Krooninen sairaus

tiivistelmä

Voimakkaat RNaasi toimintaa havaittiin seerumissa nisäkkäiden mutta fysiologinen funktio RNaaseista ei koskaan hyvin kuvitettu, mikä johtuu pääasiassa varovaisuudella menetelmissä RNaasi-aktiivisuuden mittaus. Mikään olemassa olevista menetelmistä voidaan erottaa RNaaseista eri tavoite erityispiirteet. Systemaattinen tutkimus äskettäin suoritettiin meidän lab tutkimaan sivuston spesifisyys seerumin RNaaseista on kaksijuosteinen RNA alustoille, ja totesi, että seerumin RNaaseista katkaisevat kaksijuosteisen RNA: t pääasiassa at 5′-U /A-3 ’ja 5’ C /A-3 ’dinukleotidi sivustoja, tavalla muistuttavista RNaasi A. tähän havaintoon perustuen, FRET-määritys kehitettiin nykyisessä tutkimuksessa mitata paikkakohtaisia ​​seerumin RNaasi-aktiivisuuden ihmisen näytteitä kaksijuosteisen RNA alustaan . Olemme osoittaneet, että menetelmä on dynaaminen alue 10

-5 mg /ml- 10

-1 mg /ml käyttäen sarjalaimennosta RNaasi A seerumit 303 syöpäpotilasta alistettiin verrattuna 128 terveiden verrokkien , ja todettiin, että seerumin RNase toiminta visualisoitu tällä paikkasidonnainen kaksijuosteista koetin havaittiin merkittävästi pienentää potilailla mahalaukun syöpä, maksasyöpä, haimasyöpä, ruokatorven syöpä, munasarjasyöpä, kohdunkaulan syöpä, virtsarakon syöpä, munuaissyöpä ja keuhkosyöpä, kun taas vain vähäisiä muutoksia havaittiin rinta- ja paksusuolen syövän potilaille. Tämä on ensimmäinen raportti käyttämällä kaksijuosteisia RNA koettimena määrittää paikkasidonnainen toiminta RNaasi A seerumin. Tulokset havainnollistetaan että RNase A voidaan edelleen Arvioimme, se voi toimia uuden luokan biomarkkereita tiettyjen syöpätyyppien.

Citation: Huang W, Zhao M, Wei N, Wang X, Cao H, du Q, et ai. (2014) Site-Specific RNase A Activity väheni dramaattisesti in Serum erilaatuisia syöpäpotilaiden. PLoS ONE 9 (5): e96490. doi: 10,1371 /journal.pone.0096490

Editor: Chandravanu Dash, Meharry Medical College, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 marraskuu 2013; Hyväksytty: 08 huhtikuu 2014; Julkaistu: 7. 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Beijing Natural Science Foundation (5132015), National Basic Research Program of China (2011CBA01102), National High-tech-T 0,001), kun taas seerumin RNaasi taso rintasyövän ja paksusuolen syövän potilaiden ei ollut kovin merkittävästi erilainen kuin terveillä henkilöillä.

tulokset

suunnittelu ja karakterisointi FRET Probe for Serum RNaasia Measurement

tunnettu tosiasia molekyylibiologian on että yksisäikeistä RNA: t ovat erittäin epävakaita useimmissa tapauksissa, erityisesti läsnäolo ribonukleaasit. Nopea huonontumisprosesseihin tehdä liian vaikea seurata hajoamisen prosessi reaaliajassa. Tämä tilanne edelleen johtaa vaikeuksiin määrällisten mittauksia RNaasi-aktiivisuuden.

Eri Yksijuosteisista RNA: t, kaksijuosteiset RNA: t ovat yleensä paljon vakaampi. Tuoreessa tutkimuksessa profilointi seerumin hajoamista kaksijuosteisen siRNA: t, huomasimme, että sekä pitkän että lyhyen kaksijuosteiset RNA: t hajoavat pääasiassa kahdessa alttiita sivustoja, eli 5′-U /A-3 ’ja 5′-C /A- -3 ”dinukleotidi sivustoja [31]. Tähän havaintoon perustuen olemme arveltu, että kaksijuosteisen RNA: t voidaan käyttää substraattina seerumin RNaasi-aktiivisuus. Tätä varten, kaksijuosteinen RNA-sekvenssi on suunniteltu kuljettamaan yhden 5’-C /A-3 ’alttiita sivusto, joka vahvistettiin hajoamisen määrityksessä (kuvio 1A). RNaasi A on hallitseva RNaasi ihmisen seerumissa, joka välittää hajoaminen prosessi tällaisten dsRNA: iden (kuvio 1 B). Helpottaakseen seurantaa huonontumisprosessista tämän koetin reaaliajassa, FRET järjestelmä on suunniteltu integroimalla luovuttajan fluoresenssi FAM ja akseptorin fluoresenssin TAMRA 5’jokaisen komponentin RNA säikeitä. Niin kauan kuin RNA duplex pitää ennallaan, kaksi pää-fluoresoiva väriaineet ovat tarpeeksi lähellä välittää energian siirtoa luovuttajalta vastaanottajan (kuvio 2A), mikä johtaa päästöjen huippu 575 nm: ssä, kun viritetään 480 nm: ssä (kuvio 2B ). Kun duplex on hajonnut, energian siirto FAM ja TAMRA keskeytyy, ja päästöjen huippu siirtyy 575 nm 515 nm, samoissa heräte olosuhteissa (kuvio 2B). Siksi mitataan muutos päästöjen huippu 515 nm: voidaan seurata hajoamisen prosessi duplex RNA ja heijastavat aktiivisuus RNaasi järjestelmässä (kuvio 2C).

A) Hajoaminen sellaisen 1860 emäsparin RNA duplex tehtiin RNaasi A. Hajoaminen fragmentit uutetaan ja sekvensoitiin. Kohdistamalla hajoamista fragmentteja alkuperäisen RNA-sekvenssi, katkaisukohtia tunnistettiin ja esitetään suhteena jokaisen mahdollisen dinukleotidi sivustolla [31]. B) Duplex RNA: n hajoamisen määritystä. Kaksoisleimatulla duplex RNA erikseen inkuboitiin RNaasi A seos RNase A ja RNaasi A: estäjä, ihmisen seerumin seosta ihmisen seerumin ja RNase A estäjä. Näytteet kerättiin ja ajaa denaturoituun PAGE-geelillä.

A) Kaaviokuva FRET perustuu RNaasi määrityksessä. Duplex-RNA (13 emäsparia) oli dual-leimattu fluoreseiini (FAM) luovuttajana ja tetra- (TAMRA) akseptorimo- molemmissa päissä. B) Normalisoitu fluoresenssispektrin duplex-RNA (13 bp) inkuboitiin (vihreä viiva) tai ilman (punainen viiva) RNaasi /seerumin 25 ° C: ssa 15 minuutin ajan. C) Duplex RNA: n hajoamisen määritys mittaus reaaliajassa. Duplex RNA hybridisoitiin ja inkuboitiin hybridisointipuskuriliuosta 25 ° C: ssa. RNaasi tai seerumia lisättiin määrättynä ajankohtana. Fluoresenssi Luovuttajan (FAM) rekisteröitiin reaaliajassa (kiinteät pisteet). Näytteitä eri ajankohtina (vasemmalta oikealle: 0 s, 10 s, 60 s, 180 s, 480 s) kerättiin ja ajettiin denaturoituun PAGE-geelillä (Inset). Fluoresenssi skannattu Typhoonissa näytetään jäljellä oleva täyspitkä dsRNA.

On hyvin osoitettu, että energian siirto teho riippuu pääasiassa etäisyys ja keskinäinen orientaatio luovuttajan ja akseptorin fluoresenssin anturi [32]. Toisaalta lyhyt koetin lisää energian siirto tehokkuutta FRET, kun taas toisaalta, pidempi koetin on korkeampi sulamislämpötila, ja on vakaampi. RNA-dupleksit 8 ja 13 bp tutkittiin optimoimiseksi substraatin pituudesta. Tulokset osoittivat, että 13-bp: n substraatti, jossa on sekvenssit 5′-AUGAGCCUGAUUU-3 ’/3′-UACUCGGACUAAA-5’, on optimaalinen FRET havaitsemiseen. Tämä RNA duplex käytettiin sitten reaktio substraatin tutkimuksessa.

optimointi Assay System

mittaamiseksi RNaasi-aktiivisuuden järjestelmässä, neljä mikrolitraa 5 uM dual-leimatun RNA-substraatti oli lisättiin 2 ml FRET puskuria sekoittaen jatkuvasti. Ennen lisäämistä RNaasi tai testinäytteiden, perustason käyrä kirjattiin 480 nm: n virityksellä noin 30 sekunnin ajan, käyttäen QuantaMaster 30 spektrofluorometri (Photon Technology International, Birmingham). Sitten RNaasi liuos tai testinäytteitä lisättiin reaktiojärjestelmään, ja fluoresenssi kirjattiin 515 nm: n välein 3 sekunnin 15 minuuttia. Data-analyysin, taustan fluoresenssi vähennettiin näytteen fluoresenssin saamiseksi reaaliaikaisen käyrä, niin seurata hajoamisen prosessia reaaliajassa hoidon aikana (kuvio 2C). Epälineaarinen regressiomenetelmä (single-eksponenttiyhtälöä) käytettiin sopimaan tietojen ja saada vakion K

obs hajoamisen reaktion (kuvio 3A).

A) kvantifiointi hajoaminen FRET määrityksessä. FAM fluoresoiva intensiteetti muuttuu kuten hajoamisen suhteen määrittelemällä alhaalta ja ylhäältä fluoresoiva intensiteetti kuin 0% ja 100%. Pohja on fluoresoiva intensiteetti täyspitkä kaksoisleimatulla dsRNA; top on fluoresoiva intensiteetti FAM leimatun yhden RNA. AF

max määriteltiin 100%. Fluoresoivan lukema näytteiden sovitettiin yhden eksponenttiyhtälöä (punainen viiva) saada nopeusvakio K

obs. Prosentuaalinen hajoaminen tiettynä ajankohtana laskettiin 100 × AF /AF

max. B) hajoaminen kaksoisleimatulla dsRNA eri pitoisuutena RNaasi A valvoo FRET määritys (alhaalta ylöspäin: 10

-7 mg /ml, 10

-6 mg /ml, 10

– 5 mg /ml, 0,001 mg /ml, 0,003 mg /ml, 0,006 mg /ml, 0,01 mg /ml). C) Vakiokuvaajan RNaasi Keskittymä ja K

obs. K

obs saatiin, kuten on kuvattu kuviossa 3A. D) K

obs muuttuminen alle jäädytys-sulatus hoito. K

obs määritetään ihmisen seeruminäytteistä jäädytettiin -80 ° C: ssa, ja sulatettiin huoneen lämpötilassa 0-6 kertaa.

siten, standardikäyrän perustettiin mittaamalla RNaasi A -aktiivisuutta sarjalaimennettiin RNaasi A: ratkaisuja, pitoisuusalueella between10

-7-10

-1 ug /ul (kuvio 3C). Kutakin pitoisuutta, kineettinen käyrä tallennettiin (kuvio 3A), ja viittaus käyrä tehtiin lasketun K

obs kuvaamaan suhdetta toiminnan ja pitoisuus RNaasi A. simuloitu käyrä osoitti, että hajoaminen aktiivisuus nousi nopeasti, kun RNaasi pitoisuus nostettiin (kuvio 3C). Tulokset osoittivat, että lineaarinen suhde laajalla alueella RNase A pitoisuudet 10

-7-10

-3 ug /ul. Kun oli lisätty RNase A 10

-7 ug /ul, fluoresoiva signaali voimakkuus lisääntyi 1000 A.U., signaali kohina suhde oli 2-kertainen. Detektioraja FRET määrityksessä oli 10

-7 ug /ul. Kun RNaasi määritys suoritettiin 1 x 10

-6 ug /ul RNaasi A fluoresoiva signaali intensiteettiä kasvoi 41000 A.U. 58000 A.U., ja melu tässä kokeessa oli 500. Signaali kohinasuhde alle 1 x 10

-6 ug /ul on 34 kertainen. Tämän signaalin kohinasuhde, havaittavalla alueella oli niinkin alhainen AS1 × 10

-6 ug /ul. Epälineaarinen regressio R

2 1 x 10

-6 ug /ul pitoisuus oli 0,9856. Alle pitoisuus 1 x 10

-5 ug /ul, epälineaarinen regressio R

2 oli 0,9945. Toisaalta, fluoresoiva signaali intensiteettiä kasvoi 43000 A.U. ja 78000 A.U., ja signaali kohina suhde oli 70-kertainen. Mukaan R

2 ja signaali kohinasuhde, päättelimme, että pitoisuusalueella RNaaseille jotka voidaan helposti mitata tällä menetelmällä pitäisi olla 1 x 10

-5-,1 ug /ul.

edelleen vahvistaa tämän koejärjestelmässä, RNaasi toimintaa mitattiin ihmisseeruminäytteitä jotka ovat läpikäyneet toistuvasti jäädytys-sulatus hoito. Jäädyttämällä näytteet -80 ° C: ssa ja sulatus jäällä useita kertoja, RNaasi-toimintaa näytteistä mitattiin käyttäen nykyistä FRET menetelmällä. Havaittiin, että RNaasi selviäisi useita jäädytys-sulatus sykliä ilman aktiivisuuden menetystä, mikä osoittaa nykyisen menetelmää voidaan käyttää jäädytetyn kliinisissä näytteissä (kuvio 3D).

mittaaminen Serum RNaasi Aktiivisuus syöpäpotilailla

Käyttämällä tätä FRET-pohjainen mittaus RNaasi-aktiivisuuden, joukko ihmisseeruminäytteitä tutkittiin myös 55 terveillä yksilöillä ja 34 syöpäpotilaiden kattaa joitakin yhteisiä syöpätyyppeihin. Standardikäyrä on kuvattu edellä käytettiin lasketaan suhteellinen seerumin RNaasi pitoisuuksien kanssa ihmisen seeruminäytteitä, ja sitten suhteellisen RNaasi pitoisuus syöpäpotilaiden verrattiin kuin terveiden yksilöiden (keskiarvo terveillä mielivaltaisesti oli asetettu 100%). Tulokset osoittivat, että seerumin RNase tasot olivat merkitsevästi alassäädetty kaikkien 7 eri syöpätyyppien (kuva 4).

Seerumin RNaasi toimintaa määritettiin terveille henkilöille sekä 4 mahasyöpäpotilaista, 5 paksusuolen syöpäpotilaiden , 5 keuhkosyöpäpotilaita, 5 ruokatorven syöpä potilailla, 5 munuaisten syöpäpotilailla, 5 kohtu syöpäpotilaiden ja 5 haimasyövän potilaille. RNaasi pitoisuus kutakin seeruminäytettä laskettiin standardikäyrän ja K

obs saatu yhden eksponenttiyhtälöä. Suhteellinen seerumin RNaasiaktiivisuuden kunkin syöpäpotilaan kvantifioitiin normalisoimalla syöpäpotilaan seerumin kanssa keskimääräinen pitoisuus terveiden yksilöiden seeruminäytteistä.

Vahvista Näiden havaintojen lisäksi seerumi kerättiin potilailta rintasyöpä, mahasyöpä, paksusuolen syöpä, maksasyöpä, haimasyöpä, ruokatorven syöpä, munasarjasyöpä, kohdunkaulan syöpä, virtsarakon syöpä, munuaissyöpä ja keuhkosyöpä, on näytteen koko on 303 syöpäpotilaiden yhteensä. Arviointi näistä näytteistä osoitti down-regulation seerumin RNaasi tasojen mahalaukun, maksasyöpä, haimasyöpä, ruokatorven syöpä, munasarjasyöpä, kohdunkaulan syöpä, virtsarakon syöpä, munuaissyöpä ja keuhkosyöpä (taulukko S1). Ei ilmeistä muutoksia seerumin RNaasi tasot havaittiin rintasyöpäpotilaiden ja paksusuolen syövän potilaille. Nämä tulokset tukevat laajalti meidän aikaisempien havaintojen kanssa. Mahalaukun syöpä, maksasyöpä, haimasyöpä, ruokatorven syöpä, munasarjasyöpä, kohdunkaulan syöpä, virtsarakon syöpä, munuaissyöpä ja keuhkosyöpä potilasryhmien poikkesi terveiden ryhmästä, jonka P-arvo on pienempi kuin 0,001. Vertailun vuoksi P-arvo rintasyövän ryhmässä oli vain 0,0619, joilla ei ole selvää eroa kontrolliryhmän (kuvio 5). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että alas-säätely seerumin RNaasi-aktiivisuuden on yleinen ilmiö monissa yleisin syöpä tyyppejä. Tämä havainto vihjasi mahdollisen kohdennettua RNaasi yhteisenä syöpä biomarkkereiden.

Seerumin RNaasi tasojen määrä terveille henkilöille sekä 37 kohdunkaulan syöpäpotilaille, 37 ruokatorven syöpäpotilaille, 37 munuaisten syöpäpotilaat, 24 keuhkoissa syöpäpotilailla, 10 virtsarakon syöpäpotilailla, 21 haimasyövän potilaat, 23 munasarja syöpäpotilailla, 32 maksasyövän potilaiden, 27 mahasyöpäpotilaista, 31 paksusuolen syöpäpotilaiden ja 24 rintasyöpäpotilaiden (lisätietoja tietojen taulukko S1).

oli 32 maksasyövän testattu, keskimääräinen suhteellinen aktiivisuus verrattuna normaaliin ohjaus oli 32,9%, P 0,0001. Niistä 32 näytettä, vain 1 näyte putosi tarkastustoimen alue. Kaksikymmentä seitsemän mahasyövän potilaiden seerumista testattiin, keskimääräinen suhteellinen aktiivisuus oli 38,8%, P 0,001. Oli 24 keuhkosyöpään potilaiden seerumista testattiin, keskimääräinen suhteellinen aktiivisuus oli 29,1%, P 0,0001. Kolmekymmentäseitsemän ruokatorven syöpä potilaiden seerumin ja 35 kohdunkaulan syövän potilaiden seerumissa, 37 munuaissyövän potilaiden seerumin ja 21 haimasyövän testattiin ja havaittu olevan 21,1% P 0,0001, 20,2% P 0,0001, 27,6% P 0,0001, vastaavasti. Oli 23 munasarjasyöpä potilaiden seerumit mitattiin suhteellinen aktiivisuus munasarjasyöpä oli 28,6%, P 0,0001, ja yksi tapaus pudonnut säätöalueen. Virtsarakon syövän myös havaittu poikkeustapauksessa joka putosi normaalitasolle ja keskimääräinen suhteellinen aktiivisuus oli 29,5%, P 0,0001. Rintasyöpä ei yhtynyt samanlainen alassäädetty RNase kuvio kaikkien muiden 10 erilaista syöpien, suhteellisen aktiivisuuden rintasyövän oli 61,4%, hieman pienempi kuin terveillä henkilöillä, mutta tilastollinen analyysi ehdotti tällaista eroa ei ehkä ole merkittävää (P = 0,0619). Samanlainen tilanne ilmeni paksusuolen syöpäpotilaiden tutkittu keskimääräinen suhteellinen RNase A aktiivisuus 54,5% ja P 0,05.

Ei Ero Serum RNaasi Levels välillä Potilaat, joilla on primaarinen ja metastaattinen paksusuolen syövän

RNaasi tasot tutkittiin edelleen perus- ja metastaattinen paksusuolen syöpäpotilaiden, jotta voitaisiin tutkia, jos laajalle levinnyt arvot RNaasi toimintaa seerumissa paksusuolen syöpäpotilaiden johtuivat sekoittaminen vaiheessa, ja jos RNaasi-aktiivisuuden eroja voidaan käyttää erottamaan eri vaiheissa tämä syöpä. Seeruminäytteet kerättiin ensisijainen ja etäpesäke paksusuolensyöpä potilaita, joilla etäpesäkkeiden vaiheissa määritettiin tutkimalla kudosbiopsian. Seeruminäytteistä kymmenelle potilaalle imusolmukkeiden etäpesäkkeet ja 10 ilman etäpesäkkeitä kerättiin ja analysoitiin käyttämällä FRET RNaasi määrityksessä. Tulokset osoittivat, mitään eroa näiden kahden ryhmän välillä (kuvio 6).

Nämä rum RNaasi toiminta 10 ensisijainen paksusuolen syövän potilaiden ja 10 etäpesäkkeiden paksusuolen syöpäpotilaiden kvantitoitiin FRET-määritys.

keskustelu

korrelaatio seerumin RNaasia tasojen ja haimasyövän raportoivat ensiksi Reddi vuonna 1976. optisen menetelmää, he mittasivat seerumin RNaasi mittaamalla sen toiminta poly-C RNA, ei- RNaasi substraattia [19]. Vuonna 1970-luvun lopulla ja 1980-luvun alussa, radioimmunomääritys toteutettiin RNaasi mittaus [24], [25], ja joissakin tutkimuksissa E. coli tRNA käytettiin korvaamaan poly-C-määritys alustan [26], nämä parannukset parantavat mittaustarkkuus on RNase. Useissa tutkimuksissa on tehty tutkimiseksi seerumin RNaasi tasot potilailla, joilla on pahanlaatuinen syöpä, hyvänlaatuinen kasvain, tupakoitsija, munuaisten vajaatoiminta ja erityisesti potilailla, joilla on haimatulehdus ja haimasyöpä. Nämä tutkimukset kuitenkin paljastivat ristiriitaisen kuvan [22], [24]. Vaikka Funakushi ja Kemmer ryhmät raportoivat seerumin RNaasi määrinä potilailla, joilla sekä haimasyöpä ja haimatulehdus [21], [26], Reddi ja Warshaw ryhmät kuitenkin havaittu, että RNaasi taso nousi vain haimasyövän potilaille [19], [22], kun taas seerumin RNaasi tasot haimatulehdus potilaista oli samalla tasolla kuin terveillä verrokeilla [19], [22]. Mitsuhashi ja Kurihara ryhmiä, toisaalta, todettiin, että seerumin RNaasi tasot liittyvät ainoastaan ​​iän, tupakointi sekä joitakin muita fysiologisia indeksi, kuten veren ureatypen ja albumiinin sisältö [25]. Lisäksi äskettäisessä tutkimuksessa raportoitiin seerumin RNaasi määrinä potilailla, joilla on nuoruusiän diabetes [33]. Vielä toinen raportti osoitti, että RNaasi 1 on vaihtanut ekspressiotason microarray ja western blotting menetelmä aikana mahalaukun syövän kehittymisen [34].

Nämä erot voivat johtua monimutkaisuus Reddi n määrityksen, esimerkiksi reaktion päättyminen vaihe tai aine puhdistusvaiheita. Näissä määrityksissä reaktio järjestelmät anna jäissä jo jonkin aikaa, ennen kuin suuri annos HClO

4 lisättiin lopettaa ruoansulatusta. Kuitenkin meidän tutkimuksessa todettiin, että jäähauteessa hoitoa ei voida kokonaan poistaa RNaasi-aktiivisuus. Muita, puhdistus undigested polynukleotidi voi olla toinen vaihe hankaluuksia Reddi n määrityksessä. Tässä vaiheessa yksinkertainen sentrifugointi, joita käytetään poistamaan di-nukleotidi- ja tri-nukleotidin johtui RNaasi ruoansulatusta. Tämä prosessi on kuitenkin myös voi poistaa joitakin pidemmän polynukleotidit, joita ei täysin pilkottu, johtaa siksi yliarvioida aktiivisuus seerumin RNaasi.

FRET määritystä käytettiin tutkimuksessamme tallentaa fluoresoiva intensiteetti reaaliajassa, jotta vältetään reaktion päättyminen prosessi ja puhdistusvaiheen. Tallennus fluoresenssisignaali muutokset reaaliajassa, ja käyttämällä FRET koetin, joka on vain yksi RNaasi A: katkaisukohta, ilmeisesti mahdollisti tarkka laskeminen K

obs reaktiolle.

Tässä tutkimuksessa, FRET perustuva menetelmä on perustettu mittaamiseksi seerumissa RNase tasoilla johdonmukaisesti suuri herkkyys havaita niinkin alhainen kuin 1 x 10

-7 ug /ul RNaasi. Tässä tutkimuksessa suorituskyky spektrofluoro- järjestelmällisesti optimoitu käyttäen Ramanspektri vettä. Tämä havaittiin parantaa mittauksen laatu ja toistettavuus testien välillä. Soveltamalla 2 ml reaktion tilavuus, olimme todella pystyy mittaamaan seerumin RNaasi tasolla ilman sarjalaimennokselle, millä vältettiin potentiaalinen poikkeama aiheuttama 1000 ajan laimennoksella muiden protokollien.

uudelleen löytö RNA on kiinnittänyt enemmän ja enemmän huomiota erilaisiin RNaaseista toimivan RNA muutos ja aineenvaihduntaa. Siten luotettava menetelmä RNaaseista detektiomenetelmä voi olla uskottava tällaisia ​​tutkimuksia. FRET määritys osoitettu nyt esillä olevassa tutkimuksessa ei rajoitu vain RNaasi mittaus seeruminäytteessä, mutta voidaan käyttää myös monissa muissa kliinisissä kokeissa ja tieteellisiä analyysejä. Kanssa tulosten tulkinta, kuten havaitaan lasku RNaaseista aktiviteettia seerumissa tietyntyyppisten syöpäpotilailla, viljan varovaisuutta on otettava, koska emme olleet lääkityksen eri potilaiden huomioon, ja on tarpeen onko mitään lääkitystä voi estää RNase A toimintaa. Lavastus saavilla potilailla seerumin RNaasi mittaus on tietysti yksi tärkeimmistä tekijöistä, jotka katsovat ennen otettaisiin RNaasi mahdollisena biomarkkerina, ja tästä syystä enemmän varhaisvaiheen potilaiden syöpiä tulisi testata jäljittää alkuperäiseen havaitseminen laskua RNase A aktiivisuuden .

Materiaalit ja menetelmät

Ihmisen Näytteenotto ja eettinen lausunto

Tämä tutkimus on seurannut Helsingin julistuksen, ja johdetaan periaatteiden mukaisesti hyväksymien eettinen Review hallitusten Cancer sairaala, Kiina Academy of Medical Sciences (Peking, Kiina). Kirjallinen suostumus oli säädetty näytteiden keräämistä ja myöhempää analysointia. Kaikkiaan 431 seeruminäytteet kerättiin terveiltä yksilöiltä ja syöpäpotilaiden ja analysoitiin tutkimuksessa. Ominaisuudet syöpäpotilaan kuvattiin taulukossa 1. seerumit säilytettiin -80 ° C: ssa keräämisen jälkeen.

Oligonucleotide Synthesis ja valmistus

Kaksi täydentävää ja fluorofori-leimatun RNA oligonukleotidien sekvenssien kanssa 5′-FAM-AUGAGCCUGAUUU ja 5′-TAMRA-AAAUCAGGCUCAU syntetisoitiin ja puhdistettiin TAKARA (Dalian, Kiina). Pitoisuudet RNA-oligonukleotidi määritettiin mittaamalla absorptio 260 nm: ssä, käyttäen Nanodrop spektrofotometriä. Ekstinktiokerroin mitattiin myös 260 nm: ssä, mikä johtaa 140860 L /(mol * cm) ja FAM-leimatun RNA-oligonukleotidi ja 156900 L /(mol * cm) varten TAMRA-leimatun RNA-oligonukleotidi. Kahden toisiaan täydentävän RNA oligonukleotidit sekoitettiin hehkutus puskuriin (5 mM Tris-HCl, pH = 7,6, 10 mM NaCl), jonka pitoisuus on 5 uM. Seosta inkuboitiin 95 ° C: ssa 5 min ajan lämpösyklilaite, ja sitten lämpötila laskettiin 5 ° C: ssa 5 minuutin välein, jotta duplex muodostumista. Tuloksena duplexes tarkastettiin 20% polyakryyliamidigeelillä ja visualisoitiin SYBR Gold värjäytymistä (Molecular Probes, Eugene, OR, USA).

FRET-määritys

Fluoresenssimääritykset tehtiin FRET puskurissa (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,002 MgCl

2), käyttäen QuantaMaster 30 spektrofluorometrillä (Photon Technology International, Birmingham).

2 ml FRET puskuria, 10 nM RNA duplex lisättiin jatkuvasti sekoittaen. Viritysaallonpituus asetettiin 480 nm ja emissio spektrin signaali mitattiin välillä 500-650 nm. Kasvu fluoresenssiemissio 515 nm: ssä osoittaa etenemisen RNA pilkkominen. Esimerkki kerättyjen on esitetty kuviossa 2C.

Tietojen normalisointi, ehjä 13 emäsparin siRNA analysoitiin duplex ohjaus, ja täysin pilkkoa siRNA sisällytettiin hajoamista ohjaus. FAM fluoresoiva intensiteetti muunnettiin kuten hajoamisen suhteen määrittelemällä alhaalta ja ylhäältä loisteputki intensiteetit kuin 0% ja 100%. Normalisoituminen menetelmä mainittiin kuvassa 3. Fluoresoivat lukemat asennettu yhden eksponenttiyhtälöä (punainen viiva) saada nopeusvakio K

obs. Prosentuaalinen hajoaminen tiettynä ajankohtana laskettiin 100 × AF /AF

max (kuvio 3A).

Jotta RNaasittomalla kunnossa, asetamme virityksen aallonpituudella 480 nm ja tutkittiin päästöjen välillä 500-650 nm ehjän alustoille. Ehjä alustan osoittaa alhainen signaalin 515 nm ja korkea signaali 575 nm, kun taas huonontuneen tuotteita johtaa kohonnut signaaleja 515 nm.

Mukaan kuvaus edellä, kun kaksi leimattua 13-emäsparin siRNA 2 ml FRET puskuri sekoitetaan RNaasi A: liuosta tai seeruminäytteet, fluoresenssi FAM kasvaisi. Muutos fluoresenssin seurattiin ajan kanssa eksitaatioaallonpituudella asetettu 480 nm: ssä ja emissio 515 nm: ssä. Yhden-liikevaihdon kinetiikka analyysi, nopeusvakio k

obs ja amplitudi maksimaalinen hajoaminen F

max johdettiin sovittamalla kokeelliset tiedot yhden eksponenttiyhtälöä:

.

Identification RNaasi pilkkomiskohtia

paikantaa RNaasi pilkkomiskohdat, dsRNA hajoamistuotteet uutettiin ja kloonattiin käyttäen mall RNA geeliuuttokittiä ja -kloonaustarvikesarjaa Takara (Kioto, Japani).