NAC. p-aktiini toimi sisäisenä kontrollina. (B) Solut kerättiin ja analysoitiin käyttäen virtaussytometrialla. Lisääntyi asteittain fluoresenssi havaittiin soluissa, joita käsiteltiin 25, 50 ja 100 umol /l DHA, vastaavasti, mikä osoittaa annoksesta riippuva nousu tuotannon ROS vasteena DHA hoidon kahdessa solulinjassa. Tuotanto ROS inhiboitui merkittävästi esikäsittelemällä soluja NAC (10 mM). (C) Soluja käsiteltiin DHA (50 umol /l) yksinään, Apo2L /TRAIL (100 ng /ml) yksinään tai näiden kahden yhdistelmä aineita. Solut käsiteltiin myös NAC (10 mM) yksin tai esikäsitelty NAC ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 72 tuntia. Elinkelpoisuuden on solujen arvioitiin käyttäen MTT-menetelmällä ja elinkykyisyysindeksiä (%) laskettiin. Merkittäviä eroja on merkitty ”*” (

P

0,01).

seuraava tutki huuhteluilman ROS voisi vaimentaa Apo2L /TRAIL-solukuolema tehostaa DHA . Kuten on esitetty kuviossa 4C, DHA tehosti merkittävästi Apo2L /TRAIL-indusoidun solukuoleman BxPC-3 ja PANC-1-soluja. Kuitenkin esikäsittely NAC vähensi kykyä DHA aiheuttaa solukuoleman 63%: sta 14%: in BxPC-3-solujen ja 31%: sta 17%: in PANC-1-soluissa. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ROS-välitteisen up-regulation DR5 on kriittinen havaitun DHA lisälaite Apo2L /TRAIL: n indusoiman apoptoosin.

Apo2L /TRAIL: n indusoiman apoptoosin välittyy DHA-säänneltyjen DR5 ilmaisu

tutki myös DHA välittämä DR5 ilmentymistä tarvitaan Apo2L /TRAIL: n indusoiman apoptoosin haiman syöpäsoluissa. Voit selvittää roolin DR5 Apo2L /TRAIL: n indusoiman apoptoosin, käytimme siRNA alas-säädellä DR5 ilme. Olemme ensi tutkinut, tukahduttamista DR5 siRNA voi kumota herkistävät vaikutukset DHA Apo2L /TRAIL-solukuolema. Solujen transfektio DR5 siRNA lisäsi elinkelpoisuuden BxPC-3-solujen 47% (

P

0,01) ja elinkelpoisuus PANC-1-solujen 42%: lla (tuloksia ei ole esitetty), verrattuna yhdistelmän hoito yksinään (kuvio 5); hoidon ohjaus siRNA ei ollut mitään vaikutusta (kuvio 5). Nämä tulokset osoittavat siis, että vaikutus DHA Apo2L /TRAIL: n indusoiman apoptoosin oli tehokkaasti poistettu solut, jotka transfektoitiin DR5 siRNA, joka osoittaa, että DR5 on tärkeä välittäjäaine Apo2L /TRAIL: n indusoiman apoptoosin.

BxPC-3 ja PANC-1-solut transfektoitiin DR5 siRNA ja ohjaus siRNA, joko yksin tai yhdistelmänä. 48 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin 50 umol /l DHA: ta, 24 h, ja kokosolu-uutteet altistettiin western blotting testaamiseksi DR5. Solujen transfektio siRNA kohdistaminen DR5 erityisesti tukkinut DR5. Solut ympättiin kammion dia ja transfektoitu siRNA. 48 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin 50 umol /L DHA, 100 ng /ml Apo2L /TRAIL, joko yksinään tai yhdistelmänä, ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa 72 tuntia. Elinkelpoisuuden solujen arvioitiin käyttäen MTT-menetelmällä, ja elinkykyisyysindeksiä (%) laskettiin. Hiljentäminen DR5: tä siRNA vähentää sytotoksista vaikutusta yhdistelmän DHA: n ja Apo2L /TRAIL, mutta ei DHA yksin. Merkittäviä eroja on merkitty ”*” (

P

0,01).

DHA ja Apo2L /TRAIL merkittävästi estää kasvun ihmisen haimasyövän soluja

in vivo

vaikutuksen tutkimiseksi DHA ja /tai Apo2L /TRAIL solujen kasvuun

in vivo

, BxPC-3-soluja ihon alle ksenosiirrettyjä nude-hiirissä. Kumpikaan DHA eikä Apo2L /TRAIL ryhmät osoittivat merkittävä väheneminen kasvaimen tilavuuden verrattuna kontrolliryhmään (

P

0,05). Kuitenkin hiiret, joita käsiteltiin yhdistelmällä DHA ja Apo2L /TRAIL oli kasvaimia, jotka olivat paitsi huomattavasti pienempi kuin kontrolli (

P

0,01), mutta olivat myös pienemmät kuin hoidettiin joko aineen yksinään (

P

0,05), mikä osoittaa korkeampi vaimennus kasvaimen kasvuun

in vivo

(kuva 6A ja B). Western blot-analyysi kasvainkudoksen lysaatit paljasti myös, että ekspressiotasot DR5, kaspaasi-3 ja kaspaasi-8 olivat merkittävästi säädellään ylöspäin käsitellyssä ryhmässä yhdistelmähoito ja vielä enemmän, kuin potilailla, joita hoidettiin joko DHA tai Apo2L /TRAIL yksinään (kuvio 6C). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​meidän

in vitro

tutkimuksissa, jotka tarjoavat lisätodiste siitä, että DHA voi voimistaa antituumorivaikutuksen Apo2L /TRAIL

in vivo

.

(A) BxPC- 3 kasvaimet perustettiin ihonalaisesti hiirissä. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet noin 120 mm

3 volyymin, hiiret satunnaistettiin ohjaus, DHA, Apo2L /TRAIL, tai DHA + Apo2L /TRAIL ryhmiä ja käsitellään kuten on kuvattu menetelmät jaksossa. Koot (mitattu mm

3) kasvainten seurattiin ja kirjattiin. Merkittävä ero kasvaimen tilavuuden ohjauspaneelista merkitään ”*” (

P

0,05), ja vähennetään merkittävästi verrattuna DHA tai Apo2L /TRAIL-käsiteltyjen kasvainten merkitään ”**” (

P

0,01). (B) edustaja eläimiä ja kasvaimet näkyvät kullekin ryhmälle. (C) Kasvaimet verrokkihiiristä ja hiirille on DHA, Apo2L /TRAIL, ja DHA + Apo2L /TRAIL homogenisoitiin ja suoritettiin Western blot analyysin ekspression havaitsemiseksi kaspaasi-3 ja kaspaasi-8. p-aktiini toimi sisäisenä kontrollina. (D) analyysi leviämisen merkki PCNA immunohistokemiallisesti ja apoptoottinen tila kasvainsolujen in situ TUNEL määrityksessä. PCNA positiivinen (E) ja TUNEL-positiivisia (F) solut lasketaan myös mikroskoopilla laskea leviämisen indeksin ja apoptoottisten indeksi, vastaavasti. ”*”:

P

0,05 verrattuna kontrolli. ”**”:

P

0,01 verrattuna ainoana lääkkeenä.

Solulisääntyminen merkki PCNA ja solujen apoptoosin tutkittiin edelleen

in situ

kasvaimen näytteitä neljään ryhmään. Kuten kuviossa 6D ja E, DHA tai Apo2L /TRAIL: käsitellyissä ryhmissä oli alennettu ilmentyminen PCNA verrattuna kontrolliin ryhmään (

P

0,05). Vaikka hiiret hoidettiin yhdistelmällä DHA ja Apo2L /TRAIL oli ilmaus PCNA joka oli paitsi alempi kuin kontrolli (

P

0,01), mutta oli myös pienempi kuin kummallakaan aineella käsiteltyjen yksinään (

P

0,05). Mono-hoitoa joko DHA tai Apo2L /TRAIL merkitsevästi korkeampi apoptoosin kuin kontrolli (

P

0,05), kun taas yhdistetty hoito tuotti vieläkin apoptoosin paitsi kuin kontrolli (

P

0,05, kuvio 6D ja F).

keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitamme että DHA, puolisynteettinen johdannainen artemisiinipohjaisten, voi parantaa apoptoottista vaikutusta Apo2L /TRAIL vastaan ​​haiman syöpäsoluja. DHA vaikuttaa synergistisesti Apo2L /TRAIL estää proliferaatiota ja indusoi apoptoosin kautta ROS-välitteisen säätely ylöspäin DR5 sekä BxPC-3 ja PANC-1-soluissa. Lisäksi osoitimme, että DHA voi herkistää haimasyöpäsoluissa Apo2L /TRAIL käsittely

in vivo

.

Soluble Apo2L /TRAIL, joka on nousemassa houkuttelevana syöpälääke, on arvioitu useissa kliinisissä tutkimuksissa. Kuitenkin, monet raportit viittaavat siihen, että suurin osa haimakarsinooma solulinjat ovat resistenttejä Apo2L /TRAIL: [22] – [25]. Syöpäsolujen vastustuskyky Apo2L /TRAIL on yksi suurimmista esteistä edelleen hyödyntämiseen tämän hoidon. Siten aineet, jotka voivat joko voimistaa Apo2L /TRAIL tai vastustus tarvitaan pikaisesti [26]. Tavoitteet Tämän tutkimuksen onko yhdistäminen DHA Apo2L /TRAIL voisi edistää synergistinen antituumorivaikutuksen ja ymmärtää tarkkaa mekanismia, jolla yhdistelmähoitoa käyttävät näitä aineita nostattaa haimasyöpä solukuoleman

in vitro

ja

in vivo

.

Vaikka monet kasvaimet näyttää jonkin verran vastustuskykyä Apo2L /TRAIL kliinisissä tutkimuksissa, kasvava määrä tiedot osoittavat, että Apo2L /TRAIL voi valikoivasti tappaa syöpäsoluja vahingoittamatta normaalit solut, jotka voivat lievittää monia sivuvaikutuksia tavanomaisten kemoterapia. Erityisesti, monet raportit ovat osoittaneet, että jotkin kasviuutteita ja kemoterapeuttiset aineet voivat herkistää syöpäsolut Apo2L /TRAIL-indusoitua solukuolemaa [17], [26] – [29], mikä osoittaa, että Apo2L /TRAIL resistanssi voidaan voittaa käyttämällä tehokas sensitizers. Äskettäin DHA on osoitettu omaavan merkittäviä antituumorivaikutukset joko yksin tai yhdessä kemoterapeuttisten aineiden kanssa mahdollisimman vähän toksisuutta isännälle vastaan ​​erilaisia ​​syöpä

in vitro

ja

in vivo

[8] – [ ,,,0],10], [30] – [32]. Samaan aikaan vaikutus DHA vastaan ​​haimasyöpä on vahvistettu edellisessä tutkimuksessa [9], [30]. On kuitenkin epävarmaa, DHA ja Apo2L /TRAIL toimivat synergistisesti vastaan ​​haimasyöpä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että yhdistelmä DHA: n ja Apo2L /TRAIL aiheutti huomattavasti enemmän kasvun inhibitio BxPC-3 ja PANC-1-solut

in vitro

kuin silloin, kun joko ainetta käytettiin yksinään. Tuloksemme osoittavat, että DHA voi synergisesti parantaa Apo2L /TRAIL-välitteisen sytotoksisuuden ja herkistää ihmisen haimasyövän solulinjoissa Apo2L /TRAIL: n indusoiman apoptoosin.

Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että ROS sukupolvi on mukana Apo2L /TRAIL-välitteisen apoptoosin [33], [34]. ROS on myös yleisesti hyväksytty liittyvän kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeitä, vaikka tämä korrelaatio on usein monimutkaisia ​​ja ristiriitaisia ​​[35]. Itse asiassa useimmat syöpälääkkeiden on vakiintuneet vaikutusmekanismeja, joihin liittyy sukupolven ROS [36]. Syöpäsoluissa, lääkkeen aiheuttama oksidatiivinen stressi superponoi luontaisia ​​oksidatiivisen stressin, mikä johtaa voimakas ROS-välitteisen sytotoksisen vasteen, joka edullisesti tappaa kasvainsoluja tai estää niiden leviäminen [37]. Endoperoxide sillan artemisiinipohjaisten reagoi solunsisäisten raudan tuottaa vapaita radikaaleja, jotka voivat johtaa makromolekyyliyhdisteisiin vaurioita ja solukuolemaa [38], [39]. DHA, johdannainen artemisiniinin, on osoitettu aiheuttavan kuolemaan ihmisen papilloomaviruksen-ilmentäviä solulinjoja indusoimalla oksidatiivisen stressin, joka johtaa sukupolven ROS [8]. Viimeaikainen työ on myös osoittanut, että viljellyissä ihmisen metastaattinen melanooma solut ovat herkkiä DHA: n indusoiman apoptoosin ja näyttelytila ​​ylössäätöä solun oksidatiivisen stressin, fosfatidyyliseriini ulkoistamista prokaspaasi-3 pilkkominen [40]. Tutkimuksessamme havaitsimme, että Solunsisäiset ROS kasvoi merkittävästi, DHA hoidon läsnä ollessa ja ilman Apo2L /TRAIL, kun taas käsittely Apo2L /TRAIL yksinään oli vähän vaikutusta solunsisäiseen ROS BxPC-3 ja PANC-1-soluja. Olemme myös havainneet, että kyky DHA parantaa Apo2L /TRAIL: n indusoiman apoptoosin voidaan vaimentaa esikäsittely NAC. Näin ollen meidän tuloksemme aikaansaada uusi mekanismi, jonka DHA voi toimia synergistisesti Apo2L /TRAIL käyttämään niiden yhdistetty pro-apoptoottisia vaikutuksia haimasyövän, ainakin osittain läpi ROS: n syntyminen. Paksusuolen syöpäsoluja, indusoiman apoptoosin Apo2L /TRAIL yksinään säädellään myös sukupolven ROS [41].

kaksi ensisijaista reittien tiedetään aloittaa solujen apoptoosin: kuoleman reseptori aiheuttama, ulkoinen tie ja luontainen, mitokondrio-reitin [42], [43]. Olemme aiemmin raportoitu, että DHA voisi laukaista mitokondrion polku indusoida apoptoosia ekspressiota sääteleviä Bcl-2: n ja Bax, mikä vapauttaa sytokromi c: n päässä mitokondrioissa ja aktivoi alavirran initiaattori kaspaasi-9, jolloin aktivointi efektori kaspaasit ja apoptoosin induktion [44]. Kuitenkin, useat tutkimukset ovat osoittaneet, että Apo2L /TRAIL vastus syöpäsolulinjoissa sisältää ekspression anti-apoptoottisen proteiinin c-FLIP ja down-regulation of pro-apoptoottista proteiinia, kaspaasi-8 [20], [27], [45 ]. Jotkut kemoterapeuttiset aineet, mukaan lukien zerumbone [20] ja garcinol [27], voidaan merkittävästi alas-säätelemään c-FLIP ja /tai ylös-säätelemään kaspaasin 8 kautta ROS lisätä herkkyyttä solujen Apo2L /TRAIL . On tunnettua, että kaspaasi-8 on suora alavirrassa oleva kohde DR5, ja pro-kaspaasi-8 rekrytoi -levy kaspaasin 8, jolloin aktivointi alavirtavaikuttajainhibiittorit kaspaasien [46]. Tutkimuksessamme DHA up-regulation kaspaasi-8 ilmentymisen annoksesta riippuvaisella tavalla aloittaa solujen apoptoosin. Osoitamme myös, että DHA moduloi DR5 annoksesta riippuvaisella tavalla, ja että lisääntynyt DR5 liittyy havaittuun muutoksia oksidatiivisen stressin. Tuloksemme osoittavat, että ROS on yksi ylävirran säätävät vastuussa DHA-välitteisen DR5- ja että DHA voi voimistaa Apo2L /TRAIL-indusoidun apoptoosin kautta ulkoisen syöttämällä-reseptorin reittejä. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​raportoitu aikaisemmassa tutkimuksessa [20]. Ylikuuluminen näiden kahden reitin johtuu todennäköisesti kaspaasi-8–välitteisen pilkkomisen Bid ja sen myöhemmissä translokaation mitokondriot, jossa se aloittaa luontainen apoptoosireittiä [28]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että sen lisäksi, että mitokondrion-välitteisen apoptoottisia reittejä, DHA-riippuvainen ROS: n syntyminen on myös keskeinen rooli on synergistinen parannus Apo2L /TRAIL: n indusoiman apoptoosin kautta ulkoisen syöttämällä-reseptorin reittejä haiman syöpäsoluissa .

Täällä me käytetty onnistuneesti ROS raadonsyöjä, NAC, estää oksidatiivista stressiä.