Krooninen sairaus

tiivistelmä

Jotta tutkia tehokas hyödyntäminen kasvien resursseja kosteikot mahdolliset anti -metastatic vaikutukset flavonoidien

poimuvita

L. tutkittiin ihmisen munasarjan syöpäsolujen (ES-2). Kaksi suurta flavonoideja, luteoliini-3′-O-β-D-glukopyranosidi ja flavoni-6-C-β-D-glukopyranosidi, eristettiin

P

.

crispus

ja tunnistettu. Näiden vaikutukset flavonoidien soluproliferaatioon, solujen morfologia, solusyklin, apoptoosin, ja solumigraatio ja invaasiota Sitten tutkittiin. Lisäksi RT-PCR määritykset ja western blotting-analyysi tehtiin ekspression tutkimiseksi mRNA-tason ja proteiinia. Tulokset osoittivat, että Luteolin-3′-O-β-D-glukopyranosidi inhiboi ES-2 solumigraation ja invaasion ja tukahdutti ilmaisu kahden matriisin metalloproteinaasien (MMP: t), MMP-2 ja MMP-9, ja flavone-6-C-β -D-glukopyranosidi ei ollut merkittävää estävää vaikutusta ES-2-soluissa. Näin ollen tämä tutkimus osoitti mahdollisia anti-metastaattisen ominaisuudet

P

.

crispus

flavonoidi, ja tarjosi tieteellistä lähestymistapaa seulontaan lupaavia luonnonvaroja kosteikot tunnistamaan hyödyllisiä tuotteita käytettäväksi lääke- ja terveydenhuollon aloilla.

Citation: Du Y, Feng J Wang R, Zhang H, Liu J (2015) vaikutukset flavonoidien

poimuvita

L. leviämisen estämistä, Migration, ja Invasion of Human munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 10 (6): e0130685. doi: 10,1371 /journal.pone.0130685

Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Etelä-Korea

vastaanotettu: 03 helmikuu 2015; Hyväksytty: 24. toukokuuta 2015 Julkaistu: 22 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Du et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee taloudellisesti National Natural Science Foundation of China (nro 31200426), National Water Special Project (nro 2012ZX07203-004), tiede- ja teknologia Planning Project Shandongin maakunnassa (nro 2011GGH21605), ja Natural Science Foundation Shandongin provinssissa Kiinassa (No.ZR2014YL001). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kasvit avainasemassa rakentamisessa suunniteltu kosteikkoympäristöissä ja niitä tulisi hallita tiukasti ylläpitämään kosteikon tehokkuus minimoiden riskin toissijainen pilaantumista ja haitallisia ekologisia vaikutuksia ekosysteemiin. Tehokas hyödyntäminen korkean biomassan kosteikko kasvi resurssit on tärkeä, koska se kannustaa korjuu ja kestävä hoito kosteikot.

poimuvita

L. on yksi tärkeimmistä kasveista työskentelee rakennettu kosteikkojen ekosysteemeihin [1]. Aiemmat raportit ovat tunnistaneet karotenoideja, rasvahappoja, lignaanista, labdane diterpenoidit, flavonoideja ja phytosterins in

P

.

crispus

[2-5], ja Karotenoidiuutteiden välillä

P

.

crispus

ilmoitettiin apoptoosin HeLa-soluissa

in vitro

[6]. Alustavien tutkimus osoitti kasvainten vastainen toiminta

P

.

crispus

uutetta ihmisen rinta- ja munasarjasyövän solulinjoissa [7], ja kemialliset analyysit ehdotti flavonoideja olevan tärkeimmät ainesosat tätä uutetta.

On hyvin tunnettua, että flavonoidit on laaja valikoima biokemiallisten toimintaa ja niillä on tärkeä rooli ihmisen terveydenhuollon alalla [8-9]. Epidemiologiset ja kliiniset tiedot osoittavat, että ruokavalion flavonoidien tekevät ratkaisevan panoksen ehkäisyyn ja /tai kroonisen sairauksien, kuten syövän, diabeteksen, sydän- ja verisuonitaudit ja ihmisen immuunikatovirus infektion, [10-14]. Viimeaikainen tutkimus flavonoidi ominaisuuksista on keskittynyt niiden sytotoksisia antituumorivaikutuksia, ja kokeelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että flavonoidit tukahduttaa muuttoliike ja invaasio, vaikuttaa solusyklin etenemistä ja indusoivat apoptoosin useissa tuumorisolulinjoissa [15-16].

syöpä etäpesäke on johtava kuolinsyy potilailla, joilla on pahanlaatuisia kasvaimia, ja sen arvioidaan olevan vastuussa 90% ihmisen syöpään liittyvien kuolemien [17]; se siis edelleen merkittävä haaste syövän hoidossa. Hajoamista soluväliaineen (ECM) on tärkeä ominaisuus, etäispesäkekasval- ja tämä prosessi liittyy yli-ilmentyminen matriksin metalloproteinaasien (MMP: t) [18-19]. On raportoitu, että luteoliini ja baicalein flavonoidit estävät etäpesäkkeiden tukahduttamalla ilmentymisen ja erittymisen MMP2 ja MMP9 ihmisen rinta- syöpäsolujen (MCF-7 ja MDA-MB-231) ja maksasyövän soluissa (MHCC97H) [20-22] . On kuitenkin epäselvää, onko flavonoideja on antimetastaattisia vaikutuksia munasarjasyöpäsoluja.

Tässä tutkimuksessa olemme puhdistettu kaksi flavonoidien

P

.

crispus

ja tutkitaan niiden vaikutukset ihmisen munasarjasyöpä ES-2 solulinjassa. Lisääntyminen, morfologia, solusyklin etenemistä, apoptoosin, muuttoliike, ja invaasion näitä soluja tutkittiin tavoitteenaan valaisemaan vaikutuksista

P

.

crispus

flavonoideja on ES-2-solut ja niihin liittyvistä mekanismeista.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

kenttätutkimus ja näytekokoelmatodistuksesta mukana tässä tutkimus tehtiin virallisen luvalla Environmental Protection Bureau of Weishan County ja hallintokomitealle Xinxue River rakennettu kosteikko. Kenttätyö ei liittynyt uhanalaisten tai suojeltujen kasvilajien tai eläinlajeja. Laboratorio protokolla hyväksyttiin Shandongin yliopistossa eettinen komitea.

valmistaminen kasviaineksen

P

.

crispus

kerättiin vuonna Xinxue River rakennettu kosteikko (117,16 ° E, 34.78 ° N), kello Nansi Lake, Weishan maakunta, Kiina. Kokoelma tehtiin heinäkuun alussa, kun

P

.

crispus

oli suurin biomassaa. Koko kasvi kuivattiin, jauhettiin ja uutettiin etanolia kuumentamalla palautusjäähdyttäen kolme kertaa, 90 minuuttia per uuttamalla. Etanoli uute suspendoitiin sitten veteen ennen eristäminen petrolieetterillä (PE), etyyliasetaatti (EtOAc), ja n-butanoli peräkkäin; Näiden konsentroitiin tyhjiössä, jolloin saatiin PE-uute, EtOAc-uute, ja n-butanolia uutetta. Perustuen aiempien tutkimusten [7], EtOAc-uute valittiin edelleen erottamiseen. EtOAc-uute kromatografoitiin MCI silikageelipylväässä, jonka jälkeen Sephadex LH-20-pylväskromatografialla, kaksi tärkeintä yhdisteet Sitten valmistetaan käyttämällä korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) (Agilent 6270, USA). Molemmat yhdisteet tunnistettiin HPLC, ydinmagneettinen resonanssi (NMR) (AVANCE 600, Bruker, Saksa), ja korkean resoluution sähkösumutus ionisaatiomassaspektrofotometrisesti (HR-ESI-MS) (LTQ Orbitrap XL, ThermoFisher, USA).

Soluviljely ja käsittely

ES-2 ihmisen munasarjasyövän solulinja saatiin Shandong Analysis ja Test Center elokuussa 2014. Soluja viljeltiin RPMI-1640-alustassa (HyClone, USA) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco, Life Technologies, USA) ja antibiootteja (100 ug /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä) (HyClone). Soluviljelmät pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2. Yhdisteet liuotettiin pitoisuutena 0,1 M 100% dimetyylisulfoksidiin (DMSO) (Solarbio, Kiina) muodostamiseksi kantaliuoksia, säilytettiin -20 ° C: ssa, ja laimennettiin ilmoitettuina pitoisuuksina väliaineen kanssa ennen kutakin koetta. Lopullinen DMSO-konsentraatio ei ylittänyt 0,1% koko tutkimuksen, ja kaikki valvonnan ryhmät altistettiin 0,1% DMSO: ta.

Soluproliferaatiomääritys

Flavonoidi vaikutuksia soluproliferaatiota arvioitiin käyttämällä MTT (tiatsolyylisininen liumbromidi) (Solarbio) määritys. ES-2-solut ympättiin (1 x 10

4 kuoppaa kohden) 96-kuoppaisen levyn RPMI-1640, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Sen jälkeen kun oli inkuboitu yli yön 37 ° C: ssa, 5% CO

2, eri pitoisuuksia (15-240 ug /ml), ja yhdisteet lisättiin kolmeen rinnakkaiseen kuoppiin. Kun oli inkuboitu 48 tuntia, MTT lisättiin kuhunkin kuoppaan saavuttaa lopullinen konsentraatio 0,5 mg /ml, ja inkubointi suoritettiin vielä 4 tuntia. Sitten väliaine korvattiin pysäytysliuosta (DMSO; 150 ui kuoppaa kohti) ja absorbanssi 490 nm: ssä mitattiin levylukijalla (EnSpire, Perkin Elmer Corporation, USA). 0,1% DMSO valvonta mitattiin rinnakkain. Sytotoksisuus ilmoitettiin eston määrä, joka laskettiin seuraavasti: jossa A

kontrolli = absorbanssi kontrollikuopissa;

näyte = absorbanssi käsiteltyjen kuoppien;

0 = absorbanssi nollakoekuoppien. Alkuperä 7.5 ohjelmistoa käytettiin analysointiin ja laskea IC

50-arvot. Määritykset toistettiin ainakin kolme kertaa.

Observation solumorfologian

ES-2-soluja viljeltiin, kuten on kuvattu solulisäkasvumääritykselle. Soluja käsiteltiin 30 tai 60 ug /ml luteoliini-3′-O-β-D-glukopyranosidi (LU3’O-GP) tai 100 ug /ml flavoni-6-C-β-D-glukopyranosidi (FL6C-GP ). Solujen morfologia havainnot tehtiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu 48 tuntia, käyttämällä käännettyä fluoresenssimikroskooppia (Ti-S, Nikon, Japani).

solusyklin etenemisen määritys

ES-2-solut (5 x 10

4 per kuoppa) ympättiin 6-kuoppaiselle levylle ja niitä inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ennen kuin lisättiin ilmoitettu yhdisteet valmistettiin täydelliseen media 48 tuntia. Sitten solut kerättiin trypsiinikäsittelyllä, pestiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) ja kiinnitettiin 70% etanolilla 4 ° C: ssa 2 tuntia. Solut pestiin kahdesti PBS: llä ja sentrifugoitiin nopeudella 2000 rpm 5 minuutin ajan; supernatantti heitettiin pois. Solut suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan PBS: ää, joka sisälsi RNAasi (50 ug /ml) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 min; reaktio lopetettiin sitten asettamalla jäissä 2 minuuttia. ES-2 solut värjättiin inkuboimalla 10 ug /ml propidiumjodidilla (PI) ja 0,1% Triton X-100 pimeässä 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Näytteet analysoitiin virtaussytometrialla (FACSAria, BD, USA), ja tulokset analysoitiin FlowJo 7.6.1.

Cell apoptoosimäärityksessä

anneksiini-V-PE /7-AAD apoptoosin havaitseminen kit (BD Pharmingen, USA) käytettiin tutkimaan vaikutuksia testiyhdisteiden apoptoosin ES-2-soluissa. Anneksiini V: on proteiini, jolla on suuri affiniteetti fosfatidyyliseriini (PS). Apoptoosin aikana, PS translokoituu sisäpinnasta plasmamembraanin solun pintaan, jossa se voidaan havaita käyttäen fluoresoivaa anneksiini V-konjugaatti. ES-2-soluja viljeltiin ja ympättiin, kuten yllä on kuvattu solusyklin etenemisen määrityksessä. Inkuboinnin jälkeen

P

.

crispus

flavonoideja 48 tuntia, solut kerättiin trypsinoimalla, pestiin kahdesti PBS: llä, ja suspendoitiin uudelleen 400 ul: aan sitovaa puskuria ennen kuin lisättiin 5 ui anneksiini V-PE, inkubaation pimeässä 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan, ja värjäys 10 ui 7-AAD ratkaisu. Näytteet analysoitiin virtaussytometrialla (FACSAria, BD) inkuboinnin jälkeen pimeässä 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan, ja tulokset analysoitiin FlowJo 7.6.1 ohjelmisto. Apoptoottisia ja nekroottinen solut tunnistettiin anneksiini V positiivinen /7-AAD negatiivisesti värjätty ja anneksiini V positiivinen /7-AAD positiivista värjäytymistä, vastaavasti.

Cell migraatiokokeessa

Cell muuttoliike määritykset suoritettiin käyttämällä Transwell kammiot (Corning Costar, USA) Transvvell- kammio täytettiin väliaineen ja 0,1% naudan seerumialbumiinia (BSA) (Gibco, Life Technologies) sisällytettiin seerumia ylemmässä kammiossa, ylläpitää osmoottista painetta. ES-2 solut altistettiin ilmoitetut flavonoidien pitoisuudet seerumittomassa väliaineessa 48 h ennen solujen lisäämistä (2 x 10

5) ylempään Transwell kammioon. Alaosaan sisälsi väliainetta, jossa 5% FBS palvelemaan chemo-houkutinta. Kammiot inkuboitiin 24 tunnin ja ei-muuttoliike solujen ylä- puolella Transwell kalvon poistettiin käyttäen vanupuikoilla. Kalvo kiinnitettiin 100% metanolia; siirrettyjä jälkeen solut värjättiin 0,1% kristallivioletilla 10 minuutin ajan, ja pestiin kolme kertaa PBS: llä. Kalvo valokuvattiin mikroskoopilla ennen pestiin 33% etikkahappo; absorbanssi eluentin mitattiin 590 nm: ssä levynlukijalla (EnSpire, Perkin Elmer Corporation).

Cell invaasiomääritys

Solun hyökkäystä määritettiin käyttämällä edellä kuvattua protokollaa varten solujen vaeltamiseen määritys, paitsi että Transwell kammio päällystettiin Matrigelillä (BD Pharmingen) ja väliaine oli vapaa BSA.

eristäminen kokonais-RNA ja RT-PCR (RT-PCR) määritys

ES-2-solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle (4 x 10

5 solua kuoppaa kohti) ja inkuboitiin yön yli ennen käsittelyä eri pitoisuuksilla LU3’O-GP (0, 30, 60, 90 ug /ml ) 48 tuntia. Solut kerättiin trypsinisaatiolla ja pestiin PBS: ssä. Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol (Invitrogen Life Technologies) ja 5 mg käytettiin cDNA: n syntetisoimiseksi käyttämällä M-MLV (Invitrogen Life Technologies). CDNA monistettiin käyttäen seuraavia alukesekvenssejä (BGI, Kiina):

MMP2, eteenpäin, 5′-GTTCATTTGGCGGACTGT-3 ’, kääntää, 5′-AGGGTGCTGGCTGAGTAG-3’;

MMP9 , eteenpäin, 5′-AATCTCACCGACAGGCAGCT-3 ’, kääntää, 5′-CCAAACTGGATGACGATGTC-3’;

Glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), eteenpäin, 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 ’, kääntää, 5’ -CATGGGTGGAATCATATTGGAA-3 ’.

PCR suoritettiin käyttäen seuraavaa ohjelmaa: 95 ° C 5 min; sitten 45 sykliä 95 ° C: ssa 10 s; 55 ° C: ssa 15 s; ja 72 ° C: ssa 10 s. Sitten näytteet kuumennettiin (72 ° C: ssa 10 min) ja jäähdytettiin 4 ° C: ssa. GAPDH: ta käytettiin RNA loading ohjaus. PCR-tuotteet erotettiin 1% agaroosigeeleillä ja havaitaan etidiumbromidivärjäyksellä. Tulokset analysoitiin BandScan5.0.

Western blotting -analyysi

ES-2-solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle (4 x 10

5 solua kuoppaa kohti) ja inkuboitiin yön yli ennen hoitoa eri pitoisuuksilla LU3’O-GP (0, 30, 60, 90 ug /ml) 48 tuntia. Solut suspendoitiin 500 ul: aan lyysipuskuria 4 ° C: ssa (40 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM KCI, 100 mM NaVO3, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, pH 7,5). Proteiinit erotettiin 10% natriumdodekyylisulfaattia-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Kalvot tämän jälkeen tukittiin käyttämällä rasvatonta maitoa 5%: Tris-puskuroitu suolaliuos, jossa Tween-20 (TBST) 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan ja inkuboitiin yön yli primaarisilla vasta-aineilla (MMP-2-vasta-aine: Santa Cruz Biotechnology, USA; MMP-9 vasta-aine: RabMab, Abcam, UK) TBST, joka sisälsi 5% rasvatonta maitoa 4 ° C: ssa. Membraanit inkuboitiin sitten sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Bändit havaittiin tehostetulla kemiluminesenssin ja valokuvataan; tulokset analysoitiin Image J ohjelmisto.

Tilastollinen analyysi

Kutakin määritystä varten, kolmena kokeet suoritettiin, ja tulokset esitetään keskiarvona ± standardipoikkeama (SD). Merkitys ryhmäeroja tutkittiin käyttämällä Studentin kaksiosaisella t-testiä (Microsoft Excel-ohjelmisto).

Tulokset

tunnistaminen kahdesta

P

.

crispus

flavonoideja

HPLC, NMR, ja HR-ESI-MS suoritettiin eristää ja tunnistaa kaksi yhdisteiden

P

.

crispus

EtOAc-uute. Nämä yhdisteet identifioitiin ja karakterisoitiin Luteolin-3′-O-β-D-glukopyranosidi (LU3’O-GP) ja flavoni-6-C-β-D-glukopyranosidi (FL6C-GP) vertaamalla niiden spektritiedot (HPLC , HR-ESI-MS,

1 H ja

13C-NMR) ja fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien kanssa raportoitu kirjallisuudessa [23-25]. Tämä on ensimmäinen raportti louhinnan näiden kahden flavonoidien

P

.

crispus

. Molekyylirakenne kaksi yhdistettä on esitetty kuviossa 1, ja puhtaus sekä yhdisteiden oli yli 90% (kuviot A ja B S1 File).

LU3’O-GP inhiboi ES- 2-solujen lisääntymisen

ES-2 munasarjasyövän soluja inkuboitiin 48 h viidellä eri pitoisuuksia LU3’O-GP tai FL6C-GP. MTT-määritystä tulokset osoittivat pitoisuudesta riippuvaa vähenemistä solujen elinkelpoisuuden läsnä ollessa LU3’O-GP (kuvio 2). Solujen elävyys laski 63,8% ja 73,6% 48 tunnin kuluttua altistumisesta 120 ja 240 ug /ml LU3’O-GP, vastaavasti, ja IC

50-arvo oli 57,1 ug /ml. Sama pitoisuudet FL6C-GP oli huomattavasti pienempi vaikutus solujen elävyyden ja tämä yhdiste oli IC

50-arvo 182,7 ug /ml. Nämä tulokset osoittivat, että LU3’O-GP inhiboivat ES-2-solujen pitoisuudesta riippuvalla tavalla.

Soluja inkuboitiin viisi eri flavonoidien pitoisuus tai dimetyylisulfoksidia (DMSO; kontrolli) 48 tunnin ajan. Tiedot edustavat keinot rinnakkaisessa kokeessa ± keskihajonta (SD) *

p

0.01.

LU3’O-GP vaikuttaa ES-2 morfologia

Morfologiset tutkimukset tehtiin edelleen vaikutuksen tutkimiseksi LU3’O-GP ES-2-soluissa. ES-2-soluja käsiteltiin pitoisuuksilla LU3’O-GP liittyy alhainen sytotoksisuus (30 ja 60 ug /ml) tai 100 ug /ml FL6C-GP. Kuvat saatu käänteinen mikroskopialla sen jälkeen, kun 48-tunnin inkuboinnit on esitetty kuviossa 3. Ohjaus- ja FL6C-GP vertailu solut osoittivat klassisen karan solu, joka havaittiin munasarjojen kasvainsoluissa. Solut käsiteltiin LU3’O-GP osoitti merkittävää menetystä liikkuvuutta ja muutoksia solujen morfologian; suuret morfologinen muutos oli, että cytomere muotoon, josta tuli pallomainen, jossa on lyhennetty lonkero. Nämä muutokset tapahtui pitoisuudesta riippuvalla tavalla. FL6C-GP hoito ei tuottanut merkittävää muutosta verrattuna kontrollisoluihin. Nämä tulokset osoittivat, että LU3’O-GP voi muuttaa solun morfologia ES-2-solut ja ehdotti sen mahdollinen vaikutus solun liikkuvuutta.

ES-2-soluja käsiteltiin osoitetuilla

P

.

crispus

flavonoideja 48 tuntia, ja kuvattiin käyttämällä käännettyä fluoresenssimikroskooppia.

LU3’O-GP aiheuttama solukierron pysähtymisen ES-2-solut

onko

P

.

crispus

flavonoidit vaikuttavat solusyklin, ES-2-soluja käsiteltiin joko LU3’O-GP tai 100 ug /ml FL6C-GP vertailun, ennen analysointia virtaussytometrisesti. Tulokset (kuvio 4) osoitti, että LU3’O-GP hoidon aiheuttama pitoisuudesta riippuvainen määrä kasvaa solujen G0 /G1 vaiheeseen, ja pienenee solujen määrä S-vaiheessa, kun taas FL6C-GP hoito ei ollut merkittäviä vaikutuksia solusyklin etenemisen ES-2-soluissa. Nämä tulokset osoittivat, että LU3’O-GP vaikuttaa ES-2 solusyklin etenemisen aiheuttamalla solukierron pysähtymisen klo faasirajalla G1 vaihe ja S-vaiheessa.

(a) Negatiivinen kontrolli; (B) solut käsiteltiin 100 ug /ml flavoni-6-C-β-D-glukopyranosidi (FL6C-GP); (C) solut käsiteltiin 30 ug /ml luteoliini-3′-O-β-D-glukopyranosidi (LU3’O-GP); ja (d) solut käsiteltiin 60 ug /ml LU3’O-GP. Solut kiinnitettiin etanoliin ja värjättiin propidiumjodidilla ennen solusyklin jakautuminen analyysi virtaussytometrialla. Solujen määrä in G0 /G1 vaihe edustaa ensimmäinen huippu, ja ne, G2 /M-vaiheen edustaa toinen piikki. Soluja S-vaiheessa on läsnä alueella välillä G0 /G1 ja G2 /M-huiput. Nämä tiedot edustavat keskiarvoa kolmesta kokeesta. *

p

0,01 verrattuna kontrolli.

P

.

crispus

flavonoideja ei ollut vaikutusta apoptoosin ES-2-soluissa

Apoptoosi on aktiivinen ja fysiologinen tila solukuoleman, joka on yleisesti palautetaan syöpälääkkeet. Virtaussytometria käytettiin määrittämään onko LU3’O-GP vaikuttaa ES-2 apoptoosin. Kuten kuviossa 5 on esitetty, solupopulaation Q3 vyöhykkeellä edustaa apoptoottisten solujen, jotka olivat anneksiini V: positiivinen ja 7-AAD negatiivinen. Tämä väestön ei osoittanut ilmeisiä muutoksia läsnä LU3’O-GP tai FL6C-GP, viittaa siihen, että

P

.

crispus

flavonoideja ei ollut vaikutusta apoptoosin ES-2-soluissa.

(a) Negatiivinen kontrolli; (B) solut käsiteltiin 100 ug /ml flavoni-6-C-β-D-glukopyranosidi (FL6C-GP); (C) solut käsiteltiin 30 ug /ml luteoliini-3′-O-β-D-glukopyranosidi (LU3’O-GP); (D) solut käsiteltiin 60 ug /ml LU3’O-GP. Apoptoottisia soluja esitetään Q3.

LU3’O-GP esti muuttoliike ja hyökkäys ES-2-solut

soluliikkuvuus pidetään tärkeä tekijä metastaattisen potentiaalin syöpäsoluja. Vaikutus LU3’O-GP motiliteettia ES-2 syöpäsolujen tutkittiin käyttäen solujen vaeltamiseen määrityksessä. Kuten kuviossa 6, migraation ES-2-solujen väheni huomattavasti pitoisuudesta riippuvaisella tavalla altistumisen jälkeen LU3’O-GP. Tämä inhibitio oli noin 67,7% ja 88,1%, verrattuna kontrollisoluihin, kun läsnä on 30 ja 60 ug /ml LU3’O-GP, vastaavasti. Soluja käsiteltiin FL6C-GP ei osoittanut merkittävää muutosta siirtymätesteissä aktiivisuutta, verrattuna kontrollisoluihin.

Solut altistettiin osoitettujen konsentraatioiden luteoliini-3′-O-β-D-glukopyranosidi (LU3 ” O-GP) ja flavoni-6-C-β-d-glukopyranosidi (FL6C-GP), ja että niiden siirtymä kvantitoitiin käyttäen Transwell kammioon. Arvot edustavat kolmen kerrannaiskuopan kokeissa. *

p

0,01, verrattuna kontrolliin; #

p

0,05, verrattuna ilmoitetun pitoisuuden.

aikana kasvaimen etäpesäke, solut täytyy kulkea ECM. Sen arvioimiseksi, LU3’O-GP vaikuttaa ES-2 cell invasion, soluinvaasiota määritykset suoritettiin Transwell kammiossa päällystetty Matrigel. Treatment of ES-2-soluja kasvavien pitoisuuksien kanssa LU3’O-GP johtanut merkittävään pitoisuudesta riippuvainen lasku soluinvaasion nopeudella, verrattuna kontrolliin (kuvio 7). Tämä prosessi estyi noin 73,7% ja 89,9%, kun läsnä on 30 ja 60 ug /ml LU3’O-GP, vastaavasti, kun taas esto indusoi 100 ug /ml FL6C-GP oli vain 6,7%. Tulokset tästä määrityksessä osoitti, että LU3’O-GP dramaattisesti esti hyökkäyksen ES-2-soluissa.

Soluja käsiteltiin luteoliini-3′-O-β-D-glukopyranosidi (LU3’O-GP ) tai flavonin-6-C-β-d-glukopyranosidi (FL6C-GP), ja niiden invaasio kvantitoitiin Transwell kammiossa kalvon kanssa Matrigeliä. Arvot edustavat kokeiden avulla suoritettiin kolmena rinnakkaisena. *

p

0,01, verrattuna kontrolliin; #

p

0,05, verrattuna ilmoitetun pitoisuuden.

edelleen vaikutuksen määrittämiseksi LU3’O-GP ylävirran tekijät ovat tärkeitä säätelyssä kasvainsolun invaasiota, mRNA ja proteiini ilmentymistä MMP2 ja MMP-9 tutkittiin. RT-PCR-määrityksen tulokset on esitetty kuviossa 8. tasot MMP2 ja MMP9 mRNA: t vähenivät pitoisuudesta riippuvaisella tavalla käsittelemällä LU3’O-GP, Western blotting -analyysi (kuvio 9) osoitti samanlaista tukahduttaminen MMP- 2 (pro-MMP2 ja aktiivisuutta MMP-2) ja MMP-9-proteiinin ilmentymisen LU3’O-GP. Nämä tulokset viittaavat siihen, että flavonoidi, LU3’O-GP, tukahdutti ilmaus MMP2 ja MMP-9 sekä mRNA ja proteiini tasoilla.

(a) LU3’O-GP vaikutuksia MMP-2: n ilmentymisen; (B) LU3’O-GP vaikutuksia MMP-9 ilmaisun. mRNA-tasot tutkittiin RT-PCR (RT-PCR), käyttäen glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi, kun lastaus ohjaus. RT-PCR-tuotteet havaittiin etidiumbromidivärjäyksellä. Arvot edustavat kolmen kerrannaiskuopan kokeissa. *

p

0,05, verrattuna kontrolliin.

(a) LU3’O-GP vaikutuksia MMP-2 (pro-MMP-2 ja aktiivisuutta MMP-2); (B) LU3’O-GP vaikutuksia MMP-9 ilmaisun. Proteiini tasot tutkittiin western boltting analyysi. Arvot edustavat kolmen kerrannaiskuopan kokeissa. *

p

0,05 verrattuna kontrolliin.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa kaksi suurta flavonoideja, LU3’O-GP ja FL6C-GP, eristettiin ja tunnistettiin

P

.

crispus

tavoitteenaan selvittää mahdollisuudet antimetastaattisia vaikutusten vuoksi rakennettu kosteikon kasvi resurssi. Etäpesäke on merkittävä kuolinsyy syöpäpotilaiden ja uusien hoito-ohjelmia, jotka estävät kasvaimen levittäminen on ratkaisevan tärkeää onnistuneen syöpähoidon ja ehkäisyyn. Kuitenkin useimmat erittäin sytotoksinen synteettinen syöpälääkkeet hallussaan alhainen spesifisyys; tämä tuottaa vaikutuksia normaaleissa kudoksissa, lisäksi kasvainsolujen, mikä johtaa huonoon kliiniseen tulokseen. Huomattavaa painopiste on siis annetaan tunnistaakseen uusia syöpälääkkeet luonnollisista lähteistä, ja syötävä resurssit ovat erityisen arvokkaita, koska niiden korkea turvamarginaali; monet luonnon ravinnon aineet ovat tällä hetkellä alkuvaiheessa kliinisissä tutkimuksissa [26]. Flavonoidit ovat yksi merkittävimmistä luonnonvaroista tässä yhteydessä. Ravinnon flavonoidit lähes kaikki olemassa glykosidit luonnossa ja runsaimmin kasvi flavonoidi glykosideja ovat flavone O /C-glykosideja ja flavonolia O-glykosidit [27].

LU3’O-GP on flavone O-glykosidin ja FL6C-GP on flavone C-glykosidi. Kuitenkin tässä tutkimuksessa osoitti, että LU3’O-GP tuotetaan merkittäviä ES-2 lisääntymistä, morfologia, solusyklin etenemistä, muuttoliike, ja invaasio, kun taas FL6C-GP ei ollut ilmeistä vaikutusta näihin soluihin. Oletimme, että tämä ero liittyi kaksi eroja näiden yhdisteiden. Ensinnäkin, flavonoidi Aglykonit voi näyttää eri bioaktiivisuuksiin. Luteoliini, aglykonien ja LU3’O-GP, ja jotkut luteoliini C-glykosideja on osoitettu inhiboivan kasvainsolun eloonjäämistä ja etäpesäkkeiden ihmisen eri epithelioid syöpäsoluja, mukaan lukien MCF-7, MDA-MB231, ja LNM35 soluihin [21, 28- 29]. Toiseksi, flavonoidi glykosideja ovat liian vesiliukoisia diffundoitua solumembraanin läpi, kun taas aglykonien ovat hydrofobisia ja ne voidaan helposti syöttää solujen passiivisella diffuusiolla; Deglykosylaatiota flavonoidi glykosidit niiden Aglykonit vuoksi katsotaan olevan ensimmäinen vaihe aineenvaihdunnan, jotka tuottavat vaikutukset

in vivo

[30]. Siksi eri sokeriosiin sidottu flavonoidien Aglykonit voisivat vaikuttaa heidän deglykosylaatiotek- ja aineenvaihdunta jossain määrin ja johtaa eroihin bioaktiivisuuden [31]. Esillä olevassa tutkimuksessa, LU3’O-GP ei indusoinut apoptoosia ES-2-soluissa, vaikka luteoliinia on aiemmin raportoitu aiheuttavan apoptoosia eräissä ihmisen syöpäsoluja ja hiiren neuroblastoomasoluja [32-33]. Siten tuloksemme voidaan saada sellaista näyttöä varten flavonoidi glykosylaation liittyvää vaihtelua toimintaan.

On kuitenkin mahdollista, että vaikutukset glykosylaation flavonoidi bioaktiivisuus

vuonna vitr

o voivat poiketa havaitut

in vivo

. Flavonoidi glykosideja on raportoitu osoittamaan samanlaisia ​​tai jopa suurempia diabeteksen, tulehdusta, anti-jyvästen häviämistä, stressiä, ja allergisille toimintaa kuin niiden flavonoidi Aglykonit

in vivo

[31]. Kaiken kaikkiaan on erittäin vaikeaa tehdä yleisiä johtopäätöksiä vaikutuksista glykosylaation flavonoidi bioaktiivisuuksiin ja lisätutkimusta tarvitaan ymmärtää suhde flavonoidi glykosylaatiota ja bioaktiivisuus

in vivo

ja

in vitro

.

MMP-2 ja MMP-9 ovat ratkaisevan tärkeitä entsyymejä, joiden katsotaan olevan merkittävimpiä prosesseihin invasiivisen etäpesäke ja angiogeneesiä erilaisissa kasvaimissa [34-37]. MMP-9: n ja MMP-2: n ilmentymisen arvot ovat selvästi kohonneet alueella syöpäkasvainten [36, 38]. Siksi MMP-2 ja MMP-9 ilmaisun pitäisi olla etusijalla syöpähoidon aikana. Esillä olevassa tutkimuksessa, ES-2-soluja käsiteltiin LU3’O-GP pitoisuuksina liittyy alhainen sytotoksisuus, jotta voidaan arvioida anti-metastaattisen aktiivisuuden tätä yhdistettä, ja apoptoosimäärityksessä tehtiin myös. Nämä havainnot osoittivat, että LU3’O-GP esti merkittävästi ES-2 solumigraation ja invaasion ja vaikutukset olivat läheistä sukua tukahdutti MMP-2 ja MMP-9 mRNA ja proteiini tasolla ilman sytotoksisten tai apoptoottisia vaikutuksia. Lisäksi, kun otetaan huomioon, että metastaattinen leviäminen tuumorisolujen on monivaiheinen prosessi, johon liittyy useita monimutkaisia ​​fysiologisia tapahtumia, MMP-2 ja MMP-9 ilmentymistä säätelee monimutkainen verkko signalointireittien, joka voidaan aktivoida eri kasvua tekijät, sytokiinit, ja kemikaaleja, kuten PI3K /Akt, p38-MAPK, NF-KB: n, EGFR: n, ERK1 /2, ja TPA, joka toimii kautta useita reittejä, kuten MAPK /ERK-reitin [39-45]. Tämä osoittaa, että mekanismeista etäpesäke voivat olla spesifisiä eri kasvainsolun. Kirkas LU3’O-GP-indusoidun inhibition ES-2 etäpesäkkeitä olisi tarkasteltava muun tyyppisissä kasvainsolun.

P

.

crispus

on laajalti käytetty lajin kosteikot ja sitä olisi korjattu sopivana ajankohtana säilyttää tehokas epäpuhtauden poisto ja välttää toissijainen pilaantumista ja haitallisia ekologisia vaikutuksia. Suuri määrä

P

.

crispus

biomassa voi tehdä sadonkorjuun jälkeen menettelyjä haastava. Luontaistuotteet ja kasviperäisten lääkkeiden ovat lupaavia lähteitä uusia terapeuttisia aineita ihmisen terveydenhuollon alalla [46]. Tässä tutkimuksessa flavonoideja antimetastaattisia aktiivisuutta eristettiin

P

.

crispus

, mikä osoittaa, että tämä laji oli mahdollisia terveyshyötyjä. Tutkimuksemme tarjosi tieteellisen pohjan seulontaan lupaavia luonnonvarojen lähteenä lääkkeiden ja ehdotti mahdollisia lähestymistavan tehokas ja kestävä hyödyntäminen kasvien resurssien kosteikot.

tukeminen Information

S1 File. Korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) analyysi kahden flavonoideja eristetty

P

.

crispus

.

Luteolin-3′-O-β-D-glukopyranosidi (LU3’O-GP) (kuvio a). flavonin-6-C-β-D-glukopyranosidi (FL6C-GP) (kuvio b). HPLC palveluksessa Agela C18-pylvästä (symmetria R 4,6 x 250 mm), metanolilla ja H

2O (40%: 60%) liikkuvana faasina, on virtausnopeudella 1 ml /min 40 min ajan ja käytetään UV /V tunnistus.

doi: 10,1371 /journal.pone.0130685.s001

(TIF) B

Kiitokset

Olemme kiitollisia akateemisen toimittaja ja arvioijat heidän arvokkaasta ehdotukset. Haluamme myös kiittää ammatillisen toimittajat Editage heidän Englanti muokkausta.