Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sykliinistä riippuvaisen kinaasin 5 (CDK5) on sytoplasminen seriini /treoniini-kinaasi. Knockdovvn CDK5 lisää paklitakselin herkkyyttä ihmisen munasarjasyövän soluja. Tutkimuksessa tarkastellaan mekanismeja, joilla CDK5 säätelee paklitakselin herkkyys ihmisen munasarja- syöpiä. Useita munasarjasyövän solulinjoissa ja ksenograftit hoidettiin CDK5 Sirna (siRNA) kanssa tai ilman paklitakselin tutkia vaikutusta syöpäsolujen elinkelpoisuuden solusyklin pysähtymiseen ja kasvaimen kasvua. CDK5 proteiini mitattiin immunohistokemiallisella värjäyksellä munasarjasyöpäsolu kudos microarray korreloivan CDK5 ilmaisutapoja yleistä potilaan selviytymistä. Knockdovvn CDK5 siRNA: illa estää aktivoinnin AKT joka merkittävästi korreloi vähentynyt solujen kasvua ja lisää paklitakselin herkkyyttä munasarjasyövän solulinjoissa. Lisäksi CDK5 pudotus yksinään ja yhdistettynä paklitakseliin aiheuttama G1 solusyklin pysähtymiseen ja kaspaasi 3 riippuvaista apoptoottista solukuolemaa liittyvät translaation jälkeisen ylösajon ja ydinvoiman translokaation TP53 ja p27

Kip1 sekä TP53-riippuvaisen transkription induktio p21

CIP1 villityypin TP53 syöpäsoluja. Hoito HEYA8 ja A2780 villityypin TP53 vierassiirrännäiset nu /nu -hiirten kanssa CDK5 siRNA ja paklitakselin tuotetaan merkittävästi suurempia kasvun estäminen kuin jompikumpi hoito yksinään. Lisääntynyt ilmentyminen CDK5 ihmisen munasarjasyöpiä korreloi käänteisesti kokonaiselossaolo. CDK5 moduloi paklitakselin herkkyyttä säätämällä AKT aktivointi, solusyklin ja kaspaasi-riippuvaista apoptoosia. CDK5 inhibitio voi voimistaa paklitakselin vaikutus ihmisen munasarjan syöpäsolujen.

Citation: Zhang S, Lu Z, Mao W, Ahmed AA, Yang H, Zhou J, et al. (2015) CDK5 Säätelee Paclitaxel Herkkyys munasarjasyöpäsoluja moduloimalla AKT Activation p21Cip1- ja p27Kip1 välittämä G1 solusyklin pysähtymiseen ja Apoptosis. PLoS ONE 10 (7): e0131833. doi: 10,1371 /journal.pone.0131833

Editor: Peiwen Fei, Havaijin yliopiston Cancer Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 02 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 6 kesäkuu 2015; Julkaistu: 06 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Anne ja Henry Zarrow Foundation ja laji lahjoja Stuart ja Gayle Lynn Zarrow sekä avustuksia Cancer Prevention and Research Institute Texas RP110-595, National Foundation for Cancer Research, MD Anderson SPORE munasarjasyövässä NCI P50 CA83639, U54 CA151668, UH2 TR000943-01, The RGK Foundation, ja MD Anderson NCI CCSG P30 CA16672 (virtaussytometria ja Research Animal Tuki palvelut). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Yhdysvalloissa vuonna 2014 oli noin 21980 uutta tapausta munasarjasyöpä ja 14270 kuolemista tähän sairauteen, sopusoinnussa paranemisasteella vain 30% kaikissa vaiheissa. Parannettu tulokset voidaan saavuttaa, jos herkkyyttä ensisijainen kemoterapia tehostettiin. Kaksi päätyyppiä epiteelin munasarjasyövän on tunnistettu. Tyyppi I ”huono laatu” syöpiä kasvaa hitaasti ja usein havaitaan varhaisessa vaiheessa. Molekyylitasolla, tyypin I syövät on villin tyypin

TP53

ja ohjaavat aktivoimalla mutaatioita Ras ja eri jäsenten PI3K signalointireitin. Tyypin II ”korkealaatuista” syövät kasvavat nopeammin ja ovat usein diagnosoidaan pitkälle. Laadukas munasarjasyöpiä aineilla mutatoitunut

TP53

sekä usein poikkeavuuksia homologisen rekombinaation korjaus DNA ja ohjaavat lukuisat DNA kopiomäärä poikkeavuuksia, mutta vain hyvin harvoin aktivoimalla mutaatioita. Molemmat munasarjasyövän käsitellään sytoreduktiivisen leikkauksen ja lääkeaineiden yhdistelmä, joka sisältää karboplatiinin ja paklitakselin. Parantaa tehokkuutta paklitakseli munasarjasyövän hoitoon, teimme kinome siRNA kirjasto näytön läsnä ollessa ja puuttuessa paklitakselin tunnistaa kinaasit, jotka säätelevät paklitakseli herkkyys. Knockdovvn CDK5 tehostetun paklitakselin herkkyys [1]. CDK5 tarvitaan riittävään hermosolujen muuttoliike, synapsi muodostumista, ja selviytymistä. Hyperactivation ja CDK5 liittyy vakavia neurodegeneratiiviset sairaudet, mukaan lukien Alzheimerin tauti [2-5]. Äskettäin dysregulaatio CDK5 on yhdistetty maligniteetti, mukaan lukien syövät eturauhasen, haiman, kilpirauhasen, keuhkojen, kohdunkaula, myelooma, ja rintojen [6-13].

Tässä tutkimuksessa olemme havainneet, että CDK5 knockdown estää fosforylaatiota AKT, ja indusoi G1 solusyklin pysähtymiseen, apoptoosin ja suurempi herkkyys paklitakselia munasarjasyövän solulinjoissa. Lisäksi induktio G1 pidätyksen ja apoptoosin CDK5 Knockdown koskee induktion TP53, p21

CIP1 ja p27

Kip1 proteiinia. CDK5 esto saadaan aikaan uusi strategia hallintaan munasarjojen syöpien ja ilman villin tyypin TP53 toiminto.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kulttuureissa

HEI, A2780, CaOV3, ES-2 ja SKOV3 ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa ostettiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). EF021, EF027, OAW42, OC316 ja IGROV1 ystävällisesti toimittanut Dr. Gordon Mills laboratoriossa [14-17], ja kaikki solulinjat varmistettiin STR DNA-sormenjälkien joka tehtiin jonka MDACC Ominaista Cell Line ydin (jota NCI # CA016672). SKOV3- soluja viljelmässä Macoy 5A; OC316, EFO27, EFO21, IGROV1, ES-2, A2780 ja Hey soluja kulttuuri RPMI1640; CaOV3 ja OAW42 soluja viljeltiin DMEM. Kaikki media saatiin Media Valmistelu Core Facility M. D. Anderson Cancer Center. SW626-soluja viljeltiin Leibovitzin L-15 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Kaikki solulinjat testattiin mycoplasma kanssa MycoSensor PCR Assay Kit Stratagene (La Jolla, CA) ja sen havaittiin olevan likaa.

siRNA ja plasmiditransfektiolla

Kaikki solulinjat olivat transfektoitu negatiivinen kontrolli siRNA tai tietyn siRNA avulla DharmaFECT 4 reagenssia (GE Dharmacon, Lafayette, CO). Seosta, jossa oli siRNA (15 nM lopullinen konsentraatio) ja DharmaFECT 4-reagenssia (12,5 nM lopullinen konsentraatio) inkuboitiin 20 minat huoneen lauhkean ennen soluille.

Cell kasvun määritykset

kristalliviolettia määritystä käytettiin arvioimaan kiinnittymisestä riippuvaisten solujen kasvun, kuten aikaisemmin on kuvattu. Lyhyesti, HEY (6 x 10

3) tai A2780 (8 x 10

3) soluja ympättiin kolmena rinnakkaisena 96-syvennyksen soluviljelmälevyihin ja joko kääntää transfektoitiin 24 tuntia negatiivinen kontrolli siRNA tai CDK5 siRNA ja inkuboitiin vielä 48 tuntia tai ilman paklitakselin (3 nM). Solut pestiin PBS: llä, kiinnitettiin 1% glutaraldehydiä, ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) liuotettiin metanoliin. Väriaine, joka värjätään solut maljoilla eluoitiin Sorenson puskurilla (0,9% natriumsitraattia, 0,02 N HCl: lla, ja 45% etanolia), ja sitä mitataan käyttämällä Vmax mikrolevylukijalla (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), jonka aallonpituudella 570 nm.

klonogeeninen määrityksissä

klonogeenisten määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [18]. Lyhyesti, HEI tai A2780-soluja ympättiin 500 ja 800 solua per kuoppa kolmena kappaleena jälkeen transfektoitiin 24 h ja negatiivinen kontrolli siRNA tai CDK5 siRNA varten 14 päivää. Solut kiinnitettiin sitten 1% glutaraldehydiä ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla metanolissa. Pesäkkeitä, joissa on enemmän kuin 30 solusta, laskettiin.

Virtaussytometria

solujen prosenttiosuus sub-G1-vaiheen solusyklin (eli apoptoottisten solujen) on määritetty perustuen suhteelliseen DNA pitoisuus mitattiin virtaussytometrialla, kuten on kuvattu aiemmin [1]. Lyhyesti, HEI solut transfektoitiin 24 h ja negatiivinen kontrolli siRNA tai CDK5 siRNA ja käsiteltiin kanssa tai ilman paklitakselin (3 nM), 24 tuntia ja sitten irrotettiin inkuboimalla 0,05% trypsiini-EDTA: lla, pestiin PBS: llä, ja kiinteä yön yli 70% etanolia. Kiinteä Sitten solut sentrifugoitiin, pestiin, suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi RNaasi A: lla ja propidiumjodidilla (50 ug /ml kutakin) ja inkuboitiin 20 minuutin ajan 37 ° C: ssa varovasti ravistellen. Värjätään solut suodatettiin nailonverkon (41-um huokoskoko) ja analysoitiin Coulter virtaussytometrillä XL-MCL (Coulter Corporation, Miami, FL). Prosenttiosuudet Saharan G1 väestön ja solukierron jakelu määritettiin käyttämällä multicycle ohjelma (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA).

qRT-PCR-analyysi

Solut kerättiin ja yhteensä RNA uutettiin soluista käyttäen RNA: ta on helppo (Qiagen, Str 1 Hilden, 40724Germany) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA puhtaus arvioitiin mittaamalla absorptio 260 nm: ssä (A260) ja 280 nm: ssä (A280). Näytteitä, jotka oli A260 /A280-suhde 1,9-2,1 pidettiin hyväksyttävinä. Eheys RNA määritettiin etidiumbromidivärjäyksellä 18S ja 28S RNA: n geeleissä elektroforeesin jälkeen. RNA pitoisuudet määritettiin absorbanssilla 260 nm (A260). qRT-PCR suoritettiin käyttämällä Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems Incorporated, Foster City, CA) ja SYBR Green Universal PCR Master Mix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), kuten aiemmin on kuvattu [1]. Kokonais-RNA eristettiin Hey transfektoitujen solujen yksittäisten siRNA: t käänteiskopioitiin cDNA käyttämällä cDNA-kittiä (Invitrogen, Carlsbad, CA), ja cDNA altistettiin qRT-PCR arvioida mRNA tasoilla p21Cip, TP53, p27Kip1 Bcl2 ja CDK5. TP53 (VHPS-9498) ja p21Cip (VHPS-1770) alukkeet ostettiin Real Time Alukkeet (Elkins, PA). P27Kip1 alukkeet ovat 5′-GAGTGGCAAGAGGTGGAGAA-3 ’(F) ja 5′-GCGTGTCCTCAGAGTTAGCC-3′ (R), Bcl2 alukkeet ovat 5’-GGAGGATTGTGGCCTTCTTT-3 ’(F) ja 5′-GCCGTACAGTTCCACAAAGG-3′ (R) ja CDK5 alukkeet olivat 5’-ACTCCTACATGGGCAACGAG-3 ’(F) ja 5′-CGTTCTTCAGGTCGGAGAAG-3’ (R). PCR suoritettiin kokonaistilavuudessa 30 ui, joka sisälsi 15 ui 2X yleisen PCR master mix, 3 ui 10 x SYBR Green, 20 uM kutakin eteenpäin ja taaksepäin-aluketta, 50 ng kutakin cDNA-näyte. Monistukset tehtiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä. Lämpökäsittelyyn-olosuhteet olivat seuraavat: 95 ° C 5 minuutin ajan, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C 10 sekunnin ajan, ja 59 ° C: ssa 40 sekunnin ajan. Sulamiskäyrä analyysiä käytettiin kaikkiin alukesarjat jättää epäspesifisen monistuksen ja koostui 95 ° C: ssa 15 sekunnin ajan, 59 ° C 15 sekunnin ajan, minkä jälkeen nostamalla lämpötilaa 1 ° C 2 sekunnin välein, kunnes 95 ° C: ssa, ja sitten 95 ° C 15 sekunnin ajan.

Immunoblot ja immunosaostus

Solut uutettiin lyysipuskurilla (50 mM HEPES, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, pH 4) sisältäviä fosfataasi ja proteaasinestäjät. Proteiinipitoisuus lysaatit määritettiin BCA-proteiinin määritys (Pierce, Rockford, IL). Yhtä suuret määrät kokonaisproteiinia keitettiin näytepuskurissa ja erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) kalvolle (Millipore, Bedford, MA). Membraanit inkuboitiin erityisiä vasta-aineita p-AKT (Cell Signaling, Danvers, MA), p53 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), p27Kip1 (BD Transduction laboratoriossa, Franklin Lakes, New Jersey), p21Cip (Santa Cruz Biotech , Santa Cruz, CA), kaspaasi 3 (solusignalointia, Danvers, MA). Aktiini tai GAPDH (Cell Signaling, Danvers, MA) käytettiin latauskontrollina kokeissa solun proteiinien kanssa. HEI-soluja (2 x 10

6) transfektoitiin joko siRNA 72 h ja sitten lyysattiin RIPA-puskuriin (20 mM Tris-HCI [pH 7,5], 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA: ta, 1% NP-40, 1% natriumdeoksikolaatti, 2,5 mM natriumpyrofosfaatti, 1 mM b-glyserofosfaatti, ja 1 mM natriumortovanadaattia). Lyhyesti, alikvootit kokosolulysaateista (~ 500 ug) inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa hiiren anti-CDK5-vasta-ainetta (~ 1 ug) (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA). Hiiren seerumia käytettiin negatiivisena immunosaostus valvontaa. Vasta-aine-antigeeni-kompleksit kerättiin käyttämällä proteiini A-agaroosi-helmiä (GE Healthcare, Piscataway, NJ) ja pestiin kolme kertaa pesten RIPA-puskurilla.

Solunosafraktiointi

HEI-solut transfektoitiin negatiiviseen kontrolliin ja CDK5 siRNA ja sitten fraktioitiin käyttämällä Nuclear ja Sytoplasmiset Extraction Kit (Promega, Madison, WI) mukaan valmistajan ohjeiden. Yhtä suuret määrät proteiinia sytoplasman ja tumauutteiden (10 ug) alistettiin immunoblot-analyysillä vasta-aineilla p21Cip1 (1: 300), p27Kip1 (1: 1500), PARP (1: 1000 laimennus, BD, Franklin Lakes, New Jersey ), ja a-tubuliinia (1: 1000 laimennos, Sigma, St. Louis, MO).

Kinaasimääritykset

in vitro kinaasimääritys suoritettiin EnzyChrom Kinase Assay Kit (MEDIBENA Life Science Diagnostic Solutions, Wien, Itävalta) mukaan valmistaa ”opetusta. Lyhyesti, perustettiin 75 ui reaktioseosta, joka sisälsi yhdistelmä-DNA-CDK5 /p25 (Invitrogen), kuten kinaasin, ATP: tä ja rekombinantti-p53 (Millipore, Billerica, MA), p27Kip1 (Abcam, Cambridge, MA), p21Cip1 (Abcam, Cambridge, MA), Histione H1 (Santa Cruz, Santa Cruz, CA) ja Arhi NTD (Origene, Rockville, MD) substraattina määrityspuskurissa, vastaavasti. Inkuboi huoneen lämpötilassa 20 minuuttia. Alikvootti 20 ui seosta 3 erillistä kuoppiin 96-kuoppalevyllä, lisätään 40 ui työskentelee reagenssia kutakin määritystä hyvin. Inkuboitua huoneenlämpötilassa 10 minuuttia ja lukea fluoresenssin intensiteetti (viritys = 530 nm ja emissio = 590 nm). Laske kinaasiaktiivisuutta kuin kaavalla.

δFluorescence = (fluoresenssin voimakkuus näytteen hyvin tyhjäksi hyvin) ja kaltevuus on kulmakerroin ADP standardikäyrän.

Luciferase promoottori määrityksissä

Lusiferaasiaktiivisuus määritykset suoritettiin, kuten seuraavat. Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille, kotransfektoitiin siRNA tai sen negatiivinen kontrolli ja Renilla sivektorissa (PRL-TK) toimi sisäisenä kontrollina. Transfektion jälkeen 16 h, solut jaettiin 12-kuoppalevyille, talteen 24 h ja Firefly ja Renilla lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin peräkkäin käyttäen dual lusiferaasianalyysissä Kit (Promega, Madison, WI) ja luminometrillä (BD Parmingene, Sparks, MD). WWP-Luc 9p21 /WAF1 promoottorin hankittiin Addgene (16451, Cambridge, MA). Tulokset ilmaistaan ​​suhteellisena lusiferaasivaikutusta jälkeen normalisoinnin Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Suhteellinen luminenssi yksikköä (RLU) normalisoitiin proteiinin pitoisuudet jokaisessa näytteessä, ja lopullisia arvoja RLU ilmaistiin RLU kohti mikro-gramma proteiinia millilitraa kohti.

Apoptosis esto kaspaasi inhibitioanalyysissä

HEI-soluja käsiteltiin 2 h 20 uM pan-kaspaasi-inhibiittori (Z-VAD-FMK, Promega, Madison, WI), tai negatiivinen kontrolli (Z-FA-FMK, Promega, Madison, WI), sen jälkeen, kun transfektoituja negatiivisen kontrollin siRNA tai CDK5 siRNA 24 tuntia. Sitten solut kiinnitetään 70% etanolilla, värjättiin propidiumjodidilla, ja alistettiin analyysi virtaussytometrialla. Sub-G1 solufraktio pidetään apoptoottisen solupopulaatio.

Protein puoliintumisaika määrityksessä

HEI solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin siRNA tai CDK5 siRNA 24 tuntia, pestiin, ja käsiteltiin 5 ug /ml sykloheksimidiä (CHX) varten osoitetut ajat. Solut otettiin talteen ja käyttää valmiita kokosolulysaateista, joka alistettiin immunoblot-analyysi vasta-aineilla p27Kip1 ja glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH).

Ihmisen munasarjasyövän nude-hiirissä

Kokeet Nu /Nu-hiiriä tarkistanut ja hyväksynyt Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC ID: 00001052-RN00) (MD Anderson Cancer Center). 60 female nude-hiiriin ruiskutettiin vatsaontelonsisäisesti (i.p.) 1×106 A2780 soluissa. Päivänä 7 injektion jälkeen hiiret satunnaistettiin seuraaviin hoitoryhmiin (n = 10 hiirtä ryhmässä kullekin solulinja): 1) i.p. injektion PBS (kahdesti viikossa, 100 ul /hiiri), 2) i.p. injektio paklitakselilla (kerran viikossa, 30ug /hiiri), 3) i.p. injektio ohjaus siRNA-DOPC (kahdesti viikossa), 4) i.p. injektio CDK5 siRNA-DOPC (kahdesti viikossa, 5 ug /hiiri), 5) i.p. injektio yhdistelmä ohjaus siRNA-DOPC (kahdesti viikossa) ja paklitakseli (kerran viikossa, 30 ug /hiiri), ja 6) i.p. injektion yhdistelmä CDK5 siRNA-DOPC (kahdesti viikossa, 5 ug /hiiri) ja paklitakseli (kerran viikossa, 30 ug /hiiri). Kaikki hiiret käsiteltiin 3 viikkoa ja tapettiin CO2 ja niskanmurrolla lopussa tutkimuksissa. Kaikki kasvaimet kerättiin välittömästi kuoleman jälkeen ja punnittiin.

immunohistokemia

formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin kudoksen mikrosiru (TMA) näytteet primääri munasarjojen syöpien (215 potilaan näytettä) saatiin MD Anderson patologia osasto. Protokollat ​​käsittelyyn parafinoidut munasarjasyöpä yksilöitä ja analysointi potilastiedot oli hyväksynyt eettinen valiokuntien MDACC Institutional Review Boards. Näytteet ja siihen liittyvät kliiniset tiedot kerättiin kirjallisella tietoon perustuva suostumus, jotka allekirjoittivat kukin ilmoittautunut potilaan alla eettisten ohjeiden ja hyväksymistä MDACC Institutional Review Boards. Tätä tutkimusta varten kudos microarray rakentaminen suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [19]. Tissue microarray liukuu alistettiin immunohistokemiallisella värjäyksellä mukaan valmistajan protokollan (biocare Medical, Concord, CA, USA). Kuusi mikronin leikkeitä leikattiin kustakin TMA. Inkuboitu 60 ° C: ssa 20 min, käytetään palauttamaan antigeeninen reaktiivisuus seurasi kaksi 20 minuutin inkubaatioissa Ksyleeni. Sen jälkeen kun objektilasit uudelleen hydratoituja antigeeni haku suoritettiin 6,5 mM natriumsitraattia (pH 6,0) 10 minuutin ajan. 3% naudan seerumin albumiinia 0,1 M Tris-puskuroitua suolaliuosta käytettiin estää. Leikkeitä inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli anti-CDK5-vasta-ainetta (1: 100, Sigma HPA018977). Anti-kani-immunoglobuliini-vasta-aineita sovellettiin sitten 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen pestiin 3 kertaa PBS: ssä 10 minuutin ajan. DAB kromogeenina lisättiin 1 min per slide seurasi lisäksi 3 pesua PBS: ssa 10 minuuttia ja sitten hematoksyliinillä värjäys suoritettiin 1 min per slide seurasi lisäksi 3 pesua PBS: ssa 10 min. Kaksi gynekologiset patologit (J.L, R. M.) itsenäisesti analysoi immunologiseen histokemiallisesti värjätään dioja CDK5 ilme.

Tilastollinen

Data esitetään keskiarvoina +/- standardipoikkeamat, ellei toisin mainita. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin riippumaton näytteen Mann-Whitneyn U-testiä. Survival analyysi suoritettiin Kaplan-Meier-menetelmää. Minimaalinen merkitsevyystaso oli p = 0,05.

Tulokset

CDK5 Knockdown estää solujen kasvua ja lisää paklitakselin herkkyyttä munasarjasyöpäsoluja

Vaikka knockdovvn CDK5 siRNA voisi muuttaa solujen kasvua ja paklitakselin herkkyys munasarjasyövän solulinjoissa mutantti TP53 (EFO21, EFO27, IGROV1, Caov3, OAW42 ja ES-2, SKOV3- ja OC316) (kuvio 1A), selvin vaikutuksia havaittiin kahdessa munasarjasyövän solulinjoissa villityypin TP53 (HEI ja A2780) (kuvio 1A ja 1 B). Hiljentäminen CDK5 vähensi IC50 paklitakselin Hei ja A2780-soluissa (kuvio 1 B). Pakko ilmentymisen CDK5 tehostetun kasvun ja laski herkkyys paklitakselin HEY soluissa (S1 kuvio). CDK-estäjä roskovitiinilla esti myös CDK5 aktiivisuutta ja solujen kasvua Hey soluissa kuten teki CDK5 siRNA HEI ja A2780-soluja (S1 kuvio). Estämisen lisäksi kasvua lyhyellä aikavälillä määrityksissä, knockdovvn CDK5 esti merkittävästi pesäkkeiden muodostumista ja suurempi herkkyys paklitakselin HEY ja A2780-soluissa (kuvio 1 B ja S2 kuvassa).

(A) Lyhytaikainen solukasvumäärityksessä. Hei ja A2780-soluissa 96-kuoppaisilla levyillä käänteinen transfektoitiin kontrolli-siRNA tai CDK5 siRNA (Dhamarcon) 24 tuntia ja käsiteltiin 5 nM paklitakselia (Pac) tai laimentimen (Control) vielä 48 h. Kristalliviolettimäärityksessä solujen lisääntymisen määritystä käytettiin mittaamaan solujen kasvua. (B) klonogeeninen ja solujen kasvua määritykset. HEI ja A2780-solut transfektoitiin kontrolli-siRNA tai CDK5 siRNA: ssa 24 tuntia, ja sitten soluja käsiteltiin laimentimen (Control) tai 3 nM paklitakselia (Pac) ja 14 päivää (klonogeeninen määritys) tai soluja käsiteltiin useita pitoisuuksia paklitakselin ( Pac) tai laimentimen (Control) vielä 48 h (solujen kasvua määritykset). IC50 Paklitakselin tai CDK5 siRNA hoitoa Hei ja A2780 solut laskettiin GraphPad.

CDK5 Knockdown estää aktivoinnin AKT

phosphatidyinositol-3-kinaasi (PI3K ) -Akt selviytyminen cascade ajatellaan liittyvän herkkyyttä syöpälääkkeiden. Tutkia mekanismia, jolla CDK5 hiljentäminen esti munasarjojen syöpäsolujen kasvua ja parantaa paklitakseli herkkyys, ensin tutkittiin, mikä vaikutus CDK5 knockdown aktivoituessa AKT havaitsemalla Ser473 fosforylaatio AKT. Hoidon jälkeen CDK5 siRNA tai ohjaus siRNA, Western-analyysi suoritettiin. Hiljentäminen CDK5 esti merkittävästi aktivointi AKT 2 villityypin TP53 (kuvio 2) sekä 4 8-mutantti TP53 munasarjasyövän solulinjoissa (kuvio 2). siRNA: t inhibitio AKT aktivaation 6 munasarjasyövän riviä merkittävästi korreloivat alentuneen solun kasvua ja lisää paklitakselin herkkyys (kuviot 1A ja 2).

Western-analyysi eston mittaamiseksi AKT: fosforylaatio (Ser473) käyttäen spesifisiä anti-p- AKT-vasta-ainetta. HEI soluja käsiteltiin kontrolli-siRNA tai CDK5 siRNA: ssa 72 tuntia. Solulysaatit alistettiin immunoblot-analyysillä.

CDK5 Knockdown lisää apoptoosia ja G1 solukierron pysähtymisen läsnä ja poissa ollessa paklitakselin

tutkia muita mekanismeja, joilla CDK5 hiljentäminen estää villi kirjoita TP53 munasarjasyövän solujen kasvua ja parantaa paklitakseli herkkyyden, tutkimme vaikutus CDK5 knockdown tai ilman paklitakselihoidolla on apoptoosin induktio ja solukierron pysähtymisen Hei soluissa, jotka on TP53 villityypin. Hoidon jälkeen CDK5 siRNA tai ohjaus siRNA, virtaussytometria-analyysi suoritettiin. Hiljentäminen CDK5 aiheuttama G1 pidätyksen ja tuottanut apoptoottisen solukuoleman lisääntynyt osa soluista Saharan G1 (kuvio 3A ja 3B). CDK5 hiljentäminen myös parannettu paklitakselin indusoiman apoptoosin (kuvio 3B).

(A, B) pudotus p53 vähentää CDK5 pudotus-indusoitua apoptoosia (A) ja G1 pidätys (B). HEI solut käänteinen transfektoitiin kontrolli-siRNA tai CDK5 siRNA: ssa 24 tuntia ja käsiteltiin 5 nM paklitakselia (Pac) tai laimentimen (Control) vielä 48 tuntia, ja sitten solusyklin analysoitiin virtaussytometrialla. Tiedot ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) CDK5 Knockdown lisäsi ilmentymistä p21

CIP1, p53 ja p27

Kip1. HEI soluja käsiteltiin kontrolli-siRNA tai CDK5 siRNA: ssa 24 tuntia ja sitten paklitakselin (3 nM) tai laimentimen kanssa 48 tuntia. Immunoblot-analyysi suoritettiin vasta-aineilla p21

CIP1, p53 ja p27

Kip. (D) knockdovvn p53 ilmaisun vähensivät CDK5 siRNA aiheuttama kasvun esto ja vähensi parantamiseksi paklitakselin herkkyys. Solut ko-transfektoitiin CDK5 siRNA ja p53 siRNA 24 h ja käsiteltiin paklitakselia (Pac) tai laimentimen kanssa. Solujen lisääntymisen mitattiin kristallivioletilla soluproleferaatiomäärityksessä. (E, F) knockdovvn p53 vähensi CDK5 pudotus indusoiman apoptoosin (E) ja G1 pidätys (F). HEI-soluja käsiteltiin kuten kohdassa (A) ja solukierron analysoitiin virtaussytometrialla. Tiedot ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta. (G) Western-analyysi vahvisti lisääminen TP53 ilmentymisen hiljentäminen CDK5. HEI soluja käsiteltiin kontrolli-siRNA tai CDK5 siRNA: ssa 24 tuntia ja sitten paklitakselin (3 nM) tai laimentimen kanssa 48 tuntia. Solut lysaatit alistettiin immunoblot-analyysi, jossa p53, CDK5 ja aktiini vasta-aine.

CDK5 Knockdown indusoi TP53-riippuvaisen kasvun estäminen, apoptoosin ja G1 pidättämään

testaamiseksi vaikutuksen CDK5 hiljentäminen proteiineja, jotka säätelevät solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin, teimme Western-analyysi TP53, p21Cip1 ja p27Kip1 käsittelyn jälkeen hEI solujen ohjaus siRNA ja CDK5 siRNA: n läsnä ja poissa ollessa paklitakseli. Knockdovvn CDK5 huomattavasti TP53, p21

CIP1 ja p27

Kip1 (kuvio 3C). Paklitakselihoidon edelleen kohonneeseen näiden kolmen proteiinin (kuvio 3C). Lisäksi, pudotus ja CDK5 indusoi kasvun inhibition ja knockdovvn TP53 vähentää hiljentäminen CDK5-välitteistä kasvun inhibition läsnäolo tai puuttuminen paklitakselin (kuvio 3D). Mukaisesti Tämän CDK5 siRNA lisääntynyt syöpäsolun G1 solusyklin pysähtymiseen ja apoptoosiin, mutta knockdovvn TP53 vähensi CDK5 siRNA aiheuttama G1 solukierron pysähtymisen läsnä tai poissa paklitakselin (kuvio 3E ja 3G) ja vähensi CDK5 siRNA indusoimaan apoptoosin (kuvio 3F ja 3G) in HEY soluissa. Vuonna SKOV3- solut, jotka ovat TP53 null, pudotus ja CDK5 lisääntynyt osa solut G2 /M-hoidon jälkeen paklitakselin (S3 kuvassa). Pakko ilmentymisen villityypin TP53 in SKOV3- soluissa lisäsi osa solujen G1 (S3 kuvassa).

CDK5 Knockdown tuottaa translaation jälkeisen ylösajon ja ydinvoiman translokaation TP53 ja p27

Kip1 ja indusoi TP53-riippuvainen transkriptio p21

CIP1

CDK5 knockdown vuonna HEI soluissa pidensi merkittävästi puoliintumisaika TP53 ja p27

Kip1 proteiineja (kuvio 4A). Hiljentäminen CDK5 lisääntynyt ydinvoiman lokalisointi TP53 ja p27

Kip1 proteiineja ja sytoplasman tasolla p21

CIP1 (kuva 4B). P27

Kip1 proteiini taso on pääosin säänneltyjen transkription jälkeen [20, 21]. CDK5 siRNA vähentynyt fosforylaatio p27Kip1 on Thr187 (kuvio 4C), joka tarvitaan sitoutumiselle ubikitiinipromoottori ligaasilla ja johtaa 26S-proteasomin hajoamista. TP53 on raportoitu olevan suora substraatti CDK5 [22-24]. Käyttämällä puhdistettua CDK5 proteiinia ja fluoresenssiin perustuva in vitro kinaasimäärityksessä, havaitsimme fosforylaatiota TP53 ja p27

Kip1 (kuvio 4D), käyttäen liity proteiini, Arhi-NTD, negatiivisena kontrollina ja histoni H1 positiivisena kontrollina (S4 kuvio) [25, 26]. Koska p21

CIP1 voidaan säädellä TP53 transkriptiotasolla ja CDK5 hiljentäminen voi myös ylössäätää TP53 ilmaisun testasimme vaikutus CDK5 Knockdown ja TP53 knockdown on p21

CIP1 promoottorin aktiivisuutta. Verrattuna hallita siRNA, CDK5 siRNA huomattavasti promoottorin aktiivisuutta p21

CIP1, joka poisti kotransfektion TP53 siRNA (kuvio 4E). Lisäksi pudotus p21

CIP1 ja p27

Kip1 samanaikaisesti (kuvio 4F) vähensi CDK5 siRNA-indusoidun apoptoosin lisääntyminen (kuvio 4G) ja vähensi CDK5 siRNA-indusoidun G1 solusyklin pysähtymisen läsnä tai poissa paklitakseli (Kuva 4H) in HEY soluissa. Siten vaimentaminen CDK5 tuotettujen translaation jälkeisen ylösajon TP53 ja p27

Kip1 liittyy TP53-riippuvaisen transkription induktio p21

CIP1.

(A) Transfektio CDK5 siRNA lisääntynyt puoliintumisaika p53 ja p27

Kip1 proteiinia. HEI solut transfektoitiin kontrolli-siRNA tai CDK5 siRNA: ssa 24 tuntia ja käsiteltiin sitten 5 ug /ml sykloheksimidiä (CHX) varten ilmoitettu välein. Solulysaateista tehtiin Western-analyysi vasta-aineiden kanssa osoitti. (B) CDK5 siRNA lisäsi ydinvoiman lokalisointi p53 ja p27

Kip1. HEI solut transfektoitiin ohjaus siRNA tai CDK5 siRNA: ssa 24 tuntia ja suoritettiin fraktiointi osaksi soluliman ja ydin- komponentteja. Soluliman (CE) ja ydin- (NE) uutteet analysoitiin immunoblottauksella. (C) CDK5 siRNA vähentynyt fosforylaatio p27Kip1 on T187. Solun immunoblot-analyysi suoritettiin vasta-aineilla fosforyloidun ja yhteensä p27Kip1. (D) CDK5 tehostettu fosforylaatio TP53 ja p27

Kip. Fluoresenssin perustuva in vitro kinaasimääritykseen käytettiin arvioimaan vuorovaikutusta CDK5 kanssa TP53 ja p27

Kip1. (E) CDK5 siRNA säädellään transkriptionaalisesti ilmentymistä p21

CIP1. HEI-solut transfektoitiin CDK5 siRNA yksin tai yhdessä TP53 siRNA ja lusiferaasireportteri- määritystä käytettiin mittaamaan p21

CIP1-promoottorin aktiivisuutta. (F) CDK5, p21

CIP1 ja p27

Kip1 Knockdown vähentynyt ilmentyminen CDK5, p21

CIP1 ja p27

Kip1. HEI soluja käsiteltiin kontrolli-siRNA tai CDK5 ja /tai p21 ja p27 siRNA 48 h ja sitten paklitakselin (6 nM) tai laimentimen kanssa 24 tuntia. Immunoblot-analyysi suoritettiin vasta-aineilla osoitettu. (G, H) knockdovvn p21and p27 vähentää CDK5 pudotus-indusoitua apoptoosia (G) ja G1 pidätys (H). HEI soluja käsiteltiin kuten (F) ja solukierron analysoitiin virtaussytometrialla jälkeen siRNA transfektion. SubG1 soluja pidettiin apoptoottisia soluja. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta.

CDK5 pudotus-indusoi apoptoosia, joka riippuu kaspaasi-3-aktivaation ja liittyy Bcl-2 downregulation

selvittämiseksi mekanismi joka CDK5 knockdown aiheuttaman apoptoosin, kysyimme CDK5 knockdown ja paklitakselihoidolla aktivoitu kaspaasi-3. Western-analyysi osoitti, että CDK5 pudotus voi indusoida kaspaasi-3, ja tämä lisäsi edelleen käsittelemällä paklitakselin (kuvio 5A). Z-VAD-FMK, yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä, tukossa apoptoosin soluissa transfektoiduissa CDK5 siRNA (kuvio 5B). Tästä seuraa, että apoptoottista solukuolemaa indusoi CDK5 hiljentäminen oli kaspaasi riippuvainen. Bcl-2 on merkittävä apoptoosi-inhibiittori. CDK5 hiljentäminen todettiin vähentävän ilmentymisen Bcl-2: n mRNA tasolla qRT-PCR: llä (kuvio 5C), joka voidaan ottaa huomioon, että säätelyä p27Kip1, kuten olemme aiemmin raportoitu [1]. Yhdistelmä CDK5 siRNA ja paklitakselin osoitti suurempaa inhibitiota Bcl-2: n mRNA kuin teki CDK5 siRNA yksin.

(A) CDK5 pudotus indusoi kaspaasi-3-aktivaation läsnä ollessa ja poissa ollessa paklitakseli. HEI solut transfektoitiin kontrolli-siRNA tai CDK5 siRNA 24 h, hoidettiin paklitakselilla (3 nM) tai laimentimen kanssa 48 tuntia, hajotettiin ja kokonaisproteiinin analysoitiin immunoblot käyttämällä vasta-aineita vastaan ​​aktivoitu kaspaasi-3 ja GAPDH. (B) yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä estetty CDK5 pudotus indusoiman apoptoosin. HEI soluja esikäsiteltiin 2 h 20 uM pan-kaspaasi-inhibiittori (Z-VAD-FMK), tai negatiivinen kontrolli (Z-FA-FMK), minkä jälkeen sitä käsitellään 24 h tai ilman paklitakselin (3 nM). Sitten solut kiinnitetään 70% etanolilla, värjättiin propidiumjodidilla ja alistettiin solusyklin analyysi virtaussytometrialla. Sub-G1 solupopulaatio pidettiin apoptoottisia ja ilmaistaan ​​prosentteina koko-solupopulaatio. (C) CDK5 pudotus vähentynyt ilmentyminen Bcl-2: n mRNA.