Krooninen sairaus

tiivistelmä

ihmisen syövissä, metylaatio pitkien välissä ydin- elementti -1 (LINE-1 tai L1) retrotransposoneja vähenee. Tämä tapahtuu osana genomin laaja hypometylaatio, ja vaikka se on yleistä, sen rooli ymmärretään huonosti. L1s ovat levinneet laajalti ja sen ulkopuolella geenien, geeninsisäiset ja geenien välinen vastaavasti. Mielenkiintoista, lisäämällä aktiivista täyspitkän L1 sekvenssit isännän geenistä introneja häiritsee geenin ilmentymistä. Täällä arvioimme jos en sisäinen L1 hypometylaatio vaikuttaa vastaanottavaan geenien ilmentyminen syövässä. Ensin uutetaan tietoja L1base (https://l1base.molgen.mpg.de), tietokanta, joka sisältää oletettavasti aktiivisia L1 lisäykset, ja verrattiin geenin sisäinen ja geenien välinen L1 merkkiä. Huomasimme, että en sisäinen L1 sekvenssit on säilytetty yli evoluution ajan suhteen transkriptionaalisen aktiivisuuden ja CpG sivustoja nisäkkäiden DNA: n metylaatio. Sitten vertasimme säädellä mRNA-tasoja solujen kahdesta eri kokeista saatavilla Gene Expression Omnibus (GEO), tietokanta repository suurikapasiteettisten geenien ilmentyminen tietojen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) by chi-neliö. Kertoimet suhde alas geenien välillä demetyloiduksi normaalin keuhkoputken epiteelin ja keuhkosyöpä oli korkea (p 1E

-27; OR = 3,14; 95% CI = 2,54-3,88), mikä viittaa syöpään genomin laaja hypometylaatio alaspäin säätäminen geeni ilmaisu. Kattava analyysi L1 paikoissa ja geenien ilmentymistä osoitti, että geenien ilmentymistä, jotka sisältävät L1s oli merkittävästi suurempi todennäköisyys olla tukahdutettu syövän ja hypometyloidut normaaleja soluja. Sen sijaan monet mRNA: ita, jotka ovat peräisin geeneistä, jotka sisältävät L1s ovat koholla Argonaute 2 (AGO2 tai EIF2C2) -depleted soluja. Hypometyloidut L1s kasvu L1 mRNA-tasoja. Lopuksi todettiin, että AGO2 tavoitteet introni L1 pre-mRNA: n kompleksit ja tukahduttaa syöpägeenit. Nämä havainnot ovat yksi mekanismeista syövän genomin laaja hypometylaatio muuttamatta geenin ilmentymisen. Hypometyloidut geeninsisäiset L1s ovat ydin- siRNA välittämä

cis

sääntelyvälineitä elementti, joka voi tukahduttaa geenit. Tämä epigeneettisellä asetus retrotransposonien todennäköisesti vaikuttaa moniin näkökohtiin genomisen biologian.

Citation: Aporntewan C, Phokaew C, Piriyapongsa J, Ngamphiw C, Ittiwut C, Tongsima S, et ai. (2011) hypometylaatio geeninsisäiset LINE-1 tukahduttaa transkriptio syöpäsoluissa kautta AGO2. PLoS ONE 6 (3): e17934. doi: 10,1371 /journal.pone.0017934

Editor: Esteban Ballestar, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), Espanja

vastaanotettu: 14 syyskuu 2010; Hyväksytty: 18 helmikuu 2011; Julkaistu: 15 maaliskuu 2011

Copyright: © 2011 Aporntewan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukevat osittain Thaimaa Research Fund (TRF), National Center for Genetic Engineering ja biotekniikan (BIOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA), Four Seasons Hotel Bangkok ja Thaimaan Punaisen Ristin 4. Cancer Care Hyväntekeväisyys ja Chulalongkorn University. Chureerat Phokaew tukee Royal Golden Jubilee Ph.D. avustus (PHD /0190/2550), Ranskan suurlähetystön Thaimaassa ja Chulalongkorn University. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä, DNA: n metylaation muualla genomin, erityisesti pitkän lomassa ydin- elementti-1 (LINE-1 tai L1) retrotransposoni, yleensä loppuun ja tämän tapahtuman puitteissa genomin leveä tai maailmanlaajuinen hypometylaatio [1], [2], [3]. Global hypometylaatio voi olla useita rooleja, monivaiheisessa karsinogeneesissä. Yleisimmin tunnustettu vaikutus on helpottaa kromosomi epävakautta [4], ilmeisesti aikaan hypometyloidut genomin liittyvät replikointi riippumaton DNA kaksinkertainen lohkon murtuma virhealtista korjaus [5], [6]. Viime aikoina on raportti, joka hypometylaatio L1 aktivoi vaihtoehtoinen promoottori MET onkogeenin [7]. Kuitenkin rooli globaalin L1 metylaation, genomipohjaisia ​​leveä geeniekspressiota, on harvemmin tutkittu eikä siten ole hyvin karakterisoitu.

DNA: n metylaatio on oleellinen molekyyli ominaisuus ihmisen perimän, ja muuttaminen tämän epigeneettiset asetuksen liittyy syöpiin [2]. Vaikutukset promoottorin metylaation on chromatin kokoonpano ja geenin transkriptio on hyvin dokumentoitu [8]. Sen sijaan mekanismeja, miten DNA: n metylaatio geenin sisällä (geeni runko metylaatio) säätelee geenien ilmentyminen, ovat vähemmän tunnettuja. Gene elin metylaatiomuutokset saattaa olla useita seurauksia. Ainutlaatuinen metyloidut sekvenssit intronien esiintyvät usein erittäin ilmentyvien geenien [9]. Sen sijaan, muodostumista heterochromatin tiheä geeninsisäinen DNA: n metylaatio rajoittaa tehokkuutta RNA-polymeraasin [10]. Kuitenkin nämä todisteet ymmärtää, että metylaatio geeninsisäinen toistuvat sekvenssit, mukaan lukien L1s, voi myös olla tärkeää säilyttää normaali toiminta liittyy genomisen lokuksen.

L1s myös laajalti genomissa [11]. L1 lisäys on useita mahdollisia toiminnallisia seurauksia [12]. On huomattava, että L1s eivät jakaudu tasaisesti [11] ja monet jäävät genomisista alueista taloudenhoito geeni [13]. Geneettisesti muokattu in vitro -tutkimus osoitti, että muun muassa aktiivisen L1 sekvenssit isännän geenistä introneja häiritsee geenin ilmentymistä [14]. Koko evoluutio, retrotranspositiossa tapahtumia tuotetaan 500000 kopiota L1 ihmisen genomissa [15]. Kuitenkin kaikki L1s ovat täyspitkät ja aktiivinen; useimmat ovat katkaistu. On 80-100 retrotranspositiossa-toimivaltaisen L1s ihmisen perimässä, mutta vain kuusi näistä arvellaan taustalla kaikki historialliset retrotranspositiossa tapahtumat [16]. Yli 10000 L1s ovat pidempiä kuin 4,5 kb: n ja sisältää 5 ’UTR: n, kaksi avointa lukukehystä ja 3’ UTR, joka sisältää polyadenylaatiosignaalin [17]. Yli 2000 näistä L1s ovat geeninsisäiset, ja he asuvat sisällä yli 1000 geenit.

Viime aikoina olemme arvioineet metylaation 5’UTR L1 sekvenssit [1], [18] ja totesi, että metylointi tasot vaihtelevat kunkin lokuksen ja eri solutyypeissä villityypin soluissa. Ihmisen syövissä, metyloinnin L1 retrotransposonien pienenee portaattomasti [1], [18], [19]. Menetys genomin laaja L1 metylaation syöpäsoluja tapahtuu yleinen prosessi. Kuitenkin L1 metylaatio vaikuttaa sen sijainti genomissa [18]. Esimerkiksi L1s eri intronit samat geenit ovat yleensä muutetaan samalla tavalla [18]. L1 hypometylaatio korreloi tiettyjen solujen fenotyyppejä. Syövän, L1 hypometylaatio liittyy suoraan monivaiheisia syövän synnyn ja aggressiivinen syövät huono ennusteet [1], [20], [21], [22], [23], [24]. Lisäksi normaaleissa soluissa metylaatio L1 voidaan muuttaa yhdessä tiettyjen solun fenotyyppejä kuten korkea syöpäriski, kudosten erilaistumiseen ja ravinnon [25], [26], [27], [28], [29], [30] , [31], [32], [33]. Mielenkiintoista, sirotella toistuva sekvenssi (IRS) hypometylaatio kuviot ovat erilaisia ​​solujen eri fenotyyppejä. Esimerkiksi Alu hypometylaatio on yleisesti todettu ikääntymisen soluissa, mutta L1 hypometylaatio ei ole [34]. Nämä linjat todisteet johtavat meidät oletuksen, että tuhansien geenien voidaan säädellä geeninsisäiset L1 hypometylaatio syöpäsoluissa.

Täällä poimimamme tietoja L1base (https://l1base.molgen.mpg.de) [ ,,,0],17], tietokanta, joka sisältää oletettavasti aktiivisia L1 insertioita, vertailla geeninsisäiset ja geenien välinen L1 merkkiä. Sitten vertasimme mRNA tasoilla hypometyloidut normaalit solut ja syövän ilmaisun array kirjastoja, saatavana Gene Expression Omnibus (GEO), tietokanta repository suurikapasiteettisten geenien ilmentyminen tietojen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) [35], [36]. Lopuksi kattava analyysit L1 paikoissa ja genomin laaja-geenin ilmentyminen suoritettiin arvioimaan geeniregulatiivista mekanismeja geeninsisäiset L1s syövässä.

Tulokset

geeninsisäiset ja geenien välinen L1 sekvenssit osoittavat selvästi rakenteellisia piirteitä

sekvenssivariantit kunkin pitkiä L1 luokitellaan evoluution aikana ja retrotranspositiossa toimintaa [17]. Täällä analysoimme jos L1s ovat erotettavissa riippuen paikkoihin, jos sekvenssit ovat geenejä, en sisäinen tai geenien välillä, geenien välinen (Fig. 1A). Eri ominaisuudet, on kuvattu L1base [17] kuten sijainti kromosomissa, alaperheessä järjestyksessä ja CpG saarta, 9355 geenien välinen L1s ja 2546 geeninsisäiset L1s löytyy 1454 geenejä arvioitiin 218 chi-neliö kokeet ja 18 t-testit (tukeminen Taulukko S1 ja S2). Esimerkkejä chi-neliö testi ja t-testin osoitettiin (Fig. 1 B ja 1 C). Tilastollinen analyysi osoitti, että on olemassa lukuisia rakenteellisia ominaisuuksia geeninsisäinen L1s jotka ovat erillään intergeeniset L1s (Fig. 1 ja tukeminen Taulukko S2). 100 chi-neliö kokeet analysoitiin muunnelmia sekvenssit, jotka määrittävät L1 transkription ja retrotranspositional toimintaa ja läsnäolo CpG-saarekkeiden ja 57 testit olivat merkitsevästi erilainen p-arvot 0,001 (Fig. 1D ja tukeminen taulukko S2). Nämä testit osoittivat esiintyvyys n konservoituneiden sekvenssien geeninsisäiset L1s olivat aina korkeampia kuin intergeeniset L1s taas kaikki mutatoidut sekvenssit olivat yleisempiä intergeenisessä L1s (Fig. 1D ja tukeminen taulukko S2). Lisäksi useammin-CpG-saarekkeiden havaittiin en sisäinen L1s (Fig. 1D ja tukeminen taulukko S2). Tukivat tätä havaintoa vertaamalla avulla 18 ominaisuuksia t-testillä (Fig. 1 C, 1E ja tukeminen taulukko S2). Intergeeniset L1s sisältävät enemmän A ja T nukleotidin lukukehyksen, aukkoja ja lopetuskodonit. Sen sijaan en sisäinen L1s olla suurempia G-C sisältö ja eheys pisteet (Fig. 1 E ja tukeminen taulukko S2). Lopuksi en sisäinen L1-sekvenssit on säilytetty yli evoluution ajan suhteen transkriptionaalisen aktiivisuuden ja CpG sivustoja nisäkkäiden DNA: n metylaatio. Nämä havainnot hiljaista fysiologiasta geeninsisäiset L1 metylaation.

A) L1s jaettiin kahteen luokkaan, geeninsisäiset ja geenien välinen L1s joita edustavat siniset ja punaiset nuolet, vastaavasti. B) Erot rakenteelliset ominaisuudet L1 ryhmien analysoitiin käyttäen chi-neliö testi, kategorisen ominaisuudet ja C) homoscedastic

t

-testi muiden kuin kategorinen piirteitä. D) 100 p-arvot chi-neliö testit kolme luokkaa L1 järjestyksessä merkkejä, konservoituneet sekvenssit, mutatoitunut sekvenssit ja läsnäolo CpG-saarekkeiden, joita löytyy yliedustettuina tai aliedustettuina geeninsisäiset L1s olivat esillä, geeninsisäiset L1s intergeeniset L1s ja geenien välinen L1s geeninsisäiset L1s, vastaavasti. E) 18 p-arvot t-testejä L1 merkkejä ovat yliedustettuina ja aliedustettuja geeninsisäiset L1s näytettiin sinisenä, sisäisessä muun, ja punainen väri muun sisäinen, vastaavasti.

geeninsisäiset L1s tukahduttaa geenit syöpäsoluissa

L1s ovat hypometyloidut monissa syövissä [1]. Sen tutkimiseksi, geeninsisäiset L1s ohjaus isäntägeenejä L1 hypometyloidut syöpäsoluissa, vertasimme geenien ilmentyminen syövässä geenien välillä, joilla geenin sisäinen L1s ja loput. Geenit jolla L1s määritettiin L1base [17] ja ilmaisun microarray data on julkisesti saatavilla tietoja GEO [35], [36]. Kukin geeni luokiteltiin 2 opiskelija t-testejä, ylä- ja alas-asetuksia. Jos keskiarvo syövän ryhmässä oli tilastollisesti suurempi tai pienempi kuin normaali ryhmä, geeni luokiteltiin ylä- tai alassäädetty, vastaavasti. Jos t-testiä ei ollut tilastollisesti merkitsevä, geeni oli luokiteltu ei up- tai alassäädetty, vastaavasti. Jakelu geenejä, joilla on L1s joka osoitti lisääntynyttä ilmentymistä syövän verrattiin muuhun geenin asettaa khi-neliö-testejä (Fig. 2A). Sama analyysi suoritettiin geenien kanssa vähentynyt ilmentyminen syövän (Fig. 2B). Kuvio 2A ja 2B osoittaa, esimerkkejä khi-neliö-testejä geeniekspression mahasyövän. Geenit jolla geeninsisäiset L1s havaittiin vähemmän todennäköisesti sääteli (riskisuhde (OR) = 0,61, p = 3.04E-06) (Fig. 2A). Lisäksi geenien ilmentymistä, jotka sisältävät L1s olivat yleisesti vähentynyt (OR = 1,64, p = 2.66E-13) (Fig. 2B). Geeninsisäiset L1s voivat valvoa satoja geenejä. Niistä 1340 geenejä sisältäviä L1s, 1242 geenejä ei säädelty ja 304 geenien alassäädetty (Fig. 2A ja 2B). Analyysi useita ilmaisun paneelit osoittivat samanlaisia ​​tuloksia. Testasimme pään ja kaulan okasolusyöpä, kohdunkaulan syövän soluja, keuhkon adenokarsinoomassa solut, maksasyöpä, rintasyöpä solut, duktaalinen ja lobulaarinen rintasyöpä, virtsarakon karsinooma in situ, mikrosatelliitti epävakaa mahasyöpä, metastaasit eturauhassyöpä. Olemme havainneet, että geenit alassäädetty kohdunkaulan syövän soluja, keuhkon adenokarsinoomassa solut, rintasyöpäsoluja, duktaalinen ja lobulaarinen rintasyöpä, virtsarakon karsinooma in situ, mikrosatelliitti epävakaa mahasyövän ovat todennäköisesti sisältävät L1s. Lisäksi, geenit, joilla on korkeampi ekspressiotasot pään ja kaulan okasolusyöpä, kohdunkaulan syövän soluja, maksasyöpä, rintasyöpä solut, virtsarakon karsinooma in situ, mikrosatelliitti epävakaa mahasyöpä, metastaasit eturauhassyöpä ovat vähemmän todennäköisesti on L1s (tukeminen Taulukko S3 ja kuvio . 2C). Siksi en sisäinen L1s voi tukahduttaa isäntägeenejä näissä syövissä. Vaikka in vitro lisäämisen aktiivisen L1 sekvenssit isännän geenistä introneja häiritsi geeniekspressiota [14], useimmat mRNA tasoilla sisältävien geenien L1 olleet poissa (tukeminen Fig. S1). Lisäksi vertailu geenien syövän, kuten on kuvattu tukipöydän S3.1-S3.9, osoitti, että todennäköisyys sisältävien geenien L1 on yleisesti alas-säädellä itsenäisestä kokeesta on suurempi kuin geenit ilman L1 (p-arvo = 7.99E-08, keskiarvo L1 = 1,6642, tarkoita mitään L1 = 1,4861) (tukeminen Fig. S2). Nämä analyysit tukevat biologista merkitystä geeninsisäiset L1s geenisäätelyn syövässä.

A) ja B) ovat Khin neliö 2 × 2 taulukoita, p-arvot ja kertoimet suhdeluvut, vertaamalla osuudet mahasyövän geenien joilla L1s välillä ylös – ( ”ylös”) tai alaspäin ( ”alas”) säänneltyjä ylä- tai ei alassäädetty ryhmiä, vastaavasti. C) Prosenttiosuudet L1 sisältävien mRNA: iden, jotka ovat ylä- tai alassäädetty eri syöpätyyppeihin. D) EPHA3 mRNA ja L1-EPHA3-IVS5 ja IVS15 metylaatiotasoilla in WSU-HN-solujen ja Aza-dC-käsitellyn WSU-HN17s. E) Kaksi Khin neliö 2 × 2 taulukoita, p-arvot ja kertoimet suhdeluvut, vertaamalla osuudet Aza-dC-käsitelty hBECs tai hMSC geenit jolla L1s välillä alassäädetty ( ”Alas”) eikä alassäädetty ryhmiä, vastaavasti. F)% mRNA geeneistä, jotka sisältävät L1s in Aza-dC-käsiteltyjen hBECs ja hMSC: eitä. ”Ylös” ja ”Alas” ilmaisevat lisätä ja vähentää ilmaisu, vastaavasti. GSE kirjaa, GSM näytteitä ja tyyppi

t

-testin ja 2 x 2 pöytää chi-neliö kokeet tarjotaan tukeminen taulukossa S3.

Osoittaakseen suhteen kuvio L1 metylaatiotasoilla ja geenin ilmentymisen, mittasimme geenin sisäinen L1 metylaatiotasoilla ja isännän geenin mRNA-tasolla. Aiemmin arvioimme metylaatiotasoilla 17 geeninsisäinen L1 lokuksen ja totesi, että L1 metylaatiotasoilla L1-EPHA3-IVS5 ja L1-EPHA3-IVS15 korreloivat voimakkaasti syöpäsoluissa, mikä viittaa siihen, locus erityistä mekanismia [18]. Mittaaminen geeninsisäiset L1-EPHA3 metylaatio ja EPHA3 mRNA tasot pään ja kaulan okasolusyöpä (HNSCC) solulinjat (WSU-HNS) paljasti, että alhaisempi geeninsisäiset L1-EPHA3-IVS5 ja L1-EPHA3-IVS15 metylaatio korreloivat pienempi EPHA3 mRNA-tasot (Pearson r = 0,7961 ja 0,7638, vastaavasti, Fig. 2D). EPHA3 mRNA WSU-HN17 soluissa oli myös huomattavasti pienempi, kun L1-EPHA3 oli hypometyloidut (pariksi

t

-testi; p 0,001; Fig. 2D). Näin ollen, mRNA: n tasoon voidaan suoraan korreloida geeninsisäinen L1 metyloinnin.

menetys metylaation normaalissa solussa tukahduttaa geenien satama L1s

analyysi geenin ilmentymisen ihmisen keuhkoputken epiteelisoluissa (hBECs ) ja ihmisen mesenkymaaliset kantasolut (hMSC) jälkeen genomin laaja demetylaatio 5-atsa-2′-deoksisytidiini (atsa-dC) käsittely osoitti suurempaa esiintyvyys geeninsisäiset L1s in down-geenien (OR = 1,52, p = 0,0017 ja OR = 1,62, p = 0,0069, vastaavasti) (kuvio. 2E, 2F ja tukeminen taulukko S3), mielenkiintoisesti, samanlaista mallia kuin todettu syövän (Fig. 2C). Me tutkia tarkemmin, jos genomin laaja hypometylaatio geenien syövässä. Suoritimme chi-neliö testi määrittää merkitystä päällekkäisyydet alassäädetty geenien demetyloituja hBECs ja keuhkosyöpää. Geenit, jotka ovat alaspäin säädeltyjä atsa-dC käsittely hBECs havaittiin edullisesti olla pienempi mRNA tasoilla syöpäsoluja keuhkojen (p = 2.67E-28; OR = 3,14; 95% CI = 2,54-3,88; kuvio 3A ja 3B ja tukeminen taulukko S4). Tämä tukee oletusta, että hypometylaatio alas säätelee geenien syöpää.

A) 2 x 2 pöytää, p-arvot ja kertoimet suhdeluvut ja B) kerroinsuhde mRNA: t, jotka ovat alle ilmaistaan ​​( ”Alas”) keuhkosyövän ja Aza-dC-käsiteltyjen hBEC soluja verrattuna ei-atsa-dC-käsiteltyjen hBEC solujen (A ja B) kaikki geenit, (B) geenien L1s (L1) ja geenit ilman L1s (o L1). B) Keskimmäinen, ylhäältä ja alhaalta riviä jokaisesta kaksivärinen box ovat kertoimet suhde ja ylemmän ja alemman 95%: n luottamusväli (CI), tässä järjestyksessä. C) 2 x 2 pöytää, p-arvot ja kertoimet suhdeluvut ja D) prosenttiosuudet mRNA: iden, jotka ovat alle ilmaistaan ​​( ”Alas”) sekä Aza-dC-käsiteltyjen solujen ja syöpäsolujen verrattuna geenejä, joita ei vaimentua in Aza-dC -käsitellyssä soluja tai syöpään, sillä geenien kanssa ja ilman L1s (L1 ja nro L1). Vastaava 2 × 2 virhematriiseja A) ja B) ja C) ja D) annetaan tukeminen taulukossa S4 ja S5, vastaavasti.

Mielenkiintoista, hypometylaatio alas säätelee molempien ryhmien geenien , jossa L1 (p 2.59E-04; OR = 3,24; 95% CI = 1,73-6,05; tukeminen Taulukko S4) ja ilman L1 (p 2.34E-24; OR = 3,09; 95% CI = 2,46-3,87; tukeminen Taulukko S4). Näin ollen, on mahdollista, että sen lisäksi, L1 on olemassa muita DNA metyloitu geenin kehon osia, jotka säännelty geenin ilmentymistä. Tätä hypoteesia tukee tuoreessa raportissa, että geenin rungon ainutlaatuinen metyloidut sekvenssit ovat enemmän esiintyvyys erittäin ilmaistaan ​​geeneihin [9]. Eriyttää edelleen roolin L1s vertasimme geenien välillä ja ilman L1s. Huomasimme, että jos alas-säätely geenien sekä Aza-käsitellyt DC hBECs ja keuhkosyöpä on yleisempää sisältävien geenien L1s kuin geenien ilman L1. (OR = 2,08, p = 0,009; Kuva. 3C ja 3D sekä tukeminen taulukko S5). Siksi hypometylaatio vähentää ilmentymistä monien geenien syöpää, ja geenin sisäinen L1s toimii metylointi välittämä

cis

sääntelyvälineitä elementti.

Monet geenit usein vaimentua syövässä näytössä hypermetyloitunut promoottorit [8] . Emme kuitenkaan löytäneet mitään yhteyttä promoottorin hypermetylaatio syövän ja läsnäolo geeninsisäiset L1s. Geenejä hypermetyloitunut promoottori on osoitettu olevan säädelty kun solut demetyloitunut. Geenien kanssa L1 ei usein lisääntyi, kun syövän solut demetyloituu (tukeminen taulukko S6.1 ja S6.2).

L1 hypometylaatio lisää L1-RNA tasot

mittaus metylaation ja RNA tasoilla osoitti käänteinen korrelaatio genomin laaja L1 metylaatio ja L1 RNA (Pearson r = -0,6955; Fig. 4A). Tämä havainto tukee oletusta, että L1 hypometylaatio lisää L1 RNA transkriptio [37]. Introniset geenejä on ehdotettu muodostamaan poikkeavaa RNA komplekseja isäntägeenejä ja siten inaktivoida isäntä geenin transkriptio [38]. L1s ovat retrotransposable tekijöitä, jotka voivat edelleen hallussaan transkription aktiivisuutta huomattava DNA-kohtien [29]. Lisäksi jotkut L1s kopioidaan niiden kautta polyA lisäksi sivustoja ja näin kimeeristen RNA: ita, jotka sisältävät sekä L1 ja ainutlaatuinen intronisekvenssit [39]. Me seulottiin ja löysi L1-EPHA3 RNA intronin 15 EPHA3 geenin ja havaittiin vastakkainen vaikutus L1-EPHA3 RNA ja L1-EPHA3 metylaatio (Pearson r = -0,8686; Fig. 4B). Siksi L1 hypometylaatio johtaa lisääntyneeseen L1 transkription ja siten tuottaa enemmän introni L1-RNA.

A) Genome leveä L1 metylaatio ja L1 RNA-tasoissa WSU-HN-soluissa. B) L1-EPHA3 metylaatio ja L1-EPHA3 RNA-tasot.

geeninsisäiset LINE-1 elementtejä tukahduttamiseksi transkriptio syöpäsoluissa kautta AGO2

retrotransposonisekvenssin RNA: ita tai transkriptien muodostaen dsRNA rakenteita laukaista RISC kokoonpano [40]. Sitoutumisen jälkeen pienet häiritsevät RNA: t (siRNA), RISC tunnistaa ja pilkkoo täydentävät RNA-molekyylit [41]. L1s oltava enintään kolme sisäistä promoottoreita, 5′- ja 3′-päät ja 5 ”antisense suuntaan [42], [43], [44]. Sense- ja antisense promoottorit 5’UTR tuottaa kaksisuuntaisia ​​selostukset, joita myöhemmin jalostetaan siRNA estää retrotranspositiossa [40]. Siksi me arveltu, että L1 RNA: n ja introni-pre-mRNA: n sisältävien geenien L1s, koska täydentävät sekä sekvenssit, muodostavat dsRNA, joka voidaan kohdistaa RISC siten heikentäviä mRNA: n määrä, jotka ovat peräisin geeneistä, jotka sisältävät L1s. RISC kompleksi koostuu Dicer, Argonaute ja siRNA. Samanlainen kompleksi AGO2 toimii hiljentämään geenitranskriptiota tumassa [45], [46].

Jos en sisäinen L1 RNA vähentää isäntä geenin mRNA kautta AGO2, AGO2 proteiini puute johtaa lisätä mRNA-tasojen geenien hosting L1s. Analyysi mRNA microarray of AGO2 alassäädetty soluja, AGO2sh [47], osoitti, että rajallinen ilmentymistä AGO2 ihmisen alkion munuais- solulinja (HEK293T-) johti ekspressiokuviota geenin sisältävien L1s joka oli päinvastainen kuin havaittu L1 hypometylaatio; nimittäin, ne olivat todennäköisemmin sääteli (OR = 1,44, p = 0,0004, Fig. 5A ja 5B ja tukeminen taulukko S3). ShRNAs of DICER1, AGO1, AGO3 ja sitten4 ei upregulate geenejä L1 (tukeminen taulukko S6.3-S6.7). Tämä viittasi siihen, että AGO2 edullisesti rajoittaa pitoisuus mRNA: iden, jotka ovat peräisin geeneistä, jotka sisältävät L1s. Arvioimme lisäksi mRNA microarray kokeilun hybridisoitiin by AGO2 saostunut RNA [48], ja totesi, että AGO2 voi suoraan heikentää mRNA: t, jotka ovat peräisin geeneistä, jotka sisältävät L1s. Vaikka RISC sitoo ja pilkkoo mRNA, mRNA: ita, jotka ovat peräisin geeneistä, jotka sisältävät L1s olivat vähemmän todennäköisesti sitoutua AGO2 (OR = 0,64, p = 0,009; Fig. 5A ja 5B ja tukeminen Taulukko S3), joka oli alussa yllättävää, koska tulokset AGO2sh kokeita (Fig. 5A ja 5B ja tukeminen taulukko S3).

A) 2 x 2 pöytää, p-arvot ja kertoimet suhdeluvut ja B) prosenttiosuuksia L1 sisältävien-geenejä, jotka osoittavat lisääntynyttä mRNA tasot AGO2sh saaneilla solut ( ”ylös”) tai sitovat AGO2 in AGO2IP ( ”Bound”), tässä järjestyksessä. C) 2 x 2 pöytää, p-arvot ja kertoimet suhdeluvut ja D) kertoimet suhdeluvut (95% CI) verrataan HEK293T- mRNA välillä jopa geenien eikä ajan geenien upon AGO2sh ja sitoo AGO2 proteiinien kaikkien geenien (D), geenejä L1s (L1) ja geenit ilman L1s (o L1), (C ja D). D) Keskimmäinen, ylhäältä ja alhaalta riviä jokaisesta kaksivärinen box ovat kertoimet suhdeluvut ja ylemmän ja alemman 95% CI, vastaavasti. E) tasot AGO2, EPHA3 mRNA ja L1RNA in WSU-HN17 AGO2si soluissa. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SEM. GSE kirjaa, GSM näytteitä, tyyppi

t

-testi A) ja B) annetaan tukeminen taulukossa S3. 2 x 2 virhematriiseja C) ja D) esitetään tukeminen taulukossa S4. F) Kaksi skenaariota AGO2-tavoite sitova heijastavat eri mRNA array laitetta käytettäessä AGO2-IP ja AGO2sh koettimina. Negatiivinen tulos oli odotettu mRNA ilmaisun microarray käyttäen AGO2-IP RNA koettimina, ( ”AGO2-IP + mRNA array”), kun intronit pre-mRNA oli suunnattu. Kuitenkin positiivisen tuloksen odotettiin mRNA ilmaisun microarray käyttäen mRNA AGO2sh koettimina, ( ”AGO2sh + mRNA array”), riippumatta AGO2 tavoitteet pre-mRNA tai mRNA.

Verrattaessa AGO2 sitoutuneen mRNA: t