Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti. Yhdysvalloissa, vain yksi kuudesta keuhkosyöpäpotilaita selviää viiden vuoden kuluttua diagnoosista. Nämä tilastot voivat parantua, jos uusia terapeuttisia kohteita tunnistetaan. Raportoimme aikaisemmin, että entsyymi rasvahappoaineenvaihdunnan, hyvin pitkäketjuiset asyyli-CoA 3 (ACSVL3), yli-ilmenee pahanlaatuisen gliooman, ja että heikentävien glioblastoomasolut of ACSVL3 heikentää heidän pahanlaatuinen ominaisuudet. Sen määrittämiseksi, ovatko ACSVL3 ilmentyminen lisääntyi myös keuhkosyövän, tutkittiin kasvaimen histologisen kohdat ja keuhkosyövän solulinjat. Immunohistokemiallinen analyysi ihmisen normaalien keuhkojen osoitti kohtalaista ACSVL3 ilmentymistä ainoastaan ​​keuhkoputken epiteelisoluissa. Sitä vastoin kaikki 69 eri keuhkokasvaimet testattiin, mukaan lukien adeno-, okasolu-, suuri solu, ja pienten solujen karsinoomat, oli voimakkaasti kohonnut ACSVL3 tasoilla. Western blot-analyysi keuhkosyövän solulinjat, jotka ovat peräisin näistä kasvaintyypeissä oli myös kasvanut merkittävästi ACSVL3 proteiinia verrattuna normaaliin keuhkoputken epiteelisolujen. Vähentämällä kasvu keuhkosyövän solulinjat eivät muutu ACSVL3 ilmaisua. Kuitenkin kaatamalla ACSVL3 ilmentymisen RNA-interferenssi pienentää solujen kasvu viljelmässä 65-76%, ja kyky syöpäsolujen muodostamaan pesäkkeitä pehmeässä agarissa suspensiossa 65-80%. Olemme tutkivat myös saada parempi käsitys biokemialliset ominaisuudet ihmisen ACSVL3. ACSVL3 mRNA havaittiin monissa ihmisen kudoksissa, mutta ilmaisu kuvio poikkesi jonkin verran, että hiiren. Entsyymi aktivoidaan pitkä- ja hyvin pitkäketjuisten tyydyttyneiden rasvahappojen substraatteja, sekä pitkän ketjun mono- ja monityydyttymättömiä rasvahappoja niiden koentsyymi-A-johdannaiset. Endogeeninen ihmisen ACSVL3 proteiini löydettiin pistemäinen subsellulaarisessa, että osittain colocalized kanssa mitokondrioita määritettynä immunofluoresenssimikroskopialla ja subsellulaarifraktiointikokeet. Näistä tutkimuksista, voimme päätellä, että ACSVL3 on lupaava uusi terapeuttinen tavoite keuhkosyöpään.

Citation: Pei Z, Fraisl P, Shi X, Gabrielson E, Forss-Petter S, Berger J, et al. (2013) Very Long-Chain asyyli-CoA 3: n yli-ilmentyminen ja kasvu riippuvuus in Lung Cancer. PLoS ONE 8 (7): e69392. doi: 10,1371 /journal.pone.0069392

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. heinäkuuta, 2012 Hyväksytty: 13 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 23 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Pei et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Institutes of Health myöntää HD024061, NS037355, ja NS062043 (PAW) ja Itävallan Science Fund (FWF) P14163-MOB. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Asyyli-CoA-syntetaasien (ACS) katalysoivat ATP-riippuvainen thioesterification rasvahappojen (FA) ja koentsyymi A: n (CoA) [1]. Tämä ”aktivointi” vaihe on tarpeen FA osallistua lähes kaikissa myöhemmissä metabolisia reaktioita. Joka perustuu niiden asyyliketjun pituus parempana, samoin kuin niiden aminohapposekvenssihomologian, 26 eri ACS: t todettu ihmisillä voidaan jakaa useiden erillisten perheiden entsyymejä, mukaan lukien ”erittäin pitkän ketjun” (ACSVL) perhe, joka sisältää 6 jäsentä. Viisi entsyymejä ACSVL perhe voi aktivoida pitkä- hyvin pitkäketjuisten FA alustoista; kuudes tämän perheen jäsen on maksaspesifiset sappihappoja CoA [2]. Lisäksi niiden aineenvaihdunnan toimintoihin, nämä entsyymit on myös tutkittu FA liikenteen proteiinit (FATP) [3], kuten kolme kuudesta perheenjäsenten edistää ottoa solun sisään pitkäketjuisten FA [4]. Virallinen nimitys koodaavat geenit ACSVL /FATP perhe on

SLC27A1-6

.

aiemmin kuvattu ominaisuuksia hiiren ACSVL3 (Slc27a3; FATP3) [5]. Kun ACSVL3 oli yli-ilmentynyt COS-7-soluissa, proteiini lokalisoitu endoplasmakalvostoon. Kuitenkin endogeeninen entsyymi MA-10 hiiren kiveksen Leydigin soluissa osittain colocalized kanssa mitokondrioita sekä erotussentrifugoinnilla ja immunofluoresenssimenetelmällä. Ohimenevä knockdovvn ACSVL3 käyttämällä siRNA vähentynyt kyky MA-10-solujen aktivoimiseksi joko pitkäketjuisia (palmitaatti; C16:0) tai hyvin pitkän ketjun (lignokeraatti; C24:0) FA. Kuitenkin ACSVL3 knockdown ei vaikuttaisi MA-10 soluja ryhtyä C16:0. Jälkimmäinen havainto vahvistettiin myöhemmin, kun ilmentymisen nisäkkään ACSVL3 hiivan onnistunut edistämään pitkäketjuisia FA otto [4]. Northern blot ja Western blot -analyysit aikuisen hiiren kudoksissa paljasti, että entsyymi ilmentyy pääasiallisesti lisämunuaisen, munasarjojen ja kivesten heikommin ekspressio muissa kudoksissa, kuten aivo-, keuhko-, ja munuaisten [5]. Korkea ACSVL3 mRNA oli läsnä alkion (E12) hiiren aivoissa; kuitenkin, ilme väheni nopeasti ja yhden kuukauden iästä lähtien, mRNA oli tuskin havaittavissa.

Aikuisille hiiren aivoissa kohdat osoittivat heikkoa ACSVL3 immunovärjääminen aivokuoren, hippokampuksen neuronit, ja pikkuaivojen Purkinjen solujen, mutta proteiinia ei havaittu gliasoluissa [5]. Siksi oli odottamatonta, kun löysimme ACSVL3 olevan selvästi yli-ilmennetään pahanlaatuinen gliooma ja ihmisen glioblastoomasolulinjoissa [6]. Kaatamalla ACSVL3 ilmentymistä ihmisen U87 glioblastoomasoluissa vähentäneet pahanlaatuisia käyttäytyminen sekä kulttuuriin ja kun pistetään joko ihon alle tai kallonsisäisesti hiirillä. Siksi me kysyttiin ACSVL3 ilmentyy muissa ihmisen maligniteettien, kuten keuhkosyöpä, joka on johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti [7]. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että ACSVL3 on erittäin yli-ilmentynyt kaikissa keuhkojen kasvaimet ja solulinjoissa tutkittiin. Keuhkosyövän solulinjat, ACSVL3 ehtyminen paransivat merkittävästi pahanlaatuisten kasvainten ominaisuuksia. Kuvaamme myös muita biokemiallisia ominaisuuksia ihmisen ACSVL3.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

[1-

14C] palmitiinihappo (C16:0), [1 –

14C] öljyhappoa (C18:1), [1-

14C] arakidonihapon (C20:4), [1-

14C] dokosaheksaeenihappoa (C22:6) ja [1-

14C] lignoseriinihappo (C24:0) saatiin Moravek Biochemicals Inc. (Brea, CA, USA). [1-

14C] linolihappo (C18:2) oli American Radiolabeled Chemicals (St. Louis, MO, USA). Polyklonaaliset lampaan antiseerumi 70 kDa peroxisomal kalvoproteiinin (pMP70) oli lahja tri S. Gould (Johns Hopkins Univ. Sch. Med.). Hiiren monoklonaalinen vasta-aine-proteiini-isomeraasin ja kanin polyklonaalista vasta-ainetta mangaani-superoksididismutaasia (MnSOD), olivat Stressgen (San Diego, CA, USA). Kanin polyklonaalista vasta-aine ATP nopaliinisyntaasin oli Chemiconilta (Chemicon International, Temecula, CA, USA). Kanin polyklonaalista vasta-aine fosfatidyylietanoliamiini N-metyylitransferaasin 2 (PEMT), oli lahja Dr. D. Vance (University of Alberta, Edmonton, Kanada). Affiniteettipuhdistettua kanin polyklonaalista anti-ACSVL3-vasta-aineen on aiemmin kuvattu [5]. HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita Western blotit olivat joko Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA) tai Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA), ja toisen vasta-aineita immunofluoresenssilla olivat Jackson ImmunoResearch (West Grove , PA, USA). De-tunnistettu, formaldehydi-kiinteä parafiinileikkeillä ihmisen keuhkosyöpä kudoksia kahdelta potilaalta saatiin ja käytettiin noudattaen protokollan hyväksymän Johns Hopkins Office of ihmiskoe Institutional Review Boards (Protocol NA_00003308); Tämä protokolla mahdollistaa käytön de-tunnistaa kudosten ilman ylimääräisiä kirjallista suostumusta (muut kuin mukana menettelyssä suostumuslomakkeet). Kudos array (luettelo # CBL-TMA-078), joka sisältää normaalia ihmisen keuhko- ja 67 eri keuhkotuumoreiden ostettiin Creative BioLabs (Port Jefferson, NY).

kloonaaminen Ihmisen ACSVL3 cDNA ja rakentaminen Ekspressioplasmidien

Täyspitkä ACSVL3 sekvenssi saatiin käyttämällä kombinatorinen lähestymistapa expressed sequence tag (EST) seulonta ja eristäminen liittyvien sekvenssien käyttäen erilaisia ​​-kloonausstrategiat. Lyhyesti, yksi klooni (C24355, Stratagene; GenBankin no. BC003041), joka sisälsi pitkän mutta 5′-rajaton avointa lukukehystä käytettiin perustana ylimääräisten 5′-sekvenssi, jossa käytetään genomista alukekävelyn. Sittemmin tunnistettu 5 ’laajennettu genomi-DNA-sekvenssi toimi tunnistaa ylimääräinen EST-klooni, peräisin kirjastosta, joka on rikastettu täyspitkää kloonia, jotka oli saatu kautta Cap-Trapper menetelmä [8], joka sijaitsee ylävirtaan ensimmäisestä ATG-klooni BC003041 . Tämä uusi EST-klooni (GenBankin no. BG720126), voitaisiin linjassa perimän DNA ja edellyttäen uusista cDNA-sekvenssin asemasta -115-179, joka toimi mallina edelleen alukesuunnittelu saadakseen täysimittaisen cDNA . Konstrukti, jossa on täydellinen avoin lukukehys ihmisen ACSVL3 geeni koottiin kaksivaiheista protokollaa. Ensimmäinen, joka on 2480-bp

Hind

III

EcoRI

I-fragmentti leikattiin irti cDNA-klooni C24355 ja insertoitiin ekspressiovektoriin pCDNA3.1 (+) (Invitrogen), jolloin saatiin P434. Toisessa vaiheessa, joka on 915 bp PCR-fragmentti monistettiin eksonin 1 genomisen ACSVL3 klooni, käyttäen eteenpäin-aluketta, 549 (5′-CGCCAAGCTTAGCCAGATGCCTAAA-3 ’), jossa on ATG (+1) alleviivattu, ja reverse-aluketta 530 (5’-AGCGCCACAGTTGCTCCAGGT-3 ’), puhdistettu, pilkottiin

Hind

III (käyttöön pohjamaalilla 549) ja

Eco47

III, ainutlaatuisen restriktiokohdan ACSVL3 cDNA, ja kloonattiin

Hind

III,

Eco47

III pilkottiin P434, mikä johti plasmidiin P435, joka sisältää täyspitkän konstruktin ACSVL3. DNA: n sekvensointi suoritettiin MWG Biotech (Ebersberg, Saksa).

Solulinjat ja kasvuolosuhteet

Ihmisen HepG2 hepatoma, COS-1, ja A549, H82, H460, EKVX, ja U1752 keuhkojen syöpäsolulinjoja olivat ATCC: ltä (Rockville, MD). HepG2-soluja ylläpidettiin minimal essential väliaineessa (Mediatech, Manassas, VA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Gemini Bioproducts). COS-1-soluja kasvatettiin DMEM: ssä (Mediatech), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Kaikki keuhkosyövän solulinjoja ylläpidettiin RPMI (Mediatech), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Kuolemattomiksi ihmisen keuhkoputken epiteelisolut (HBEC) [9] jalomielinen lahjoitus tohtori Jerry Shay (University of Texas Southwest Medical Center) ja ylläpidettiin seerumittomassa BEGM (keuhkoputken epiteelisolujen kasvualusta, Lonza, Walkersville, MD). Kaikki solut viljeltiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO

2/95,% ilmaa.

Tuotanto kloonilinjoissa kanssa Vakaa ACSVL3 Knockdown ja mittaus Tarttuneesta ja Anchorage riippumaton Cell Kasvuvauhdit

Kloonit, joilla on stabiili knockdovvn ACSVL3 tuotettiin käyttämällä pSilencer ™ 4,1-CMV hygro-vektoriin (Ambion), kuten aiemmin on kuvattu [6]. Vektorit, jotka sisältävät pudotus sekvenssit ACSVL3-3 (kohdistaminen nukleotidit 397-415) ja ACSVL3-4 (kohdistaminen nukleotidit 1863-1881), jotka on molemmat aiemmin osoitettu vähentävän ACSVL3 ilmentymistä ihmissoluissa, transfektoitiin yhdessä A549, EKVX, H82, ja H460 keuhkosyövän solulinjat elektroporaatiolla. Ohjaus solut transfektoitiin pSilencer vektorin (toimittaja Ambion), joka ei ole kohdistettu mitään ihmisen mRNA-sekvenssin kanssa. Kloonit stabiilisti kätkeminen ohjaus ja pudotus plasmidit valittiin hygromysiinin (250 ug /ml), kestävyys ja analysoitiin ASCVL3 ilmentyminen immunofluoresenssilla ja Western blot. Solujen lisääntyminen ja ankkurista riippumaton kasvu mitattiin aikaisemmin kuvatulla [6].

RNA Pistesiirto ja Northern Blot analyysit

Moninkertainen kudosekspressiotutkimuksen (MTE) array sisältäviä poly (A) -selected RNA 61 eri aikuisen ihmisen kudoksista saatiin Clontech. CDNA-koetin valmistettiin monistamalla PCR: llä 657 bp: n fragmentti (asema 1631-2287 on ACSVL3 /SLC27A3 mRNA, NCBI-# NM_024330) käyttämällä 5′-GCACTGTATGGCCACATCTCC-3 ’ja 5′-TCTCTCAGGTGCCTCAGGTGT-3′ eteenpäin ja käänteinen alukkeet, vastaavasti, ja plasmidi-P435, joka sisälsi täyspitkän ACSVL3 cDNA: ta templaattina. Voit tarkistaa spesifisyys koetin ACSVL3, BLAST haku ja useita sekvenssijärjestystä käyttämällä muiden jäsenten ACSVL /SLC27A perhe suoritettiin ja havaittu mitään samankaltaisuutta SLC27A1, 4, ja 5, ja vain pieni samankaltaisuutta SLC27A2 ja 6 ( ei näytetty). Valvontaan, joka on 528 bp: glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) koetin valmistettiin PCR: llä käyttäen 5’-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3 ’ja 5′-CTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3’ eteenpäin ja reverse-alukkeita, vastaavasti. Edellytykset koetin merkintöjä, hybridisaatio- ja havaitseminen olivat kuten aiemmin on kuvattu [10], [11]. Hybridisaatiota GAPDH-koetin oli vahvaa kaikkien mRNA kohdetta (ei esitetty).

Northern blot -analyysiä varten, samaa koetinta kuin MTE array hybridisoitiin ihmisen usean kudoksen Northern blot (Ambion, Austin, TX, USA); kana β-aktiini-koetinta käytettiin kontrollina. Hybridisaatio suoritettiin käyttämällä Express Hybridization liuosta (Clontech), yön yli 65 ° C: ssa ja pesun alhaisen vaativuuden käyttäen 2 x SSC, 0,05% SDS 40 minuutin ajan 65 ° C: ssa, minkä jälkeen 0,1 x SSC, 0,1% SDS 40 minuutin ajan 50 ° C korkeampi vaativuus. Koettimet hybridisoidaan havaittiin altistuksen Molecular Imager FX System (Bio-Rad).

Solunosafraktiointi ja Western blot -analyysi

HepG2-solut fraktioitiin kuten aikaisemmin on kuvattu [12]. Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [13]. Immunodetektioon hiiren anti-MnSOD, kanin anti-PEMT tai kanin anti-ACSVL3 ensisijainen vasta-aineita käytettiin yhdessä HRP-konjugoitua anti-kani-anti-hiiri-vasta-aineita.

epäsuoralla immunofluoresenssilla ja immunohistokemia

HepG2-soluja kasvatettiin -60% konfluenssiin lasipeitinlevyjä kiinnitettiin 4% formaldehydiä PBS: ssä ja tehtiin läpäiseviksi 1,0% Triton X-100 ennen inkubointia primääristen (kanin anti-ACSVL3, lampaan anti-pMP70, hiiren anti-proteiini-disulfidi isomeraasia tai kanin anti-ATP-syntetaasin) ja toisen (FITC-konjugoitu anti-kani tai Rhodamine-konjugoidulla anti-hiiri tai anti-lammas-IgG) vasta-aineita, kuten aiemmin on kuvattu [14]. Fluoresenssi tehtiin näkyväksi käyttämällä Zeiss Axiovert epifluoresenssimikroskoopilla. Immunohistokemiallinen tunnistus ACSVL3 on histologinen kohdissa ihmisen keuhkotuumoreiden kuten aiemmin on kuvattu [5], [6].

Asyyli-CoA-määritys

COS-1-solut transfektoitiin ACSVL3 ilmaisu plasmidi P435 tai tyhjän vektorin elektroporaatiolla, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Solut kerättiin 3 päivää transfektion jälkeen, pestään, suspendoidaan homogenointipuskuriin, ja säilytettiin -80 ° C: ssa ennen määritystä. Aktivointi [1-

14C] -leimattua FA (C16:0, C24:0, C18:1, C18:2, C20:4 tai C22:6) niiden CoA tioesterit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [15] . Analyysit kanssa C16:0 sisälsi 15 ug COS-solu proteiinia, testeissä, joissa C24:0 sisälsi 60 ug proteiinia, ja määritykset kaikkien muiden FA sisälsivät 50 ug proteiinia.

Rasvahappokoostumus

H460 ja EKVX solut kasvatettiin lähes konfluenssiin, korjataan kevyesti trypsinisaatiolla, ja pestään fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella. Solupelletit, jotka sisältävät 1,0 mg proteiinia, uutettiin, derivatisoitu pentafluoribentsyyli bromidi, ja kvantitoitiin kapillaarikaasukromatografista elektronin kaapata negatiivinen ioni massaspektrometria (GC /MS), kuten ovat kuvanneet Lagerstedt et al. [16]. Tulokset on esitetty prosentteina rasvahappojen kokonaismäärästä.

tulokset

Tissue Distribution of Human ACSVL3 mRNA

ACSVL3 mRNA: n ekspressio tutkittiin RNA dot blot-analyysillä käyttäen usean kudoksen ilmentymistä (MTE ™) joukon sisältäessä 61 aikuisen ihmisen kudosnäytteitä (Fig. 1A). Signaali voimakkuus jokaisen yksittäisen pisteen kvantitoitiin ja ACSVL3 ilmaisun suhteessa, että GAPDH laskettiin. Vahvin normalisoitu ACSVL3 signaalit olivat läsnä haimassa, mahassa, aortta, ja perna. Vuonna verenkiertoelimistön, ACSVL3 mRNA oli erityisen rikastettu aorttaan verrattuna kaikilla sydämen. ACSVL3 transkripti oli suhteellisen runsaasti koko ruoansulatuskanavan, viittaa mahdolliseen rooli suolen FA aineenvaihduntaan. MRNA voidaan myös helposti havaita useimmissa imukudoksen ja sukuelimiin ja virtsateiden. Kohtalainen signaali voimakkuus saatiin eniten rauhaset, paitsi rintarauhasen ja aivolisäkkeen, joissa esiintyy esiintyi useammin. Lähes kaikilla alueilla keskushermostoon, paitsi pikkuaivot ja aivolisäkkeestä, oli hyvin alhainen ACSVL3 mRNA-tasoja. ACSVL3 ilmaisu luustolihasten oli myös erittäin heikko. O, joka ilmaisee ei-spesifisen sitoutumisen ACSVL3 koettimen eri valvonnan RNA: n ja DNA-näytteet havaittiin.

(

) Ihmisen usean kudoksen ilmentymistä (MTE ™) array RNA dot blot-analyysi. RNA dot blot hybridisoitiin

32P-leimattua, 657-bp: n PCR-fragmentti on peräisin ihmisen ACSVL3 cDNA, kuten on kuvattu menetelmät. Kalvo riisuttu ja hybridisoitiin GAPDH koetin ohjata mRNA runsautta. Signaalin voimakkuus yksittäisiä pisteitä kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa (saatavana: https://rsbweb.nih.gov/ij/download.html), ja ACSVL3 ilmaisun suhteessa, että GAPDH laskettiin. (

B

) Ihmisen usean kudoksen Northern blot, joka sisälsi 2 ug poly (A)

+ – valittu RNA hybridisoitiin saman ACSVL3 cDNA-koettimeen kuin

(A)

. Kaistat ovat: M, Millenium merkkiaineet ™; 1, aivot; 2, maksa; 3, istukka; 4, ohutsuoli; 5, paksusuoli; 6, kateenkorva; 7 perna; 8, eturauhanen; 9, kives; ja 10, munasarja. Arvioitu koot havaittujen bändit näkyvät oikealla. Ohjaus hybridisaatio β-aktiini anturi näkyy pohjalevy.

Jotta voitaisiin koon ACSVL3 mRNA, ihmisen usean kudoksen Northern blot hybridisoitiin koettimen käytetty MTE blot. Tämä koetin havaittiin 2,7 kb ACSVL3 transkriptin kaikissa kudoksissa paitsi aivoissa (Fig. 1 B, ylhäällä). Puuttuminen signaalin aivoihin näytteestä todennäköisesti vähäisen määrän mRNA läsnä tässä kaistaa, dokumentoimat β-aktiini ohjaus (Fig. 1 B, alhaalla). MRNA: n koko on sama kuin ennustettu ACSVL3 cDNA. Toinen mRNA noin 1,5 kb ilmestyi maksassa, kiveksissä ja eturauhasen (Fig. 1 B, ylhäällä). Tämä pienempi mRNA oli yleisin maksassa ja siksi todennäköisesti osaltaan korkea signaali maksasta täpläblottauksessa. Pieni koko on rajat hybridisoituva sekvenssi ei pystyä mukautumaan avoimen lukukehyksen tyypillisen ACS, ja näin ollen ei analysoitu edelleen. Kaiken kaikkiaan on hyvä korrelaatio ilmaisun tasojen Northern blot ja monen kudoksen array.

Asyylikoentsyymi-CoA Activity of Human ACSVL3

Analysoimme toimintakyky ihmisen ACSVL3 proteiinin aktivoimiseksi FA niiden CoA tioestereihin seuraava yli-ilmentyminen COS-1-soluissa. Verrattuna COS-1-solut transfektoitu tyhjällä vektorilla, solut, jotka ilmentävät ACSVL3 osoittivat lisääntynyttä ACS aktiivisuutta määritettiin useiden FA alustoille. Tilastollisesti merkitsevä aktivointi palmitiinihappoa (C16:0), oleiinihappo (C18:1ω9), α-linolihappoa (C18:2ω6), ja arakidonihappo (C20:4ω6) havaittiin (Fig. 2). Vaikka me rutiininomaisesti mitataan lisännyt kapasiteettia aktivoida hyvin pitkäketjuiset FA, lignoseriinihappo (C24:0), tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Lievää aktivoituminen dokosaheksaeenihappoa (C22:6w3) havaittiin myös, mutta ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Samanlainen kuin mitä on osoitettu muille ACSVL entsyymejä [15], [17], [18], yli-ilmentynyt ACSVL3 proteiini aktivoituu pitkäketjuiset FA suuremmassa määrin kuin hyvin pitkän ketjun FA.

COS-1 -solut yli-ilmentävät ACSVL3 (harmaat pylväät) plasmidista P435 (ks menetelmät) ja valvonta-solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla (valkoiset pylväät) määritettiin ACS aktiivisuus käyttäen ilmoitettua

14C rasvahappoa substraattina menetelmät kuvatulla tavalla. Yksi yksikkö (U) entsyymiaktiivisuutta = 1 umol /min. Tulokset esitetään keskiarvona ± S.D. kolmen itsenäisen transfektion kokeissa. ns, ei ole merkittävä. p-arvot: * 0,05; ** 0,01; *** 0,001.

ACSVL3 solunosasijaintia HepG2 solut

epäsuoralla immunofluoresenssilla käytettiin paikallistaa endogeenisten ACSVL3 ihmisen hepatoomasolulinjassa HepG2. ACSVL3 osoitti pistemäistä fluoresenssia kuvio havaitut konfokaalimikroskopialla (Fig. 3a, d, ja g). ACSVL3 immunovärjäystä näistä pistekeratopatiaa rakenteita ei colocalize joko peroksisomaalisen merkki, pMP70 (Fig. 3b ja c) tai Endoplasmakalvosto markkeri, proteiini-isomeraasin (Fig. 3e ja f). ACSVL3 immunofluoresenssilla colocalized osittain mitokondrioita visualisoitiin käyttäen ATP-syntaasi merkkiaineena (Fig. 3 h ja i).

Konfokaalimikroskopia havaitsemiseen käytettiin endogeenisen ACSVL3 HepG2-soluissa immunovärjäys anti-ACSVL3-vasta-aine (a, d, ja g). Double-merkinnät anti-ACSVL3 (a) ja anti-pMP70 (b) osoittivat, että pistemäinen ACSVL3 sisältävät vesikkelit eivät peroksisomeissa, kun kuvat yhdistettiin (c). Double-merkinnät anti-ACSVL3 (d) ja anti-proteiini-isomeraasin (e) merkkiaineena Endoplasmakalvosto eivät paljastaneet rinnakkaispaikantumisen yhdistetyssä kuvassa (f). Double-merkinnät käyttäen anti-ACSVL3 (g) ja anti-ATP syntaasi (h) osoitti osittaista rinnakkaispaikantumisen of ACSVL3 kanssa mitokondrioiden yhdistetyn kuvan (i).

karakterisoimiseksi edelleen solunosasijaintia ACSVL3 HepG2-solut fraktioitiin differentiaalisentrifugoinnilla. Homogenaatit erotettiin jakeisiin rikastettu ytimet (N), mitokondrioissa (M), peroksisomeihin (L), solulimakalvoston (P), ja kalvo-solusoolin (S), ja analysoitiin Western-blottauksella. ACSVL3 havaittiin pääasiassa M-fraktiossa (Fig. 4), kuten on esitetty läsnäolo mitokondrion markkeriproteiinia MnSOD. Vähemmässä määrin proteiini voitiin havaita myös, että N-murto-osa. Ei ACSVL3 signaalia ei voitu havaita L-, P- tai S-jakeet. Läsnäolo ACSVL3 N-jae johtuu todennäköisesti saastumisen epätäydellisesti homogenoitiin soluja, kuten MnSOD ja fosfatidyylietanoliamiini N-metyylitransferaasin 2 (PEMT) havaittiin myös tässä fraktiossa (Fig. 4).

HepG2-soluissa fraktioitiin ydin (N), mitokondrioiden (M), kevyt mitokondrion (L), mikrosomaalisen (P), ja sytosolin (S) fraktiot differentiaalisella sentrifugoinnilla, ja yhteensä mitokondrion (ML) fraktio erottaa edelleen puhdistettiin mitokondrioiden (Mito ) ja mitokondriot liittyvä kalvon (MAM) jakeet, kuten on kuvattu menetelmät. Kukin kaista ladattiin -30 ug proteiinia. Western blot -analyysit saman kalvon suoritettiin käyttäen vasta-aineita ACSVL3, mitokondrio-markkeri Mn-superoksididismutaasia (MnSOD), ja MAM markkeri fosfatidyylietanoliamiini N-metyylitransferaasin (PEMT).

Koska rinnakkais- ja ACSVL3 ja mitokondriot immunofluoresenssilla ei ollut täydellinen, me arveltu, että ACSVL3 voisi löytyä mitokondrioissa liittyvän kalvon (MAM) jae, joka on Endoplasmakalvosto johdettuja osaston, joka sedimenteistä on mitokondrioita aikana differentiaalisentrifugointia [19]. Siksi olemme ratkaisseet MAM jae puhdistetaan mitokondrion sentrifugoimalla Percoll. MAM-markkeri proteiinia, PEMT, havaittiin MAM osa vain, mikä osoittaa onnistuneen erottamisen mitokondrioiden ja MAM. Oli merkittävä rikastuminen ACSVL3 signaalin puhdistettu mitokondrioissa, mutta proteiini ei ollut havaittavissa MAM osa (Fig. 4). Kuten havaittiin vain osittaista rinnakkaispaikantumisen of ACSVL3 kanssa mitokondrioita immunofluoresenssianalyysin avulla (Fig. 3), vaikka sen sedimentaatio tässä murto ja sen poissaolo MAM jae, ehdotamme, että ACSVL3 proteiini asuu uudella subsellulaarisessa, joka eroaa, mutta tiiviisti liittyvä mitokondrioita. Vastaava tulos saatiin hiiren ACSVL3 [5].

ACSVL3 Expression Normal Human Lung ja Lung Kasvaimet

aiemmin raportoitu, että huolimatta heikosta ilmentymistä aivoissa ja olennaisesti mitään havaittavaa proteiinia glia, ACSVL3 tasot olivat voimakkaasti koholla pahanlaatuinen gliooma ja ihmisen glioblastoomasolulinjoissa [6]. Sen määrittämiseksi, onko muiden maligniteettien yliekspressoitu ACSVL3, tutkimme tämän proteiinin ilmentymisen normaaleissa ihmisen keuhko- ja keuhkojen kasvaimet immunohistokemiallisesti. Vaatimaton ACSVL3 ilmentyminen havaittiin normaalissa keuhkoputkien ja keuhkoputkien epiteelisolujen (Fig. 5). Ei ACSVL3 histokemiallisella nähtiin tyypin I tai tyypin II keuhkorakkuloiden solut, pikari soluja, strooman soluja tai jotka käsittävät keuhkojen verisuonistoon. Sen sijaan, kudosleikkeiden kasvaimista resektoitiin kahdelta potilaalta Johns Hopkins Hospital, yksi diagnosoitu adenokarsinooma ja toinen okasolusyöpä, esillä suuresti kohonnut ACSVL3 tasoa (ei esitetty). Vahvista näiden ensimmäisten havaintojen, suoritimme immunohistokemiallinen analyysi kudoksen array, joka sisältää 67 erilaista ihmisen keuhkokasvaimia. Edustettuna jono oli 25 okasolukarsinoomia, 21 adenokarsinoomat, 6 papillaarinen adenokarsinoomat, 7 pieni solukarsinoomat, 3 suurta solukarsinoomat, yksi bronchioloalveolar karsinooma, yksi basaloid okasolusyöpä, ja 3 karsinoidikasvaimissa. Näiden kasvainten, 100% osoitti yliekspressio ACSVL3; useita edustavia kasvaimia, on esitetty kuviossa. 5. Ei ollut selvää korrelaatiota laajuus ACSVL3 ilmaisun ja erilaistumisen tilasta kasvain.

Parafiinisektioista keuhkotuumoreiden läsnä kudoksen array immunovärjättiin anti-ACSVL3 vasta-aineella (ruskea) ja vasta- värjättiin hematoksyliinillä (sininen). Kasvaimet edustaja 67 eri kasvaimia läsnä array, sekä normaali keuhkokudoksessa, näkyvät. Kaikki kasvaimet värjätään positiiviseksi ACSVL3. Yhteensä suurennus, 400 ×. Bar = 50 pm.

ACSVL3 Expression Lung tuumorisolulinioissa

Vahvista ja laajentaa näitä havaintoja, tutkimme ACSVL3 ilmentyminen normaaleissa ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (HBEC) ja useita keuhkosyövän solulinjoja. ACSVL3 ilme oli tuskin havaittavissa HBEC (Fig. 6A ja 6B). Solulinjat on johdettu ihmisen keuhko- kasvainten, jotka edustavat pienisoluinen karsinooma (H82), ei-pienisoluinen karsinooma (A549), adenokarsinooma (EKVX), levyepiteelisyöpä (U1752), ja suuri cell carcinoma (H460), kaikki vahvasti ilmaistaan ​​ACSVL3 ( kuva 6A).

(

) kasvu tavanomaisissa viljelyolosuhteissa. HBEC ja viisi keuhkosyövän solulinjoja viljeltiin, kuten on kuvattu menetelmät ja analysoitiin ACSVL3 ilmentymisen Western blot. Tuumorisolulinjat olivat peräisin ei-pienisoluisen (A549), pienisoluinen karsinooma (H82), suuri cell carcinoma (H460), adenokarsinooma (EKVX), ja okasolusyöpä (U1752). p-Actin ilmentyminen määritettiin latauskontrollina. (

B

) vaikutus kasvu vähentämisen ACSVL3 ilmentymistä keuhkosyövässä solulinjoissa. HBEC, viljeltiin seerumittomassa BEGM, kasvaa merkittävästi hitaammin kuin syöpäsolulinjoilla. Hidastaa niiden kasvuvauhtia, A549, H82, H460, ja U1752 solut siirrettiin BEGM. Kaikki soluja ylläpidettiin tässä väliaine 3 viikkoa, jolloin ne otettiin talteen ja altistettiin Western blot-analyysi. Kasvainsolut kasvatettiin standardin väliaineessa, RPMI plus 10% naudan sikiön seerumia (FBS), kerättiin vertailun. Kasvuvauhti BEGM kaikille syövän solulinjat väheni yli 50%.

HBEC kasvaa hitaasti, koska ne viljellään seerumittomassa synteettinen väliaine (BEGM) estämään levy- erilaistumista [ ,,,0],20]. Koska kasvainsolulinjat, viljeltiin rikkaassa alustassa, joka sisälsi naudan sikiöseerumia, kasvavat huomattavasti nopeammin kuin HBEC, kysyimme, onko korkea ACSVL3 tasot olivat yksinkertaisesti seurausta nopean kasvun. Neljä kasvainsolulinjoja, A549, H82, H460, ja U1752, siirrettiin seerumittomaan BGEM ja pidettiin tässä alustassa kolmen viikon ajan. Huolimatta 50%: n lasku kasvu, nämä solulinjat kaikki yllä korkea ACSVL3 lauseke (Fig. 6B). Tämä havainto viittaa siihen, että muut tekijät kuin kasvu vastaa ylläpidosta korkean ACSVL3 tasojen syöpäsolulinjoissa.

vaikutus ACSVL3 Knockdown on Tarttuneesta ja Tarttumattomat kasvu Lung tuumorisolulinioissa vuonna Culture

Stable knockdovvn ACSVL3 ilmaisun glioblastoomasoluissa vähentäneet pahanlaatuisen fenotyypin kulttuuri [6]. Molemmat kasvu kulttuuriin ruokia ja kyky muodostaa pesäkkeitä pehmeässä agarissa keskeytys tunnusomaisempaa normaalien solujen kun ACSVL3 oli tyhjentynyt. Sen määrittämiseksi, ovatko ACSVL3 ilme vaikuttaa myös kasvua keuhkosyöpään solujen, tuotimme neljä riviä vakaa ACSVL3 pudotus käyttäen RNA-interferenssin Menetelmät kuvatulla tavalla. Ohjaus solulinjoja stabiilisti plasmidia, joka koodaa salattu lyhyt hiusneula-RNA ikään on tuotettu. Kaikki neljä pudotus solulinjat oli laskenut ACSVL3 proteiinin tasot Western blot (kuvio. 7).

lyhyen hiusneulan tuottavat vektorin pSilencer (Ambion) käytettiin tuottamaan useita keuhkosyövän solulinjoja on pienentynyt ACSVL3 ilmaisua, kuten on kuvattu menetelmissä. Kloonilinjoissa of H460, H82, A549, ja EKVX keuhkosyöpä solut vakaa taintumisen (KD) on ACSVL3 valittiin. Ohjauslinjaa stabiilisti satama plasmidi, joka sisältää salatun sekvenssi, joka ei ole kohdistettu mitään ihmisen tai jyrsijän mRNA. (

) ACSVL3 ilmentymistä valvonta ja KD solut arvioitiin Western-blottauksella. (

B

) Gel-Pro Analyzer 4.0 ohjelmistoa käytettiin kvantifioimiseen Western blot signaalien (A). Expression of ACSVL3 suhteessa p-aktiini laskettiin kunkin parin ohjaus- ja KD-solulinjat. Ohjaus solulinjaa suhdelukuja mielivaltaisesti asetettu 100 ja suhteellinen, normalisoitu ilmentyminen ACSVL3 KD soluissa laskettiin. Valkoiset pylväät, kontrollisolut; harmaat palkit, KD soluja.

Sitten mitataan vaikutus ACSVL3 knockdown proliferaatioon viljeltyjen H460 ja H82 keuhkosyövän solulinjat. Kuten on esitetty kuviossa. 8A, puute ACSVL3 laski solujen kasvua hinnat 65-76% (mitattiin vuorokautena 6). Olemme myös mitattava tarttumattomat kasvua neljä solulinjojen, A549, EKVX, H82, ja H460, pehmeässä agarissa jousitus. Kuten on esitetty kuviossa. 8B, pesäkkeiden muodostuminen väheni kaikissa ACVL3 puutosta solulinjoissa 65-80%. Nämä havainnot osoittavat, että ACSVL3 ehtyminen keuhkojen syöpäsoluja, kuten glioblastooma soluissa, vähenee niiden pahanlaatuinen

in vitro

kasvufenotyyppiä.

(

) kasvu kulttuuriin. Ohjaus (▪) ja taintumisen (▴) H460 ja H82-soluja (5 x 10

3) ympättiin 6-kuoppaisille levyille. Päivinä 2, 4, 6, ja 8, solujen kolminkertaisista kuopista kerättiin trypsinisaatiolla ja laskettiin käyttäen hemasytometriä. Keskiarvo ± S.D. piirretään. (

B

) Anchorage riippumatonta kasvua. Kiitämme Drs.