Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kohdistaminen kasvain aineenvaihdunta on tulossa merkittävä uusi alue lääkealan pyrkimyksessä. Näin ollen järjestelmällinen haku määrittää, onko olemassa erityisiä energianlähde riippuvuuksia kasvaimissa, ja miten niitä voidaan sanelemia ylävirran ajo geneettisiä mutaatioita, vaaditaan. PI3K-AKT-mTOR signalointireitistä on uraauurtava rooli säätelyssä monipuolinen soluprosesseissa myös solujen jakautumista ja selviytymistä, mutta on myös liittynyt metabolisia säätelyhäiriötä. Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet määrittelemään miten mutaatioita

PI3KCA

voi vaikuttaa metabolisen riippuvuus syöpäsolun, käyttämällä juuri rakennettua isogeenisiin solulinjoissa. Tutkimukset paljastivat geeniekspression allekirjoitusten

PIK3CA

mutanttisoluja osoitus johdonmukaisen säätely ylöspäin Glykolyysivaiheen. Mielenkiintoista, geenit ylä- ja alassäädetty vaihteli isogeenisten mallien viittaa siihen, että ensisijainen solmu sääntelyn ei ole sama välillä malleja. Muita geenin ilmentymistä muutoksia havaittiin myös, mikä viittaa siihen, että aineenvaihduntareitit muut kuin Glykolyysivaiheen, kuten glutaminolysis, vaikutti myös. Ravinteiden riippuvuutta tutkimukset osoittivat, että kasvu

PIK3CA

mutanttisoluista on erittäin riippuvainen glukoosista, kun taas glutamiinin riippuvuus ei riipu

PIK3CA

tila. Lisäksi glukoosi riippuvuus näytteillä

PIK3CA

mutanttisoluista ei voida ohittaa lisäravinteen muita ravintoaineita. Tämä erityinen riippuvuus glukoosi kasvun edelleen havainnollistettu tutkimuksissa vaikutuksia arvioitaessa kohdennetun häiriöitä glykolyyttisellä reitin käyttämällä siRNA ja todettiin myös olevan läsnä useammilla paneeli syöpäsolulinjojen kätkeminen endogeenisen

PIK3CA

mutaatioita. Lopuksi olemme havainneet, että

PIK3CA

mutaatiot johtavat siirtymistä erittäin glykolyyttistä fenotyyppi, ja että huolimatta ehdotuksia, jotka syöpäsolut ovat taitavia hyödyntää vaihtoehtoisia ravinteiden lähteitä,

PIK3CA

Mutantit solut ei pysty kompensoimaan glukoosin peruuttamista. Ymmärtäminen metabolinen riippuvuudet

PIK3CA

mutantti syövät antaa kriittistä tietoa suunnitteluun tehokkaiden hoitojen ja kasvaimen visualisointi strategioita.

Citation: Foster R, Griffin S, Grooby S, Feltell R, Christopherson C, Chang M, et al. (2012) Multiple Metabolinen Muutokset Olemassa Mutant PI3K Syövät, mutta vain glukoosi on olennainen ravinnelähteeksi. PLoS ONE 7 (9): e45061. doi: 10,1371 /journal.pone.0045061

Editor: Jen-Tsan Ashley Chi, Duke University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 helmikuu 2012; Hyväksytty: 14 elokuu 2012; Julkaistu: 13 syyskuu 2012

Copyright: © Foster et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus ei saanut ulkopuolista rahoitusta. Työ olisi kokonaan rahoitettu Horizon Discovery Oy ja Celera Corporation osana sisäisen tutkimusohjelman. Tutkimuksen suunnittelu, tietojen keruu ja analysointi, päätöstä julkaista ja valmistelu käsikirjoituksen suoritettiin työntekijät Horizon Discovery Oy ja Celera Corporation.

Kilpailevat edut: Rebeccca Foster, Sue Griffin, Suzanne Grooby, Ruth Feltell ja Chris Torrance ovat kaikki työntekijät Horizon Discovery Oy Chris Torrance on co-perustaja Horizon Discovery Oy palvelee hallituksen. Cindy Christopherson, Monica Chang, John Sninsky ja Shirley Kwok ovat kaikkien työntekijöiden Celera Corporation. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

PI3K-AKT-mTOR-reitti on keskeinen kasvaimia synnyttävän signalointireitin ja sellaisenaan on keskeinen rooli säätelyssä solujen proliferaatiota ja eloonjäämistä, syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäkkeiden [1] – [3]. Hyper-aktivaatio polku on yleinen ihmisen syövissä ja voidaan saavuttaa useilla tavoilla, mukaan lukien mutaation

PIK3CA

.

PIK3CA

, koodaavan geenin alfa-katalyyttisen alayksikön kinaasin, on mutatoitunut noin 15% paksusuolen ja peräsuolen kasvainten ja noin 30% rintasyövistä, ja useimmat mutaatiot esiintyvät kolme verkoissa,

E542K

,

E545K

ja

H1047R

[4] – [9]. Kaksi ensimmäistä hotspot mutaatiota,

E542K

ja

E545K

, löytyy eksonissa 9, joka sijoittuu kierteisen domeenin, kun taas

H1047R

, yleisin mutaatio rintojen syöpä, on todettu eksonissa 20, mikä sijoittuu kinaasidomeenisekvenssiin. Mutaatiot molemmilla alueilla johtavat konstitutiivisen aktivaation PI3K-AKT-mTOR signalointi [3], [5], [10].

PI3K-AKT-mTOR koulutusjakson paitsi säätelee solujen lisääntymisen ja solujen eloonjäämistä, mutta on tärkeä väylän valvonta ja sääntely syövän aineenvaihdunnan [2], [11] – [15]. Integrointi aineenvaihdunnan muutoksia leviämisen signalointi on ratkaisevaa annetaan kilpailuetu Olipa syöpäsolun, jolloin kasvaimen synnyssä ja etäpesäkkeitä.

Vertaileva geeniekspressioanalyysissä suoritettiin joukko geenejä, jotka edustavat eri metaboliareittiä käyttäen (A ) MCF10A PI3Kα isogeenisiin pari (+ /+ ja H1047R /+) ja (B) HCT116 PI3Kα isogeeninen pari (+/- ja H1047R /+). Ox Phosph, oksidatiivisen phosphorytion; PPP, pentoosifosfaattireitistä. Replikoi aineistoja on laskettu keskiarvo ja geenien ilmentymisen muutoksia PI3Kα mutantti solut edustettuina kertamuutosta suhteessa PI3Kα villityypin soluista. Eri Glykolyysivaiheen geenejä säädellään ylöspäin seurauksena

PIK3CA

mutaation eri solumalleja.

metabolinen sopeutuminen syöpäsolujen on hyvin tunnettu ilmiö, jossa tutkimukset Otto Warburg että osoitti syöpäsolut kuluttaa glukoosia korotetussa nopeudella jopa hapen läsnäollessa, jäljellä uraauurtava kentälle (tarkistetaan [16] – [18]). Metabolinen muutokset eivät yksinkertaisesti aiheuttaa muutoksia energian tuotannossa, mutta ovat keskeisiä säätelemiseksi tuotantoon makromolekyyliyhdisteiden rakennuspalikoita vaatima solu ja ylläpidosta redox tasapaino [16], [19] – [22]. Vaikka aerobinen Glykolyysivaiheen (Warburg vaikutus) on yleisimmin dokumentoitu metabolinen aktiivisuus kasvaimissa ja syöpäsolulinjoissa, muita reittejä kuten mitokondrioiden glutamiini aineenvaihduntaa ja rasvahappojen synteesin yhteistyössä tuottaa makromolekyylien tarvitaan tukemaan jatkuvaa solukasvua. Todellakin, glutamiini vaikuttaa monia keskeisiä aineenvaihdunnan tehtäviä lisääntyvien kasvainsolujen ja on usein ainoastaan ​​muutosten katsotaan glukoosiin suhteen merkitys kasvaimen solujen aineenvaihduntaa. Glutamiini on runsain aminohappo ihmisen plasmassa, ja syöpäsolujen metaboloida glutamiini yli minkä tahansa muun aminohapon [23] – [25]. Estämättä, julkaissut useita tutkimukset ovat sidoksissa muun aminohapon riippuvuudet metabolisia vaikutuksia ja selviytymistä syöpäsolujen [26] – [28]. Nämä ravinteiden tutkimukset korostavat monimutkainen ja hieman joustava luonne kasvain aineenvaihdunta, koska syöpäsolut eivät voi vain sopeutua ja vaihtaa eri metaboliareittiä, vaan myös yhtä aikaa useaan ravintoaineita.

PI3K signalointireitistä, pitkälti sen vaikutukset AKT ja mTOR, on liittynyt sääntelyä useiden metabolisia vaikutuksia, kuten glukoosin oton, stimulaatio Warburg vaikutus, ja parannettu synteesi lipidien ja proteiinien [11], [29], [30]. AKT aktivointi esimerkiksi on osoitettu stimuloivan Glykolyysivaiheen lisäämällä ilmaisun ja kalvo translokaation glukoositransportteria GLUT4. Aktiivinen AKT toimii myös kautta GSK3p säännellä glykogeenisyntaasiin ja edistää yhdistyksen heksokinaasin 2 mitokondrion kalvon, jossa heksokinaasin 2 voi helpommin fosforyloida glukoosi [11], [13], [29] – [33].

proteiinin ilmentyminen arvioitiin Western-blottauksella vahvistaa geenin ilmentymisen tiedot sekä (A) MCF10A PI3Kα isogeenisiin pari (+ /+ ja H1047R /+) ja (B) HCT116 PI3Kα isogeeninen pari (+/- ja H1047R /+ ) solulinjojen.

Vaikka historialliset tutkimukset ovat osoittaneet yhteyksiä PI3K-AKT-mTOR-reitin ja aineenvaihduntaa, mallin käyttämät järjestelmät ovat usein luottaneet vertailun solulinjoilla, joissa on useita geneettisiä eroja tai käytetty yli-ilmentyminen strategioita, jotka eivät täysin heijasta potilaan kasvaimen genetiikkaa. Hallitseva painopiste tutkimus on keskittynyt vaikutus kasvaimen genetiikan glukoosiaineenvaihduntaan. Kuitenkin geneettiset muutokset voivat myös sanella vaihtoehtoisia ravinteiden ja aineenvaihdunnan riippuvuuksia.

Jotta tutkia miten endogeenisen

PIK3CA

mutaatiot nimenomaan muuttaa metaboliareittiä ja ymmärtää paremmin, onko jokin näistä mahdollisista muutoksista perustaa terapeuttisesti kohdistettavaksi cellular metabolinen riippuvuudet, olemme suorittaneet keskittyneet metabolisen geenin ilmentymisen analyysi, ravinteiden vaihto ja siRNA kokeellisesti isogeenisiin solulinjaa malleja, jotka ovat geneettisesti identtisiä, lukuun ottamatta mutaatiostatus endogeenisen

PIK3CA

geeni.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Kaikki MCF10A ja HCT116 X-MAN ™ isogeenisiin solulinjat saatiin Horizon Discovery Ltd (https://www.horizondiscovery.com). Seuraavat X-MAN ™ isogeenisiin solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa: MCF10A PI3Kα (H1047R /+), heterotsygoottinen knock-in on

PIK3CA

kinaasidomeenissa aktivoiva mutaatio (HD 101-011); MCF10A PI3Kα (E545K /+), heterotsygoottinen knock-in on

PIK3CA

kierteisen domain aktivoiva mutaatio (HD 101-002); HCT116 PI3Kα (+/-), knock-out

PIK3CA

kinaasidomeenissa mutantti alleeli (

H1047R

) heterotsygoottisessa vanhempien soluissa (HD 104-007). Kantasolulinjoista, MCF10A PI3K (+ /+) ja HCT116 PI3K (H1047R /+) käytettiin myös. Kaikki isogeenisiin solulinjat luotu rAAV-välitteisen homologisen rekombinaation tarkasti ja vakaasti muuttaa erityistä tavoitetta genomista loci [3], [34]. Kaikki MCF10A isogeenisiin solulinjoja pidettiin yllä DMEM /F12-(PAA), johon oli lisätty 5% hevosen seerumia (Invitrogen), 10 ug /ml insuliinia (Sigma), 0,5 ug /ml hydrokortisonia (Sigma) ja 0,1 ug /ml koleratoksiinia ( Sigma). MCF10A vanhempien solut lisäksi täydennetty 20 ng /ml hEGF (R 0,05; ** p 0,01).

MCF10A PI3Kα (+ /+) ja MCF10A PI3Kα (H1047R /+) -soluja kasvatettiin 120 tuntia väliaineessa, joka sisälsi 25 mM glukoosia tai ilman glukoosia kuten on osoitettu. Kaikki alustat sisälsivät 2 mM glutamiinia. Lisäksi, soluja kasvatettiin ilman glukoosia, johon on lisätty joko 0,5 mM fruktoosi (+ fruktoosi), 10 mM galaktoosia (+ galact), rasvahappojen soluviljelmässä täydentää (+ FA) tai 0,1 mM asparagiinihappo (+ AA). Solujen kasvua arvioitiin käyttämällä SRB.

MCF10A PI3Kα (+ /+) ja MCF10A PI3Kα (H1047R /+) solut transfektoitiin ei-kohdennettu siRNA (NT) ja 2 yksittäisten siRNA kohdistaminen

HK2

, HK2 A ja HK2 B (A) Solujen kasvu arvioitiin 96 tuntia transfektion jälkeen käyttäen SRB. Kasvu arvioitiin prosentteina Kohdentamattoman ohjaus (* p 0,05; ** p 0,01). (B) knockdovvn HK2 proteiinin vahvistettiin Western-blottauksella. HK1 Western blottaus suoritettiin spesifisyyden varmistamiseksi ja pudotus.

solulinjat kasvatettiin 120 tuntia väliaineessa, joka sisälsi 2 mM glutamiinia, ja osoitettu pitoisuus glukoosin ja kasvua arvioitiin käyttämällä SRB. Kasvu kunkin solulinjan ilmaistiin prosentteina kasvusta 25 mM glukoosi (* p 0,05; ** p 0,01).

Growth Riippuvuus Analyysit

Leviämisen solujen yli 120 tunnin ajan arvioitiin käyttäen Sulphordamine B (SRB) määritys [35]. Solut ympättiin 96-kuoppalevyille kolmena kappaleena glukoosia ja glutamiinia DMEM: (PAA), johon oli lisätty tarvittava glukoosin konsentraatio (Sigma) ja glutamiinia (PAA). MCF10A isogeenisiin solulinjat lisäksi lisätty 5% hevosen seerumia, 10 ug /ml insuliinia, 0,5 ug /ml hydrokortisonia, 0,1 ug /ml koleratoksiinia ja 0,2 ng /ml hEGF. Kaikki muut solulinjat, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia vain. Milloin on osoitettu media lisättiin myös 0,5 mM fruktoosia, 10 mM galaktoosia, 0,5 ml /l rasvahapon soluviljelmässä täydentää tai 0,1 mM asparagiinihappo (Sigma).

Gene Expression Studies

MCF10A isogeenisistä solulinjat siirrostettiin 25 cm

2-pulloihin DMEM /F12-alusta täydennettynä 5% hevosen seerumia, 10 ug /ml insuliinia, 0,5 ug /ml hydrokortisonia, 0,1 ug /ml koleratoksiinia ja 0,2 ng /ml hEGF. HCT116 isogeenisiin solulinjoja istutettiin 25 cm

2-pulloihin McCoyn 5A-alusta täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia. 48 tunnin jälkeen solut kerättiin trypsinoimalla ja RNA valmistettiin käyttämällä RNeasy Kit (Qiagen), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Kokonais-RNA käänteiskopioitiin käyttämällä High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Transkription tasot 45 osallistuvien geenien glykolyysiin, glutaminolysis, pentoosifosfaattireitin, oksidatiivinen fosforylaatio, ja rasva-aineenvaihduntaan kvantifioitiin reaaliaikaisella PCR: llä yhdessä kolmen normalisoinnin geenien (

NUP214

,

PPIG

ja

SLU7

). 5 ng cDNA: ta kohden käytettiin PCR. Monistukset suoritettiin

ΔZO5

DNA -polymeraasia puskurissa, joka sisälsi 20 mM Tris pH7.85, 30 mM KCI, 3 mM MgCI

2, 100 uM dA, G, CTP, 200 uM dUTP, 0.8units urasiili N-glykosylaasia, 6% glyserolia, 1 X ROX, ja 0,2 x SYBR vihreä. Reaktiot monistettiin Prism 7900 käyttäen seuraavia sykliparametrit: 50 ° C 2 minuuttia, 95 ° C: ssa 12 minuuttia, minkä jälkeen 45 sykliä 95 ° C: ssa 20 sekunnin ajan ja 60 ° C: ssa 1 minuutti. Viittaus allas (Universal Human Reference RNA, Stratagene) 2,5 ng monistettiin kukin geeni. Kaikki monistukset suoritettiin kahtena kappaleena.

Geenien ilmentyminen määritettiin käyttäen 2 (-ΔΔCt) kuvaamalla menetelmällä Livak ja Schmittgen [36]. Ekspression geenin

PIK3CA

mutanttien solujen suhteen

PIK3CA

villityypin soluissa määritettiin käyttämällä kaavaa 2

(ΔΔCt PI3K mutatoitu-ΔΔ Ct PI3K WT).

Western-blottaus

Solut lyysattiin TG lyysipuskuria jäissä ja proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttämällä BCA-proteiinimäärityksellä (Sigma). Yhtä suuret määrät proteiinia, ladattiin 10% Bis-Tris geeleillä SDS-PAGE-elektroforeesilla ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Invitrogen). Membraanit blokattiin 5% w /v rasvatonta kuivamaitoa, 1 x Tris-puskuroitua suolaliuosta, 0,1% Tween-20: ssa 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja sitten inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla 4 ° C: ssa yön yli. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: anti-GLUT1 (1:5000 laimennus; Epitomics 2944-1), anti-GLUT5 (1:500 laimennus; Santa Cruz ac-271055), anti-heksokinaasin 1 (1:500 laimennus; Cell Signalling Technology 2804), anti-heksokinaasin 2 (1:500-1000 laimennus; Cell Signalling Technology 2106), anti-MCT4 (1:500; Millipore AB3314P), anti-fosfo-AKT (1:1000; Cell Signalling Technology 9271) ja anti -β-aktiini (1:500 000; Sigma A5441). Sen jälkeen, membraaneja inkuboitiin sopivan sekundaarisen vasta-aineen (Cell Signalling Technology) 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Proteiinit tunnistettiin käyttämällä ECL-Plus (GE Healthcare) ja valotuksen filmille.

siRNA Studies

ON-TARGETplus kuin kohdistaminen allas siRNA (Dharmacon # D-001810-10-20) ja kaksi yksittäistä oN-TARGETplus siRNA vastaan ​​heksokinaasin 2 (Dharmacon # J-006735-06 ja # J-006735-07) transfektoitiin soluihin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen), valmistajan ohjeiden mukaisesti eteenpäin transfektioon. Transfektio komplekseja jätettiin soluihin 6 tuntia ennen korvaamalla kasvualustojen. Solukasvu määritettiin 96 tuntia transfektion jälkeen käyttäen SRB-määritystä edellä kuvatulla tavalla. Heksokinaasilla 2 Knockdown vahvistettiin Western-blottauksella kuvattu, jossa heksokinaasi 1 ilme seurataan spesifisyyden varmistamiseksi naistaintumisprosenttia.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen 2-tie ANOVA kokeista seuraa Bonferronin useita vertailutestillä. Yksinkertaisuuden vuoksi p-arvot ovat edustettuina p 0,05 (*) tai p 0,01 (**) vain.

Tulokset

läsnäollessa PIK3CA aktivointi mutaatio johtaa Gene Expression Muutokset Associated Lisääntynyt glykolyyttisiä Riippuvuus ja Additional metaboliareitissä muutostyöt

täysin luonnehtivat vaikutuksen

PIK3CA

mutaatio aineenvaihdunnan muutoksiin kokonaisuutena, kohdegeenin setti oli ensimmäinen koottu, mikä vastaa 45 geenit eri metaboliareitit kuten glykolyysin, oksidatiivinen fosforylaatio, glutaminolysis, pentoosifosfaattireitistä ja rasvahappojen aineenvaihduntaan. Geenien ilmentyminen analysoitiin sitten poikki rinnakkaisnäytettä RNA-näytteet, valmistetaan kahdesta isogeenisiin mallijärjestelmiin. Ensimmäinen solu mallijärjestelmä oli ei-tuumorigeenisiä syövän solulinja pari koostuu MCF10A vanhempien soluja, joissa PI3Kα on villityypin (WT), PI3Kα (+ /+) ja MCF10A solut, joihin

H1047R

aktivoiva mutaatio oli otettu käyttöön, PI3Kα (H1047R /+). Toinen oli koolonisyöpäsolulinja HCT116, joka on heterotsygoottinen

H1047R PIK3CA

mutaatio, PI3Kα (H1047R /+), pariksi solut, joissa mutantti alleeli on tippuu ulos tehdä solut toiminnallisesti WT, PI3Kα (+/-). Analyysi geenien ilmentyminen varten

PIK3CA

mutantti solu näytteitä suhteessa

PIK3CA

WT solut paljasti joitakin silmiinpistävä muutokset aineenvaihdunnan geeniekspressiotasot. Vaikka tarkkoja geenejä ylä- ja alassäädetty

PIK3CA

mutanttisoluista verrattuna

PIK3CA

WT erosivat kahden solumallin järjestelmien yleinen muutoksia geenien ilmentyminen oli osoitus lisääntynyt aerobinen glykolyyttisissä fenotyyppi sisällä

PIK3CA

mutanttisoluista. Käyttöönotto aktivoiva mutaatio

PIK3CA

vuonna MCF10A soluissa johti kasvuun ilmaus keskeisten glykolyyttisen entsyymin

heksokinaasin 2

(

HK2

), ja samanaikainen lasku ilmaus fruktoosi kuljettajaa,

GLUT5

(kuvio 1A). Vuonna HCT116-paksunsuolen syöpäsolujen tausta, kun läsnä on mutatoitu

PIK3CA

johti kohonnut ilmentyminen glukoosin kuljettajaa,

GLUT1

(kuvio 1 B).

Muut geeniekspression muutokset seurauksena, kun läsnä on

PIK3CA

mutaatio ehdotettu, että ylimääräinen metaboliareittiä muutoksia voi esiintyä. In MCF10A PI3Kα (H1047R /+) solujen, rasvahapon kuljettaja

SLC27A1

oli vähentynyt ilmentyminen, on useita geenejä, mukaan oksidatiivisen fosforylaation osoittaa myös vähentää ilmentymistä (kuvio 1A). Kohonneita geenien ilmentymistä, kuten

asparagiini syntetaasin (ASNS) B ja

gluta- (GLS) B oli johdonmukaisesti nähtävissä PI3Kα (H1047R /+) soluja, viittaavia kohonnut glutaminolysis (kuva 1A ja 1B).

muutoksia mRNA ilmaisun sitten vahvistettiin proteiinin tasolla, mikä osoittaa kohonneet keskeisten glykolyyttisten entsyymien kuten HK2 ja GLUT1, ja lisäksi paljastaen säätely ylöspäin laktaatin kuljettajan MCT4 vuonna MCF10A PI3Kα ( H1047R /+) soluja (kuvio 2). Aktivointi PI3K reitin vahvistettiin molemmissa isogeenisiin malleissa, kuten on esitetty AKT fosforylaatio.

kasvu PIK3CA mutanttisolut selektiivisesti Riippuu glukoosi Vaikka Glutamiini on välttämätöntä Sekä WT ja PIK3CA mutanttisolut

tulokset geeniekspressioprofilointi olivat viittaavia useita muutoksia solun aineenvaihduntaan seurauksena mutatoituneen

PIK3CA

, erityisesti lisääntynyt glykolyysin ja muuttunut glutaminolysis. Tutkia mahdollisuutta, että solut voivat olla riippuvainen paitsi tiettyjä reittejä, mutta myös osoittavat ravinteiden lähde riippuvuutta, tutkimme vaikutus ravinteiden ehtyminen solu- kasvuun, keskittyen cellular riippuvuutta glukoosin ja glutamiinia. Yli 120 tuntia, täydellinen vetäytyminen glukoosin (läsnä ollessa glutamiini) vaikutti negatiivisesti kykyyn MCF10A PI3Kα (H1047R /+) lisääntymään ja kasvaa, mutta sillä ei ole vaikutusta kasvuun MCF10A PI3Kα (+ /+) solujen (kuvio 3A). Tämä ero vaikutus oli myös totta toisen MCF10A solulinja, joka sisältää vaihtoehtoisen

PIK3CA

mutaatio, MCF10A PI3Kα (E545K /+) (kuvio 3A). Samoin kasvu HCT116 PI3Kα (H1047R /+) on ankarampi vaikutti seuraavat glukoosin vähenemistä ja peruuttamista kuin HCT116 PI3Kα (+/-) soluja (kuvio 3B). Tämä havainto viittasi siihen, että

PIK3CA

WT-solut pystyivät paremmin sietää glukoosin poistamista kuin

PIK3CA

mutanttisoluja, vaikkakin läsnä glutamiini. Jotta ymmärtää paremmin osallistumisen glutamiini, suoritimme matriisin tutkimuksissa arvioidaan glukoosi ehtyminen ja peruuttamista yhdessä glutamiinin ehtyminen ja peruuttamista. Kasvu MCF10A solujen riippumatta

PIK3CA

mutaatiostatus oli vakavasti vaarantunut täydellistä vetäytymistä glutamiinia, vaikka läsnä glukoosin (kuvio 3C). Osittainen ehtyminen glutamiinia vaikutti negatiivisesti myös solujen kasvua, mutta laajuus riippuvuus ei näytä korreloivan

PIK3CA

mutaatio aseman. Samoin täydellinen glutamiini vetäytyminen vakavasti vaarantua kasvua HCT116-solujen. Toisin kuin MCF10A soluihin, HCT116-solut pystyivät paremmin sietää keskitason glutamiinia peruuttamista, eikä kasvun hidastuminen näkyy joko

PIK3CA

WT tai mutantti soluja (kuvio 3D). Rakenteessa glukoosin herkkyys säilyi tällä keskitasolla glutamiinia (kuva S1).

Glucose Riippuvuus näytteillä PIK3CA Mutant soluja ei voida ohittaa Lisäravinteen muiden ravintoaineiden

Jotta edelleen luonnehtia glykolyyttisellä fenotyyppi ja näennäinen glukoosin riippuvuus

PIK3CA

mutanttisoluja, käytimme MCF10A isogeeninen mallijärjestelmä arvioida vaihtoehtoisia ravinnelähteisiin voisi kompensoida glukoosin ja ohittaa riippuvuus. Kytkeminen ravinnelähde vaihtoehtoiseen monosakkaridi (fruktoosi tai galaktoosi) ei pystynyt kompensoimaan glukoosin peruuttamista MCF10A PI3Kα (H1047R /+) soluja, kun taas kasvu MCF10A PI3Kα (+ /+) solujen pysyi muuttumattomana poistamalla glukoosia tai ravinteiden vaihto (kuvio 4). Koska geenien ilmentyminen tiedot osoittivat, että

PIK3CA

mutanttisoluista voi olla muutoksia metaboliareitteihin muissa kuin Glykolyysivaiheen, me tutki tarkemmin, onko glukoosin kasvu riippuvuutta voitaisiin ohittaa täydentämällä kanssa ravinteita, jotka voivat edistää näitä vaihtoehtoisia reittejä. Joka perustuu geenien ilmentymisen muutoksia asparagiini-syntetaasin ja rasvahappojen kuljettajat, me täydennetty solut asparagiinihapolla tai rasvahappojen seoksen. Kumpikaan täydennys pystyi ohittaa vaikutusten poistamista glukoosi kasvuun MCF10A PI3Kα (H1047R /+) soluja (kuva 4). Tulokset olivat samankaltaisia, kun MCF10A PI3Kα (E545K /+) ja HCT116 PI3Kα (H1047R /+) soluja profiloitu (kuva S2).

Häiriöt glykolyyttisellä Pathway Osoittaa antiproliferatiivisia vaikutuksia in PIK3CA Mutant Cells

MCF10A PI3Kα (H1047R /+) solut näyttävät korkean glukoosin riippuvuuden ja eivät pysty kompensoimaan puuttuminen glukoosin hyödyntämällä muita ravintoaineita. Yhdessä myös tiedot, jotka osoittavat, että

PIK3CA

mutanttisoluja osoittavat lisääntyneen ekspression avaimen glykolyysin entsyymiä HK2, me oletettu, että häiriöt glykolyyttisen reitin pitäisi olla riittävä, jopa glukoosin läsnä ollessa, estää kasvua mutanttisoluista. Siksi arvioitiin vaikutuksia kohdennettuja häiriöitä Glykolyysivaiheen käyttäen kahta siRNA-molekyylien pudotus tasoja HK2 että MCF10A isogeenisistä soluja. Käyttämällä ei-kohdennettu siRNA-molekyyli kontrollina, olemme havainneet, että tietyn HK2 pudotus johtaa todellakin antiproliferatiivisia vaikutuksia, selektiivinen

PIK3CA

mutanttien solujen (kuvio 5A). Knockdovvn HK2 proteiinin tasot sekä

PIK3CA

WT ja mutanttien solujen linjat vahvistettiin Western-blottauksella (kuvio 5B), jossa spesifisyys naistaintumisprosenttia varmistettiin seuraamalla HK1 ilme.

Glukoosi Riippuvuus nähdään Muut Cancer Cell Lines Harbouring Endogeeniset PIK3CA Mutaatiot

tutkimukset ovat käyttäneet tarkka ja geneettisesti määritelty järjestelmä tutkia vaikutukset

PIK3CA

mutaatio soluaineenvaihduntaan erillään. Olemme laajentaneet tutkimuksia ymmärtää, ovatko nämä löydökset olivat totta poikki laajempaa paneeli syöpäsolulinjojen. Siksi määritettiin glukoosin kasvun riippuvuutta kuusi paksusuolen ja rintasyövän solulinjat, jotka kaikki sisältävät endogeenisen

PIK3CA

mutaatiota (taulukko 1). Kuitenkin, nämä rivit on myös varoitus ottaa useita muita geneettisiä eroja, jotka voivat moduloida tai ohittaa oletetun glukoosin riippuvuus määritettiin isogeeninen cell-järjestelmissä. Se, missä määrin kasvuun vaikuttivat vaihteli rivien välistä, jossa 3 6 solulinjojen (T47D, BT20 ja DLD-1), jotka osoittavat kasvun hidastumista seuraavaa osittaista glukoosin loppuminen (kuva 6). Kuitenkin kasvu kaikki 6 solulinjojen vaarantunut täydellistä vetäytymistä glukoosia vaikka läsnä glutamiini, joka tukee käsitystä, että

PIK3CA

mutantti syövät ovat voimakkaasti riippuvaisia ​​glukoosista tukemaan solukasvua.

keskustelu

Kiinnostus opiskeluun syövän aineenvaihduntaa ja metabolisen kohdennettuja tekijöille hoitoja on kasvanut viime vuosina, ja niin parempi ymmärrys ainutlaatuisen aineenvaihdunnan syöpäsolujen on välttämätöntä tehokasta lääkekehityksessä ja järkevä potilaiden hoitoon sekä merkitty ravinteiden visualisointi ja hoitovasteen seurannassa. Huolimatta aktivointi PI3K-AKT-mTOR polku on yhteinen piirre monissa syövissä, ja aktivointi tämän reitin liittyessä sääntelyä useiden vaikutuksia aineenvaihduntaan, kattava profilointi seurausta

PIK3CA

mutaatioita aineenvaihdunnan riippuvuudet ei ole tutkittu. Käyttämällä geneettisesti määritelty isogeenisiin solumalleja olemme voineet tarkasti määrittää, miten

PIK3CA

mutaatiot voivat vaikuttaa metaboliareitit sisällä kasvain.

asetus aineenvaihduntaan ja ravinteiden hyödyntäminen ovat monimutkaisia ​​prosesseja. Geeniekspressioanalyysissä tässä tutkimuksessa kävi ilmi, että yleinen seuraus

PIK3CA

mutaatioita on siirtyminen kohti lisääntyvää glykolyyttisiä fenotyyppi. Kuitenkin tarkkaa solu vaikutuksia, siirtyminen saattaa vaihdella. Sen sijaan yksi nopeutta rajoittava molekyyli, useita vaiheita luoda ”sääntely polku” voi jakaa homeostaattisina ohjaus energia-aineenvaihdunnan. Monivaiheinen kontrolli korostui ero geenin säätely ylöspäin avaimen Glykolyysivaiheen entsyymien eri isogeenisistä malleja. Vaikka erot nähtiin, nettovaikutus on viittaavia säätely ylöspäin Glykolyysivaiheen molemmissa tapauksissa. Tämä yhteys potilaan asianomaisten

PIK3CA

mutaatioita ja tuloksena glykolyyttisissä fenotyyppi on yhdenmukainen aiempien tutkimusten kanssa, jotka ovat liittäneet aktivointi AKT signalointireitin kanssa stimuloimalla Warburg vaikutus [11], [13]. Tämä konsepti on rakennettu ja vahvistettu paljastettua selvä riippuvuus

PIK3CA

mutanttisoluista glukoosista jatkamaan kasvuaan. Huolimatta ehdotuksia, jotka syöpäsolut ovat taitavia käyttämällä muita ravintoaineita, tämä tutkimus on osoittanut, että

PIK3CA

mutanttisoluista eivät ole helposti pysty kompensoimaan glukoosi peruuttamista joko käyttämällä glutamiinia, vaihtoehtoisia monosakkarideja tai muita ravintoaineita. Riippuvuus glukoosi kasvun osoitettiin myös useammilla paneeli syöpäsolulinjojen kätkeminen endogeenisen

PIK3CA

mutaatioita. Tulokset Tämän tutkimuksen voisi tarjota tärkeitä tietoja suunnitteluun hoitostrategioita, koska he ovat korostaneet kriittinen solmut metaboliareitit jotka saattavat olla avain kohdistaa. Todellakin, Knockdown tutkimukset vahvistivat, että kohdistaminen glykolyyttisellä koulutusjakson häiriöitä tuloksia antiproliferatiivisia vaikutuksia, nimenomaan

PIK3CA

mutanttisoluja, mikä viittaa siihen, että tämä voisi olla terapeuttista strategia on erityisesti suunnattu potilaille, joilla on

PIK3CA

mutantti kasvaimia. Näkyvän glukoosi riippuvuus solujen tämä mutaatio on reittejä ei-invasiiviset PI3K-reitti aktivoituu kasvaimia.

kautta luonnehdinta metabolisen fenotyypin geneettisesti täsmäsi isogeeninen soluja, olemme pystyneet määrittämään aineenvaihdunnan seurauksia yhden suunniteltu geneettinen muutos, tässä tapauksessa aktivoiva mutaatio

PIK3CA

geeni. Vaikka vahvistetaan, että aktivointi PI3K-AKT-mTOR-reitin johtaa kasvaneeseen glykolyyttisissä fenotyyppi, olemme myös osoittaneet erityistä riippuvuus

PIK3CA

mutatoitunut solujen glukoosista ja kuvitettu että kohdistaminen tämän reitin tarjoaa terapeuttista potentiaalia ja kasvaimen kuvantamisessa oivallus.

tukeminen Information

Kuva S1.

glukoosi herkkyys HCT116 PI3Kα (H1047R /+) soluja ylläpidettiin kun kasvatettiin 0,5 mM glutamiinia media. HCT116 isogeeninen-solut (+/- ja H1047R /+) kasvatettiin 120 tuntia väliaineessa, joka sisälsi 0,5 mM glutamiinia ja glukoosia esitettynä pitoisuutena. Solujen kasvu arvioitiin käyttämällä SRB värjäystä. Kasvu kunkin solulinjan ilmaistaan ​​suhteessa kasvun väliaineessa, joka sisälsi 0,5 mM glutamiinia ja 25 mM glukoosia.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0045061.s001

(TIF) B Kuva S2.

glukoosi riippuvuus

PIK3CA

mutanttisoluista ei voida ohittaa lisäravinteen vaihtoehtoisia ravinteita. MCF10A PI3Kα isogeenisiin soluja (+ /+ ja E545K /+) ja HCT116 isogeenisistä solut (+/- ja H1047R /+) kasvatettiin 120 tuntia väliaineessa, joka sisälsi 2 mM glutamiinia ja glukoosia esitettynä pitoisuutena (A ja B). Lisäksi soluja kasvatettu ilman glukoosia täydennettiin joko rasvahappojen soluviljelmässä täydennys (+ FA) tai 0,1 mM asparagiinihappo (+ AA). Solujen kasvu määritettiin SRB värjäystä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0045061.s002

(TIF) B