Krooninen sairaus

tiivistelmä

Jotta ymmärtämään koko potentiaalin syövän itsemurhan geeniterapian, jonka avulla tarkka ilmaus itsemurhan geenin syöpäsoluissa, käytimme kudosspesifiä epiteelisolujen adheesiomolekyyli (EpCAM) promoottori (EGP- 2), joka ohjaa siirtogeenin Herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasi (HSV-TK) ilmentyminen tapahtuu ensisijaisesti EpCAM yli ilmentävien syöpäsolujen. EpCAM pitoisuudet ovat huomattavasti korkeammat retinoblastooma (RB), lapsuuden silmäsyöpä rajoitetun ilmentymisen normaaleissa soluissa. Käyttö miRNA asetuksen vieressä käyttöä kudoksen-promoottorin, antaisi toisen kerroksen ohjaus siirtogeenin ilmentymisen vain kasvainsoluissa säästäen normaalit solut. Tämän hypoteesin testaamiseksi me kloonattu let-7b miRNA tavoitteet 3’UTR alueella HSV-TK itsemurhageenille ohjaa EpCAM promoottori koska let-7 perheen miRNA, kuten let-7b, havaittiin alas säännellä RB kasvaimet ja solulinjat. Käytimme EpCAM yli ilmentävät ja anna-7 säädeltiin RB solulinjoissa Y79, WERI-RB1 (EpCAM

+ ve /let-7b

alassäädetty), EpCAM säädeltiin, anna-7 yli ilmentävät normaali verkkokalvon Müller glial cell line MIO-M1 (EpCAM

-ve /let-7b

säädelty), ja EpCAM ylös säännelty, anna-7b sääteli normaali kilpirauhasen solulinja N-Thy-Ori-3.1 (EpCAM

+ ve /let-7b

säädelty) tutkimuksessa. Soluproliferaatioon mitattiin MTT-määritystä, apoptoosi mitattiin tutkimalla lohkaista Caspase3, EpCAM ja TK ilmentyminen kvantitoitiin Western blot. Tuloksemme osoittivat, että EGP2-promoottori HSV-TK (EGP2-TK) rakentaa 2 tai 4 kopiota let-7b miRNA tavoitteet ilmaistaan ​​TK-geenin vain Y79, WERI-Rb-1, kun taas TK-geeniä ei ilmaista MIO -M1. Yhteenvetona, olemme kehittäneet kudosspesifisiä, miRNA-säädellään dual ohjaus vektori, joka selektiivisesti ilmentää itsemurhan geenin EpCAM yli ilmentävät solut.

Citation: Danda R, Krishnan G, Ganapathy K, Krishnan UM, Vikas K, Elchuri S, et ai. (2013) Kohdennettu Expression of Suicide Gene by Tissue-promoottori ja MicroRNA asetuksen Cancer Gene Therapy. PLoS ONE 8 (12): e83398. doi: 10,1371 /journal.pone.0083398

Toimittaja: Rajiv R. Mohan, University of Missouri-Columbia, Yhdysvallat

vastaanotettu: Kesäkuu 27, 2013 Hyväksytty: 5. marraskuuta 2013 Julkaistu: 31 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Danda et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Intian neuvoston Medical Research, Grant nro 35/6/2010 /-BMS Nano suorittamiseksi kloonausta, transfektio, ja toiminnallinen analyysi. Osittain tämä työtä tuki Department of Biotechnology, Intian hallitus, Grant ei BT /01 /CE1B /11 /V /16 suorittamiseksi let-7miRNA perheen profiilin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Perinteiset lääkkeet kuten kemoterapiaa, radio hoito ja kirurgia ovat tehokkain keino hoitaa syöpäpotilaita [1]. Perustuen taudin vaiheissa, nykyiset hoitomenetelmät retinoblastoomaa (RB) yleisin kasvain silmän lapsuudessa, kuuluu intensiivinen kemoterapia, säteily, vakauttaminen Autologisella luuydinsiirtopotilailla pelastus- ja kirurginen resektio. Kuitenkin potilaat, joilla lasiaisen siemeniä, sub verkkokalvon siemeniä, ja kahdenvälistä kehittyneet multifokaalinen sairaudet ovat suuri haaste nykyisen hoitovaihtoehtoja [2], [3]. Viime löytö syövän kantasoluja, osajoukko syöpäsolujen kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia, joka on osittain vastuussa kasvaimen kasvun eri ominaisuudet verrattuna eriytetty kasvainsoluja lisäävät monimutkaisuutta syövän hoitoon [1]. Siksi tarvitaan uusia hoitomenetelmiä tarvitaan taistelemaan syöpää. Joukossa erilaisia ​​lähestymistapoja, itsemurha geeniterapia voi olla lupaava vaihtoehto strategia, koska itsemurha-geenin ilmentymistä voidaan säädellä tiettyyn kudokseen [4], [5]. Suicide geeniterapia edellyttää solunsisäistä toimituksen geeni, joka koodaa entsyymiä, joka muuntaa aihiolääkkeen sytotoksiseksi tuotetta [6], [7]. Yleisimmin käytetty itsemurhageeni on herpes simplex -virus tyypin I tymidiinikinaasin (HSV-TK). Eri tutkimukset oli käytetty HSV-TK itsemurha geeniterapian hoitoon RB ja muiden syöpien [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Ei-spesifinen ilmentyminen itsemurhageeni normaaleissa soluissa on vakava rajoitus olemassa olevien itsemurhageeniä strategioita syövän hoidossa.

Jotta tehokkaasti ohjata ilmentymistä ainoastaan ​​kohdesoluissa, useissa tutkimuksissa on käytetty erilaisia ​​kudosspesifisiä promoottoreita [15], [16], [17], [18], [19], [20]. Yksi tällainen promoottori on epiteelin glykoproteiini-2 /EpCAM /17-1A (EGP2) promoottori, joka selektiivisesti tappaa EpCAM yli ilmentävät solut monissa syövissä rajoitettua ilmaus TK (tymidiinikinaasin) seurasi Gansikloviiri (GCV) käsittely [21], [ ,,,0],22]. EpCAM /CD326 on tyypin I trans- membraani glykoproteiini, joka ilmentyy apikaalisella kalvo syöpäsolujen osoittaa Baso sivuttainen ilmentyminen normaaleissa epiteelisoluissa. Se on raportoitu erikseen ilmaistaan ​​epiteelikudoksen, ja yli ilmaistu suurin ihmisen epiteelisolujen karsinoomat, mukaan lukien peräsuolen syöpä, rintasyöpä, eturauhasen, pään ja kaulan, maksan karsinoomat ja retinoblastooma [23], [24]. Hallittu geeniekspressiota kohteena kudoksissa on ratkaisevan tärkeää geeniterapiaa erityisesti yhteydessä syövän itsemurhan geeniterapia. Vaikka kudos promoottori ajaa itsemurhaan geeniterapian osoitti lupaavia tuloksia, vuotava ilmentyminen kudoksen promoottorit ulkopuolisissa kohdennettua soluissa on raportoitu [21]. Näin ollen vaihtoehtoiset strategiat ovat välttämättömiä lisäksi kudosspesifisen promoottorin säätelyn itsemurhan geeniterapiassa.

MikroRNA (miRNA) ovat luokan pienen, ei-koodaavat RNA: t ( 1000 nisäkässoluissa), jotka säätelevät solujen eri toimintojen vaihtelevat solunjakautumisen signaalitransduktion ja aineenvaihduntaa. Posttranskriptionaalisella geenin ilmentymisen säätelyyn kautta miRNA-välitteisen RNA-interferenssi (RNAi) on tunnettu [25]. miRNA tiedetään estää mRNA käännöksen tai vähentää mRNA vakautta jälkeen painoerä oppaan säikeen Mirna tunnustamatta elementit (MRE) sisällä 3

luntranslated alue (UTR) kohdegeenien [26], [27], [28], [29]. let-7 on luokan miRNA jotka osallistuvat solujen sääntelyn ja tuumorisuppressiogeeneksi. Aikaisemmat tutkimukset eturauhas-, keuhko- ja rintasyöpiä, osoitti alas säätely let-7 perheen miRNA [30], [31]. Äskettäin, Glial fibrillary hapan proteiini (GFAP), jota ohjaa kudosspesifisiä ilmentämisvektoreita yhdessä kohdesekvenssejä vapailla miRNA (mir122a, mir31, mir127, mir143) tuotiin 3’UTR alueeseen siirtogeenin [32], [ ,,,0],33], [34], [35], [36]. Tämä lähestymistapa oli sallittu muuntogeeniekspression vain kohdennettu glioblastooma syöpäsoluja ilman ilmentymistä normaaleissa astrosyyttien soluissa samaa linjaa [34].

Tässä tutkimuksessa rakensimme nisäkässolun ekspressiovektoriin, joka satamat EpCAM promoottori (EGP2) ajettu itsemurhageenille HSV-TK säätelevät ilmentymistä vapailla miRNA tasoa. Tavoitteena on ilmaista itsemurhageenille vain EpCAM

+ ve solujen hyvin vähän tai ei ilmentymistä normaaleissa soluissa saman linjaa. Let-7b miRNA on alle ilmaistuna Y79, WERI-Rb-1 syöpäsolun linjat. Teimme EGP2-TK rakentaa kanssa 2 ja 4 kopiota let-7b miRNA kohdesekvenssien. Ekspressiota TK-geeni on rajoitettu syöpäsolulinjoissa, kuten Y79, WERI-Rb-1, MDA-MB-453 ja MCF-7 ottaa huomioon, että TK-geenin ilmentyminen on vähäistä MIO-M1-solulinja. Osoitimme ensimmäistä kertaa käyttöön EpCAM promoottorin ajettu miRNA säännellyn TK Suicide geenin EpCAM positiivisia ja anna-7 säädeltiin soluja. Tämä strategia on kaksitasoinen säätö siirtogeenin, joka voi johtaa valikoivan ilmentymistä syöpäsoluissa ilman ilmentymistä normaaleissa soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

retinoblastoomakasvaimien kerättiin enukleoidaan silmän pallot osana hoitoa ja hyödyntää tutkimusta varten kirjallinen yleinen suostumus saatiin vanhemmilta /vartijoita potilaasta enucleation. Tutkimus toteutettiin saatuaan hyväksynnän eettisen alakomitean (Institutional Review Board) on Sankara Nethralaya silmäsairaalassa [Ethical välys no: 147 (A) -2009-P].

kasvain näytteet ja patologinen yksityiskohdat

tässä tutkimuksessa 10 tuoretta retinoblastoomakasvaimien käytettiin, Clinocopathological yksityiskohdat kasvaimia perustuivat kansainvälisiin retinoblastoomaa pysähdyspaikan työryhmä (IRSWG) [37], [38] ja annettiin taulukossa S1. Yhdistettiin aikuisten verkkokalvon 50-55 (n = 3) vuotias käytettiin kontrollina ja saatiin ihmisruumiiden silmät lahjoittanut CU Shah silmäpankkiviikkoa, Sankara Nethralaya.

Soluviljely

retinoblastoomaa solulinja Y79, WERI-RB1, ja Rintasyöpä solulinjoissa MDA-MB-453, MCF-7 saatiin RIKEN Bio Resource Centre (Japani). Ihmisen Verkkokalvon Müller hermotukisolulinjasta MIO-M1 peräisin hermo verkkokalvon oli lahjakas maasta G.A. Limb, UCL Institute of Ophthalmology, London, England [39]. Ihmisen kilpirauhasen follikulaarinen epiteelisolujen linja Nthy-ori 3-1 oli lahjakas alkaen Dr.Omer Ugur, Hacettepe syöpäinstituutti [40], [41]. MIO-M1, MDA-MB-453, MCF-7 kasvatettiin Dulbeccon modifioituun Eaglen media (DMEM), joka sisälsi glutamiinia, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliiniä (100 IU /ml) ja streptomysiiniä (100 IU /ml). Nthy-ori 3-1 ja Y79, WERI-RB1 viljeltiin RPMI1640 täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua vasikan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia ja 4,5% dekstroosia ja kasvatettiin suspensiossa 37 ° C: ssa 5% CO

2-kostutetussa inkubaattorissa.

in vitro

ilmentymistä analyysi

(EGP2-TK) luovutti ystävällisesti Dr. MG Rots, Department of terapeuttinen Gene Modulation, yliopistojen Pharmacy, University of Groningen, Alankomaat. PUT649 ekspressiovektoria, joka sisältää Zeocin resistenssigeenin ja kuljettaa HSV-TK-geenin säätelyn alaisena ihmisen sytomegaloviruksen promoottori (CMV-TK) [syntyy professori G.Tiraby (University of Toulouse), Cayla, Ranska] transfektoitiin transientisti Y79 , WERI-RB1, Nthy-ori 3-1, MIO-M1 käyttäen Lipofectamine TM 2000 transfektioreagenssi (Invitrogen, USA) mukaan valmistajan ohjeiden.

kloonaus miRNA tavoitteet EGP2-TK plasmidi

rakentamiseksi plasmidit let-7 miRNA kohdesekvenssien, EGP2-TK käytettiin pääketjun, joka sisältää HSV-TK alavirtaan EGP2 promoottori. Rakentamiseksi Mirna tavoitteet, oligonukleotidit suunniteltiin let-7b tavoitteet (täydellinen lisä sekvenssi let-7b miRNA otettiin miRBase liittymisestä ei-MIMAT0000063) seurasi

Kpnl

jotka on nimetty T1 a (jolla tavoitteet täydellinen käänteinen komplementaarinen let-7b miRNA) ja T1B (täydellisesti komplementaarinen T1a) ja ligatoitiin välillä

Notl

ja

BstBI

restriktiokohdat tuloksena EGP2-TK-2T, jossa on 2 kappaletta let-7b tavoitteita.

Kpnl

/

BstBI

fragmentti digestoitiin vastaavien entsyymien ja liitettiin oligonukleotidien, joilla on kaksi kopiota let-7b kohdesekvenssien. Joka on nimetty T2A (joilla tavoitteet täydellinen täydentävä päästää-7b miRNA) ja T2B (täydellisesti komplementaarinen T2A) vastaavasti. Nämä hybridisoitiin ja liitettiin tuloksena EGP2-TK-4T, jossa on 4 kappaletta let-7b kohdesekvenssien. Ohjaus tavoitteet C1A, C1B ja C2A, C2B luotiin ottamalla täydellinen käänteinen komplementaarinen että let-7b miRNA tavoite. Koko käsikirjoitus EGP2-TK 2 kopiota let-7b tavoitteita mainittakoon EGP2-TK-2T ja 4 kopiota let-7b tavoitteita EGP2-TK-4T. Samalla tavalla EGP2-TK, jossa on 2 kappaletta let-7b säätelysekvenssi on tarkoitettu niin EGP2-TK-2C ja 4 kopiota kontrollisekvenssin on merkitty EGP-TK-4C. Plasmidirakennelmissa lusiferaasin (luc) reportterimääritys muodostettiin korvaamalla HSV-TK-geenin

Guassia lusiferaasi

geenin. Lusiferaasi konstruktit nimettiin edellä mainittiin korvaamalla TK Luc. Taulukossa 1 luetellaan oligonukleotideja käytetään tutkimuksessa.

miRNA ilmentymisanalyysiä

TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit ja TaqMan® Universal PCR Master Mix ilman Amperase® UNG Applied BioSystems (CA, USA) käytettiin havaitsemiseen ja kvantifiointiin kypsä miRNA. Kvantifiointi tehtiin mukaisesti valmistajan protokollan käyttäen 1 ug kokonais-RNA-näytettä. Käytimme RNU6 miRNA (määritys ID, 001093) kontrollina. TheTaqMan® MicroRNA (Applied Biosystems) yksittäisiä määrityksiä käytettiin seuraavia miRNA arviot: HSA-let-7a (määritys ID, 000377), HSA-let-7b (määritys ID, 2619), HSA-let-7c (määritys ID, 000379), HSA-let-7d (määritys ID, 002283), HSA-let-7e (määritys ID, 2406), HSA-let-7f (määritys ID, 000382), ja HSA-let-7 g (määritys ID, 0002282 ) ja HSA-let-7i (määritys ID, 002221). Data normalisoitiin käyttäen Ct-arvoja talon pitäminen geeni U6 kussakin näytteessä. Laskea suhteelliset määrät miRNA keskimääräinen Ct-arvo U6-RNA vähennettiin, että kohde-miRNA saada muutos Ct-arvo. Kansi muutos geenien ilmentyminen määritettiin sitten log2 suhteellista yksikköä. PCR-tuotteet havaittiin ABI PRISM 7500 Sequence Detection järjestelmän ja analysoitiin ABI PRISM 7500 SDS-ohjelmisto (Applied Biosystems).

reportterigeenimäärityksessä

käytetään lusiferaasireportterigeenin määritys promoottorin lujuusanalyysit ja tutkimalla miRNA asetus transgeeniekspression. pGluc plasmidi, joka sisältää CMV-promoottorin ajettu -luciferase konstruktin hankittiin (New England Biolabs, MA, USA). EGP2 promoottori kloonattiin edessä lusiferaasigeeni (EGP2-luc) korvaamalla CMV-promoottori. 2 ja 4 kopiota let-7b kohdesekvenssien kloonattiin klo 3’UTR alueella konstruktin (EGP2-luc). Transfektio tehtiin lyhytaikaisesti seuraavat plasmidit CMV-luc, EGP2-luc, EGP2-luc-2T, EGP2-luc-4T, EGP2-luc-2C ja EGP2-luc-4C. 48 tunnin jälkeen transfektion kanssa lusiferaasin konstruktilla, solut pestiin PBS: llä ja kasvatettiin tuoreessa väliaineessa vielä 24 tuntia. Solut kerättiin ja analysoitiin lusiferaasi ja β-galaktosidaasi mukaisen toiminnan valmistajan protokollien (New England Biolabs).

Western blot-analyysi

Jotta ekspression analysoimiseksi TK ja EpCAM proteiineja, koko solu-uutteet valmistettiin lysoimalla solut lyysipuskuriin [10 mM Tris-HCI, pH 7,2, 2% SDS: ää, 10 mM ditiotreitolia, 1% proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit cocktail (Sigma Aldrich, MO, USA)]. Proteiinipitoisuus arvioitiin Lowryn menetelmällä. Solulysaatit sekoitettiin 5X Laemmli latauspuskuria ja keitettiin 5 min. Yhtä suuret määrät (50 pg) proteiinia tehtiin elektroforeesi 12% SDS-polyakryyliamidigeelillä ja elektro-blotattiin nitroselluloosakalvolle. Kalvon blotit blokattiin 1 tunnin ajan 5% rasvatonta maitoa TBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Tween-20, ja sitten niitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaarisen vasta-aineen. HSV-TK (saatu Dr. William C. Summers, Yale University) ja EpCAM (Soluviestintä, MA, USA) vasta-aineita käytettiin laimentamiseen 1:100 ja 1:150, vastaavasti. Blotit pestiin ja inkuboitiin asianmukaisten piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (anti-kani-1:5000, anti-hiiri-1:2000 (Soluviestintä) 3 tuntia huoneen lämpötilassa ja visualisoitiin tetrametyylibentsidiini /Vetyperoksidia (TMB /H

2O

2, Bangalore genei, Intia) mukaista reagenssia valmistajan ohjeiden. Kalvot riisuttu käyttäen 100 mM glysiiniä, pH 2, 40 min, tukossa, ja uudelleen probed varten β-aktiini (Sigma). blotit skannattiin UVP BioDoc-IT kuvantamisjärjestelmä (CA, USA) ja densitometrinen analyysi digitoitujen kuvien suoritettiin ImageJ ohjelmisto (NIH). intensiteetti kullakin kaistalla normalisoitiin intensiteetin vastaavan β-aktiini-band jälkeen taustalla normalisointi.

mittaus herkkyys Gansikloviiri (GCV) B

Y79, WERI-RB1, Nthy-ori 3-1, MIO-M1cells ympättiin 96-kuoppaiselle levylle 24 tuntia ennen transfektiota tiheydellä 10000 solua per kuoppa määrittää solujen elinkelpoisuuden. transfektio tehtiin lyhytaikaisesti plasmideilla, jotka sisältävät CMV-TK, EGP2-TK, EGP2-TK-2T, EGP2-TK-4T, EGP2-TK- 2C, EGP2-TK-4C ja inkuboitiin 48 tuntia. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (1, 10, 50100 uM) GCV 24 tuntia. Herkkyys GCV arvioitiin käyttämällä kolorimetristä MTT-määritystä. Monen hyvin skanneri (BioTek, VT, USA) käytettiin mittaamaan absorbanssi 570 nm: n aallonpituudella. Ei-transfektoituja käsittelemättömiä kontrolleja annetaan arvo 100%. Solujen eloonjääminen laskettiin yhtälöllä: Test OD /verrokki-OD X 100%.

Immunofluorscence

Seuraavat transfektoituja solulinjoja MIO-M1, Nthy-ori-3-1, WERI-RB1 , Y79 solut pestiin 1 x PBS: llä ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sitten permeabilised 0,25% Triton X-100: ssa 5 min. Solut blokattiin 5% naudan sikiön seerumia 30 min, inkuboitiin anti- katkaistun kaspaasi 3 (Soluviestintä) ja anti-Bcl2-vasta-aine (solu signalointi) 3 tuntia, sitten FITC: tä (vihreä) ja TRITC (punainen) konjugoituna sekundäärisiä vasta-aineita (Jackson Immunoresearch, PA, USA) 2 tuntia. Solut värjäämällä visualisoitiin käyttäen Zesis Axio vison käänteinen järjestelmä mikroskooppi 10X tavoitteen. Spesifisyyden varmistamiseksi värjäystä, kuvat saatiin käyttämällä asetuksia, jossa ei fluoresenssia ei ollut havaittavissa negatiivisten kontrollien kanssa sekundaarisia vasta-aineita yksinään (tuloksia ei ole esitetty).

Tilastollinen analyysi

Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD 3 kokeen jokaisen kokeen tehdään kolmena kappaleena. Tilastollinen merkittävyys laskettiin Studentin t-testiä ja ap arvo ≤ 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

rajoitettujen TK ilmentymisen EGP2 promoottori

Analysoimme selektiivisen siirtogeenin ilmentyminen by EGP2 promoottori Y79, WERI-RB1, Nthy-ori 3-1 solulinjat. Western blot-analyysi osoitti EpCAM proteiinin ilmentymistä Y79, WERI-RB1, Nthy-ori 3-1 soluihin ja sen ilmentymistä ei havaittu MIO-MI solulinja (Figure1A). Siksi Y79, WERI-RB1, Nthy-ori 3-1cells katsottiin EpCAM positiivinen (EpCAM

+ ve) ja MIO-MI kuin EpCAM negatiivinen (EpCAM

ve) varten EpCAM proteiinin ilmentymisen. Arvioidaan EGP-2 promoottori sen kykyä säädellä HSV-TK ilmentymisen EpCAM ilmentävät solut, me ohimenevästi transfektoituja soluja EGP2 promoottori ajettu HSV-TK konstruktio (EGP2-TK). CMV-promoottori-ajettu HSV-TK (CMV-TK) konstruktia käytettiin positiivisena kontrollina. CMV-TK ohimenevästi transfektoiduissa soluissa, TK-proteiini ilmentyy kaikissa solulinjoissa (Nthy-ori 3-1, Y79, WERI-RB1 ja MIO-M1) (kuvio 1 B). In EGP2-TK ohimenevästi transfektoiduissa soluissa, TK ilmentyminen nähtiin Nthy-ori 3-1, Y79 ja WERI-RB1 soluissa. Lisäksi TK-proteiinin ekspressio oli alhainen MIO-M1-solut (kuvio 1 C). Tämä voi johtua siitä, että leakiness että EGP2 promoottorin kuten on raportoitu aiemmin muut promoottorit, [34], [35]. Reaaliajassa PCR kokeissa CMV-promoottori ohjaa TK-geeni olivat pysyvästi ilmentymistä kaikissa 4 solulinjoissa (kuvio 1 D). EGP2-TK transfektoiduissa Nthy-ori 3-1, Y79 ja WERI-RB1 solulinjat osoittivat merkittäviä korkeampi TK ilmaisu verrattuna CMV-TK transfektoituja solulinjoja. Kuitenkin EpCAM promoottori vähensi TK geeniekspressiota MIO-MI solulinjassa (kuvio 1 D). Reportterigeenimäärityksessä osoittivat, että CMV-luc transfektio esillä aiempaa suurempi geeniekspression verrattuna transfektoimattomilla soluihin. EGP2-luc transfektion osaksi Nthy-ori 3-1, Y79, ja WERI-RB1 solulinjat osoittivat merkittäviä korkeampi lusiferaasiekspressio verrattuna CMV-luc transfektoituja soluja paitsi MIO-M1 jossa lusiferaasiekspression on huomattavasti alhaisempi EGP2- luc transfektio (kuvio 1 E). Nämä tulokset osoittavat, että EpCAM promoottori on selektiivisesti aktivoidaan EpCAM positiivisissa solulinjoissa Y79, WERI-RB1, Nthy-ori 3-1, eikä EpCAM negatiivisia solulinjassa MIO-M1.

EpCAM ilmentyminen arvioitiin western blot -analyysi ja β-aktiini käytettiin latauskontrollina (A). Muuntogeeniekspression ohjaavat EGP2 ja CMV-promoottori arvioitiin lyhytaikaisella transfektiolla CMV-TK, EGP2-TK, CMV-luc, ja EGP2-luc. Jälkeen 2 päivää transfektion TK-proteiinin ilmentymistä ohjaa CMV-promoottori arvioitiin western blot-analyysiä ja tulokset normalisoitiin suhteessa β-aktiini (B). TK-proteiinin ilmentymistä ohjaa EGP2 promoottori arvioitiin Western blot -analyysillä ja tulokset normalisoitiin suhteessa β-aktiini (C). Proteiini kvantifiointi kvantifioitiin käyttämällä ImageJ ohjelmistoja ja proteiinien ilmentyminen ilmaistu suhteellinen signaalin voimakkuuden arvoja. TK mRNA kvantitoitiin Real-time PCR: n mRNA-tasot normalisoitiin suhteessa GAPDH ja ilmaistiin suhteessa kertainen muutos yksikköä (D). Lusiferaasin ilmentymisen analyysi suoritettiin mittaamalla eritetty Gaussia lusiferaasi. Tulokset normalisoitiin vastaan ​​un-transfektoituja soluja, ja ne ilmaistaan ​​suhteellisina valoyksiköinä (E). Normalisoidut tasot lusiferaasin ilmentymisen prosentteina on esitetty keskiarvona ± S.D (n = 3). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 vs. Control + p 0,05, ++ p 0,01, +++ p 0,001 vs. CMV-luc.

EGP-2-promoottori ohjaa valikoiva soluntappokyky rajoitettua ilmaus TK

jotta voitaisiin arvioida toiminnallisia ominaisuuksia TK-geenin ilmentymistä, eri pitoisuuksia (1, 10, 50, 100 uM) GCV hoito tehtiin 24 tuntia CMV-TK tai EGP2-TK ohimenevästi transfektoituja solulinjoja kuten Y79, WERI-RB1, Nthy-ori 3-1, MIO-M1. 10 uM pitoisuuden GCV hoito osoitti lähes 50-60% solujen elinkelpoisuutta kaikkien CMV-TK transfektoituja solulinjoja tutkittu. Prosenttiosuus solujen elinkelpoisuus väheni konsentraation kasvaessa GCV in Nthy-ori 3-1, Y79, ja WERI-RB1-solut (kuvio 2A, 2C, 2D). Näissä solulinjoissa, solujen elävyys oli laskenut alle EpCAM-promoottorin säädellään TK verrattuna CMV-promoottorin säännelty TK EpCAM

+ ve-solut. Mio-MI Solujen elinkelpoisuus osuus on noin 60% alle CMV promoottori sääntelyä TK /GCV (kuvio 2B) ja 90% alle EpCAM promoottorin säätely geenin. Lisäksi solujen elävyyden merkittävästi laskenut alle EpCAM promoottori säännelty TK Y79, WERI-RB1, Nthy-ori 3-1 solua. Nämä tulokset viittaavat siihen, EGP2 promoottori ilmentää TK geeniä EpCAM

+ ve ja ole EpCAM

ve solulinjoissa.

solunelinkykyisyysmäärityksen MTT arvioitiin transfektoimalla EGP2-TK ja CMV -tk plasmidit soluun linjat. Nthy-ori-3-1 (A), MIO-M1 (B), Y79 (C), WERI-RB1 (D). 48 tunnin kuluttua transfektion seurasi GCV käsittely eri pitoisuuksilla (1, 10, 50, 100 uM) 24 tunnin ajan. Tulokset normalisoitiin vastaan ​​un-transfektoiduissa soluissa ja ilmaistiin prosenttiosuutena solujen elinkelpoisuuden. Solujen elinkelpoisuus on esitetty prosentteina keskiarvo ± SD (n = 3).

läsnäolo anna-7 perheen miRNA Retinoblastoomasolulinjoista reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR

On raportoitu, että anna-7 perheen miRNA on apoptoottisia, ja hyvin säilyneitä kaikilla eläinlajeilla järjestyksessä ja toiminta ja sääntelyn purkaminen anna-7 perheen johtaa syöpään [25]. Analysoimme ilmaus profiilia let-7 perhettä (n = 10) ensisijaisen retinoblastoomakasvaimien ja Y79, WER-RB1, MIO-M1, Nthy-ori 3-1 solulinjoissa (kuva 3). Let-7 perheensä alas säännelty primaarikasvainten verrattuna, että normaalin aikuisen verkkokalvon. let-7a oli erittäin säädeltiin joukossa kirjeet 7 perheenjäsenten primaarikasvainten (kuvio 3A, B). let-7c ja anna -7d olivat erittäin alas säännelty Y79 ja WERI-RB1 vastaavasti verrattuna MIO-M1cell line (kuvio 3C). In Nthy-ori 3-1 solulinja, kaikki miRNA olivat jopa säädellään verrattiin MIO-M1 (kuvio 3C). Lisäksi let-7b osoittivat johdonmukaisesti alaspäin sääntely sekä retinoblastooma solulinjoissa verrattuna muihin let-7 perheenjäseniä ja osoitti korkealla-sääntelyn Nthy-ori 3-1. Näin ollen tämä (let-7b) valittiin kloonata miRNA kohdesekvenssien meidän plasmidikonstrukteja.

ilmentyminen let-7 miRNA kvantitoitiin käyttäen reaaliaikaista PCR. Ilmaisu analyysi let-7 perheen miRNA arvioitiin retinoblastooma primaarikasvaimia. Tulokset normalisoitiin vastaan ​​normaalin aikuisen verkkokalvon ja ilmaistiin kertamuutos arvojen suhteessa normaalin aikuisen verkkokalvon (A, B). Ilmaisu analyysi let-7 perheen miRNA arvioitiin retinoblastooma solulinjoissa. Tulokset normalisoitiin vastaan ​​MIO-M1 ja ilmaistiin kertamuutos arvojen suhteessa MIO-M1 (C). miRNA kertainen muutos laskettiin 2

-▵▵CT menetelmällä.

In vitro

lusiferaasianalyysissä välittämiä pCMV /EGP2-

luc

vektorit

transfektointi EGP2-TK ja EGP2-luc konstruktioita in EpCAM negatiivinen solulinjassa osoitti merkittävää ilmentymistä TK ja lusiferaasigeenit (Kaavio 1 C, E). Merkittävä sytotoksisuus upon GCV hoidon havaittiin EpCAM negatiivinen solulinjassa MIO-M1 upon EGP2-TK transfektion GCV hoitoon (kuva. 2B) voi johtua vuotavat ilmentymisen EGP2 promoottorin EpCAM negatiivinen solulinjoissa. Samanlainen vuotavat ilmentymistä GFAP promoottorin havaittiin normaaleissa astrosyytit [34]. Säätelemään epäspesifisen siirtogeenin ekspressiota siirto- ohjaa EGP2 promoottori, kloonasimme let-7b tavoitteita 3′-UTR-alueen EGP2-luc-konstrukti (kuvio 4A). Solut transfektoitiin EGP2-luc, EGP2-luc-2T EGP2-luc-4T, EGP2-luc-2C, EGP2-luc-4C plasmidikonstrukteja ja lusiferaasin geenin ilmentyminen analysoitiin 24 tunnin jälkeen. Merkittävä väheneminen lusiferaasiaktiivisuudeksi havaittiin EGP2-luc-2T ja EGP2-luc-4T verrattuna EGP2-luc in MIO-M1 (EpCAM

-ve /let-7b

ylös säännelty) ja Nthy -ori 3-1 (EpCAM

+ ve /let-7b

säädelty) solut (kuvio 4B). Toinen merkittävä väheneminen lusiferaasiaktiivisuuden EGP2-luc-2T verrattuna EGP2-luc-4T havaittiin MIO-M1-solut. Kuitenkin Y79 ja WERI-RB1 (EpCAM

+ ve /let7

alassäädetty) soluja, emme tarkkailla merkittävä väheneminen lusiferaasiaktiivisuutta EGP2-luc-2T ja EGP2-luc-4T verrattuna EGP2-luc (kuvio 4B). Nämä tulokset korostaa tarvetta miRNA sääntelyn transgeeniekspression yhdessä kudoksen promoottorin kohdennettuun ilmaus siirtogeenin.

miRNA kohdesekvenssien kaksi kappaletta tai neljä kappaletta kuten taulukosta 1. reportterigeeni lusiferaasin alle CMV promoottori kloonattiin EpCAM-TK konstruktio poistamalla TK-geeni ja lisäämällä lusiferaasin geeni. miRNA tavoitteet kloonattiin 3 ’UTR-alueen ekspressiovektorin, joka sisältää Gluc geenin EpCAM-promoottorin (A). Lusiferaasin ilmentyminen kvantifioitiin erittyy Gaussia lusiferaasi. Plasmidi rakentaa EGP2-luc, EGP2-luc-2T, EGP2-luc-4T, EGP2-luc-2C, ja EGP2-luc-4C transfektoitiin MIO-M1, Nthy-ori 3-1, Y79, WERI-RB1 solulinjat. Kun oli inkuboitu 48 tuntia tulokset normalisoitiin un-transfektoituja soluja, ja ne ilmaistaan ​​suhteellisina valoyksiköinä (B). Lusiferaasin tasoja ilmaistaan ​​prosentteina keskiarvo ± S.D (n = 3). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 vs EGP-2-luc-2T.

Soluspesifistä sytotoksisuuden dual ohjaus vektori transfektio GCV hoito oli suurempi kuin ETK pelkästään

arvioitiin suunnattu sytotoksisuus aiheuttama GCV-hoidon EGP2-TK-2T ja EGP2-TK-4T transfektion verrattuna kontrolleihin EGP2-TK, EGP2-TK-2C ja EGP2-TK-4C kaikilla 4 solulinjat. Normaali solulinjat Nthy-ori 3-1 (kuvio 5A) ja MIO-M1 (kuvio 5B), jotka on transfektoitu EGP2-TK-2T ja EGP2-TK-4T-konstrukteja GCV-hoito johti huomattavasti alempi solukuolemaa verrattuna EGP2- TK. Nämä solulinjat osoittivat merkittäviä vähemmän sytotoksisuus välittyy EGP2-TK-2T verrattuna EGP2-TK-4T konstruktio. Retinoblastoomasolulinjoista solulinjoissa Y79 (kuvio 5C), WERI-Rb-1 (kuvio 5D) transfektoitu EGP2-TK, EGP2-TK-2T, EGP2-TK-4T, EGP2-TK-2C ja EGP2-TK-4C rakentaa, minkä jälkeen GCV käsittely ei osoittanut mitään merkittävää eroa solujen kuolemaan. Nämä tulokset osoittavat, että solujen spesifisen sytotoksisuuden välittyy HSV-TK käsittelemällä GCV lääke on säännelty let-7b miRNA tavoitteet normaalissa solulinjoissa.

Solujen elinkelpoisuus määritys MTT arvioitiin transfektoimalla EGP2-TK , EGP2-TK-2T, EGP2-TK-4T, EGP2-TK-2C, EGP2-TK-4C plasmidit soluun linjat, Nthy-ori-3-1 (A), MIO-M1 (B), Y79 ( C), WERI-RB1 (D). 48 tunnin kuluttua transfektion seurasi GCV käsittely eri pitoisuuksilla (1, 10, 50, 100 uM) 24 tunnin ajan, lukemat mitattiin 570 nm: ssä käyttäen spektrofotometriä. Tulokset normalisoitiin transfektoimattomiin soluihin. Solujen elinkelpoisuus on esitetty prosentteina keskiarvo ± S.D (n = 3). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 vs. kontrolli.

EpCAM promoottori ja anna-7b kohdesekvenssin välittää ilmentymistä apoptoottisten markkeri retinoblastoomasoluissa

ohjata raportoitiin vuotavat ilmentymisen TK-geenin ei-kohdennettu normaaleihin soluihin (kuvio 1 2), transfektoimme EGP2-TK, EGP2-TK-2T, EGP2-TK-2C-konstruktien viemiseksi seuraavat solulinjat : N-Thy-Ori-3.1, MIO-M1, Y79 ja WERI-Rb-1. Koska havaitsimme EGP2-TK-2T osoitti merkittävää vaikutusta ohjaamalla transgeeniekspression, me valitsemme vain EGP2-TK-2T analysointiin apoptoosin markkereita jälkeen GCV hoidon. EGP2-TK-konstrukti ilmentyy suuresti EpCAM

+ ve-solulinjat, Nthy-ori 3-1 (kuvio 6A, kaista 1), Y79 (kuvio 6A, kaista 3), WERI-Rb-1 (kuvio 6A, kaista 4), verrattuna EpCAM

ve MIO-M1cell linjan (Kuva 6A, kaista 2). Transfektio EGP2-TK-2T-rakenne rajoittaa TK ilmentymistä vain retinoblastooma solulinjoissa (kuvio 6B, kaista 3, 4) ja normaaleissa solulinjoissa, kuten MIO-M1 ja Nthy-ori 3-1, vaikka läsnä ollessa EpCAM-proteiinia. EGP2-TK-2T transfektoitujen retinoblastooma solulinjoja käsiteltiin GCV lääkkeen osoittivat apoptoottisten markkeri, aktivoitu Caspase3 ja nekroottisen marker PARP-1 ilmentymisen (kuvio 6C, kaistat 3, 4), mutta ei normaaleissa solulinjoissa (kuvio 6C, kaistat 1, 2). Edelleen vahvistaa apoptoottista merkkiaineita ilmaisua, suoritimme immunofluroscence kokeissa, joissa samanlaiset tulokset havaittiin, joka tukee apoptoottinen merkki ilme western blot (kuvio S1). Sen sijaan, että PARP käytimme Bcl-2, joka on anti apoptoottisen markkeri.

Western blot-analyysi suoritettiin, kun läsnä on TK-proteiinin, EGP2-TK transfektoitiin Nthy-ori-3-1, MIO-M1 , Y79 ja WERI-Rb-1 solulinjoja (A).