PLoS ONE: Mitostatin säätyy alas Human Eturauhassyöpä ja estää Invasive Fenotyyppikuvaus eturauhassyöpäsolujen
tiivistelmä
MITOSTATIN
, uusi otaksuttu tuumorisuppressorigeeniä aiheuttama dekoriini yli-ilmentyminen, ilmentyy useimmissa normaaleissa ihmisen kudoksissa, mutta on selvästi säädellä vähentävästi pitkälle edennyt rinta- ja virtsarakkokarsinoomat . Mitostatin vaikuttaa kielteisesti solujen kasvua, indusoi solukuolemaa ja säätelee ilmaisun ja aktivoinnin tasoja Hsp27. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että ektooppinen ilmentyminen Mitostatin PC3, DU145 ja LNCaP eturauhassyövän solut paitsi indusoi merkittävä väheneminen solujen kasvua, mutta esti myös muuttoliikettä ja invaasiota. Lisäksi Mitostatin esti pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa PC3 ja LNCaP sekä kasvainten muodostumiseen LNCaP-solujen nude-hiirissä. Toimenpiteen kohdentaminen endogeeninen Mitostatin siRNA ja anti-sense strategioita PC3 ja DU145 syöpäsolujen tehosti pahanlaatuinen fenotyyppi molemmissa solulinjoissa. Yhteisymmärryksessä näistä anti-onkogeenisen rooleja, huomasimme, että Mitostatin puuttui ~35% (
n
= 124) eturauhaskasvainnäytteissä ja sen yleinen väheneminen liittyi edennyt syöpä vaiheissa. Yhdessä meidän havainnot osoittavat, että
MITOSTATIN
voi toimii tuumorisuppressorigeeniä eturauhassyövässä ja aikaan uudenlainen solu- ja molekyylitason mekanismi hyödynnettävä edelleen ja avannut ymmärrystämme eturauhassyövän etenemisen.
Citation: Fassan M, D’Arca D, Letko J, Vecchione A, Gardiman MP, McCue P, et al. (2011) Mitostatin säätyy alas Human Eturauhassyöpä ja estää Invasive Fenotyyppikuvaus eturauhassyöpäsolujen. PLoS ONE 6 (5): e19771. doi: 10,1371 /journal.pone.0019771
Editor: Hava Karsenty Avraham, Beth Israel Deaconess Medical Center, Yhdysvallat
vastaanotettu: 31 tammikuu 2011; Hyväksytty: 04 huhtikuu 2011; Julkaistu: 06 toukokuu 2011
Copyright: © 2011 Fassan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ oli osittain tukee Sidney Kimmel Foundation for Cancer Research, Benjamin Perkins virtsarakon syövän Fund ja Martin Greitzer Fund (RB), National Institutes of Health myöntää RO1 CA39481, RO1 CA47282 ja RO1 CA120975 (ja RVI), RO1 DK068419 (AM). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Eturauhassyöpä on tärkein syy syövän liittyvän kuoleman miehillä useimmissa kehittyneissä maissa, ja yleisin maligniteetti Amerikan miehillä. Yhdysvalloissa, yksi yli kahdeksan miestä kehittää eturauhassyöpä elämänsä aikana ja yli 27360 miestä odotetaan kuolevan tautiin tänä vuonna [1].
Molekyyligenetiikka tutkimuksia eturauhassyövän ovat tunnistaneet mutaatioita, deleetioita tai menetykseen tuumorisuppressorigeeneille ilmentymistä potilasryhmissä eturauhassyövän [2]. Kuitenkin johtuen heterogeenisyys eturauhassyövän itse ja polttoväli luonne onkogeenin /kasvainsuppressorigeenin muutoksia, rooli näiden geenien eturauhassyövän synnyssä ja diagnostinen ja /tai ennusteen arvioinnissa tällaisten geenien muutokset on epävarmaa [2].
heterotsygoottisuuden menetys (LOH) huomauttaa läsnäolo estogeenien tiettyinä kromosomialueita kasvaimissa. Useat allelotyping tutkimuksissa raportoitu telomeerisesti osa kromosomin 12 poistetaan erilaisia kiinteitä kasvaimia [3] – [11], mukaan lukien eturauhassyöpä [12].
MITOSTATIN
on uusi oletetun tuumorisuppressorigeenin paikallistaa 12q24.1 [13] – [15] hiljattain tunnettu siitä laboratoriossamme [13]. Olemme aiemmin osoittaneet, että tämä dekoriini aiheuttama 62-kDa: n proteiini ilmentyy useimmissa ihmisen kudoksissa; se vaikuttaa eturauhasen syöpäsolun kasvua ja solukuoleman säätelemällä taso ja aktivoinnin Hsp27 [13]. Olemme myös analysoitiin immunohistokemiallisesti ekspressiota Mitostatin sarjassa ensisijaisen virtsarakon ja rintasyövistä, ja havaittiin väheneminen Mitostatin proteiinin tasojen pitkälle kasvaimen vaiheissa. Lisäksi, Kim ja kollegat ovat äskettäin tunnistettu lukukehyksen on
MITOSTATIN
geenin mahalaukun karsinooma mikrosatelliitti epävakauden [14].
Vaikka biologisen toiminnan Mitostatin eturauhassyövissä ei ole vielä tunnettu, sen suhde dekoriini ja Hsp27 ehdottaa rooli Mitostatin syövän kehittymisessä. Tutkia tuumorisuppressori funktio Mitostatin eturauhassyövässä, me yli-ilmentynyt ja köyhdytettyä endogeenisen Mitostatin proteiinin antisense- ja siRNA strategioita eturauhassyövän solulinjat.
Tässä tutkimuksessa tarjoamme ensimmäinen todiste roolin Mitostatin estämisessä solumigraatioon, invaasiota ja tuumorigeenisyystesti eturauhassyöpäsolujen. Lisäksi meidän tiedot osoittavat, että Mitostatin on säädellä vähentävästi pitkälle ihmisen eturauhasen syöpiä. Siten Mitostatin voisi toimia klassisen tuumorisuppressorigeeniä ja sen ekspression analyysin voi osoittautua hyödylliseksi kliininen markkeri diagnoosia ja ennusteen tähän yhteiseen ihmisen syöpä.
Tulokset
Mitostatin Yli-ilmentyminen eturauhassyöpä solut Estää Pesäkkeenmuodostusta
Koska alkuperäinen lähestymistapa perustaa Mitostatin eturauhasessa käytimme solu otteita neljästätoista eri eturauhasen peräisin olevia soluja, mukaan lukien sekä normaali ja pahanlaatuisten eturauhasen soluja. Käyttäen immunoblottauksella, jossa on Mitostatin-spesifistä vasta-ainetta [13], havaitsimme, että kaikki solulinjat analysoitiin, mutta yksi (
so.
: 1542CP
3TX), ilmaistuna Mitostatin proteiinin eri tasoilla (kuvio 1A). Erityisesti, LNCaP-solut näytetään korkein ilmentymä ja 1532CP
2TX osoitti tuskin havaittavia tasoja endogeenisen Mitostatin (kuvio 1A). Huomattavaa on, että 1542NPTX soluja, jotka ilmentävät Mitostatin, ovat ”normaali” vastineita Mitostatin-negatiivinen pahanlaatuinen 1542CP
3TX soluja.
V: Western blot-analyysi: Mitostatin ilmentyy differentiaalisesti ihmisen eturauhasen syöpäsolu linjat. Proteiini lastaus varmistettiin reprobing kalvon kanssa vasta P-aktiini. B: Western blotit osoittavat ilmentymisen Mitostatin PC3, DU145 ja LNCaP solulinjat Tässä tutkimuksessa käytettiin.
Seuraavaksi keskityttiin tutkii biologisen toiminnan Mitostatin eturauhassyöpäsoluissa transfektoimalla PC3 ja LNCaP-solut, joissa on V5-merkitty Mitostatin cDNA ilmentymiskonstrukti ja PC3 ja DU145-soluissa anti-sense-cDNA-konstrukti. Meillä on myös sijoitettu Mitostatin koodaavan sekvenssin itsensä inaktivoiva retrovirusvektorilla valvonnassa indusoituvan Drosophila HPS70 promoottorin tartuttaa DU145-soluissa. Saimme viisi klooneja stabiilisesti-ilmentäviä Mitostatin (PC3 B2, DU145 Mitostatin, LNCaP B1A, LNCaP B3a ja LNCaP A3A) ja kaksi kloonia, jotka osoittivat alentuneet endogeenisen Mitostatin proteiinin (PC3 M2 ja DU145 M2) (kuvio 1 B). Kolmessa riippumattomassa pesäkemuodostusta määrityksissä, kaikki Mitostatin yli-ilmentyvä solulinjat osoittivat määrän vähenemiseen ja koon pesäkkeitä 15 päivää (kuvio 2 A-C) verrattuna joko vanhempien tai V5-transfektoiduissa soluissa. DU145 Mitostatin, joka on myös klooni, jolla on korkein ekspression Mitostatin verrattuna emo-ekspressioon (4,2-kertainen kasvu, vrt kuvio 1 B), osoitti korkeimman inhibition pesäkemuodostuksen (kuvio 2 B). Kohteisiin, jotka ilmentävät Mitostatin antisense-rakenne osoitti, joko samanlaisia (DU145 M2, kuvio 2 B) tai korkeampi (PC3 M2, kuvio 2A) pesäkkeiden lukumäärä verrattuna emo- tai mock transfektoiduissa soluissa.
Mitostatin yli-ilmentyminen eturauhassyövässä solulinjat [PC3, A; DU145, B; ja LNCaP, C] laski kyky muodostaa pesäkkeitä jälkeen 15 päivää, kun taas solut, joissa ehtyminen endogeenisen Mitostatin proteiinia oli samanlainen (DU145 M2) tai korkeampi (PC3 M2) pesäkkeiden lukumäärä verrattuna emo-soluihin. Pylväät, keskimäärin ruokalaji kolmena kappaleena kokeet;
baareja
, SEM. *
P
0,05; **
P
0,01.
Mitostatin Yli-ilmentyminen Antimikrobiainetta Migration eturauhassyöpäsolujen
On hyvin tunnettua, että dekoriini ja Hsp27 osallistuu solussa muuttoliikettä. Entinen on osoitettu saavan aikaan anti-vaeltavia vaikutus erilaisissa solulinjoissa, joissa eri signalointireittejä [16] – [19], kun taas jälkimmäinen on mukana aktiini uudelleenjärjestely kun solut muodostavat lamellipodioihin [20]. Koska olemme aiemmin havainneet Mitostatin in dekoriini-over-ilmentävien solujen ja osoitti, että Mitostatin estää ilmaisun ja fosforylaatiota Hsp27 eturauhassyövän solulinjoissa [13], pyrimme määrittämään, onko Mitostatin voivat säädellä solujen vaeltamiseen eturauhassyöpäsoluissa. Näin ollen teimme
in vitro
maahanmuuton, joissa käytetään eri Mitostatin yliekspressoiva tai Mitostatin-köyhdytettyä eturauhasen syöpäsoluja. Kaikissa solulinjan testattu, Mitostatin yli-ilmentyminen inhiboi solujen kyky siirtää (kuvio 3A), joka ilmaisee, että Mitostatin säätelee negatiivisesti migraation eturauhasen syöpäsoluja. In Mitostatin-over-ilmentävät LNCaP kloonien estävää vaikutusta muihin Mitostatin muuttoliikettä oli suoraan korreloi proteiinin määrä (
so.
: LNCaP A3A klooni, jolla on korkein Mitostatin lauseke oli hitainta migraatiokokeessa). Kääntäen, eturauhassyövän solut, joissa endogeeninen Mitostatin oli alassäädetty joko antisense strategia (PC3 M2 ja DU145 M2) tai Mitostatin siRNA (PC3-solut) osoitti lisääntynyt solun liikkuvuus (kuviot 3A).
ja
B: Mitostatin yli-ilmentävien kloonien oli vähentynyt muuttavien ominaisuudet verrattuna vanhempien soluihin. Migration arvioitiin maahanmuuton avulla (A) ja haavan paranemista määritykset (B). Solut, joissa alassäätöä endogeenisen Mitostatin proteiini (PC3 M2, PC3 Mitostatin shRNA, ja DU145 M2) osoittivat lisääntyneen pahanlaatuinen käyttäytymistä. Tiedot ilmoitetaan prosentteina muuttoliikkeen
versus
vanhempien soluja.
Sarakkeet
, edustavat kuvat triplikaatit kolmesta itsenäisestä kokeesta;
baareja
, SEM. *
P
0,05; **
P
0,01.
Seuraavaksi määritetään kyky Mitostatin estää migraation eturauhasen syöpäsolujen käyttämällä
in vitro
”wound- paranemista ”motiliteetti määritys [21]. Toisin kuin emosoluista ja PC3 V5 kontrollisoluja (tietoja ei ole esitetty), PC3-B2-solut yli-ilmentävät Mitostatin osoitti huomattavaa laskua kulkeutuminen paljaaksi alueella, sekä 4 ja 8 tunnin kuluttua haavan tekemisen jälkeen (kuvio 3B). Suoritimme saman kokeilu LNCaP ja DU145 solujen ja havaittiin että kaikissa solulinjoissa. Pohjimmiltaan Mitostatin yli-ilmentyminen aiheutti vähenemistä solun liikkuvuus verrattuna vanhempien tai mock-transfektoituja soluja (tuloksia ei esitetä).
Mitostatin Yli-ilmentyminen Estää invaasio ja Cell Adhesion
hankkii syöpäsoluja invasiivisen fenotyypin on kriittinen vaihe syövän etenemiseen. Matrigel päällystettyjä suodattimia käytetään laajasti tutkimaan invasiivisen siirtolaisuutta kolmiulotteinen soluväliaineen [21]. Näin ollen teimme
in vitro
hyökkäyksen määrityksiä arvioida kykyä eturauhassyöpäsolujen hyökätä kautta Matrigel 5% seerumia sisältävässä väliaineessa. Mitostatin yli-ilmentyminen inhiboi solujen invaasio kaikissa testatuissa solulinjoissa (kuvio 4A). LNCaP-over-ilmentävien kloonien inhiboiva vaikutus proteiini, siirtymisestä korreloi suoraan sen proteiinin määrään (LNCaP A3A oli alhaisin kyky hyökätä). Lisäksi havaitsimme lisääntynyt solujen invaasiota PC3 M2 ja DU145 M2 antisense klooneja, ja PC3 Mitostatin siRNA soluja.
V: Mitostatin estää invasiivisia ominaisuuksia eturauhasen syöpäsoluja. Solut, joissa alassäätöä endogeenisen Mitostatin proteiini (PC3 M2, PC3 Mitostatin shRNA, ja DU145 M2) osoittivat lisääntyneen pahanlaatuinen käyttäytymistä. B: Mitostatin yli-ilmentyminen vaikuttaa solujen kykyyn kiinnittyä laminiini. Tiedot ilmoitetaan prosentteina muuttoliikkeen
versus
vanhempien soluja.
Sarakkeet
, edustavat kuvat triplikaatit kolmesta itsenäisestä kokeesta;
baareja
, SEM. *
P
0,05; **
P
0,01.
noudattaminen soluväliaineen on luontainen ominaisuus invasiivisen ja metastaattisen fenotyypin ja vaeltavat solut muodostavat ohimenevä liitteet soluväliaineen. Erityisesti, laminiini-1 on pääasiallinen komponentti Matrigel. Siksi teimme adheesiomäärityksiä ja päällystetty eri Mitostatin-yliekspressoivassa tai Mitostatin-köyhdytettyä syöpäsolujen laminiinille levyillä. Solujen annettiin tarttua laminiinin 2 tuntia ja määrä kiinnittyneitä soluja laskettiin sitten. Solujen määrän, jotka kiinni laminiinin oli merkitsevästi pienempi soluissa yli-ilmentävät Mitostatin verrattuna emo-solujen DU145 ja PC3 solulinjoissa (kuvio 4B), joka osoittaa, että Mitostatin estää solun tarttumista laminiini. Suostumuksella tämän päätelmän, Mitostatin-köyhdytettyä PC3-solut osoittivat lisääntynyttä kyky tarttua laminiini (kuva 4B). Toisaalta puute merkittäviä eroja soluadheesion laminiinin havaittiin LNCaP voitaisiin osittain selittää niiden dokumentoitu alhainen liima kyky
in vitro
[22], [23].
Yhdessä tuloksemme viittaavat siihen, että Mitostatin paitsi estää leviämiskyky eturauhasen syöpäsolujen lisäksi myös kykyä hyökätä monimutkainen kolmiulotteinen matriisi, kuten Matrigel, ja noudattamaan laminiinin kasvualustoja.
Mitostatin yli-ilmentyminen Estää Anchorage riippumaton kasvu ja tuumorigeenisyystesti
tutkimiseksi edelleen hypoteesia, että Mitostatin voi olla suora rooli eturauhasen syövän synnyn, suoritimme ankkurista riippumaton kasvu määritykset ja
in vivo
kasvainten muodostumiseen määrityksissä nude-hiirissä. PC3 B2 solujen korkea Mitostatin ilme ei muodostanut pesäkkeitä, kun taas PC3 M2 alhainen Mitostatin tason todettiin olevan suurentunut pesäkkeiden lukumäärä (kuvio 5A). Lisäksi suurin osa pesäkkeiden PC-3 M2 solut olivat suurempia kuin kontrollisoluissa (tuloksia ei ole esitetty). LNCaP-soluja (kuvio 5A-B) määrän vähentäminen ja ulottuvuus pesäkkeiden suoraan korreloi Mitostatin ekspressiotasoja.
V: Tiedot kolmena viljelmistä vanhempien PC3 ja LNCaP, ja kloonit PC3 V5, PC3 B2, PC3 M2, LNCaP V5, LNCaP B1A, LNCaP B3a, ja LNCaP A3A maljattiin pehmeässä agarissa tuottavien pesäkkeiden suurempi kuin 0,2 millimetriä. Kloonit yli-ilmentävät Mitostatin osoitti heikentymisen pesäkkeitä, kun taas Mitostatin alassäädetty klooni, PC3 M2, oli suurempi määrä pesäkkeiden verrattuna vanhempien soluihin. Pesäkkeet laskettiin 21 päivän jälkeen. *
P
0,05; **
P
0,01 B: Havainnollinen pesäkkeitä LNCaP vanhempien soluja (vasemmalla), LNCaP B1A (keskellä) ja LNCaP A3A (oikealla) on esitetty 21 päivän jälkeen (suurennos x 200).
In vivo
kokeet osoittivat, että ksenograftien peräisin Mitostatin-over-ilmentävät LNCaP-solut olivat merkittävästi pienempiä kuin indusoi LNCaP emosoluista ja LNCaP V5 kontrollisolut (kuvio 6A-B). Kasvaimet johdettu LNCaP B1A ja LNCaP B3a pääsivät keskimääräinen tilavuus 50% ja 25% pienempi kuin kasvaimista peräisin vanhempien soluista. Immunohistokemiallinen analyysi parafinoidut kasvaimia ja immunoblot-analyysit jäädytettyjen ksenograftien (kuvio 6C-D) osoittivat korkeaa Mitostatin ekspressiota LNCaP B1A ja LNCaP B3a ksenografteissa verrattuna perustason ja Mitostatin ilmentymisen esitetty emosoluilta. Mitostatin ilmentyminen transfektoiduissa soluissa lisäksi vahvistettiin immunohistokemiallisella analyyseistä anti-V5 tag-vasta-ainetta (kuvio 6C).
V: ksenoqraftit perustettu sub ihon injektion LNCaP, LNCaP V5, LNCaP B1A ja LNCaP B3a solujen joilta puuttuu kateenkorva (BALB /c
nu /nu
) kasvatettiin 65 päivää. B: Kasvaimen tilavuus eläimillä ruiskutettiin soluja yli-ilmentävät Mitostatin oli merkittävästi laski verrattuna kasvaimia eläimissä ruiskutettiin ohjaus soluilla. Kaavio ilmaisee jakautuminen kasvaimen kokoa muodostettu BALB /c
nu /nu
hiirille kautta 65 päivää. *:
P
0,05. C, D: n immunohistokemiallinen ja immunoblot-analyysi Mitostatin ilmaisun LNCaP ja johdannainen tuumoriksenografteissa. Immunohistokemia suoritettiin käyttäen sekä anti-V5 (ylempi paneeli) ja anti-Mitostatin (alempi paneeli) vasta-aineita. Mitta-asteikko: 50 um.
Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että Mitostatin osallistuu suoraan annoksesta riippuvalla tavalla valvoa yksi tehokkaimmista
in vitro Etsinnän pahanlaatuisia soluja , kuten ankkurointi riippumattomaan kasvuun sekä
in vivo
kasvainten muodostumiseen. Näin ollen, Mitostatin on keskeinen negatiivinen säätelijä transformoidun fenotyypin eturauhassyövän.
Mitostatin Expression on vähentynyt in Advanced eturauhasen karsinoomat
Olemme äskettäin osoittaneet, että Mitostatin ilmentyy kaikkialla normaaleissa ihmisen kudoksissa, mutta sen tasot ovat selvästi heikennettyjä pitkälle edennyt rinta- ja virtsarakon syöpien [13]. Tutkia Mitostatin ilmentymisen eturauhassyövissä, arvioimme qRT-PCR-analyysillä 10 vastaaviin normaaleihin-syöpänäytteissä ja immunohistokemiallisesti (IHC) kolme kudossiruina koostuu 293 yksilöiden lukien 124 eturauhasen syöpiä ja 43 normaali kollegansa. Mitostatin mRNA-tasot olivat merkittävästi säädellä vähentävästi cancerous vastine (kuvio 7A;
P
= 0,029). Tämä tieto vahvistettiin myöhemmin IHC. Mitostatin ilmaistiin pääasiassa sytoplasmassa tyvisolukerroksessa normaalin eturauhasen epiteelissä (kuvio 7B) ja vahva positiivisuus havaittiin ns eturauhasen rauhanen atrofia (kuvio 7C). Kaikki pre-neoplastisia vaurioita (
eli
: PIN) osoitti lievää tai kohtalaista Mitostatin immuunivärjäysmenetelmällä (kuvio 7D), kun taas suurin osa adenokarsinooma osoittivat joko polttoväli värjäytymistä (kuvio 7E, F) tai ei värjäytymistä lainkaan ( Kuva 7G). Kuten odotettua, lihassoluja ja verisuonia ”endoteeleille osoitti Mitostatin kohtalainen positiivisuus. Kiinnostaa, viisi neoplastisia tapauksissa ollut yksinomaan ydinvoiman positiivisuutta. Kaikkiaan 44 124 kasvain näytteet olivat täysin negatiivisia (~35%), 65 osoitti lievää tai keskipitkällä positiivisuutta (52,4%) ja vain 15 näytteet osoittivat voimakasta Mitostatin positiivisuus (12,1%). Vuonna univariate analyysissä vähentynyt Mitostatin immunohistokemiallinen pisteet korreloivat kasvaimen vaiheet (
P
= 0,046), pT lisäys (
P
= 0,040), ja kasvaimen tilavuus (
P =
0,045). Kliinisiä-patologiset parametrien johti itsenäisesti tilastollisesti merkitsevä liittyy Mitostatin ilmaisua monimuuttujamenetelmin. Nämä havainnot edelleen vahvistavat käsitystä, että menetys Mitostatin kautta mutaatioiden tai proteiinien hajoaminen voisivat edistää eturauhassyövän etenemistä siltä osin kuin eturauhassyöpä yksilöt arvioitiin edellä peräisin edennyt eturauhassyöpä potilailla.
V: Suhteellinen taitteeseen Mitostatin mRNA normaalissa eturauhasen kudosnäytteistä (N, musta), ja Gleason 7 eturauhassyöpänäytteissä (K, kirkas harmaa). Mitostatin osoitti johdonmukaisesti alassäätöä syövän kudoksissa (
P
= 0,029). Pylväät, edustavat kuvat kolmen rinnakkaisen; baareja, SD. B-G: n immunohistokemiallinen havaitseminen Mitostatin ihmisen eturauhasen. Mitostatin proteiini paikantuu sytoplasmassa normaalin (B) ja atrofinen (C) eturauhasen rauhaset. Korkeammalla Mitostatin proteiinin havaittiin PIN leesioita (D) ja joissakin kasvaimissa (E). F: Sen lisäksi heikkoa värjäytymistä, Mitostatin havaittiin myös, että ytimien muutamia tapauksia adenokarsinooma. G: Mitostatin ilme on läsnä atrofinen rauhanen (musta nuoli) toisin kuin ympäröivä negatiivinen neoplastisten rauhaset. Mitta-asteikko: 50 um.
Keskustelu
Vaikka eturauhasen syöpä on yksi yleisimmistä syöpäsairauksia, tiedetään hyvin vähän siitä, molekyylitason mekanismeja, jotka määrittävät pahanlaatuinen muutos eturauhasen epiteelissä. Aikana eturauhassyöpä etenemisen, kasvainsolujen entistä liikkuvien ja hankkia invasiivisia kapasiteettia. Eniten kuolemantapauksia eturauhassyöpään eivät johdu primaarikasvaimen vaan toissijainen etäpesäkkeitä kaukaisiin elimiin. Tästä syystä on erittäin tärkeää tutkia mekanismeja, jotka ohjaavat eturauhassyövän hyökkäyksen ja etäpesäkkeitä. Kromosomaalinen alue 12q on osoitettu poistettava suuri erilaisia kiinteitä kehittynyt kasvaimia [3] – [12], joten viittaa läsnäolon, tällä alueella, on yksi tai useampi tuumorisuppressorigeeneille mukana prosessissa syövän etenemisen.
Olemme aiemmin tunnistettu Mitostatin geeni, paikallistaa 12q24.1, prosessissa seulonnan kasvua pidätti geenien aiheuttama leusiinirikkaita proteoglykaani dekoriini [13]. Dekoriini kuuluu pieni leusiinirikkaita proteoglykaani geeniperheen joka on viime aikoina tullut keskittyä useilla aloilla syöpätutkimuksen [20]. Tämä liukoinen proteiini on mukana useita soluprosesseja, mukaan lukien perusaineen kokoontumista, fibrillo-, ja ohjaus- soluproliferaation [18], [24] – [33]. Dekoriinin on osoitettu estävän muuttoliike [16] – [19], [34], invaasio [18], ja tuumorigeenisyystesti [19], [29], [33], [35], [36] on monenlaisia transformoituja soluja. Lisäksi dekoriini indusoi apoptoosia kautta kaspaasi-3 [36], [37]. Näin ollen on todennäköistä,, että dekoriini-proteiineina voisi olla efektorien tuumoria tukahduttavan vaikutuksen tämän proteoglykaanin.
Olemme aiemmin osoittaneet, että Mitostatin ilmentyy kaikkialla normaaleissa ihmisen kudoksissa. Kuitenkin sen proteiinin tasot ovat huomattavasti vaimennetaan pitkälle edennyt ensisijaisen maitorauhasen ja urothelial kasvaimet [13]. Olemme lisäksi osoittaneet, että Mitostatin yli-ilmentyminen vaikuttaa kielteisesti solujen kasvuun ja indusoi solukuoleman virtsarakon syövän solulinjoissa [13], mikä viittaa siihen, että Mitostatin voisi käyttäytyä kuin klassisen tuumorisuppressorigeeniä muilla keinoilla maligniteetti. Esillä olevassa tutkimuksessa käytettiin kolmea käytetään laajalti eturauhassyövän solulinjoissa, nimittäin, PC3 ja DU145 kastraatio-resistentit solut, ja LNCaP androgeenista riippuvaisten solujen, ja hyödynnetään siirtogeenisten ja immunologisten strategia osoittaa toiminnon Mitostatin näissä soluissa. Tuloksemme vahvistaneet ennustuksen Mitostatin kuuluvat tuumorisuppressorigeenin perheen sikäli kuin yliekspressio Mitostatin inhiboi pesäkkeiden muodostumisen, kun taas tukahduttaminen endogeenisen Mitostatin aiheutti päinvastaisia vaikutuksia.
Solujen migraation ja invaasion on keskeinen osa kasvainsolujen etäpesäkkeiden . Koska lisääntynyt solujen muuttoliikkeen ja invaasiota ovat tunnusmerkkejä metastaattisen fenotyypin, ja siten mitta aggressiivisuus, nykyinen tutkimus antaa tuloksia, jotka sotkea Mitostatin tärkeä proteiinin määrittämiseksi aggressiivisen solun fenotyyppi. Todellakin, Mitostatin yli-ilmentävien kloonien havaittiin merkittävä lasku liikkuvuudessa, ja
päinvastoin
by alaspäin säätäminen endogeeninen Mitostatin joko antisense- tai siRNA strategioita me laukaisi päinvastaiseen tulokseen. Suora rooli Mitostatin edistämisessä solumigraatiota näkyy myös meidän arpeutumisprosessit tutkimuksissa varmistui kaikissa solulinjoissa analysoitiin.
Tuloksemme osoittavat, että Mitostatin säätelee solujen liikkuvuutta ja kyky eturauhassyöpäsolujen hyökätä läpi 3D-matriisi mekanismilla vielä selvittämättä. Mitostatin muuttanut soluadheesiota ominaisuudet laminiinin, joka on ensimmäinen välttämätön askel hyökätä Matrigel kalvo. Tämä havainto on sopusoinnussa sen osuuden kanssa, joka dekoriini soittaa negatiivisena säätelijänä soluadheesion laminiinin [19]. Muut tuumorisuppressorigeeneille on osoitettu vaikuttavan useita syöpäsoluja ominaisuudet (siirtymien, invaasio, kasvun, alttiutta apoptoottisille ärsykkeille), joka vaikuttaa tärkeisiin solun proteiini- kompleksien [38] – [40]. Siten myös tulevaisuudessa keskitytään tunnistamaan Mitostatin proteiinin kumppanit ja tutkimalla mahdollisia kaskadin signaaleja sekaantuneet Mitostatin biologiassa.
tutkia mahdollisen suoran roolin Mitostatin eturauhasen soluissa transformaatio suoritimme ankkurista riippumaton kasvu määritykset ja
in vivo
tuumorigeenisyyden nude-hiirissä. Molemmat tutkimukset vahvistivat rooli Mitostatin negatiivisena säätelijänä muutosta. Molemmissa kokeissa Mitostatin ilmentyminen korreloi hyvin aggressiivisuus syöpäsoluja.
Tässä tutkimuksessa havaittiin väheneminen Mitostatin ilmentymisen kaksi eturauhassyövän solulinjat (1542CP
3TX ja 1532CP
2TX , 16,7%: n syövän solulinjat) ja ~35% sarjan 124 eturauhassyövissä. Kiinnostaa, normaaleissa näytteissä, ylempi epiteelin eturauhasen kerros oli johdonmukaisesti negatiivisia Mitostatin epitooppeja, kun taas alempi kerros oli vahva positiivisuus, jotka viittaavat eri solujen sitoutumista Mitostatin ilme. Vahva positiivisuus oli aina havaittu ns eturauhasen rauhanen surkastuminen (yhteisen prosessin tyypillisesti mutta ei yksinomaan löydy vanhemmilla potilailla), kun taas kohtalainen positiivisuus havaittiin kaikissa pre-neoplastisia vaurioita, pienentynyttä pisimmällä eturauhassyövän vaiheissa. Vuonna ensisijainen eturauhasen kasvaimia, Mitostatin alassäätöä oli tilastollisesti liittyy kehittynyt kasvain vaiheissa ja lisääntynyt koko (tai suora määrin) primaarikasvaimen klo patologinen tutkimus (
eli
: pT), mikä vahvistaa aiemmat tarkkailu rinta- ja virtsarakon syöpä [13]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että alas-säätely Mitostatin myöhemmissä vaiheissa eturauhasen kasvaimien syntyyn voisi edistää syövän etenemistä. Emme löytäneet mitään korrelaatiota Mitostatin ilmaisun ja muita kliinisiä parametrejä käytetään arvioitaessa eturauhassyövän huono ennuste, kuten Gleason luokalla, vaikka tämä seikka on vielä tutkittava suuremman joukon tapauksia.
Yhteenvetona esillä oleva tutkimus on ensimmäinen näyttö siitä, että Mitostatin voisi olla merkittävä rooli tuumorisuppressori eturauhassyövän kehitykseen ja etenemiseen kautta inhiboivia vaikutuksia solujen vaeltamiseen, invaasio, ankkurointi riippumattoman kasvun, ja
in vivo
kasvainten synnyssä. Lisäksi Mitostatin taso on vähentynyt pitkälle edennyt ensisijainen eturauhasen syöpiä. Yhdessä nämä tiedot tukevat edelleen hypoteesia, että Mitostatin toimii
bona fide
tuumorisuppressoriproteiinia ja viittaavat siihen, että lisäselvityksiään Mitostatin hyödyllisenä kliininen markkeri diagnoosia ja ennusteeseen eturauhaskasvaimissa ovat perusteltuja.
Materiaalit ja menetelmät
Cell Culture ja Generation stabiilien kloonien
Eturauhassyöpä solulinjat 2220, 2221, 11609, 11610, 11611, Tsup, 1532CP
2TX, 1535CP
1TX, 1542CP
3Tx, LNCaP, DU145, ja PC3 ja eturauhasen kuolemattomaksi normaali solulinjat 1535NPTX, ja 1542NPTX saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ja ylläpidetään suositellaan. Solut transfektoitiin kuten aikaisemmin on kuvattu [13], [41] (Data S1), ja jotka on valittu väliaineessa, jota oli täydennetty joko G418: aa (400 ug /ml) tai puromysiiniä (0,75 ug /ml) 3 viikon ajan.
Mitostatin geenien
geenien ihmisen Mitostatin saavutettiin siRNA strategioiden validoitu SureSilencing Mitostatin siRNA ja ohjaus plasmidit (SuperArray Bioscience Corp, Frederick, MD). PC3-solut transfektoitiin ajoneuvon (DEPC-käsiteltyä vettä), ohjaus siRNA (salattu), tai vastaan suunnattu siRNA Mitostatin (100 pmol /L) käyttäen Oligofectamine ™ reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja noudattamalla valmistajan protokollia. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen, PC3-soluja ilman ravintoa seerumittomassa väliaineessa (SFM) 12 tuntia ja sitten käsiteltiin ja analysoitiin muuttoliike ja invaasion alla kuvatulla tavalla. Ekspressio Mitostatin proteiini havaittiin immunoblot-analyysillä (kuvio S1).
Colony muodostaminen ja Migration Analyysit
Solut maljattiin tiheydellä 400 solua /100 mm malja. Päivänä 15 solut kiinnitettiin 10% formaliinilla [100% formaldehydiä on 37%, mikä 3,7% on 10% formaliinia,
eli
: PBS-formaldehydi] ja värjättiin kristallivioletilla pesäkkeiden laskenta [21] . Soluja ilman seerumia 24 tunnin ajan. Solut (2,5 x 10
4 200 ui) ympätään sitten Boyden kammioissa (ylempi kammio) (BD BioCoat, Bedford, MA). Alakammioissa sisälsi 500 ui joko SFM tai 1% tai 5% seerumia. 10 tunnin jälkeen siirtyneet solut laskettiin mikroskoopin alla kiinnityksen jälkeen ja värjäys Coomassie sinisellä kuten on kuvattu [42], [43].
Migration, Invasion ja adheesiomäärityksiä
Solut ympättiin 35 mm: n maljoille seerumissa sisältävässä väliaineessa kunnes subkonfluenssin ja siirrettiin sitten SFM. 24 tunnin kuluttua maljat raaputettiin ohut kertakäyttöinen kärki tuottaa haava yksisolukerroksen [42]. Soluja inkuboitiin vielä 72 tuntia 1% tai 5% seerumia sisältävää väliainetta ja analysoidaan ja valokuvattiin Zeiss Axiovert 200 M solu elää mikroskoopin (Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY) käyttäen Metamorph Image kerääminen ja analyysi ohjelmisto (Universal Imaging, Downingtown, PA) klo Kimmel Cancer Center konfokaalimikroskopialla Core Facility. Soluinvaasiota kautta kolmiulotteinen soluväliaineen arvioitiin Matrigel invaasiomääritys käyttämällä BD matrigeelin Invasion Chambers (BD BioCoat) kanssa 8,0-um suodattimen kalvot kuten aikaisemmin on kuvattu [42], [43]. Tarttumisen määritykset, 96-kuoppaisille levyille, jotka on päällystetty hiiren laminiinin (BD BIOCOAT), inkuboitiin huoneenlämmössä 1 tunnin ajan 1% naudan seerumin albumiinia (BSA) (Sigma, St. Louis, MO), estää epäspesifinen sitoutuminen. 100000 solua /kuoppa siirrostettiin kolmena rinnakkaisena, ja annettiin kiinnittyä 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja tarttumattomat solut poistettiin sitten kaksi pesua. Kiinnittyneet solut värjättiin CyQuant NF Cell Proliferation Assay -kittiä (Invitrogen), ja absorbanssi luettiin 490 nm: ssä. Taustatasot soluadheesion kuopissa päällystetty pelkkää BSA: ta vähennettiin saadut arvot laminiinin.
riippumattomaan kasvuun ja kasvainten muodostumiseen Analyysit
pehmeän agarin määrityksen, solut suspendoitiin 0,2%: isessa DMEM 10% FBS: ia, maljattiin tiheydellä 10
3-soluja 60 mm: n malja on päällystetty aikaisemmin 0,4% agaroosia, ja pidettiin lämpötilassa 37 ° C. Päivänä 21, pesäkkeitä 0,2 mm halkaisijaltaan laskettiin ja analysoitiin [21]. Tuumorigeenisyystesti määritykset suoritettiin olennaisesti kuten [44], pöytäkirjojen mukaisesti hyväksymä Thomas Jefferson Animal Care ja käyttö komitea. Immuunivajausta, kateenkorvattomissa nude (BALB /c
nu /nu
) hiiriin injektoitiin subkutaanisesti osaksi posterior sivuaa 2 x 10
6 solua 200 ul: ssa Matrigel tyvikalvon matriisin (BD Biosciences). Kasvaimen kasvua seurattiin päivittäin 65 päivän ajan.
Ethic lausuntoja
Kaikki potilaat osallistuvat qRT-PCR tutkimuksessa ovat antaneet kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen.