Krooninen sairaus

tiivistelmä

androgeenideprivaatio (AD) on tehokas menetelmä aluksi vaimentamiseksi eturauhassyöpä (PC) eteneminen. Kuitenkin androgeenireseptorin tulenkestävä PC soluja väistämättä esiin androgeenin reagoiva kasvain, joka johtaa parantumaton sairaus. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, AD indusoi solujen vanhenemista, ilmiö, joka on solu-itsenäisesti kasvain heikentävän mutta joka antaa kasvain edistäviä muutoksia, jotka voivat helpottaa kynnyksellä vanhenemista kestävä pahanlaatuinen solupopulaatioiden. Koska androgeenista tulenkestävä PC soluja esiin kloonaamalla päässä perin androgen-kasvainsolujen, pyrimme tutkimaan, onko AD-aiheuttama vanhenemista (ADIS) vaikuttaa hankinta androgeenin tulenkestävä käyttäytymistä androgeenien reagoiva LNCaP ja LAPC4 eturauhasen syöpäsoluja. Huomaamme, että toistuva altistuminen näiden androgeenien reagoiva solujen vanhenemista aiheuttavia ärsykkeitä kautta syklisen AD johtaa kehittyy nopeasti ADIS vastustuskykyisten, androgeeni-tulenkestävä soluja suurin senescent solupopulaation. Tuloksemme osoittavat, että ADIS fenotyyppi liittyy kasvaimen edistäviä ominaisuuksia, erityisesti chemoresistance ja parannettu pro-selviytymisen mekanismeja, kuten inhibition p53-välitteisen solukuoleman, jotka edistävät pysyvyyttä senescent soluja. Olemme lisäksi löytää että farmakologinen täytäntöönpano p53 /Bax aktivaation kautta Nutlin-3 ennen perustamista ADIS ratkaisemiseksi tarvitaan siihen liittyviä pro-selviytymisen vasteen ja valikoivasti laukaista läpitunkevaa solukuolemaa sijasta vanhenemisen aikana AD. Niinpä meidän tutkimus osoittaa, että ADIS edistää seuraus androgen-tulenkestävien PC soluja ja näin ollen toivottua heikompi kasvaimeen vaimennin vastaus AD.

Citation: Burton DGA, Giribaldi MG, Munoz A Halvorsen K, Patel A, Jorda M, et al. (2013) androgeenideprivaatio aiheuttama Vanheneminen Edistää seuraus androgeenin Tulenkestävät syöpäsolujen. PLoS ONE 8 (6): e68003. doi: 10,1371 /journal.pone.0068003

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 marraskuu 2012; Hyväksytty: 28 toukokuu 2013; Julkaistu: 28 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Burton et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ Rahoitin Florida Biomed Bankhead Coley New tutkija Award, University of Miami /Sylvester Kattava Cancer Center Papa Corps Developmental Cancer Research Grant ja Miamin yliopisto /Stanley Glaser Foundation palkinto (PR). MGG oli osittain tuettu Sylvester Kattava Cancer Center Summer ylioppilas Research Award. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PC) on yksi yleisimmistä pahanlaatuisten miestä ja johtava syy syöpään liittyvien kuolemien. Kehittyneen sairaus, androgeenien puute hoito on tärkein hoito johtuen kriittistä riippuvuutta eturauhasen kudosta androgeenien lisääntymisen ja eloonjäämisen [1]. Kuitenkin lopulta syntymistä androgeenista tulenkestävien kasvaimia, jotka eivät enää vastata myönteisesti androgeenireseptorin peruuttamista, vähentää potilaan eliniän alle kaksi vuotta, koska nämä kasvaimet ovat huonosti reagoivien Lisähoidot [2], [3]. Molekyylitason mekanismeja, jotka aiheuttavat nämä androgeenireseptorin tulenkestävä kasvaimia ei ymmärretä hyvin. Merkittävää tutkimus on keskittynyt androgeenireseptorin (AR) signalointia ja syytöksiä AR liittyvien poikkeavuuksien kuten geenimonistuksen, ligandista riippumatonta tai siveetön ligandi-pohjainen aktivointi ja muuttunut yhteistyössä säädin ilmaisun [2], [4] – [7]. Non-AR väyliä ajatellaan liittyvän androgeeni tulenkestävä leviämisen sisältävät ohitus AR-pohjainen leviämisen ohjaus onkogeeni aktivointia tai kasvaimia estävä alisäätely, muuttunut chromatin geenien transkription säätelystä, häiriöt solusyklikontrollin koneet ja kohonnut ilmentyminen steroidien entsyymien [8 ] – [14].

kuitenkin monet tutkimukset tutkivat näiden mekanismien tarkastelemaan niitä osana edenneen eturauhassyövän malleja ja ei käsitellä aikaisintaan muutoksia tarvitaan kiertäminen AD aiheuttaman tuumorisuppressiogeeneksi. Tämä on tärkeä asia, koska huolimatta sen korkea alkuperäisen kasvainta estävä vaikutus [15], AD ei tappaa kaikki androgeeni-reagoiva syöpäsolujen vaan indusoi proliferatiivinen pidätykseen merkittävästi alaryhmässä [16]. Ottaen huomioon, että androgeenin tulenkestävä solupopulaatioiden on ominaista hankinta tai tehostaminen stressiin suojaava pro-syntyreitit [8], [10], [17], ominaisuuksia näiden leviämisen-pidätti solut ovat todennäköisesti tärkeitä ymmärtämään, miten androgeenin tulenkestävä osapopulaatioiden syntyy. Onkin todennäköistä, että joissakin näistä pidätettiin solujen poistua proliferatiivinen pysähtymiseen ja toimimattomuuden AD. Tueksi tätä ajatusta, on raportoitu, että eturauhasen kasvaimia koostuvat heterogeeninen soluseosten kannalta androgeenin vastauksen [18], ja että androgeenireseptorin tulenkestävät solujen syntyä valittu variantti väestöä vanhempien androgen reagoiva soluihin [18], [19]. Lisäksi sopusoinnussa kliininen fenotyyppi, pitkittynyt ( 6 kk)

in vitro

androgeeni-ablatoitu kulttuurin androgen reagoiva eturauhassyöpäsolulinjoissa johtaa lopulta seuraus androgeenin peruuttamisesta-resistenttien kloonien päässä perin kasvusta -arrested väestöstä [8], [20]. Näin ollen, valaisemaan molekyyli mekanismeihin, jotka ovat AD-indusoidun kasvun pysähtymisen on kriittinen määrittämiseksi etiologiaa androgeenin tulenkestävien PC.

molekyylitason ominaisuudet AD aiheuttaman kasvun pysähtymisen kuuluu G1 /S lohkon, alennetaan sykliiniriippuvainen kinaasiaktiivisuuden hypophosphorylated Rb, ja kumota ne pidätettiin fenotyypin kautta käyttöönoton onkoproteiinia, SV40 Large T-antigeenin [21]. Nämä piirteet ovat yhdenmukaisia ​​AD aiheuttama pidätys on eräänlaista solun vanhenemisen [22], ja kaksi viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet, että androgeenireseptorin puutteellisista soluista kehittää molekyylimarkkereina yhdenmukainen senesenssiin [23], [24]. Malleja onkogeenin perustuva kasvainten synnyssä ovat osoittaneet, että onkogeenin indusoimaa vanhenemista johtaa selektiivisen paineita, jotka edistävät seuraus vanhenemista kestävä aggressiivinen kasvainsolun alapopulaatiot [25] – [27]. Kuitenkin tämä kasvain edistäviä näkökohta Vanheneminen ei ole, meidän tietomme, aiemmin tutkittu hormoneja peruuttamisen liittyviä vanhenemista. Siksi suunniteltu Tutkimuksemme selvittää samanlainen paradigman eli kiertäminen AD aiheuttaman vanhenemisen (ADIS), toimii sukupolven androgeenista tulenkestävien syöpäsolujen päässä vanhempien androgen-reagoiva populaatio. Niinpä tässä tutkimuksessa käytimme LNCaP ja LAPC4 PC solulinjojen, tiedetään olevan tärkeimmät keskeiset piirteet androgen reagoiva eturauhasen tuumorisoluissa myös vankka androgeenireseptorin ja prostataspesifisen antigeenin ilmentymisen, tehostetut jakautumista vasteena Androgeenit ja proliferatiiviset lopettamisen yhteydessä androgen peruuttamista, ja kyvyttömyys muodostaa kasvaimia kastroitu hiirillä. Me viljeltiin näiden solujen hiilellä erotettua seerumia (CSS) sisältävä media kerrata AD kulttuuriin. Tavoitteena oli kuvata molekyylitason reitit liittyy ADIS ja onko voisimme eristää vanhenemista kestävä variantteja pystyy lisääntymään alle AD.

Tuloksemme osoittavat, että ADIS johtaa hankintaan kasvain edistäviä ominaisuuksia, kuten parannettu pro-selviytymisen mekanismeja ja chemoresistance. Merkittävää on, jatkuva läsnäolo vanhenemista aiheuttavia ärsykkeitä kautta syklisen AD helpottaa laajentamista ADIS vastustuskykyisten androgen-tulenkestäviä LNCaP ja LAPC4 variantteja kuluessa viikon. Nämä vaihtoehdot ovat osittain painatus vanhenemiseen liittyvän pro-eloonjäämisen ominaisuudet huolimatta ADIS kestävä. Siten meidän havainnot yhdessä kannatettava rooli senescent fenotyyppi herättämiselle muutoksia, jotka edistävät syntymistä androgeenin tulenkestävä syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki tutkimus ihmiseen kohdistuvan on hyväksynyt Miamin yliopiston Institutional Review Board. IRB hyväksytty luopumista suostumuksen tämän protokollan.

Cell Culture

LNCaP ja LAPC4 soluja (ATCC) viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa (Gibco, Invitrogen) täydennettynä 5% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco, Invitrogen) tai 5% hiilellä erotettua nautasikiön seerumia (CSS, Gibco, Invitrogen) ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä /streptomysiiniä (Gibco, Invitrogen) 37 ° C: ssa 21% happea /5% CO

2. Varten lepotilassa viljelmät, soluja viljeltiin, kuten edellä, mutta ilman mitään seerumia.

Switchback (SB) Menetelmä tuottaa androgeenin tulenkestävät ADIS kestävä LNCaP Muuttujat

LNCaP-soluja ympättiin joko 10 cm astiat (3 x 10

5 solut) tai 15 cm astiat (1 x 10

6 solua) RPMI 5% FBS 36-48 tuntia ennen siirtynyt RPMI 5% CSS. Väliaine vaihdettiin joka 3-4 päivä ja 14 päivää, aiheuttaa ADIS, jälkeen, jotka viljelmät palautettiin RPMI 5% FBS-alustaan. Kun kasvain näkyvän solun pesäkkeitä, solut trypsinoitiin ja laajennettiin yhden tai kaksi kohtaa ennen menettely toistettiin.

Creation ja Stable transduktio shRNA ja fluoresoivan proteiinin ilmentävä Constructs

retroviruksen pWZL -blast GFP konstrukti oli lahja Dr. Robert Weinberg laboratoriossa. ShRNA vektorit muodostettiin kuten aiemmin on kuvattu [28], [29]. Validoitu tai erittäin sai ehdokkaan sekvenssit TRC Broad Consortium shRNA kirjasto (https://www.broadinstitute.org/genome_bio/trc/publicSearchForHairpinsForm.php) valittiin ja subkloonattiin lentiviruksen pLKO.1 vektorin puromysiiniresistenssin kasetti. Oligonukleotidit hankittiin Integrated DNA Technologies, Inc. konstrukteja sekvensoitiin sen varmistamiseksi, insertin läsnäolon suhteen. Ohjaus shRNA on kohdistettu GFP: 5′-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCA-3 ’. Seuraavat kohdesekvenssejä käytettiin:

shp53: 5’GACTCCAGTGGTAATCTACTT 3 ’,

shp16: 5’GCATGGAGCCTTCGGCTGACT 3′

Shar rakentaa [30] oli lahja Dr. Kerry Burnstein yliopiston Miami ja on kohdistettu seuraavan sekvenssin: 5 ’GAAAGCACTGCTACTCTTCAGCATTATTC 3’.

Lentivirusvektorikonstruktit tai retroviruksen tuotannon suoritettiin HEK 293T-soluissa ja infektio kohdesolujen suoritettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [29]. Transdusoidut solut valittiin 2 ug /ml puromysiiniä sisältävää tai 10 ug /ml blastocidin sisältävää median (SB5 GFP solut) vähimmäisajan 5-7 päivää (vastaa aikaa kuluu trandusoidun solut kuolevat kokonaan valinta media). Sillä shRNAs, proteiini knockdown varmistettiin kautta Western blotting. GFP: n ilmentymisen on SB5 soluissa varmistettiin epifluorescent kuvantaminen ja virtaussytometrinen analyysi.

Western-blottaus ja vasta-aineet Käytetyt

Solut kerättiin mekaanisesti kaapimalla jäällä ja hajotettiin natriumfluoridia (NAF ), joka sisälsi natriumvanadaattia, PMSF, DTT ja proteinaasinestäjä. Proteiinikonsentraatiot mitattiin käyttäen Bradford-reagenssia (Bio-Rad). 30-50 ug kokonaisproteiinia ajettiin 4-12% Bis-Tris pre-cast NuPage geeli (Invitrogen) on Novex betonielementtien geeli-järjestelmän ja sen jälkeen siirretään osan PVDF-membraanille (Immobilon, EMD Millipore) 30 V 4 ° C: ssa. Blotit värjättiin Ponceau reagenssiin määrittämään edes lastaus ja siirto, pestiin 0,1% TBST ja sitten koetettiin vasta-aineita seuraavia proteiineja: AR (sc-816, Santa Cruz Biotech), p53 (sc-126, Santa Cruz Biotech), p21 (sc-817, Santa Cruz Biotech) p16

INK4 (554079, BD Biosciences), sykliini A (sc-751, Santa Cruz Biotech), GAPDH (AB9485, Abcam) Bcl-2 (sc-492, Santa Cruz Biotech), Bax (sc-493, Santa Cruz Biotech) Mcl-1 (sc-819, Santa Cruz Biotech), Bak (06-536, Millipore), fosfo-Akt (4060, Cell Signaling) yhteensä Akt (9272, Cell Signaling) lohkaistaan-PARP (9541, Cell Signaling) surviviiniperäiset (71G4B7, Cell Signaling), TAp63 (618902, BioLegend), p27 (sc-528, Santa Cruz Biotech), deltaNp63 (619002, BioLegend). Kun oli inkuboitu sopivan sekundaarisen piparjuuriperoksidaasi-konjugoiduilla vasta-aineilla (Amersham), blotit kehitettiin käyttämällä ECL Plus (GE Healthcare) kehittää ratkaisu. Sen jälkeen immunoblottauksella, kalvot värjättiin Coomassie sinistä väriainetta (Sigma) normalisoimaan kokonaisproteiinin lastaus.

Cell Cycle Analysis

Noin 1 x 10

6 solut kerättiin kautta trypsinaatiolla. Solut pestiin kerran kylmällä seerumia sisältävässä väliaineessa, kahdesti kylmällä PBS: llä ja suspendoitiin sitten uudelleen 200 ul: aan PBS: ää + 2 mM EDTA. Noin 600 ui kylmää 70% etanolia, lisättiin tipoittain soluihin samalla vorteksoiden niitä keskinopeudella. Soluja pidettiin 4 ° C: ssa yön kiinnittämiseen. Ennen analyysiä soluja sentrifugoitiin 4 ° C: ssa 1000 rpm: llä 5 minuutin ajan ja etanoli huolellisesti pois. Saatu solujen pelletit suspensoitiin uudelleen 0,5 ml: aan PBS: ää + 2 mM EDTA: ta ja 10 ui lämmöllä inaktivoitua RNaasi A: ta (10 mg /ml, Sigma). Sen jälkeen 25 ui propidiumjodidia (PI) (1 mg /ml, Sigma) lisättiin solususpensioon. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa vesihauteessa 30 minuutin ajan ja määritettiin välittömästi koskevasta Accuri C6 virtaussytometrillä (BD) käyttäen PI magnetointi laser (FL2). Solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa solusyklin määritettiin CFlow Plus sytometrin ohjelmisto, CFlow analyysi 202,1, mittaamalla pinta-ala kyseisellä segmentillä profiilin (kuten on esitetty). Profiilit relabeled MS Excel selvyyden vuoksi.

Cell Proliferation Mittaukset

määrittämiseksi solujen lisääntymisen hinnat LNCaP sekä FBS ja CSS sisältävillä alustoilla, 1 x 10

5 ympättiin 6 cm levyille ja solumäärät, hemosytometrillä, suoritettiin 24 tunnin välein, kolmena kappaleena yli kuuden päivän ajan hemosytometrillä. Lisättiin tuoretta elatusainetta, joka 2-3 päivä. Pelastus kokeita kuvassa. 1D, solut ympättiin FBS-alustaan ​​24 tuntia ennen siirtymistä CSS mediaa. Solut kytketään takaisin FBS medialle ilmoitettuina ajankohtina.

(A) Vanheneminen liittyy beeta-galaktosidaasi (SA-beta-gal) värjäys alla esitettyjen tilojen ja ajankohtina. FBS, naudan sikiön seerumia osoittaa androgen-täynnä kulttuuri; CSS, hiilellä erotettua seerumia osoittaa androgeeni- riistää kulttuuria. 9D FBS jälkeinen SEN merkitsevät LNCaP-solut, jotka tehtiin 14 päivän CSS kulttuurin ja kytketään FBS 9 päivää. Kvantitointi positiivisesti värjättyä solua esitetään oikealla puolella edustavat kuvat. (B) Ki67 yleiseurooppalaisen leviämisen merkki värjäys näkyy ilmoitetuilla olosuhteissa ja ajankohtina. DAPI värjäys käytetään merkitsemään solutumien varten laskenta Ki67-positiivisia soluja. Prosenttiosuus värjätään solut piirretään oikealla. (C) propidiumjodidianalyysi solusyklin analyysi, merkityillä ajankohtina ja viljelyolosuhteet. Huomaa S–faasifraktiolla putoaa 15,6% FBS 0,4%: iin 10d CSS ja 0,8%, kun uudelleenkäynnistäminen FBS 9 päivää (9D FBS jälkeinen SEN). (D) leviämisen käyrä LNCaP viljeltiin CSS 3, 8 tai 14 päivää ennen kytkemisen takaisin FBS media. (E) mittaus koko ROS tasoilla kautta virtaussytometrialla LNCaP-soluissa 1. päivänä, päivä 4 ja päivä 7 näyttämän viljelyolosuhteissa. Huomaa oikea-siirtynyt huippu punaisella vastaa yhä ROS tasoilla CSS-viljellyt LNCaP suhteessa FBS-soluviljelmässä. (F) DNA double-lohkon murtuma (DSB) pesäkkeitä havaittiin kautta H2AX /53BP1 co-värjäys (vihreä = H2AX, punainen = 53BP1) ja LNCaP viljelty ilmoitettu olosuhteissa. Kuvat ovat soluille kanssa eri määrä laskettiin pesäkkeitä näkyvät. Huomaa, että prosentuaalinen solujen 5+ pesäkkeitä kasvaa kestoa CSS kulttuurin.

Cell Co-kulttuuri Kokeet ja analyysi

Yhdessä viljelemisen kokeita, 1 x 10

5 LNCaP-SB5-GFP solut (syntyvät SB0 LNCaP vakaasti transdusoitu pWZL-räjähdys GFP) maljattiin neljänä kappaleena 10 cm: n maljalla, joko yksin tai yhdessä sekoitettuna 1 x 10

5 merkitsemätön LNCaP SB0, SB5 tai LNAI soluja. Solut perin levytettiin 5% FBS täydellinen media (päivä 0) ja päivänä 1, co-viljelmät siirtyi 5% CSS median ja ylläpidettiin 7 päivää, CSS median muutos joka kolmas päivä. Edustavia viljelmät analysoitiin kahtena kappaleena virtaussytometria koskevasta Accuri C6 taussytometrin 1. päivänä varmistamaan suhteellisen vastaava määrä vihreitä ja ei-vihreitä soluja elossa viljelmässä. Käyttämällä SB5-GFP solut päällystetty yksin, ruiskutus suoritettiin ja FITC kanavalla erottamaan GFP solut ei-GFP-soluissa. Solut edelleen aidatulla jättää matala FSC /SSC hiukkasia varmistaa ainoastaan ​​elävien solujen populaatiot olivat analysoitiin. Päivänä 7, Virtaussytometriaa käytettiin määrittämään suhteellinen osuus GFP-positiivisten vs. leimaamatonta solupopulaatioiden sekä kokonaismäärä GFP-positiivisia (SB5) soluja. Histogrammit ja pistekuvioita piirrettiin käyttämällä BD Accuri C6 Analyysi Mac OSX. Kaikki mittaukset suoritettiin kahtena kappaleena vähintään kahden itsenäisen kokeen.

Vanheneminen liittyvän beeta-galaktosidaasin Activity (SA-beta-gal) B

SA-beta-gal-värjäys suoritettiin kuten muualla on kuvattu [31]. Lyhyesti, solut pestiin PBS: ssä, kiinnitettiin 0,2% glutaraldehydillä 5 minuuttia huoneen lämpötilassa, pestiin kerran PBS: ssä ja inkuboitiin yön yli vasta valmistetun värjäyksen (1 mg /ml 5-bromi-4-kloori-3-indolyyli- β-galaktosidi (Sigma), 150 mM NaCl, 2 mM MgCI

2, 5 mM K

3Fe (CN)

6, 5 mM K

4Fe (CN)

6, 40 mM NaPi, pH 6,0). Seuraavana päivänä soluja inkuboitiin vielä tunnin ajan 37 ° C: ssa tehostamaan värjäystä ja sen jälkeen pestään ja varastoidaan PBS: ssä 4 ° C: ssa. Määrällisesti positiivista värjäytymistä, 100 solua laskettiin kullekin näytteelle useilla näkökenttien saamiseksi keskihajonta. Kokeita tehtiin ainakin kahtena, kahdessa itsenäisessä kokeessa.

Ki67 Värjäys

havaitsemiseksi Ki67 värjäystä, solut maljattiin 2 x 10

4 solua kammio ja vasen 36-48 tuntia ennen joko siirtymistä CSS, bikalutamidia hoitoa tai tallennuksen FBS vain näytteitä. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydiä (16% hyllyssä, Elektronimikroskopia sciences) 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen läpäiseväksi 0,1% PBST (10 min huoneenlämpötilassa), ja blokattiin 1 tunnin ajan 0,1% Triton X, 15% FBS , PBS huoneenlämpötilassa. Ki67-vasta-ainetta (Santa Cruz) laimennettiin 1:50 blokkauspuskuriin ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Solut pestiin 5x, 10 minuuttia kerrallaan RT estoliuoksessa ravistelijassa. Sopiva fluorofori-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (vuohen anti-hiiri-FITC: llä, Santa Cruz) lisättiin joka 1:100 laimennus estopuskurissa ja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Solut pestiin 5x 0,1 Triton, 10 minuuttia kerrallaan ravistelijassa huoneenlämpötilassa pimeässä. DAPI kiinnitysväliaineet (Vectashield) lisättiin ennen asennusta peitelasi. Immuunifluoresenssivasta kuvat hankittiin Nikon kamera kiinnitettynä pystyyn Zeiss mikroskoopilla.

H2AX /53BP1 Värjäys

H2AX /53BP1 värjäys suoritettiin kuten muualla on kuvattu [28]. Lyhyesti, 20000 solua siirrostettiin kammio (BD Falcon, 4-kammio kulttuuri dioja) RPMI 5% FBS ja siirtynyt RPMI 5% CSS 24 tuntia myöhemmin. H2AX /53BP1 värjäys suoritettiin osoitetuissa aikapisteissä. Solut valokuvattiin identtisissä tiedonhankintaolosuhteita Leica DMI 6000 B käänteisen digitaalinen mikroskooppi, johon on kiinnitetty DFC350 FX kamera ja FW4000 fluoresenssilla ohjelmisto. Vain yhdessä lokalisoitu H2AX /53BP1 pesäkkeitä laskettiin positiivisiksi ja vähintään 100 solua mitattiin yli useita kenttiä.

Drug Treatment of LNCaP

LNCaP-soluja viljeltiin soveltuvissa väliaineissa (5 % FBS tai CSS), joka sisältää doketakseli (1 nM), flavopiridolin (0,5 uM), tai bortetsomibilla (1 uM) 72 tunnin ajan, ja kelluva ja trypsinisoitiin kiinnittyneet solut yhdistettiin ja analysoitiin Trypan blue -värjäyksellä. LNCaP-SB0 ja LNCaP-SB5 soluja viljeltiin (RPMI + 5% FBS: ää), joka sisälsi doketakseli (1 nM) 72 tunnin ajan ja analysoitiin Trypan blue -värjäyksellä. Vähintään 3 itsenäistä koetta tehtiin kahtena kappaleena ja tilastollisia eroja lääkkeellä käsiteltyihin soluihin määritettiin kaksisuuntaisella Studentin

t

-testi kanssa p 0,05 pidettiin merkittävinä.

käänteistranskriptaasipolymeraasiketjureaktioanalyysillä PCR

Kokonais-RNA eristettiin LNCaP-soluja viljeltiin FBS: ää ja CSS median 14 päivää, käyttäen RNAqueous-4PCR Kit (Ambion). Yhteensä 1 ug puhdistettua RNA käänteistranskriptoituneet käytettäessä satunnaista aluketta, pakkauksessa mukana, jotta saadaan cDNA kautta High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). CDNA: ta käytettiin templaattina PCR-monistus käyttäen AmpliTaq Gold® 360 Master Mix (Applied Biosystems) ja alukkeet olivat seuraavat.

GAPDH forward-aluke:

5 ’GACCCCTTCATTGACCTCAAC 3’

GAPDH käänteisaluke-:

5 ’CTTCTCCATGGTGGTGAAGA 3’

IL8 eteenpäin aluke:

5 ’TTTTGCCAAGGAGTGCTAAAGA 3’

IL8 käänteisaluke-

5 ’AACCCTCTGCACCCAGTTTTC 3’

reaktiotuotteet ajettiin 1,5% agaroosigeelillä etidiumbromidilla. GAPDH käytettiin sisäisenä normalisointia valvonnan.

Measurement of Cell Death

Käsitellyt ja valvonta-solut kerättiin, suspendoitiin uudelleen PBS: ään, ja laimennettiin 1:01 0,4% Trypan blue (Invitrogen). Dead (sininen) ja elävät ei-värjättyjen solujen heti laskettiin käyttäen hemasytometriä. Prosenttiosuus kuolleiden solujen määritettiin vähintään kolmen itsenäisen kokeen kahtena kappaleena.

Measurement of Cellular ROS tasot

määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [28]. Lyhyesti, ilmoitettu soluihin yhtä konfluenssin kerättiin trypsination, pestiin jääkylmällä 1X Hankin puskuroidussa suolaliuoksessa (HBSS) ja inkuboitiin juuri valmistettua 5- (ja-6) -chloromethyl-2 ’, 7’-dikloorifluoresiinidiasetaattia ( CM-DCF-DA; Molecular Probes /Invitrogen, C6827) 20 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Sitten solut pestiin ja suspendoitiin uudelleen 1 x HBSS ennen havaitsemista FITC signaalin fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS). Virtaussytometria-analyysi suoritettiin koskevasta Accuri C6-sytometrillä (BD Biosciences). X-akseli edustaa FITC-kanavan (FL1) fluoresenssin intensiteetin log-asteikolla, ja y-akseli edustaa solujen lukumäärä. Kokeita tehtiin ainakin kahtena, jossa edustaja profiilit on esitetty.

Crystal Violet Värjäys

Noin 3 x 10

5-solut ympättiin 10 cm ruokia sisältävä RPMI plus 5% FBS 36-48 tuntia ennen siirtymistä RPMI plus 5% CSS. Media oli päivittyy joka 3-4 päivää. Crystal violet värjäys, imettiin pois ja solut pestiin kerran 1 x PBS, 1% kristalliviolettia lisättiin kuhunkin maljaan ja annettiin värjäytyä 2 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Tahra poistettiin ja jokainen astia huuhdeltiin kahdesti deionisoidulla vedellä. Astiat Sitten veden alla 20-30 minuuttia huuhtoutua ylimääräinen tahra ja vähentää taustan, ja jättää kuivua yön yli ennen laskemista pesäkkeiden tai ottaa kuvia. Kokeita tehtiin kahtena.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen merkitys tulosten määritettiin laskemalla keskihajonta keskiarvosta ja kahden tailed Studentin t-testiä, jossa p 0,05 harkita merkittävä.

tulokset ja johtopäätökset

Ominaisuudet ADIS LNCaP ja LAPC4 Cells

sen vahvistamiseksi, onko havaittu proliferatiivisia pidätys upon AD johtuu induktion solujen vanhenemista , käytimme hyvin tunnettu androgen-herkkien LNCaP koska sillä on toiminnallinen versioita sekä suurten vanhenemista-välittävä reittejä, p53 ja p16

INK4a [32], [33]. Lisäksi yhtenevä kliininen malleja eturauhassyövän, LNCaP osoittavat spontaanisti outgrowths androgeenista tulenkestävien variantteja pitkäaikaisen kulttuurin androgeeni-tyhjennetty kasvualusta [20], [34]. Niinpä me viljellä LNCaP CSS sisältävässä väliaineessa (jäljempänä CSS kulttuuri) jäljittelemään AD ja arvioi syntyminen solujen vanhenemista markkereita.

Olemme havainneet, että sen lisäksi, että odotettu proliferatiivinen pidätys (Fig. S1A ) ja hankinta neuroendokriini morfologia [35] (Fig. 1A), CSS-viljellyt LNCaP kehittänyt myös muita erillisiä merkkiaineiden solujen vanhenemista (Fig. 1) [36]. Näihin sisältyvät lisääntynyt vanhenemista liittyvän beeta-galaktosidaasi (SA-beta-gal) aktiivisuus (Fig. 1A), väheni värjäytymistä yleiseurooppalaisen leviämisen merkki, Ki67 (Fig. 1 B) ja G1 /S solusyklin pysähtymiseen (Fig. 1 C ). Kun 7 päivää CSS kulttuuri, 50% soluista näytteillä nämä ominaisuudet ja 10 päivää CSS, että osa nousi 80% suurin väestöstä (Fig. 1A-B). Hoito antiandrogeeninen, bikalutamidin, myös indusoitu lopettamista ja ulkonäkö senescent fenotyypin määritettynä SA-beeta-gal värjäys ja G1 /S pidätys (Fig. S1). Sitä vastoin minimaalinen solukuolemaa havaittiin, kun CSS tai bikalutamidin hoitoon arvioituna visuaalisella puute pyöristetty, irrallinen solut ja pilkotaan PARP lauseke (tuloksia ei ole esitetty). Merkittävästi, kun solut palautettiin androgeenista täynnä naudan sikiön seerumia (FBS) tiedotusvälineet seuraavat 14 päivän CSS kulttuurin, suurin väestö säilytti senescent markkereita (näkyy tapauksessa palauttamista täynnä FBS kulttuuriin 9 päivää, merkitään 9D FBS post -SEN), mikä osoittaa, että leviämisen pidätys on pysyvä mieluummin kuin ohimeneviä (Fig. 1A-C).

edelleen erottaa CSS kulttuuri-indusoitua proliferaatiota pidätys väliaikaisesta ilmiö solun quiescence, me viljellä LNCaP-solujen seerumittomassa alustassa, tiedetään indusoivan liikkumattomuus [37], 7 päivää rinnakkain soluilla CSS media. Sen jälkeen siirryimme molempien solujen takaisin FBS-alustaan ​​4 päivää. Kun taas LNCaP altistetaan seerumittomalla kulttuuri uudelleen leviämisen kun palauttaminen täyteen median, mikä vastaa kasvua leviämisen merkki, sykliini A, CSS-viljellyt solut eivät tehneet niin (Kuva. S2). Koska LNCaP läpi enää populaation kaksinkertaistumista kerran asetettu androgeenista riistää kulttuuri (Fig. S1A), mutta kestää jopa 4 päivää osoittaa merkittävää hankintaa vanhenemisen markkereita (Fig. 1A, B), halusimme onko tämä leviämisen pidätys oli palautuva ennen 4päivää androgen ehtyminen. Tätä varten LNCaP-solut kytketään takaisin androgeenista täynnä mediaa 3, 8 tai 14 päivän kuluttua CSS kulttuuri (Fig. 1 D). Huomasimme, että solujen kytketään takaisin FBS median päivänä 3 oli helposti voi jatkaa leviämistä. Vertailun vuoksi soluja siirtyi täynnä mediaa päivänä 8 ei uudelleen täyden leviämisen mutta joissakin näistä soluista saivat jatkaa jakamalla, mikä viittaa osittaiseen peruuttamattomasti pidätettiin solupopulaation. Yhdenmukainen tuloksemme kuvassa. 1A-B, ei proliferaatiota havaittiin, kun solut kytketään takaisin täyteen median jälkeen 14 päivää CSS kulttuuri (Fig. 1 D). Siten yhdessä tuloksemme varmista, että AD indusoi tärkeimmät toiminnot solun vanhenemisen LNCaP-soluissa.

ADIS fenotyyppi vietämme LNCaP-soluissa edelsi vähitellen enemmän solun kokonais ROS tasoilla, havaittiin jo yksi päivä vaihtamisen jälkeen solut CSS media (Fig. 1 E), sekä ulkonäkö asteittain suurempi määrä yhteistyössä paikallisen gamma-H2AX ja 53BP1 pesäkkeet (Fig. 1 F). Nämä pesäkkeet ovat osoitus kiinnitettävä DNA-vaurioita vastaus (DDR), oletettavasti vastauksena pysyviä korjaamattomat DNA-vaurioita [28], [38]. ADIS liittyvä korkeus ROS tasoilla ja DNA-vaurioita pesäkkeet ovat sopusoinnussa tunnettujen etiologiaa solun vanhenemisen [36], joissa lujitetaan että AD luo ylävirtaan jännityksiä tiedetään aiheuttavan solujen vanhenemista.

ADIS välittyy p16

INK4a Pathway ja Associated kanssa Suppression p53 Pathway

Kaksi suurta kasvaimia estävä reittejä, p53 /p21

CIP1 /Waf1 ja p16

INK4a, tyypillisesti välittäjänä vanhenemista [39], [ ,,,0],40]. Riippuen solutyypin tai stressitekijälle, The senescent fenotyyppi liittyy aktivaatio yhden tai molempien näiden reittien [39], [41]. Kuitenkin vaikka molemmat polut aktivoituvat, yksi voi vallita valvoa senescent fenotyyppi [28], [40]. Niinpä me analysoitiin LNCaP lisäämään kestot CSS kulttuurin tutkimalla proteiinin kokonaismäärän lysaatit näistä näytteistä tasoja vanhenemista-välittävien proteiinien p16

INK4a ja p53 /p21

CIP1 /Waf1. Kuten odotettua, AR ilme, laskivat kesto CSS kulttuuri (Fig. 2A). Vaikka

a priori

olemassaolo sitkeä DDR (Fig. 1 F) johti meidät odottaa, että p53 /p21-reitin olisi mukana, huomasimme sen sijaan että ADIS liittyi yhä ilmentymistä p16

INK4a (Fig. 2A). Yllättäen tasot p53 ja sen efektorisolutyyppi kierto-säätelyproteiinia, p21

CIP1 /Waf1, pieneni pidentäminen CSS kulttuuri (Fig. 2A). Lisäksi lisättiin 10 nM dihydrotestosteronin (DHT) ja CSS median kykeni estämään sekä havaitut lasku AR ja sykliini A: tasoja ja ADIS liittyvät muutokset p16

INK4a ja p53 ilmaisun (Fig. S3A). Tämä havainto vahvistaa, nämä molekyyli muutoksia tapahtuu erityisesti, koska ei ole androgeenin elatusaineet.

(A) Immunoblottaus suoritettiin noin 35 ug osoitetun proteiinin näytteiden vasta-aineita merkitään proteiineja. Coomassie blue-värjäys käytettiin normalisoimaan kokonaisproteiinin loading. Huomaa, että AR ilmaisu vähenee odotetusti kun CSS kulttuuriin. Suuntaus p53, p21 ja p16-proteiinin ilmentyminen säilyy seuraavien palauttaminen androgeenin täynnä kulttuuri post-vanhenemista (post-SEN) osoittaa pysyvyydelle muutokset. (B) Immunoblottaus osoittaa vaikutusten shRNA-välitteisen knockdovvn p16 on ADIS. Huomautus koholla AR ja sykliini A: tasot shp16 soluja CSS kulttuuri vertailuryhmään nähden tai shp53 pudotus soluja. (C) vaikutus p16 tukahduttaminen on SA-beeta-gal värjäys. Ilmoitettu soluja viljeltiin CSS 14 päivää ja sitten kytketään FBS- sisältäviä aineita vielä 9 päivää. Huomaa havaittu lasku SA-beta-gal värjäyksellä shp16 soluissa. * P 0,05.

On merkittävää, p16

INK4a ekspressiotasot pysyi korkeana ja p53 /p21 pysyivät alhaisina suurin väestö jälkeenkin androgeenista täynnä kulttuuri kunnostettiin (Fig. 2A). Tämä havainto tukee pysyvyydestä vanhenemista liittyvän molekyylitason piiri aktivoidaan androgeenista riistää kulttuuri huolimatta osittaisesta paranemisesta AR ekspressiotasoja (Fig. 2A). Kohonnut p16

INK4a tasoilla yhdessä koholla SA-beeta-gal värjäys, vähensi lisääntymistä ja laski AR ja sykliini ilmaisun havaittiin myös seuraavat CSS kulttuuri androgeenisäädellyn reagoiva mutta p53-mutantti [32] LAPC4 solulinjassa (kuvio. S4A-D). 5A.