Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Valaistaan ​​roolin biologisten ja kliinistä vaikutusta poikkeava promoottori hypermetylaation (PH) in munasarjasyöpä (OC).

Experimental Suunnittelu

PH

PGP9.5

,

HIC1

,

AIM1

,

APC

,

PAK3

,

MGMT

,

KIF1A

,

CCNA1

,

ESR1

,

SSBP2, GSTP1, FKBP4

ja

VGF

olivat kvantitatiivisen metylaatiospesifisen PCR (QMSP) on koulutus asetettu. Valitsimme kaksi geeniä (

VGF

ja

PGP9.5

) edelleen QMSP analyysiä suuremmassa itsenäinen validointi (IV) asetetaan saatavilla kliinistä tietoa. Biologinen merkitystä

VGF

geeni arvioitiin myös.

Tulokset

PH taajuus

PGP9.5

ja

VGF

olivat 85 % (316/372) ja 43% (158/366) vastaavasti IV näytesarja taas ei PH havaittu kontrolleissa. Vuonna 372 OC tapauksissa käytettävissä seurata,

PGP9.5

ja

VGF

PH korreloivat paremmin elossaololuku [hazard ratio (HR) yleiseen eloonjäämiseen (OS) oli 0,59 (95% luottamusväli (CI) = 0,42-0,84, p = 0,004), ja 0,73 (95% CI = 0,55-0,97, p = 0,028), ja otsikon tautien erityisten eloonjäämisen (DSS) oli 0,57 (95% CI +0,39-+0,82, p = 0,003) ja 0,72 (95% CI 0,54-0,96, p = 0,027). Vuonna Monimuuttuja-analyysissä,

VGF

PH pysyi itsenäisenä ennustetekijä OS (HR 0,61, 95% luottamusväli 0,43-0,86, p 0,005) ja DSS (HR 0,58, 95% CI +0,41-+0,83, p 0,003 ). Lisäksi

PGP9.5

PH korreloi merkitsevästi alhaisempi laatu, alkuvaiheen kasvaimet, ja ilman jäljellä tautia. Pakko ilmentymisen

VGF

OC solulinjoissa esti solun kasvua.

Johtopäätökset

Tuloksemme osoittavat, että

VGF

ja

PGP9.5

PH ovat mahdollisia biomarkkereita munasarjasyövän. Uudistetut ikäluokat pitkittäin seurantaa tarvitaan tulevissa tutkimuksissa määrittelemään kliinistä vaikutusta

VGF

ja

PGP9.5

PH ennen kliiniseen käyttöön.

Citation: Brait M , Maldonado L, Noordhuis M, Begum S, Loyo M, Poeta ML, et ai. (2013) yhdistys Promoottori metylointi

VGF

ja

PGP9.5

kanssa munasarjasyöpä Progression. PLoS ONE 8 (9): e70878. doi: 10,1371 /journal.pone.0070878

Editor: Anthony W. I. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 18 tammikuu 2013; Hyväksytty: 24 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 27 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Brait et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Urakehitys palkinnon Dr. Hoque erikoistuneilta Program huippututkimuksen avustuksen P50 CA098252 (PI: TC Wu). Dr. Hoque ja Dr. Begum tukena on Young Clinical Scientist Award lentoemäntä Medical Research Institute. Dr. Marchionni tukevat National Institutes of Health-National Cancer Institute apurahan P30CA006973. M. G. Noordhuis on vastaanottaja avustuksia Alankomaiden Cancer Society ja Jo Kolk studiefonds. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tietojen kerääminen, analysointi, tulosten tulkinta, valmistelu käsikirjoitus, tai päätös jättää käsikirjoituksen julkaistavaksi.

Kilpailevat edut: Meillä on seuraavat edut. Alle välisen lisenssisopimuksen Oncomethylome Sciences, SA (nyt MDxHealth) ja Johns Hopkins University, D.S. on oikeus osuuteen royalty saamien yliopiston kun myynti diagnostisten tuotteiden kuvattu tässä artikkelissa. D.S. omistaa Oncomethylome Sciences, SA kalusto, (nyt MDxHealth), joka on asetettu tiettyjä rajoituksia University politiikkaa. DS on maksettu konsultti Oncomethylome Sciences, SA (nyt MDxHealth) ja on maksanut jäsen yhtiön tieteellinen neuvottelukunta. A. van der Zee oli maksettu konsultti MDxHealth (Aiemmin Oncomethylome Sciences SA). Tekijä MOH on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. On patenttihakemus, joka sisältää joitakin tietoja julkaistaan ​​täällä tässä artikkelissa: WO201 /099489, EP2401408A2 – munasarjasyöpä Methylome. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta meidän noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Munasarjasyöpä (OC) on toiseksi yleisin gynekologinen syöpä ja johtava kuolinsyy gynekologiset syövät maailmanlaajuisesti [1]. 22240 uutta tapausta arvioitiin vuonna 2013 Yhdysvalloissa, mikä 14030 kuolemia tämän syöpätyypin [2]. Mediaani-ikä potilailla, joiden OC on 60 vuotta, ja keskimääräinen käyttöikä riski kehittää OC naisilla on noin 1 70 [3]. Seitsemänkymmentä prosenttia potilaista OC on edennyt sairaus (vaihe III tai IV) ajankohtana diagnoosi, jossa on 5 vuoden pysyvyys 15- 20%, vaikka aggressiivinen hoito [4], verrattuna alkuvaiheessa potilailla, joilla on selviytymisen korko yli 90% [3]. OC on yleensä hoidettu platinapohjaisen kemoterapian ja usein toistuu johtuen hankittu platinaa vastarintaa. Alkuperäinen kliininen vaste platinapohjaiseen lääkkeet on määräävä tekijä tuloksia potilaissa OC. Potilaat, joilla on kasvaimia, jotka osoittavat in vitro äärimmäisen lääkeresistenssin platina todettiin olevan merkittävästi lisääntynyt riski etenemisen ja kuoleman, kun niitä käsitellään standardin platina-pohjaiset hoidot [5]. On siis suuri merkitys voidaan tunnistaa hyödyllinen ennakoivaa merkkiaineita osoittaa platina herkkyys. Nämä voivat sallia parempaa hoitoa valinta 1

st linja hoidon, mahdollisesti mahdollistaa paremman lopputuloksen platinan resistenttien potilaiden. Määrittäminen sopivia markkereita ennakoida vaste standardin kemoterapeuttisten tai uudempi biologisia mahdollistaa paremman valvonnan ja paranna hinnat OC, sekä valikoima adjuvanttihoito tai tunnistamaan potilaiden asianmukaisia ​​erityisiä kliinisiä kokeita. Lisäksi kyky ennustaa OC tuloksia sen jälkeen, kun kirurginen resektio on kriittinen kliinikot, koska se vaikuttaa käytön adjuvanttihoitoa ja sädehoitoa. Riippumaton prognostinen indikaattori OC elinkelpoisuus on tämän vuoksi korvaamaton lääkäreille ja potilaille valinnassa hoitovaihtoehtoja.

On tunnettua, että geneettinen (muutokset DNA-sekvenssi, kuten poistoja, monistukset ja mutaatiot) ja epigeneettiset muutokset (määritelty periytyviä muutoksia geenien ilmentyminen, joka tapahtuu ilman muutoksia DNA-sekvenssi) edistää ja etenemistä kasvainsolujen [6]. Yleisimmät epigeneettisellä tapahtumia ovat DNA: n metylaation ja histoni asetylaatio [7], että DNA: n metylaatio ehkä laajimmin tutkittu piirre epigenetiikka osalta karsinogeneesin, ja keskeinen painopiste farmakologisen interventioiden kliinisissä tutkimuksissa. Se viittaa lisäämällä metyyliryhmä 5-hiilen asemaan sytosiini renkaan muodostaen 5-metyylisytosiinin (5mC), mutta vain sytosiinit että edeltävät guanosiini DNA-sekvenssi, joka tunnetaan CpG [8]. On CpG-rikkaita alueita kutsutaan CpG-saarekkeita, jotka yleensä ulottuvat 5′-alueen (promoottori, transloimattoman alueen ja eksonin 1) monien geenien kasvaimia estävä aktiivisuus ja ne ovat yleensä metyloitumaton normaaleissa soluissa [9]. Ihmisen genomin Tässä normaaleissa soluissa ei metyloidut tasaisesti, joka sisältää metyloimattomia segmentit lomassa denaturoidulla alueiden [10], kun taas syöpäsolut metylaation ovat muuttuneet, joille globaali DNA hypometylaatio [11], sekä hypermetylaatiota tiettyjen CpG-saarekkeiden [8] . Poikkeava CpG-saarekkeen hypermetylaation (erityisesti tuumorisuppressorigeeneille ”promoottori) sekä histonimodifikaation johtaa transkriptio- inaktivaatioon ja geenien, joka on yleinen ilmiö ihmisen syöpäsoluja ja todennäköisesti yksi varhaisimmista tapahtumista karsinogeneesissä [7]. Erityisesti promoottori hypermetylaation (PH) on usein mekanismi inaktivoimiseksi tuumorisuppressorigeeneille (APT) [7], [8], ja PH tiettyjen syöpään liittyvät geenit havaittiin liittyvän terapeuttisen vasteen ja lopputulos taudin [12 ], [13].

Tässä tutkimuksessa kartoitettiin PH 13 geenien

(PGP9.5

,

HIC1

,

AIM1

,

APC

,

PAK3

,

MGMT

,

KIF1A

,

CCNA1

,

ESR1

,

SSBP2, GSTP1

,

VGF, FKBP4)

kvantitatiivisen fluorogeenisen reaaliaikaisen metylaatiospesifisen PCR (QMSP) on koulutus joukko ja testattiin lopuksi kaksi geeniä (

VGF

ja

PGP9.5

) itsenäisessä validointi asetettu arvioimaan onko yhdistys PH näiden kahden geenin kanssa tahansa kliiniset tekijät kuten lopputuloksesta potilaalle. Lisäksi olemme tutkineet toiminnallista roolia VGF kuin antituumorigeenistä molekyyli OC solulinjat.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimus kohortti

Training Set.

jotta säveltää ensimmäiset näytteet saimme näytettä munasarjojen kasvainkudoksen meidän kudoksesta arkistosta, kerättiin 33 potilasta, joilla epiteelin OC jolle tehtiin terapeuttinen leikkaus The Johns Hopkins University School of Medicine. Olemme myös saaneet näytteitä 24 potilaalla on OC, joille tehtiin leikkaus University Campus Bio-Medico, Rooma. Sisällytettävä kohortin Tukikelpoinen potilaalla piti olla diagnosoitu OC ja riittävä määrä arkistoidaan kasvaimen materiaalia DNA: n eristämiseksi. Näytteet säilytetään parafiini, ja joukko diat (10 mikronia paksuus) otettiin kustakin lohkosta. Väestörakenteen ja kliiniset tiedot on saatu atk kasvain rekisterin The Johns Hopkins Healthcare System tai rekisteristä osastolla Naistenklinikka, University Campus Bio-Medico Rooma, Italia. Kasvaimet olivat luokiteltu FIGO lavastus järjestelmää [14]. Vuodesta Johns Hopkins potilasta (33), 16 potilaista oli alkuvaiheessa tauti (15 vaiheen I ja 1 vaihe II) ja 17, joilla on edennyt sairaus (14 vaiheen III ja 3 vaihe IV). Kaikki näytteet olivat munasarjan epiteelin karsinoomien kanssa vakavien-papillaarinen histologia. Vuodesta 24 potilasta Italiasta, 10 oli varhaisessa vaiheessa sairaus (6 vaiheen I, ja 4 vaiheen II), 13 sairaus oli edennyt pitkälle (12 vaiheen III, ja 1 vaihe IV) ja 1 oli tuntematon vaihe. Kahdeksantoista Potilailla esiintyi epiteelin munasarjojen karsinoomat (vakavien, endomet-, mucinous, suomuinen, erilaistumaton), yksi itusolutuumoritapauksia, neljä esittelyyn toissijainen (metastaattinen) kasvaimia, ja 1 potilas oli tuntematon histologia. Normaali munasarjan epiteelin kudosta saatiin 13 potilasta, joille tehtiin profylaktinen leikkaus tahansa hyvänlaatuinen kunnossa sairaalassa San Jose Tec de Monterrey Meksikossa. Yksityiskohtainen yhteenveto koulutus joukko potilaita on saatavilla taulukossa 1 (A).

Independent Validation (IV) Aseta.

Analysoimme riippumaton validointi asetettu lupaavimmista geenejä. Tämä riippumaton joukko koostui 372 munasarjakasvainten, 17 rajatapaus kasvaimia ja 18 munasarjojen cystadenomas (kaikki säilynyt Tuorenäytteissä). Nämä potilaista leikattiin yliopiston Medical Center Groningen, Groningen (UMCG), Alankomaat. Väestörakenteen ja kliiniset tiedot on saatu rekisteristä laitoksella Gynecologic Oncology, UMCG, Alankomaat. Yksityiskohtainen yhteenveto demografisen ja kliinis parametrit näiden näytteiden esitetään taulukossa 1 (B).

hyväksyminen tutkimuksen koehenkilöillä saatiin Johns Hopkins University institutionaalisten tarkastuslautakunta. Tämä tutkimus päteviä mukaista poikkeusta Yhdysvaltain Department of Health and Human Services politiikkaa koehenkilöiden suojelemiseen [45 CFR 46,101 (b)]. IRB koskevia ohjeita noudatettiin kussakin mukana toimielinten. Kaikki ihmisen materiaalit Tutkimuksessa käytetty laitokselta Naistenklinikka, University Campus Bio-Medico Rooma, Italia, kerättiin ohjeiden mukaan Local eettisen komitean Campus Bio-Medico Rooman. Ohjeissa Local eettinen komitea, jotka ovat oletuksena yhteensopiva Italian Protection Data Authority, määrittelee, että näytteet kerätään takautuvasti patologian osaston (formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudos) ei tarvitse olla mitään hyväksyntää ja ovat vapautetaan kirjallista suostumus. Mukaan Italian Protection Data Authority sääntöjä (https://www.garanteprivacy.it/web/guest/home_en asiak web n 1.884.019), Italian toimielimet ovat oletuksena lupa käyttää näytteet ja vastaavat kliiniset tiedot mukana tutkimuksessa. Kaikki näytteet kerätään Hospital San Jose Tec de Monterrey, Monterrey, Meksiko kerättiin seuraavana eettisen lautakunnan sääntöjä. Suuntaviivojen mukaan Meksikon lain Health Research (Reglamento de la Ley General de Salud en materia de Investigación para la Salud, artikkeli 23

rd, 2

nd otsikko, 1

st luku: retrospektiivinen tutkimukset pidetään ei-riskin tutkimuksia ja siksi eivät vaadi kirjallinen lupa osanottajien tai eettisen lautakunnan hyväksynnän. näytteet Meksikosta olivat arkistoitu näytteistä (formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudosta) ja haettiin sairaaloiden patologia arkisto . Jotta potilaat saatu UMCG Hollannissa, potilaat antoivat tietoon perustuvan suostumuksen keräämiseen ja varastointiin kudosnäytteiden kudospankkia tulevalle tutkimukselle. Kaikki asiaankuuluvat potilaan tiedot haettiin ja siirrettiin anonyymi, suojattu salasanalla, tietokanta. potilaiden identiteetti suojattiin tutkimuksittain, ainutlaatuinen potilas tunnuksia ja niiden todellinen henkilöllisyys oli tiedossa ainoastaan ​​kahteen omistettu tietojen johtajat. mukaan Alankomaiden lainsäädännöllä, nämä varotoimenpiteet tarkoitti enää Institutional Review board hyväksyntä tarvittiin (http: //www.federa .org /). Kaikkien potilaiden tietoja de-tunnistettu tutkijat kaikki 4 toimielimissä.

Gene Selection

Tässä tutkimuksessa valitsimme yhteensä 13 geenien analysoimiseksi metylaatiostatuksen (käyttäen QMSP ) jonkin ehdokkaan geeni lähestymistapaa. Geenit valittiin perustuen niiden syövän erityisiä metylaation OC ja /tai mikä tahansa muu kiinteä syöpätyyppeihin. Geenit valitut olivat:

PGP9.5

,

HIC1

,

AIM1

,

APC

,

PAK3

,

MGMT

,

KIF1A

,

CCNA1

,

ESR1

,

SSBP2, GSTP1, VGF

ja

FKBP4

. Yksityiskohtainen tiivistelmä tietoa näistä geeneistä on saatavana taulukossa S1 File S1.

Perustuen korjauksilla edellä mainittujen geenien syövän (käsitellään tarkemmin pohdintaosassa), analysoimme kaikki nämä 13 geenejä koulutus joukko näytteitä ja valinnut kaksi geenit (

VGF

ja

PGP9.5

) lisäanalyysiä suuren hyvin selityksin riippumaton joukko näytteitä. Valintakriteerit geenien testattavien itsenäisissä validointi asettaa olivat: a) Metylointi taajuus Tuumorinäytteissä koulutuksessa set; b) Metylointi taajuus normaaleissa näytteissä; C) uutuus geenin OC; D) Tunnetut toiminnot on geenin kirjallisuudesta /PubMed haku.

DNA: n eristämiseksi

Kun Alustava potilaan de-tunnistus, kaikki alkuperäiset OC histologinen dioja tarkistettiin uudelleen vahvistaa diagnoosin vanhempi patologi. Edustava lohko noudettiin DNA: n eristämiseksi. Histologinen diat formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettujen kudosten otettiin. Objektilasit microdissected saamiseksi 70% kasvainsoluja. Mikropaloitelluista normaalin munasarjan epiteelin eristettiin munasarjakudoksen resektoitiin leikkauksen aikana, mikä vahvistaa sen jälkeen puuttuessa pahanlaatuisten ja /tai pre-pahanlaatuinen prosessi kudoksessa. DNA uutettiin käyttäen fenoli-kloroformi uutolla protokollan saostamalla sen jälkeen etanolilla, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Sillä UMCG näytteet, DNA eristettiin käyttäen standardi suola-kloroformiuutolla ja saostus isopropanolilla. Saostettu DNA suspendoitiin uudelleen Tris-EDTA-puskuriin (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). Perimän DNA monistettiin multiplex PCR mukaan BIOMED-2 protokollaa, tarkistaa DNA laatu [16].

Natriumbisulfiitti hoito

DNA uutetaan primaarikasvaimista ja normaalin munasarjan epiteelin oli altistettiin natriumbisulfiittia hoitoon, joka muuntaa metyloitumattomat sytosiinit urasiiliksi tähteitä, kuten aiemmin on kuvattu [17]. Tätä varten EpiTect bisulfiittimodifiointi Kit (Cat No. 59104, QIAGEN Inc., Valencia, CA) käytettiin kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sillä UMCG näytteitä vetysulfiittikäsittelyä suoritettiin EZ DNA metylaatio kit mukaan valmistajan protokollan (Tsymogeeni, BaseClear, Leiden, Alankomaat). Käsittelyn jälkeen DNA säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes ne käytettiin.

metylointi Analyysi

bisulfiittimodifiointi käsiteltyä DNA: ta käytettiin templaattina fluoresenssiin perustuvaa tosiaikaista PCR: ää, kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],17]. Monistusreaktiot suoritettiin kolmena kappaleena lopullisessa tilavuudessa 20 ui, joka sisälsi 3 ui bisulfiitti-muunnettua DNA: ta; 600 nM pitoisuuksia eteen- ja taaksepäin-alukkeita; 200 nM koetinta; 0,6 U platinaa Taq-polymeraasia (Invitrogen, Frederick, MD); 200 uM pitoisuuksina kutakin dATP, dCTP, dGTP ja dTTP; ja 6.7 mM MgCl

2. Alukkeiden ja koettimien suunniteltiin nimenomaan monistamaan promoottorit 13 kiinnostavia geenejä ja edistäjä viittaus geenin,

ACTB

; pohjamaali ja koetin sekvenssit ja hehkutuslämpötiloja esitetään taulukossa S2 File S1. Monistukset tehtiin käyttäen seuraavaa profiilia: 95 ° C 3 minuuttia, jota seurasi 50 sykliä 95 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja 60 ° C: ssa 1 minuutti. Monistusreaktiot suoritettiin 384-kuoppaisissa levyissä 7900HT sekvenssin ilmaisinta (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Beverly, MA) ja analysoitiin sekvenssin ilmaisinjärjestelmä (SDS 2,4; Applied Biosystems). Jokainen levy mukana potilaan DNA-näytteet, positiivinen (

in vitro

metyloituja leukosyytti- DNA) ja negatiivinen (normaali valkosolujen DNA: ta tai DNA: ta tunnetusta metyloitumaton solulinja) valvontaa, ja useita vettä aihioita. Leukosyyttien DNA: ta terveeltä yksilöltä metyloitiin

in vitro

ylimäärällä SSSI metyylitransferaasin (New England Biolabs Inc., Beverly, MA) tuottaa täysin metyloidut DNA, ja sarjalaimennoksia (90-,009 ng) tätä DNA oli käyttää rakentamaan kalibrointikäyrän kullekin levylle. Kaikki näytteet olivat sisällä määrityksen valikoimaa herkkyys ja toistettavuus perustuu monistamiseen sisäisessä standardin (kynnyssyklistä [CT] arvo

ACTB

40). Suhteellinen taso metyloitua DNA: ta kunkin geenin kussakin näytteessä määritettiin suhteessa metylaatiospesifisen PCR-monistetun geenin

ACTB

(viite-geeni), ja sitten kertomalla 1000 helpottaa taulukkomuodossa (keskiarvo kolmen rinnakkaisen ja geeni jaettuna [keskiarvo kolmen rinnakkaisen on

ACTB

] x 1000). Näytteet luokiteltiin metyloimattomia tai metyloituja, joka perustuu määrityksen herkkyyden.

VGF

, bisulfiitti sekvenssianalyysi suoritettiin myös vahvistaa metylaatiostatuksen solulinjoissa, jotka ovat peräisin munasarjasyöpä (IGROV, IGROV CP, A2780, A2780 CP 2008 ja 2008 C13) ja normaalista munasarjan pintaepiteelissä (OSE) solulinjat (OSE2A, OSE2B ja OSE7). Bisulfiitti käsitelty DNA: ta monistettiin 5′-alueen, joka sisältyy ainakin osa CpG-saarekkeen sisällä 1 kb ehdotetun transkription aloituskohdasta (TSS), harkitse samalla alueella kuin QMSP alukkeet ja koetin. Alukkeet suunniteltiin eivät sisällä CpG sivustoja, ja harkitsee bisulfiitti käsitelty järjestyksessä, jotta monistamaan alue riippumatta sen metylaatiostatuksen, jotta voimme tarkkailla sitä ilman reaktiota harhaa. Alukkeet sekvenssi olivat: Eteenpäin 5′-TTTGTTTTTGTTAGGGGGTTGTT-3 ’ja Reverse 5’AACACCAATAAAAACTAATACTA-3’. PCR-tuotteet puhdistettiin geelillä käyttämällä QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Jokainen monistettu DNA-näyte sekvensoitiin Applied Biosystems 3700 DNA Analyzer avulla eteen tai taakse alukkeita ja BD-terminaattorin väriaine (Applied Biosystems, Foster City, CA). Kolme riippumatonta reaktiot suoritettiin vahvistamaan havaittu data.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin IBM SPSS Statistics 19,0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Jokaista geeniä metylointi kynnys (cut-off) korkeimman arvon yläpuolella kontrolliryhmässä käytettiin saavuttaa 100%: n spesifisyys koulutuksessa asettaa ja samalla raja-arvoja haettu

VGF

ja

PGP9.5

itsenäisissä validointi asetettu, analyysi suoritettiin myös käyttämällä sulku on 75

persentiilin metylaation arvoja. Erot metylaatio suhteessa välillä normaalit ja syövät arvioitiin Fisherin testiä. Lisäksi hypermetylaation arvot kunkin geenin verrattiin myös syövän ja normaalin Mann-Whitneyn U-testiä. Korrelaatiot metylaatiotasoilla geenien arvioitiin kanssa Spearmanin korrelaatiokertoimet. Yhdistyksen välillä hypermetylaation ja kliinis-patologinen ominaisuudet arvioitiin logistinen regressio, chi-neliö ja Fisherin testejä tarvittaessa. Kokonaiselinaika (OS) määriteltiin diagnoosista kuolemaan tahansa syystä tai viime seurantakäynnin elossa. Tautikohtaiset eloonjäämisen (DSS) määriteltiin aikana diagnoosista kuolemaan seurauksena OC. Erot OS ja DSS mukaan kliinis ominaisuuksien ja metylaation geenien analysoitiin Coxin regressioanalyysiä. Kaikki merkittävät muuttujat, joiden

P arvo

0,05 vuonna yhden muuttujan analyysiin, jotka sisältyivät monimuuttujamenetelmin.

P arvo

s 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki

P-arvot

ovat kaksipuolisia.

5-atsa-2′-deoksisytidiinin solujen käsittely ja Käänteinen transkriptio-PCR ja reaaliaikainen käänteistranskriptio-PCR

Jaoimme (tiheys: 1 x 10

6) kuusi munasarjasyövän solulinjoissa (IGROV, IGROV CP, A2780, A2780 CP 2008 ja 2008 C13) rivit niiden viljelyalustassa ja ylläpitää niitä 24 tuntia ennen kohtelee heitä 5 uM 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC, Sigma) 5-7 päivää. Uudis- väliaineessa, joka sisälsi 5-atsa-dC 24 tunnin välein hoidon aikana. Olemme hoitaneet kontrollisolut (mock käsitelty) samalla tavalla, ilman että lisätään 5-atsa-dC. Meillä on myös käsitelty 5-atsa-dC yhdessä trikostatiini A (TSA, Sigma, St. Louis, MO), histoni deacecetylase estäjä, ja TSA yksin. Kantaliuoksia 5-atsa-dC liuotettiin fosfaattipuskuriin suolaliuoksella PBS (pH 7,5). Me valmistettiin kokonais-RNA käyttäen Qiazol (Qiagen Inc. Valencia, CA), valmistajan ohjeita noudattaen.

Käänteinen transkriptio-PCR (RT-PCR) B

cDNA syntetisoitiin käyttäen Superscript III (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA), jonka alkuperäinen määrä 1 ug RNA, sen jälkeen vakioyhteyskäytäntöä. RT-PCR suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [18]. Yksi mikrolitra kutakin cDNA: ta käytettiin reaaliaikaista RT-PCR: llä käyttämällä spesifisiä alukkeita ja TaqMan-koetin kiinnostavan geenin. Monistukset suoritettiin 384-kuoppaisissa levyissä 7900HT Sequence Detector System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Geenien ilmentymisen suhteen glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) laskettiin perustuen kynnyksen (Ct), kuten 2

-Δ (ACt), jossa ACk

t = C

t, geeneihin C

t, GAPDH ja Δ (ACk

t) = ACk

t, AZA-ACk

t, M (M, mock hoito; Aza, 5-atsa-dC hoito) [19] .

Colony tarkennuksen määritys

Vertasimme metylaatio profiilin ja ilmaus

VGF

3 normaalin munasarjan pintaepiteelissä (OSE) solulinjat (OSE2A, OSE2B ja OSE7) ja 3 paria isogeenisten OC solulinjojen (A2780 ja A2780CP, 2008 ja 2008C13 sekä IGROV ja IGROV CP) eri suhteen sisplatiinin herkkyyttä. Sitten suoritetaan tarkennus muodostumisen määritys VGF käyttäen kahta solulinjoja (2008 ja 2008C13), jotka olivat metyloitu ja jotka eivät ilmennä

VGF.

OC solulinjoja 2008 ja 2008C13 istutettiin 10 cm ruokia ja transfektoitu VGF ekspressiovektorilla (pCMV6-AC-VGF-GFP) ja tyhjän vektorin (pCMV6-AC-GFP) (Origene, Rockville, MD). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut jaettiin useisiin ruokia. Seuraavasta päivästä lähtien, soluja viljeltiin 2 viikkoa väliaineessa, joka sisälsi 400 ug /ml ja 30 ug /ml G418: aa (Cellgro, Manassas, VA), 2008 ja 2008C13 vastaavasti. 2 viikon kuluttua solut pestiin kahdesti PBS: llä, kiinnitettiin 25% etikkahappoa ja 75% metanolia huoneenlämpötilassa 10 minuuttia ja sitten värjättiin 0,1% kristallivioletilla. Pesäkkeet laskettiin ja pesäkkeiden lukumäärä maljaa kohti on keskimäärin kolmesta itsenäisestä kokeesta (pesäkkeitä halkaisija 2 mm pidettiin positiivinen). Vahvista ilmentymisen VGF, solut otettiin talteen 48 tuntia transfektion jälkeen ja Western blot -analyysi suoritettiin, käyttäen VGF-vasta-ainetta (Santa Cruz, CA), normalisoitiin β-aktiinin tasot (vasta-aine, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO).

tulokset

Kaiken metylaatio taajuuden OC Näytteet ja Normaali Munasarjojen Näytteet (Training Set) B

Kolmetoista geenejä (

PGP9.5

,

HIC1

,

AIM1

,

APC

,

PAK3

,

KIF1A

,

CCNA1

,

ESR1

,

SSBP2, GSTP1

,

MGMT, VGF

ja

FKBP4

) analysoitiin PH käyttäen QMSP kaksi eri näytteitä. Havaittu metylaatio taajuudet kunkin geenin harjoitussarjassa esitetty yhteenvetona taulukossa 2A. Lyhyesti, harjoitussarjassa (yhteensä), useimmin metyloidut geenit olivat:

PGP9.5

,

HIC1

,

ESR1 ja VGF

. Havaittu taajuus metylaation tässä joukossa oli 19% (11/57) ja

ESR1

, 67% (38/57) ja

HIC1

, 28% (16/57) ja

PGP9.5

ja 37% (21/57) ja

VGF

. Kukin viimeksi mainituista 4 geenit olivat merkitsevästi metyloitu OC normaalia (p = 0,05 jokaista geeniä). Yhdistämällä kaikki 4 geenit analysoitiin training set vietämme metylaatio vähintään 1 4 geenien 81% (46/57) ja OC näytteitä, joiden spesifisyys 100%.

Tämä joukko kasvain analysoitiin geenin esivalinnassa tarkoitukseen. Maksimoida spesifisyys, joka on empiirinen cut-off-arvo määritettiin korkeimman arvon yläpuolella kontrolliryhmän kunkin geenin. Cut-off-arvo kunkin geenin on esitetty taulukossa 2A.

Association between DNA metylaatiomuutokset ja kliinis tekijät koulutukseen asetettu

Vertasimme metylaatiostatuksen kahden geenin (

PGP9.5

ja

VGF

) 57 OC näytteitä koulutuksen asetettu väestörakenteen ja kliinis parametrit, kuten ikä, vaiheessa histologinen tyyppi, laatu, tupakointi ja alkoholin kulutus historian potilaita, jonka logistinen taantumisanalyysi.

VGF

metylaatio oli useammin läsnä aiemmissa vaiheissa (vaihe I ja II) OC verrattuna myöhäisessä vaiheessa (vaihe III ja IV) kasvainten [14/26 (54%) verrattuna 6/30 (20 %) metyloitua] (Ristitulosuhde, OR = 0,21, 95C.I. [,07-,7],

p

arvo = 0,011). Korrelaatiot kaikkien muiden ennusteeseen viittaavia parametreja ole olleet merkittäviä metylaation minkä tahansa muiden geenien (taulukko 3A).

metylointi taajuus

VGF

ja

PGP9.5

itsenäisissä validointi (IV) joukko näytteitä ja kliinis korrelaatio

Perustuen saatavuudesta näytteiden ja uutuuden geenien OC ja metylaation taajuuksien training set valitsimme 2 geenit (

VGF

ja

PGP9.5

) testata itsenäisessä kohortin näytteitä koostuu 372 karsinoomien, 18 rajatapaus kasvaimia ja 17 cystadenomas. Molemmat

VGF

ja

PGP9.5

metylaatio oli syöpä tietty kuvio, jossa on 43% ja 85% taajuus vastaavasti kasvaimissa, kun taas 0% vuonna normaalit, kuten aikaisemmin (taulukko 2B) ( Kuvio 1). Mielenkiintoista korkea metylaatio taajuus havaittiin sekä geenien rajatapauksissa kasvaimia ja cystadenoma (taulukko 2B) (kuva 1).

laskeminen

PGP9.5

tai

VGF

geeni ja

β-aktiini

suhde perustuu fluoresenssiemissiovoimakkuudessa arvot sekä geenit saadaan kvantitatiivinen metylaatiospesifistä reaaliaikainen PCR-analyysi. Saadut suhdelukuja kerrotaan 1,000 helpottaa taulukointi. Nolla-arvot on esitetty alaosassa kuvaaja, joka esittää näytteiden määrä, koska niitä ei voida piirtää oikein log mittakaavassa. (A)

PGP9.5

metylaatio arvot normaaleissa näytteissä (0/13, 0%), cystadenomas (12/17, 71%), rajatapaus kasvaimet (18/18, 100%) ja munasarjojen kasvaimia ( 316/372, 85%). (B) metylointi

PGP9.5

koko histologisia tyyppejä (O.R = 0,24, 95% CI:. [0,14-+0,40],

p

0,001). (C)

PGP9.5

metylaatio korreloi merkitsevästi alemman luokan (O.R = 0,24, 95% CI [+0,14-+0,40],

p

= 0,012). (D)

PGP9.5

metylaatio korreloi merkitsevästi ei ole jäljellä taudin (pienempi kuin 2 cm) (OR = 0,41, 95% CI [0,24-0,68],

p

= 0,001) . (E)

PGP9.5

metylaatio korreloi merkitsevästi alkuvaiheen kasvaimet (OR = 0,26, 95% CI [0,16-0,45]

p

0,001. (E)

VGF

metylaatio arvot ja taajuudet normaaleissa näytteissä (0/13, 0%), cystadenomas (5/16, 31%), rajatapaus kasvaimet (6/18, 33%) ja munasarjojen kasvaimia (158/366, 43 %).

riippumaton validointi asetettu, käyttämällä yhden muuttujan logistista regressioanalyysiä, vertasimme metylaatiostatuksen

VGF

ja

PGP9.5

väestörakenteen ja kliinis parametreja kuten ikä, vaiheessa histologinen tyyppi, laatu, ja läsnäolo jäljellä taudin leikkauksen jälkeen.

PGP9.5

metylaatio (käyttäen cutoff yli 75. prosenttipiste metylaation suhteen) korreloi merkitsevästi alhaisempi laatu ja alkuvaiheessa kasvaimet (OR = 0,52, 95% CI [,31-0,86],

p

= 0,012) ja (OR = 0,27, 95% CI [,16-+0,45],

p

0,001), vastaavasti, samoin kuin ilman jäljellä taudin (OR = 0,41, 95% CI [+0,24-+0,68],

p

= 0,001), ja histologinen tyyppi (ei-vakavien) (OR = 0,24, 95% CI [0,14-0,40],

p

0,001) (taulukko 3B) (kuvio 1). Yhteenveto metylaation

VGF

ja

PGP9.5

kanssa kliinis korrelaatio itsenäisissä validointi set on esitetty taulukossa 3B.

Kaikki 372 tapaukset Munasarjasyövän on itsenäinen validointi setti oli käytettävissä seurantaan analyysiä. Käytimme Cox Suhteellinen Hazard Malli ennustaa yleistä (OS) ja tautikohtaisten selviytyminen (DSS) näistä 372 potilasta liittyy PH

PGP9.5

ja

VGF

. Mediaani seuranta näille potilaille oli 30 kuukautta vaihtelevat 1-234 kuukautta. Yhdenmukaisia ​​aiempien havainto, jonka muuttujan Coxin regressioanalyysi, löysimme korrelaatio on huono selviytymisen myöhemmin (III /IV) kasvaimen (riskisuhde (HR) 8,22, 95% CI [4,91-13,76], p 0,001), Taulukko S1. Taulukko S2.