PLoS ONE: tunnistaminen CD24 kuin Cancer Stem Cell Marker Human Nenänielun Carcinoma
tiivistelmä
Syöpä kantasolut (CSCS) ovat ainutlaatuinen väestöryhmästä syöpäsolujen kyky aloittaa kasvaimen kasvua ja ylläpitää itseuudistumisen. Vaikka CSC biomarkkerit on kuvattu erilaisten kasvainten, vain muutamia markkereita on tunnistettu nenänielusyöpä (NPC). Tässä tutkimuksessa osoitamme, että CD24
+ soluja eristettiin ihmisen NPC solulinjoista ilmentävät kantasolu geenejä (
Sox2
,
Oct4
,
Nanog
,
BMI-1
, ja
Rex-1
), ja näyttää aktivointi Wnt /β-kateniinin signalointireitin. CD24
+ soluilla tyypillisiä CSC ominaisuuksia, jotka sisältävät solujen lisääntymisen tehostuneen, lisääntynyt pesäkkeiden ja pallo muodostumista, ylläpito solujen erilaistumisen potentiaalin pitkäaikainen kulttuurin ja parannettu vastustuskyky kemoterapeuttisia lääkkeitä. Erityisesti CD24
+ solut tuottavat kasvaimet istuttamisen jälkeen niin vähän kuin 500 solua immuunivajaissa NOD /SCID-hiiriin. CD24
+ solujen edelleen osoittavat lisääntynyt hyökkäys kyky
in vitro
, joka korreloi parannetun ilmaisun matriksimetalloproteinaasi 2 ja 9. Yhteenvetona tulokset viittaavat siihen, että CD24 edustaa uutta CSC biomarkkereiden NPC.
Citation: Yang CH, Wang HL, Lin YS, Kumar KPS, Lin HC, Chang CJ, et al. (2014) tunnistaminen CD24 kuin Cancer Stem Cell Marker Human nenänielusyöpä. PLoS ONE 9 (6): e99412. doi: 10,1371 /journal.pone.0099412
Editor: Masaharu Seno, Okayama yliopistossa Japanissa
vastaanotettu: 04 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 14 toukokuu 2014; Julkaistu: 23 kesäkuu 2014
Copyright: © 2014 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia NSC101-2325-B-182-005 ja NSC101-2320-B-030-011 National Science neuvoston Taiwan, ja myöntää CMRPD1B0052 Chang Gung Memorial Hospital (Linkou, Taiwan). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
NPC ilmaantuvuus vaihtelevat ympäri maailmaa, mutta ovat korkeimpia Kaakkois-Aasiassa, etenkin Kiinan Guangdongin maakunnassa sekä Hongkongissa ja Taiwanissa [1]. Intermediate NPC esiintyvyys havaitaan maissa Välimeren alueen sekä Grönlannin ja Alaskan, vaikka alhainen esiintyvyys on useimmissa länsimaissa [2]. Taiwanissa, ilmaantuvuus naisilla ja miehillä vuonna 2007 oli 2,93 ja 8,41 tapausta 100000 yksilöitä, vastaavasti [3]. NPC yleensä näkyy suhteellisen suuri herkkyys säteilylle, ja sädehoidon siis edelleen suuret hoidon alkuvaiheen NPC [4], [5]. Vaikka yhdistelmä sädehoidon ja kemoterapia on parantanut hoitotuloksia potilaille myöhäisvaiheen NPC, syövän uusiutumiseen silti esiintyy usein [6].
tunnistaminen ja luonnehdinta kasvaimen aloittamista soluja, joita kutsutaan myös syövän kantasolut (CSCS ), on paljastanut solumekanismeja jotka voisivat selittää vastareaktioita hoitoon ja lepotilassa käyttäytyminen monien kasvainten [7]. Esisolulla hypoteesi syövän kehityksen viittaa siihen, että vain pieni osa-populaatio solujen kasvain (jäljempänä CSCS) on varsi kaltaisia ominaisuuksia ja kyky aloittaa uusia kasvaimia [8]. CSCS voi paitsi aloittaa ensisijainen kasvaimia, mutta voi myös olla vastuussa uusiutumisen hoidon jälkeen, ilmiö, joka saattaa johtua kyky uusiutua ja luontainen kemo- ja radio-vastus näiden solujen [9]. CSCS on tunnistettu ja eristetty eri kasvaimia käyttämällä erityisiä solunpintamarkkereiden, mukaan lukien CD44 pään ja kaulan alueen syöpä [10], CD133 eturauhasen syöpä [11], CD90 maksan kasvain [12], CD24 munasarjasyöpä [13], CD133 varten aivokasvain [14], CD44
+ CD24
– /matala rintasyövän [15], ja CD133 keuhkosyövän [16].
Vaikka erityisiä biomarkkerit on käytetty eristämään CSCS, kunkin kasvaimen osoittaa spesifisten solun pinnan merkkiaineiden [17]. Eristää mahdollisia alapopulaatioiden CSCS kasvaimia, jossa CSC biomarkkereiden ei ole vielä tunnistettu, tutkijat ovat käyttäneet kyky CSCS jättää väriaineet, Hoechst 33342 tai PKH26 [18] – [20]. Käyttämällä tätä menetelmää, sub-solupopulaatio näyttämään CSC ominaisuudet on tunnistettu NPC [21], [22]. Kuitenkin eristäminen NPC CSCS käyttämällä solun pinnan päättäjät ei ole voitu toistaiseksi, lukuun ottamatta CD44, joka tunnistettiin aiemmassa raportissa [23]. Esillä olevassa tutkimuksessa kuvaamme eristämisen väestöryhmästä of CD24
+ solujen kaksi NPC solulinjoista, ja osoittavat, että eristetyt solut ilmentävät kantasolujen geenimerkkejä. Eristetty CD24
+ soluilla tyypillisiä CSC ominaisuuksia, ja aloittaa kasvaimen kasvua ei-lihavilla diabeetikko /sekamuotoinen immuunipuutos (NOD /SCID) hiiriä alhaisella solujen määrä. Korkeampi miehityksen kyky ja lisääntynyt ilmentymä metalloproteinaasi 2 ja 9 (MMP2 ja MMP-9) havaittiin myös. Meidän havainnot viittaavat siihen, että CD24
+ solut edustavat CSC biomarkkereiden ihmisen NPC. Nämä havainnot voivat johtaa kehittää uusia hoitostrategioita kohdistaa NPC CSCS ihmispotilaille.
Tulokset
eristäminen väestöryhmästä of CD24
+ soluja NPC solulinjoista
luonnehtia solujen erityisiä solunpintamarkkereiden, analysoimme useat NPC solulinjoissa käyttämällä virtaussytometria ja monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat solun pinnan biomarkkereita. Me määritettiin solujen prosenttiosuus kätkeminen yksi 12 pinnan spesifisiä markkereita kantasolujen [24], [25], tai syöpäsolujen [26] (taulukko 1). CD24 löytyi 12,03% viljeltyjen TW02 solujen ja 5,45%: TW04 solujen, kun taas havaittiin, on alhaisempi solujen muiden NPC solulinjat testattiin (taulukko 1 ja kuvio 1). Prosenttiosuus -solut muiden 12 markkereita on erittäin epätasaista, ja arvot vaihtelevat 0-99,99% (taulukko 1). Yhdenmukaisesti aikaisemman tutkimuksen, jossa CD44 tunnistettiin CSC biomarkkerina NPC [23], tuloksemme osoittivat, että suurin osa CD24
+ solut olivat myös CD44 + (kuvio 1). Siksi keskittäneet huomiomme CD24
+ solujen mahdollisina CSC ehdokkaita.
Virtaussytometrianalyysi of CD24
+ ja CD44
+ alapopulaatioiden TW02 ja TW04 soluja. 1 x 10
6 syövän solut kerättiin ja värjättiin anti-ihmisen CD24-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) ja /tai anti-ihmis-CD44 fykoerytriini (PE) vasta-aineita. Isotyyppiyhteensovitettu ihmisen vasta toimi kontrollina.
Expression kantasolujen geenien ja aktivoitumisen Wnt /β-kateniinin väylän CD24
+ solujen
ovatko CD24
+ soluja on luontainen kantasolujen ominaisuuksia, olemme analysoineet ilmaus viiden alkion kantasolujen geenejä (
Sox2
[27],
Oct4
[28] – [30]
Nanog
[31],
BMI-1
[32], ja
Rex-1
[33]) vuonna TW02 ja TW04 solulinjoja, joita käytettiin edustavia NPC-soluja. Kuten kuviossa 2A, CD24
+ soluja jatkuvasti ilmaissut korkeampi viiden kantasolujen geenejä kuin vanhempien tai CD24
– soluja.
(A) mRNA: n ilmentymisen tasot
Sox2
,
Oct4
,
Nanog
,
BMI-1
ja
Rex-1
vanhempien, CD24
+ ja CD24
– soluja NPC solulinjat, TW02 (vasemmalla) ja TW04 (oikealla), arvioitiin käyttämällä kvantitatiivista RT-PCR-analyysillä. Esitetyt tulokset edusti keskimäärin kolmen erillisen kokeen. *:
p
0,05, **:
p
0,01. (B) Western-blotit analyysi fosforyloitua-GSK, GSK, fosforyloitu-β-kateniinin, β-kateniinin ja β-aktiini in kokosolulysaateista, ja β-kateniinin ja lamiinivektori B1 ydin- murto vanhempien, CD24
+ ja CD24
– soluja eristetään TW02 ja TW04 solulinjat. Kvantitatiivinen tulos laskettiin ImageJ ohjelmisto. *:
p
0,05, **:
p
0,01, ***:
p
0,001.
Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että aktivoituminen Wnt /β-kateniinin signalointireitin on ratkaiseva ylläpitämiseksi CSCS leukemiassa [34], rintasyövän [35], melanooma [36], suolen kasvainten [37], ja maksasyöpä [ ,,,0],38]. Tämä solu polku myös säätelee itseuudistumisen, lisääntymistä ja erilaistumista syövän kantasolujen kaltaisia soluja mahasyövän [39]. Lisäksi kun Wnt koulutusjakson, β-kateniinin on keskeinen rooli säätelyssä invaasiota ja etäpesäkkeiden lukuisia kasvaimia [40]. Meillä on siis tutkinut tilan Wnt /β-kateniinin väylän eristetyssä CD24
+ soluja. Tasot fosforyloitua β-kateniinin vähensi merkittävästi sytosolissa CD24
+ soluja, verrattuna vanhempien tai CD24
– soluja (kuvio 2B). Lisäksi tasot fosforyloitua glykogeenisyntaasikinaasi 3β (p-GSK-3β), joka toimii negatiivisena säätelijänä β-kateniinin, olivat korkeampia CD24
+ solut. Samanaikaisesti kohonnut β-kateniinin havaittiin ydin- murto CD24
+ soluja (kuvio 2B), mikä viittaa siihen, että Wnt /β-kateniinin signalointireitin aktivoituu näissä soluissa.
Tehostettu lisääntymistä ja klooni /pallo muodostumista CD24
+ solujen
mitattuna leviämisen määrä CD24
+ soluja viljeltiin täydellisessä DMEM. Verrattuna vanhempien ja CD24
– soluja, CD24
+ soluista osoitti parannettu leviämisen, joka alkaa 5
päivänä Kulttuurin TW02 soluja ja 7
th päivä TW04 solujen kanssa kaksinkertaistaa kertaa noin 42 h, 42 h, 30 h vanhempien TW02, CD24- ja CD24 + soluja, vastaavasti, ja 40 h, 40 h ja 28 h vanhempien TW04, CD24- ja CD24 + soluja (kuvio 3A). Klooni muodostuminen tehokkuus (TAE) ja CD24
+ soluja määritettiin myös. Kun 10 päivän viljelyn jolloin useimmat kloonit saattavat sisältää yli 50 solua, lasketut CFE arvot TW02 solut olivat 15,1%, 80,8% ja 12,2% vanhempien, CD24
+ ja CD24
– soluja, vastaavasti. Sillä TW04 solut, CFE-arvot 20,2%, 90,3% ja 13,0% saatiin vanhempien, CD24
+ ja CD24
– soluja, vastaavasti (kuvio 3B). Muodostumista pallomaisten soluaggregaatteja (tai yksinkertaisesti spheres), joka on osoitus itseuudistumisen kyky, analysoitiin edelleen viljelemällä soluja ei-tarttuva olosuhteissa koostuu seerumitonta DMEM, joka sisälsi vain epiteelisolujen kasvutekijä (EGF) ja perus-fibroblasti kasvutekijä (bFGF). Kun 30 päivän viljelyn CD24
+ solut osoittivat eniten palloja saavuttaen halkaisijat välillä 100 ja 200 pm, kun taas vanhempien solut ja CD24
– solut muodostivat merkittävästi vähemmän palloja, joiden halkaisijat alle 100 um (kuvio 3C ). Nämä tulokset osoittavat, että CD24
+ solut osoittavat parantaa proliferaatiota ja kyky muodostaa klooneja /palloja.
(A) Solujen lisääntyminen käyrät vanhempien, CD24
+ ja CD24
– soluja TW02 (vasemmalla) ja TW04 (oikealla) NPC solulinjoja viljellään täydellisessä DMEM 9 päivää. Tulokset esitetään edustavat keskiarvoa kolmen erillisen kokeen. *:
p
0,05, **:
p
0,01, ***:
p
0,001. (B) Klooni muodostumisen tehokkuutta vanhempien, CD24
+ ja CD24
– soluja, ja kvantifiointi analyysi. *:
p
0,05. (C) Sphere muodostuminen kyky vanhempien, CD24
+ ja CD24
– soluja viljeltiin DMEM täydennetty 20 ng /ml bFGF ja 20 ng /ml EGF 30 päivää. (D) vaikutus Wnt estäjän pallo muodostumista CD24
+ solujen TW02 ja TW04 soluja. CD24
+ soluja käsiteltiin tai ei Wnt estäjän ICG-001 (10 uM) seitsemän päivää ennen alalla käytössään muodostumisen analyysi. Mittaviivat: 100 pm.
tutki myös vaikutukset Wnt estäjän ICG-001 on alalla muodostumiseen kykyä CD24
+ soluja. Käsittelyn jälkeen Wnt estäjän 7 päivää (10 uM), pallo koko oli huomattavasti vähentynyt keskimäärin 20% ja 45% TW02 ja TW04 soluja, vastaavasti (kuvio 3D), mikä viittaa siihen, että Wnt reitti voi edistää CSC fenotyyppiä CD24
+ solut.
pitkäaikainen erilaistumisen potentiaalin CD24
+ solujen
pitkäaikainen kulttuuri CSCS voi lisätä solujen massaa, mutta myös tehdään epäsymmetrinen jako tuottaa matalan tuumorigeenistä solupopulaation kanssa heterogeeninen fenotyypit [9]. Voit seurata solujen erilaistumisen potentiaalin CD24
+ soluja, analysoitiin 10 päivän vanhoja viljelmiä CD24
+ ja CD24
– soluja virtaussytometrialla. Kasvatuksen jälkeen TW02 soluja 10 päivää, 11,56% of CD24
+ solut pysyivät CD24
+, kun taas 0,14% soluista, jotka olivat aluksi CD24
– ilmaisi CD24 viljelyn jälkeen (kuvio 4A). Samalla tavalla, seuraamalla viljelmä TW04 soluja, 5,64% ja CD24
+ solut pysyivät CD24
+, kun taas 0,03% soluista, jotka olivat CD24
– alun perin olivat CD24
+ viljelyn jälkeen (kuvio 4B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CD24
+ solut näyttävät solujen erilaistumisen potentiaalin pitkittyneen kulttuurin, vaikka erilaistumista prosessi voi olla vain osittainen näissä olosuhteissa.
(A) Kymmenen päivän ikäisiä solumassoihin alunperin viljeltiin CD24
+ ja CD24
– soluviljelmien DMEM kerättiin ja värjättiin anti-ihmisen CD24-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) vasta-aine, jota seurasi virtaussytometria-analyysi. Prosenttiosuudet esitetään edustavat soluja, joilla on CD24
+ pintamarkkereiden joko (A) TW02 tai (B) TW04 solulinjat. Virtaussytometrianalyysi of TW02 ja TW04 solut heti sub-fraktioinnin (oikea paneeli).
CD24
+ solut osoittavat parannettu kestävyys kemoterapeuttisten
Korkea vastustuskyky kemoterapeuttisia lääkkeitä edustaa kriittinen ominaisuus CSCS [9]. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että CSCS voidaan sulkea pois DNA-sitovan väriaine, Hoechst 33342, koska lisääntynyt ilmentyminen ABC transporter, ABCG2 [41], [42]. Sen määrittämiseksi, onko CD24
+ solujen sisällä Hoechst 33342 parempi kuin vanhempien tai CD24
– soluja, suoritimme väriaine syrjäytymisen määrityksen jälkeen käsittelemällä TW02 solut ABC transporter estäjä verapamiili [43]. Kuten on esitetty kuviossa 5A, on suurempi populaatio Hoechst 33342-negatiivisia soluja havaittiin CD24
+ soluja (12,9%) verrattuna CD24
– soluja (7,99%). Erityisesti verapamiili hoito kääntänyt eksluusio fenotyyppi havaittu CD24
+ soluja, vaikka tämä hoito ei ollut merkittävää vaikutusta CD24
– soluja (kuvio 5A). Samanlaisia tuloksia saatiin varten TW04 solulinjan (verapamiili ei tuottanut merkittävää vaikutusta tässä tapauksessa, koska lähes TW04 CD24
– soluja Hoechst 33342-negatiivinen). Nämä havainnot viittaavat siihen, että CD24
+ soluilla on lisääntynyt kyky sulkea väriainetta.
(A) Lajittele CD24
+ ja CD24
– soluja TW02 ja TW04 NPC solulinjoja käsiteltiin tai 50 uM verapamiilia 30 minuuttia ennen käsittelyä varten Hoechst 33342 eksluusio määrityksessä kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. (B) Vanhempien, CD24
+ ja CD24
– soluja TW02 tai TW04 solulinjoja käsiteltiin eri pitoisuuksilla sisplatiinin ja dosetakselin 24 h, ja solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTT-määritystä. CD24
+ solut osoittivat suurempi elinkelpoisuus kuin vanhempien ja CD24
– soluja hoidon jälkeen sisplatiinia tai doketakselia. Esitetyt tulokset edusti keskimäärin kolmen erillisen kokeen. *:
p
0,05, **:
p
0,01, ***:
p
0,001. IC
50-arvot sisplatiinin tai doketakselihoidon vastaan vanhempien, CD24
+ ja CD24
– soluja esitetty (C) TW02 ja (D) TW04 solujen linjat.
sen tutkimiseksi, onko CD24
+ solut näyttävät suurempi vastustuskyky kemoterapeuttisia lääkkeitä, käsittelimme solut sisplatiinia tai doketakselin, ja arvioitiin solujen elinkelpoisuus käyttäen MTT-määritystä. Sisplatiini ja doketakseli tuotti korkeampi sytotoksinen vaikutus vanhempien tai CD24
– soluja verrattuna CD24
+ soluissa (kuvio 5B,
p
0,01). Sillä TW02 solulinja, puoli maksimaalinen estävä pitoisuus (IC
50) sisplatiinin vastaan vanhempien, CD24
+ ja CD24
– soluja oli 1,84, 3,32, ja 1,66 ug /ml, vastaavasti, kun taas IC
50-arvot dosetakselia vastaan vanhempien, CD24
+ ja CD24
– soluja oli 4,23, 7,45, ja 3,53 ug /ml, vastaavasti (kuvio 5C). Sillä TW04 solulinja, sisplatiini tuotetaan IC
50-arvot 0,70, 2,45, ja 0,46 ug /ml vastaan vanhempien, CD24
+ ja CD24
– soluja, vastaavasti, kun taas IC
50 doketakselin oli 1,50, 3,93, ja 1,41 ug /ml vastaan vanhempien, CD24
+ ja CD24
– soluja, vastaavasti (kuvio 5D).
Havaitsimme myös, että proteiini tasot ABC transporter ABCG2 olivat 1,42 ja 2,12 kertaa suurempi CD24
+ soluissa kuin vanhempien ja CD24
– soluja, vastaavasti (kuvio 6A). Samoin TW04 soluissa, proteiini tasot ABCG2 vuonna CD24
+ solut 1,85 ja 3,56 kertaa suurempi kuin vanhempien ja CD24
– soluja, vastaavasti (kuvio 6A). Yhdenmukainen nämä tulokset, mRNA ekspressiotaso
ABCG2
oli suurempi CD24
+ soluissa kuin vanhempien tai CD24
– soluja (kuvio 6B). Nämä tulokset osoittavat, että CD24
+ solut osoittavat parannetun chemoresistance, ja että tämä fenotyyppi voi johtua ainakin osittain ilmentymisen tehostamiseksi ABCG2 transporter.
(A) Cellular ABCG2 proteiinin tasot vanhempien, CD24
+ ja CD24
– TW02 ja TW04 solut määritettiin Western blot -analyysillä. Kvantitatiivinen tulos laskettiin ImageJ ohjelmisto. *:
p
0,05, **:
p
0,01. (B) mRNA ilmentymisen taso ABCG2 vanhempien, CD24
+ ja CD24
– TW02 ja TW04 solut määritettiin kvantitatiivisen RT-PCR. Tulokset esitetään edustavat keskiarvoa kolmen erillisen kokeen. *:
p
0,05, **:
p
0,01.
Pieni määrä CD24
+ soluja riittää tuottamaan kasvaimia NOD /SCID-hiiriin
Testasimme Tuumorigeenisuustutkimuksissa CD24
+ solujen injektion jälkeen kainalon fossa immunopuutoksesta NOD /SCID-hiiriin. Kahdentoista viikon kuluttua injektion, kasvainten havaittiin hiirillä, jotka inokuloitiin joko 500 tai 1000 CD24
+ solut, mutta ei hiirissä, joita käsiteltiin 100 CD24
+ -soluista (kuvio 7A). Sitä vastoin ei havaittu kasvaimia ei havaittu hiirissä ympätty ≤1,000 solujen vanhempien tai CD24
– ryhmä (kuvio 7A ja 7B). Vastaavasti, ei ole kasvaimia ei havaittu hiirissä, jotka saivat PBS: ää negatiivisena kontrollina (kuvio 7A). Lisäksi histologista analyysiä kudosleikkeiden värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,01, ***:
p
0,001 (B) tasot MMP2 ja MMP-9 tuottama proteiini vanhempien, CD24
+, tai CD24
– soluja TW02 ja TW04 solulinjat kvantitoitiin Western blotting-analyysi. Kvantitatiivinen tulos laskettiin ImageJ ohjelmisto. *:
p
0,05. (C) mRNA ekspressiotasot MMP2 ja MMP-9 vanhempien, CD24
+ ja CD24
– solut määritettiin kvantitatiivisen RT-PCR: llä TW02 ja TW04 solulinjoissa. Tulokset esitetään merkitsevät keskimäärin kolmesta itsenäisestä kokeesta. *:
p
0,05, **:
p
0,01.
Keskustelu
tulokset Tämän tutkimuksen ehdottaa että CD24 edustaa uutta CSC pinta markkeri NPC. Ominaisuudet CD24
+ solujen alaryhmistä eristetty TW02 ja TW04 NPC solulinjoja ovat samanlaiset kuin aikaisemmin CSCS peräisin NPC [21] – [23]. Nämä ominaisuudet ovat lisääntynyt ilmentyminen liittyvien geenien kehittämiseen ja ylläpitoon kantasolujen, lisääntynyt itseuudistumisen ja ylläpito solujen erilaistumisen kapasiteetin pitkittyneen kulttuuri, lisääntynyt pallo muodostuminen kyky (myös havaittu CD24
+ soluja eristettiin NPC solulinjoista HK1 ja TW076; katso kuva S1), lisääntynyt Hoechst 33342 eksluusio ja chemoresistance, kasvanut kyky aloittaa kasvaimia immuunipuutteisilla hiirillä, ja parannettu soluinvaasiota.
solupintaproteiini, CD24, ilmentyy vahvasti monissa ihmisen syövät [13], [48], [49]. CD24 ilmentyy syöpäsoluissa vuorovaikutuksessa P-selektiinin löytyy endoteelisoluissa, mikä osoittaa, että CD24 voi sitoutua P-selektiinin ja aloittaa liikkuvan syöpäsolujen endoteeliin, joka voi seurata aloittamisen etäpesäkkeiden [47]. Lisäksi NPC-solut, CD24 liittyy CSCS muiden kasvainten, kuten munasarjojen [13] ja haimasyövän [48]. Esimerkiksi CD24
+ CD44
+ ESA
+ haimasyöpäsoluissa hallussaan CSC ominaisuuksia [48]. Äskettäin samanlainen havainto oli raportoitu munasarjasyövän CSCS; eli ksenograftin injektio 5000 CD24
+ solujen kasvaimia nude-hiirissä, kun taas injektio yhtä monta CD24
– soluja tehnyt niin [49]. Lisäksi CD24
+ syöpäsolun pesäkkeet eristettiin munasarjakasvaimia ihmispotilaan osoitti heterogeenisyys proliferaationopeus, solusyklin jakelu, ja ilmaisun profiilin geenien ja proteiinien, ja esitteli kantasolujen ominaisuuksia [49]. Lisäksi CD24
+ kantasolujen kaltaisia soluja havaittiin munasarjasyövän myös näytteillä parannettu chemoresistance [50]. Erityisesti rintasyövän, puuttuminen CD24 yhdistettynä läsnäolon CD44 ja EpCAM (CD24
-CD44
+ EpCAM
+) näyttää olevan kriittinen tunnistamiseksi rintojen CSCS [15]. Aikaisempi tutkimus on raportoitu, että CD44 edustaa CSC biomarkkereiden NPC [23]. Tämän mukaisesti havainnon, CD24
+ soluja, jotka me eristettyjen TW02 ja TW04 NPC solulinjat olivat enimmäkseen CD44
+ (kuvio 1 B). Lisäksi suurin osa CD24
+ solujen HK1 ja TW076 solulinjat olivat myös CD44
+ (kuvio S2). Sekä CD24 ja CD44 voi siten olla mukana muodostumiseen CSCS NPC, ja toiminta näiden proteiinien kehittämisessä ja ylläpidossa CSCS optio lisätutkimuksia.
Havaitsimme, että CD24
+ soluja eristettyjen TW02 ja TW04 NPC solulinjat ilmentävät korkeampia mRNA tasoja
Sox2
,
Oct-4
,
Nanog
,
BMI-1
, ja
Rex-1
, verrattuna vanhempien tai CD24
– soluja. Sama ilmiö on havaittu myös HK1 ja TW076 solulinjoissa (kuvio S3). Nämä ominaisuudet ovat samanlaisia, joita on raportoitu alkion kantasolujen [27] – [33] ja munasarjasyöpä kantasolujen kaltaisia soluja [51]. Tämä malli alkion kantasolujen geenin ilmentymisen CD24
+ NPC CSCS osoittaa, että läsnä on konservoitunut kuvio kantasolujen geeni-ilmentymisen alkion kantasoluja ja CSCS. Alkion kantasolut, koekspressoimalla
Sox2
,
Oct-4
,
Nanog
, ja
Rex-1
on tärkeää ylläpitoon pluripotenttisuus ja itseuudistumiseen, ja estää solujen erilaistumista pitkin trophoblast solulinjaan [30], [33].
Sox2
ja
Oct-4
koodata transkriptiotekijöitä, jotka säilyttävät itseuudistumiseen ja pluripotenttisuus in erotukseton alkion kantasoluilla valtion säätelemällä geenejä, jotka ylläpitävät salliva kromatiinirakenteeseen ja DNA: n korjaukseen, ja estää apoptoosin [ ,,,0],52]. Toisaalta, ilmaus
Nanog
, joka on myös transkriptiotekijä kriittisesti mukana itseuudistumisen, säätää positiivisesti
Sox2
ja
Oct-4
[53]. Nämä transkriptiotekijät muodostavat toimivan transkription säätelyyn verkko, joka on kriittinen ylläpito pluripotenttisuuden alkion kantasoluja [53]. Lisäksi Polycomb-ryhmän (PcG) geenin
Bmi-1
hiljaisuus
Hox
geenien modulaation kautta kromatiinirakenteeseen alkionkehityksen aikana hedelmä- kärpäsiä, ja se voi mahdollisesti parantaa proliferatiivista aktiivisuutta sekä normaalin ja leukeemiset kantasoluja [32]. Koska ilmentymisen
Bmi-1
säätelee negatiivisesti
PTEN
, joka toimii tuumorisuppressorigeenin [54], lisääntyneen ekspression
Bmi-1
voi korreloida jossa tukahduttaminen
PTEN
ilmaisun ja induktio epiteelin-mesenkymaalitransitioon, sekä lisääntynyt liikkuvuus ja invasiivisuus ihmisen nenä-nielun epiteelisolujen [54]. Tuloksemme osoittavat, että CD24
+ alaryhmästä NPC solujen ilmaisee myös kantasolu- geenejä ja ilmentää ominaisuuksia kantasolujen itseuudistumisen ja parannettu leviämisen kapasiteettia.
Wnt /β-kateniinin signalointireitin, jonka on raportoitu säätelemään kantasolujen toimintaa ja niche-kantasolujen vuorovaikutuksia [56], parantaa ilmaus
Sox2
ja
Oct-4
[55]. Lisäksi vähennetään E-kadheriinin mRNA: n ekspressio havaittiin Gao et ai. in CD24
+ munasarjasyöpä kantasoluja [49]. Nämä havainnot osoittavat, että menetys E-kadheriinin ilmentyminen voi sallia β-kateniinin uudelleen paikallistaa tumaan ja aktivoi transkriptioaktiviteettia [57]. Tässä tutkimuksessa lisääntynyt fosforylaatio GSK-3β, vähensi fosforylaatiota β-kateniinin, ja ydinvoima translokaatio β-kateniinin havaittiin CD24
+ soluja, verrattuna vanhempien tai CD24
– soluja (kuva 2). Nämä havainnot osoittavat, että Wnt /β-kateniinin signalointireitin aktivoidaan CD24
+ solut.
Tulosten että CD24
+ NPC solut ovat invasiivisia kuin vanhempien tai CD24
– NPC solut ovat yhdenmukaisia tuloksia aiemmista tutkimuksista CSCS haiman [58], keuhko [19], ja eturauhassyövän [59]. Yhdessä lisääntynyt hyökkäys kyky, cellular markkereita, jotka luonnehtivat soluinvaasiota, kuten MMP2 ja MMP-9, lisäsi myös korkeammalla tasolla CD24
+ soluja. MMP2 ja MMP9 ovat mukana hajoamista soluväliaineen ja ilmentymisen lisääntyminen sekä entsyymien indusoi solujen invaasiota kyky [60]. Zhou et al. ehdotti, että geneettinen polymorfismi MMP2 promoottori voi selittää lisääntynyt alttius kiinalaisen yksilöiden kehittämiseen NPC [61]. Microarray analyysi paljastaa, että MMP-1 ja MMP2 ovat merkittävästi yliaktiivista geenien NPC koepaloja, verrattuna lymphohyperplasia, rauhasmainen kudoksia, ja pään ja kaulan alueen syöpä [62]. Lisäksi tutkimukset suoritetaan NPC kasvainbiopsioissa tai solulinjoja parannetuilla invasiivisuuden tai epiteelin mesenkyymisoluyhteisviljelmissä siirtymät paljasti myös parannettu ilmaus
Sox2
,
Oct-4
, ja
Nanog
[63] – [66], samanlainen havaintoja raportoitu täällä CD24
+ soluja. Nämä tulokset osoittavat, että CD24
+ NPC CSCS voi edistää kasvainten synnyssä ja myös aloittaa hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden, ja ehdottaa, että lisäkokeita vahvistaa läsnäoloa CD24
+ CSCS ihmisen NPC koepaloja perusteltua. Lisäksi riippumatta siitä, onko ilmentymisen kantasolujen ja invaasio geenit on valvonnassa yhteisen signalointireitin, kuten Wnt /β-kateniinin polku, on vielä tutkittava.
Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että CD24
+ soluilla CSC ominaisuudet NPC solulinjoissa. Strategioita, joilla pyritään hävittämiseksi CD24
+ NPC solut voivat tarjota uusia ja tehokkaampia hoitomuotoja vastaan NPC.
Materiaalit ja menetelmät
Soluviljely
NPC solulinjoja (jäljempänä keratinisoituvien squamous TW02 solulinja; erotukseton TW04 solulinja; eriytetty squamous HK1 solujen huonosti erilaistunut squamous CG1 soluja, ja keratinisoituvissa suomuinen TW039 ja TW076 solulinjat) saatiin tohtori Yu-su Chang (Chang Gung yliopisto) ja ylläpidetään Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM, Invitrogen, Grand Island, NY) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 25 ug /ml amfoterisiini B: tä (Invitrogen). Lajittelun jälkeen kuten alla on kuvattu, soluja viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 20 ng /ml bFGF: ää (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 20 ng /ml EGF: ää (Sigma-Aldrich), 200 yksikköä /ml penisilliiniä, 200 ug /ml streptomysiiniä ja 50 ug /ml amfoterisiini B: tä (Invitrogen). Kaikki soluja pidettiin kosteutetussa, 5% CO
2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa.
Virtaussytometrianalyysi ja lajittelu NPC solujen
Solut analysoitiin fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) päästyään logaritmisen leviämisen vaihe. Solut hajotettiin 0,25% trypsiiniä, 0,02% EDTA: a (Invitrogen), pestiin kahdesti kalsium /magnesium-vapaa PBS: lla ja suspendoitiin uudelleen pitoisuuteen 1 x 10
6 solua /ml jääkylmää PBS: ää, johon oli lisätty 2% FBS: ää. FITC-konjugoitu anti-ihmis-CD15, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD54, CD59, CD90, CD117 tai CD133-vasta-ainetta (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mountain View, CA) lisättiin sitten lopulliseen konsentraatiossa 1 ug /ml, ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa pimeässä sekoittaen. Sitten solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä, jota oli täydennetty 2% FBS: ää, ja analysoitiin käyttämällä FACS Aria -virtaussytometriä (Becton, Dickinson Company, Mountain View, CA). Isotyypin humaanit vasta-aineet (Becton, Dickinson Company) käytettiin kontrolleina. Solut värjättiin FITC-konjugoidulla anti-humaani-CD24 myös järjestetty käyttämällä samaa virtaussytometriä.
Kasvaimen alalla muodostumista määrityksessä
Six-kuoppaisille viljelylevyille päällystettiin 1,2% pehmeässä agarissa [22] . Vanhempien ja lajitellaan soluja kuin laskettiin ja ympättiin kolmena kappaleena tiheydellä 500 solua /kuoppa DMEM: ssä, jota oli täydennetty 20 ng /ml bFGF: ää ja 20 ng /ml EGF: ää. Soluja tarkkailtiin pallo muodostumista päivittäin.