Krooninen sairaus

tiivistelmä

syöpälääkettä kamptotesiini estää replikaatiota ja transkriptiota sieppaamalla DNA topoisomeraasi I (TOP1) kovalenttisesti DNA: n ”pilkottavissa monimutkainen”. Vaikutusten tutkimiseksi kampotekiini on RNA-synteesin genominlaajuisten käytimme Bru-Seq ja osoittavat, että camptothecin kohtelu liittyisi lähinnä transkriptio venymään. Havaitsimme myös, että camptothecin lisääntynyt RNA lukee viimeisen transkription lopetus sivustoja sekä klo tehostajana elementtejä. Poistamisen jälkeen kiinilla transkription levitä kuin aalto 5′-päähän geenien ilman elpymistä transkription ilmenee RNA polymeraasit pysähtynyt elimistössä geenien. Tämän seurauksena, kamptotesiini inhiboi etusijassa ilmentymisen suuria geenejä, kuten proto-onkogeenien, ja anti-apoptoottiset geenit, kun taas pienemmät ribosomaalisen proteiinin geenejä, pro-apoptoottiset geenit ja p53 kohdegeenien osoitti suhteellisen korkea ilmentyminen. Cockaynen oireyhtymä B-ryhmän fibroblasteissa (CS-B), jotka ovat viallisia transkriptiosta kytketty korjaus (TCR), osoitti RNA-synteesin talteenotto profiili kuin normaalien fibroblastien viittaa siihen, että TCR ei ole mukana korjaus tai RNA-synteesin toipuminen transcription- esto tOP1 vaurioita. Nämä havainnot vaikutuksista kampotekiini transkriptioon vaikuttavat merkittävästi sen syöpälääkkeen toimintaa ja voi auttaa suunnittelussa parannetun kombinatorisista hoitoja, joihin TOP1 myrkkyjä.

Citation: Veloso A, Biewen B, Paulsen MT, Berg N, Carmo de Andrade Lima L, Prasad J, et al. (2013) Genome Wide Transcriptional vaikutukset syöpälääkkeen Camptothecin. PLoS ONE 8 (10): e78190. doi: 10,1371 /journal.pone.0078190

Editor: Didier Auboeuf, INSERM, Ranska

vastaanotettu: 5. kesäkuuta, 2013 Hyväksytty: 02 syyskuu 2013; Julkaistu: 23 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Veloso ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat varoja National Institute of Environmental Sciences (1R21ES020946) ja National Human Genome Research Institute (1R01HG006786). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

DNA topoisomeraasi I: n (tOP1) rentouttaa vääntö- jännitys, joka syntyy DNA heliksin seurauksena replikaation, transkription ja kromatiinin remodeling [1,2]. TOP1 välittämä reaktio käsittää kovalenttisten sitoutumalla DNA pilkkoutuminen yksi osa DNA heliksin seuraa läpimenoa toisen juosteen katkoksen läpi ja lopuksi uudelleensuljettava DNA lohkon murtuma. Anti-syöpälääke kamptotekiinin estää spesifisesti TOP1 [3] toimimalla ennen uudelleen sulkemisen vaiheessa, näin tehokkaasti sulkee TOP1 kovalenttisesti sitoutunut DNA: n ”katkaistavissa monimutkainen”. Kamptotesiini ja muut TOP1 myrkkyjä käytetään munasarjojen, kohdunkaulan, paksusuolen, haiman, keuhko-, rinta-, eturauhas- ja aivojen syövät [4]. Syövän vastaista aktiivisuutta kamptotesiinin liittyy replikaation-proteiinien välittämässä toksisuudessa [5]. Inhiboivaa vaikutusta kamptotesiinin transkriptioon on tunnustettu myös edistää myrkyllisyyttä ei-jakautuvia soluja, [6,7].

Osoitimme aikaisemmin, että kamptotesiini-stabiloitu TOP1-DNA-kompleksit hidastamaan venymä, mutta ei transkription [8]. Itse asiassa havaitsimme lisääntynyt käyttöaste RNA-polymeraasi II: n promoottorialueen

DHFR

geeni korreloivat korotettuun transkription [8]. Vastauksena transkription venymä tukos, TOP1 on suunnattu hajoamiselle ubikitiinin riippuvaisella tavalla [9] ja sen jälkeen jäljellä oleva DNA-sitoutuneen aminohappotähteet voivat vaatia toiminnan tyrosyyli-DNA fosfodiesteraasin 1 (TDP1) niiden poistamiseksi, jotta transkription venymään jatkaa [10]. Tukos transkription konetta TOP1 komplekseja loukkuun DNA camptothecin on osoitettu johtavan induktioon DNA kaksinkertainen katkeamisen [6] ja muodostumista DNA-RNA-hybridiä rakenteet (R-silmukoita) aktivoimalla stressiä kinaasi ATM [7 , 11]. Lisäksi tämä transkription stressi johtaa aktivoinnin p53 vastereitissä [12-15] ja induktio 53BP1-välitteisen DNA: n vaurioiden käsittely [16]. Top2 ja PARP1 pelata päällekkäisiä rooleja TOP1 ei-jakautuvien solujen viittaa siihen, että yhdistelmä TOP1, top2 ja PARP kohdistamisen lääkkeet saattavat olla tehokkaita kuin jakamalla tuumorisoluissa [15].

jälkeen camptothecin peruutuksen topoisomeraasi reaktio on valmis ja transkription komplekseja uskotaan jatkaa venymään. Mielenkiintoista, me aiemmin havaittu, että elpyminen RNA-synteesin päässä

DHFR

geeni CHO soluissa camptothecin poiston uudelleen kuin aalto on 5′-3 ’-suunnassa ilman näkyviä elpymisen alavirtaan geenin [8] . Tämä viittaa siihen, että transkription komplekseja estetty jääneen TOP1 kompleksit eivät pysty jatkamaan venymään seuraavan kamptotesiini kääntyminen [8]. Cockayne komplementaatioryhmässä B-proteiini (CSB) vialliset transkriptio kytketty korjaus (TCR) on ehdotettu olevan mukana korjaukseen kovalenttisesti DNA-sidottu TOP1 [17]. Ehdotettiin, että tämä oli kytketty hitaamman elpymisen kokonais-RNA synteesiä CS-B-solujen korreloivat yliherkkiä kamptotesiiniin altistus [15,17,18]. Kuitenkin muut tutkimukset ovat osoittaneet mitään vikaa RNA-synteesiä toipuminen CSB Knockdown [16].

analysoimiseksi suora vaikutus kampotekiini transkriptioon genominlaajuisten ja tutkia transkriptio toipuminen lääkkeen poistamiseksi, käytimme äskettäin kehittäneet Bru-Seq menetelmä [19]. Tämä tekniikka perustuu metabolinen leimaus RNA käyttäen bromouridine (Bru), jota seuraa erityinen eristäminen Bru-leimatun syntyvä RNA, kirjasto valmistelu ja syvä sekvensointi [19]. Tuloksemme osoittavat, että TOP1 estäjä kamptotesiini aiheuttaa etuoikeutettu eston ilmentymisen suuria geenien kautta tukos transkription pidentymisen yhdistettynä puute elpymistä synteesiä RNA polymeraasit estetty kehossa geenien. Lisäksi löysimme mitään vikaa RNA-synteesiä elpyminen CS-B-soluissa camptothecin kääntyminen, mikä viittaa siihen, että TCR ei voida vaatia hyödynnettäväksi seuraavista topo I inhibitio kääntyminen.

Materiaalit ja menetelmät

Cell linjat kampotesiinilla hoito ja Bru-Seq

hTERT ikuisti diploidinen ihmisen esinahan fibroblasteja (lahjoitus tri Mary Davis, Department of Radiation Oncology, University of Michigan) ja CS-B fibroblasteja (GM00739, Coriell Cell Repository) olivat kasvatetaan yksikerrosviljelminä MEM mukana 10% naudan sikiön seerumia ja antibiootteja (Invitrogen). Soluja käsiteltiin 45 minuutin ajan 20 uM kamptotesiinin (Sigma) ja leimattiin 15 min 2 mM bromouridine joko viime 15 min kamptotesiinin hoitoa tai sen jälkeen huuhtoutumisen. Bru-sekvenssi ja BruChase-sekvenssi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [19]. Lyhyesti, kokonais-RNA eristetään solusta näytteistä käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen), jota seurasi erityisiä eristäminen Bru-leimattua RNA: sta käyttäen anti-BrdU-vasta-aineita (BD Biosciences) konjugoitu magneettihelmiin (Dynabeads, vuohen anti-hiiri-lgG, Invitrogen) . Eristetty RNA muunnetaan sitten DNA: lle spesifisiä kirjaston käyttäen Illumina TruSeq Kit (Illumina) kuten aiemmin on kuvattu [19].

Illumina Hi-Seq sekvensointi ja tietojen analysointi

sekvensointi cDNA-kirjastojen suorittaa henkilökunta University of Michigan Sequencing Core käyttäen Illumina HiSeq 2000 sekvensserin. Base kutsuvan suoritettiin käyttäen Illumina Casava v1.8.2. ja lukea kartoitus tehtiin käyttämällä Tophat hyväksyen lukee vain joka voitaisiin kuvata yksilöllisesti genomiin. Laskimme RPKM arvot Bru-Seq data ja piirretty dataa erikoisvalmisteinen selain kuten aikaisemmin on kuvattu [19].

Tietojen saatavuus

Primaariaineisto analyyseissa on talletettu NCBI Gene Expression Omnibus ja on vapaasti käytettävissä. Olemme ladannut alkuperäisen genomin kartoitus BAM tiedostoja ja johdetut synteesi luettelot BED tiedostoja. Hakunumerolla on GSE48678 ja täydellinen linkki on https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE48678.

Tulokset

Camptothecin inhiboi ensisijaisesti RNA-synteesin suurten geenien

haastoi ihmisen fibroblastit 45 minuuttia 20 uM camptothecin ja leimattu RNA 2 mM Bru viimeiset 15 min läsnä ollessa kamptotesiini. Sekvensointi lukee orastavan Bru sisältävä RNA kartoittaa koko geenejä kattaa sekä eksonit ja intronit ja suhteelliset nopeudet transkription määritettiin kaikkien geenien summaamalla numero lukee koko geenejä ja jakamalla se pituus geenin. Luetut tiheys ilmaistiin ”lukee promillea emäsparin miljoonasosaa lukee” (RPKM). Näyte tilastoja löytyy taulukosta S1. Kamptotesiini hoito esti transkription määrien 1142 geenien yli 2-kertainen ja lisäävät transkriptiota 919 geenien yli 2-kertainen (kuviot 1 A ja B, kuvio S1, S2 File S1 ja taulukko S2). Onko geenit todettiin nousseen suhteelliset nopeudet transkription ovat todella syntetisoidaan absoluuttisessa korkeampi määrä ei määräydy koska tiedot tuotetaan Bru-Seq edustaa jakelua lukee kuin absoluuttisia ilme arvoja. Siksi, kun synteesi vähenee kehossa suuren geenien sekvensointi lukee on kerättävä muualla (eli pieni geenien ja alussa suuri geenejä).

Ihmisen fibroblasteja käsiteltiin 20 uM kamptotesiinin 45 min 2 mM Bru lisätty viimeisten 15 min camptothecin hoidon etiketti orastavan RNA seurasi Bru-Seq. (A), Long geenejä, kuten

TRIO

, näyttelytila ​​venymä vikoja, mutta ei transkription aloitusta, kun camptothecin hoidon. (B), Short geenejä, kuten

BAMBI

, osoittavat suhteellinen kasvu RNA-synteesin jälkeen, kamptotesiini hoitoon. (C), vaikutus kamptotesiinin suhteellisesta transkription funktiona geenin koosta. Suhde Bru-Seq signaalin yksittäisten geenien kamptotekiini-käsiteltyjen haltuunsa solujen funktiona geenin koosta. Pidemmät geenit estyvät ensisijaisesti lyhyillä geenejä. (D), mediaani pituus geenien aiheuttama 2-kertaisesti kamptotesiini (919 geenit) on 8927 bp, kun taas geenien alassäädetty 2-kertainen (1145 geenit) on mediaani pituus 136355 bp. Geeni kartoilla on RefSeq Genes (UCSC genomi-selaimella).

Tiedot osoittavat ilmeinen negatiivinen korrelaatio luku- intensiteetti ja geenin koko seuraava camptothecin hoidon (kuvio 1 C). Mediaani koko geenien, joissa on enemmän kuin 2-kertainen laski suhteessa transkription hinnat oli 107089 bp. (Kuva 1 D). Mediaani genomista koon 919 geenien osoittaa lisääntynyt suhteellinen transkriptionopeuksien seuraavat camptothecin hoito oli 7748 emäsparia. Nämä havainnot ovat sopusoinnussa vaikutusmekanismi jolloin camptothecin estää transkription pidennykseen estämällä transkription aloitus- [8].

Camptothecin vaikuttaa transkription lopetus ja ilmaus ncRNA ja tehostajana RNA (Erna) B

Monille Lyhyen geenejä, joissa ei estoa pidentymisen oli ilmeinen seuraava camptothecin hoidon, transkriptio lukea läpi ohi selityksin 3 ’ poly (A) päällä oli merkittävä (kuvio 2A, kuvio S3 File S1). Tämä data tukee roolia topoisomeraasi I transkription lopetukseen näiden geenien [20]. Vaihtoehtoisesti lisääntynyt määrä lukee pidemmälle selityksin terminaatiokohtia voi johtua induktio vaihtoehtoisten poly (A) sivustot seuraavat kamptotesiiniä hoitoon tai stabilointi RNA ohi 3’-katkaisukohta. Monet geenit nisäkässoluissa on osoitettu tuottaa erilaisia ​​promoottorin kopioita (ohjeita) [19,21]. Ilmaisu Joidenkin kysyy dramaattisesti parantaa camptothecin käsittely (kuvio 2B, kuvio S4 A-C File S1). Lisäksi monet hajaantu- puhtaaksi geenit osoittivat koordinoida aloittamista lisälaite, mikä viittaa siihen, että negatiivinen superkierteisyyden odotetaan kertyvän vanavedessä transkription puuttuessa topoisomeraasi I toiminta voi parantaa transkription aloitus- (kuva S4 D-F). Lopuksi camptothecin hoito johtavat tuotanto on enemmän tehostajana RNA (Erna) monista tunnetuista ja otaksuttu tehostuselementtejä, kuten 5 ”

FOS

tehostajana (kuvio 2C, kuvio S5 File S1). Toiminnallinen seurauksena parannetun sukupolven Erna seuraavista camptothecin hoitoa ei ole selvä, koska suhteellinen transkriptio määrä

FOS

geeni ei nostettu noususta huolimatta Erna sukupolvi. Estämisen lisäksi venymään proteiinia koodaavan geenien, kamptotesiini inhiboi transkriptiota venymä ensisijaisen mikroRNA transkriptien (kuvio 2D) ja parannettu tai tukahdutettu pitkän ei-koodaavat RNA: t (lncRNAs) (kuvio 2E F).

kuviossa 1, ihmisen fibroblasteja käsiteltiin 20 uM kamptotesiinin 45 min 2 mM Bru lisättiin viimeisten 15 min kamptotesiinin hoidon merkitä syntyvä RNA, jota seuraa Bru-Seq. (A), transkription läpikirjoittautumisesta päättymisestä sivustolla

RHOB

geenin aiheuttama camptothecin. (B), Enhanced aloittaminen

ASCC3

geeni ja päällekkäisiä säätelyä eriävät alkupään PROMPT RNA. (C), Enhanced ilmentyminen Erna 5′-ylävirran tehostaja

FOS

mukaan kamptotesiini. (D), Kamptotesiini inhiboi transkriptiota ensisijaisen transkriptio miRNA138-1. (E), Kamptotesiini indusoi transkriptiota ncRNA MALAT1. (F), Camptothecin estää transkription hyvin pitkä annotoimaton ncRNA kromosomissa 2. geeni kartoilla on RefSeq Genes (UCSC genomi-selaimella).

transkriptio toipuu kuin aalto alkaen 5′ seuraavat camptothecin poisto

ansastusta topoisomeraasi I DNA by camptothecin ajatellaan olevan osittain palautuva tapahtuma [2]. Tutkia, onko poistaminen camptothecin kääntää sen vaikutuksista transkriptioon, käytimme Bru-Seq tutkia syntymässä RNA transcriptome soluissa seuraavissa huumeiden huuhtoutumiskauden. Saada yhteenlaskettu kuvan vaikutuksesta kampotekiini syntyvillä RNA synteesi useita geenejä, valitsimme erittäin ilmentyvien geenien (RPKM yli 1) ja pidempi kuin 100 kb ja linjassa heille heidän transkription aloituspaikkoja. Huomasimme, että camptothecin indusoi voimakkaan signaalin yläpuolella ohjaus ensimmäisten 10 kb geenien seurasi vakava lasku signaalin alla ohjaus jatkojalostustuotteisiin (kuvio 3A). Nämä tulokset viittaavat siihen, että esto ja pyydystäminen topoisomeraasi I camptothecin ei estä transkription mutta estää voimakkaasti venymään. Kun camptothecin pestiin pois ja solut leimattiin bromouridine 15 min puuttuessa huumeiden, elpyminen transkription levisi 5′-pää geeniin kun mikään elpymistä signaalia havaittiin jatkojalostustuotteisiin geenissä. Sen jälkeen huuhtoutuminen lääkkeen ja inkuboimalla 15 minuuttia huumeeton media ja sitten merkintöjä orastava RNA seuraavien 15 minuuttia, transkriptio aalto siirtyi syvemmälle geenin 3′-suunnassa. Jälleen ei elpyminen signaalia havaittiin edelleen alavirtaan geenistä. Mielenkiintoista, nopeus, jolla transkriptio aalto leviää 5′-päähän ja kehoon geenien oli noin 1,1-1,3 kb /min (Kuva 3, Kuva S6 File S1). Tämä on hitaampi kuin arvioitu venymä noin 2 kb /min soluissa normaaliolosuhteissa [22]. Jos pitenevä RNA polymeraasien törmäävät loukkuun topoisomeraaseista, peruuttamaton DNA vaurioita voidaan aiheuttaa, että vaatisi jatkokäsittelyä [6]. On mahdollista, että tämä alennettu pidennysluvun havaittu camptothecin hoidon ja huuhtoutumisen johtuu vaatimus TOP1 /camptothecin aiheuttaman DNA-vaurion korjaamiseen tapahduttava ennen venymä voi jatkua.

(A), yhteenlaskettu näkymä RNA-synteesin geenien yli 100 kb normaalissa ihmisen fibroblastien geenien linjassa transkription aloituspaikat (TSS). RNA-synteesin toipuu kuin aalto on 5′-to-3 ’suunnassa seuraava camptothecin poiston ilman näkyviä elpymisen RNA polymeraasien pysähtynyt elimistössä geenien. Elongaationopeutta on toipumassa transkription aalto arvioitiin ~ 1,2 kb /min. (B), Wave elpymisen RNA-synteesin voidaan nähdä etenee 5’-päähän

CD44

geeni ilman näkyvää elpymistä kehossa geenin. Edessä transkription aalto laajennettu noin 35 kb ensimmäisten 30 min elpymisen seurauksena venymä noin 1,2 kb /min. (C) Samanlaisia ​​elongaationopeutta jälkeen camptothecin poistamisen löydettiin

MEISE1

geeni. Väri avain:

Sininen

, ohjaus (30 min Bru merkinnät);

Yellow

, Bru merkintöjä viime 15 min 45 min camptothecin hoito;

Green

, 45 min camptothecin käsittely ja sen jälkeen lääkkeen huuhtoutumisen ja 15 min Bru merkinnät;

punainen

, 45 min camptothecin käsittely ja sen jälkeen lääkkeen huuhtoutumiskauden 15 min inkubaation ja lopuksi 15 min Bru merkintöjä.

Ei näkyviä vikoja talteenotto RNA synteesin CS- B-solut seuraavat kamptotesiini kääntyminen

solut, jotka ovat peräisin cockaynen oireyhtymä potilaat ovat yliherkkiä kamptotesiini [18]. Tämä yliherkkyys liittyy tehostettu induktioon kaksijuosteisen katkoksia S-vaiheessa toisinnekohteina haarukat ”törmäävät” kanssa loukkuun TOP1 komplekseja [18]. Jotkut tutkimukset ovat myös osoittaneet, että elpyminen RNA-synteesin on hitaampaa CS soluissa [15,17,18] kun taas muut tutkimukset ovat löytäneet mitään vikaa RNA-synteesin hyödyntäminen [16]. Käyttämällä Bru-Seq testasimme onko elpyminen muodostuvien RNA-synteesin in CS-B fibroblastit seuraavat camptothecin hoidon ja kääntyminen poikkesivat elpymisen normaaleissa ihmisen fibroblasteissa. Analyysi yhteenlaskettu transkription signaalin geenien vähintään 100 kb tai pitempään osoitti, että CS-B-solut talteen RNA-synteesiä aalto 5′-päähän näiden geenien samalla tavalla kuin normaalien fibroblastien (kuvio 4A). Tämä näkyi myös yksittäisten geenien (kuvio 4B

Yellow

, transkriptio lukee soluista merkitty Bru viime 15 min 45 min hoidon camptothecin;

Green

, transkriptio lukee soluista merkitty 15 min Bru jälkeen wash-out camptothecin jälkeen 45 min hoito;

punainen

, transkriptio lukee soluista merkitty Bru 15 minuutin kuluttua lääkkeen huuhtoutumisen jälkeen 45 min hoito. Kuva S7. Vaikutus camptothecin kääntyminen RNA-synteesin in CS-B fibroblasteissa. Recovery RNA-synteesin havaitaan aalto on 5 ’3’ -suunnassa seuraavaa camptothecin poiston ilman näkyviä elpymisen RNA polymeraasien pysähtynyt elimistössä geenien varten (A)

TOP1

, (B)

Smad3

ja (C)

TLE4

geenejä. Väri avain:

Sininen

, transkriptio lukee ohjaus soluissa;

Yellow

, transkriptio lukee soluista merkitty Bru viime 15 min 45 min hoidon camptothecin;

Green

, transkriptio lukee soluista merkitty 15 min Bru jälkeen wash-out camptothecin jälkeen 45 min hoito;

punainen

, transkriptio lukee soluista merkitty Bru 15 minuutin kuluttua lääkkeen huuhtoutumisen jälkeen 45 min hoito. Kuva S8. Vaikutus kamptotesiinin on geenien ilmentymistä on esitetty kuviossa 7 CS-B-soluja. (A), iso esikasvaintekijät estyy camptothecin ja näkyvissä mitään /hidas elpyminen seuraavan lääkkeen poistamiseksi.

GLI2

geeni ei vaikuttanut camptothecin käsittely CS-B-solujen. (B), p53: n kohdegeenien, jossa vain osa indusoitiin CS-B-soluissa kamptotesiini hoitoon. (C) esimerkkejä suuri anti-apoptoottiset geenit osoittavat pienenee suhteessa transkription (leftt) ja esimerkkejä pienistä pro-apoptoottisia geenejä, joissa on näkyvissä parannettu suhteellinen transkription CS-B-soluissa kamptotesiini hoidon (oikealla).