Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpäsolut usein työllistävät kehityshäiriöitä vihjeitä edullista kasvua ja etäpesäkkeiden. Täällä me raportoimme että aksoniohjauksen molekyyli, Sema3E, ilmentyy vahvasti ihmisen korkealaatuisesta munasarja- endomet- syöpä, mutta ei matala-asteinen tai muita munasarjojen epiteelin kasvaimissa, sekä helpottaa syövän etenemiseen. Toisin kuin tunnetun angiogeenisen aktiivisuuden, Sema3E toiminut kautta Plexin-D1-reseptorien laajentaa soluun leviämiskyky ja samanaikainen epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT). Sema3E aiheuttama EMT munasarjan endomet- syöpäsoluissa oli riippuvainen ydinvoiman lokalisoinnin Snail1 aktivoimalla fosfatidyyli-3-kinaasi ja ERK /MAPK. RNAi-välitteinen knockdovvn Sema3E, Plexin-D1 tai Snail1 in Sema3E ilmentäviä tuumorisoluja johti häiriintynyt solun liikkuvuus, samanaikainen palautuminen EMT ja vähentynyt ydinvoiman lokalisoinnin Snail1. Sen sijaan pakko säilyttäminen Snail1 sisällä ydin Sema3E-negatiivisten kasvainsolujen aiheuttamaa EMT ja parantaa solun liikkuvuus. Nämä tulokset osoittavat, että sen lisäksi, että angiogeenisten vaikutusten Sema3E kasvainten verisuonten endoteelin, EMT strategiaa voitaisiin hyödyntää Sema3E /Plexin-D1 signalointi kasvainsoluissa edistää solujen invaasio /kulkeutuminen.

Citation: Tseng CH Murray KD, Jou MF, Hsu SM, Cheng HJ, Huang PH (2011) Sema3E /Plexin-D1 välitteisen epiteelikasvaimet-to-mesenkymaalitransitioon munasarjojen endomet- Cancer. PLoS ONE 6 (4): e19396. doi: 10,1371 /journal.pone.0019396

Editor: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Ranska

vastaanotettu: 31 joulukuu 2010; Hyväksytty: 29 maaliskuu 2011; Julkaistu: 29 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Tseng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat rahasto National Taiwan University Hospital (NTUH98-P26-2 ja NTUH99-P21) myönnetään PH Huang. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

pahanlaatuiset etenemistä kasvain usein hankinta tehostetun leviämiskyky syöpäsoluissa paikallisen invaasion ja etäinen etäpesäke, jotka molemmat ovat tärkeimmät determinantit kliinistä sairastavuutta ja kuolleisuutta. Samanlaisia ​​biologiset prosessit tapahtuvat ympäri normaalin alkionkehityksen sekä tietyissä fysiologisissa olosuhteissa, kuten haavojen paranemista [1], [2]. Insight alkaen kehitysbiologian voisi näin ollen auttaa meitä ymmärtämään invasiivisia luonnetta pahanlaatuisten etenemisen kasvain.

Semaforiinien (Sema) suuri perhe eritettyjen ja membraaniin liittyneet proteiinit, jotka tarjoavat ympäristön ärsykkeille sovitella erilaisia ​​kehitysprosesseja lukien hermosolujen muuttoliike, aksoniohjauksen, vaskulogeneesiä haarautumisineen morphogenesis, ja sydämen organogeneesiin [3] – [8]. Semaforiinien sitovat plexin ja /tai neuropiliini-reseptorien intrasellulaarista signaaleja. Tällä hetkellä viisi luokkaa Semaforiinien kaksi neuropilins ja neljä perheitä plexins on tunnistettu nisäkkäistä [6]. Viimeaikaiset todisteet ehdottaa myös semaforiini /plexin signalointi on osallisena kasvainten synnyssä [9] – [11]. Kuitenkin niiden roolit ovat varsin vaihtelevia ja riippuvat erityisistä kasvaimen yhteydessä ja koostumus Semaforiinien, plexins, ja niiden solunsisäiset vastaavan signaalin elementtejä. Semaforiini /plexin signalointi voivat joko edistää tai estää kasvaimen kasvua säänteleviä solumigraatio tai solujen apoptoosin. Semaforiini /plexin signalointi voi myös välillisesti ohjata kasvaimen invasiivista kasvua angiogeneesin säätelyyn tai kasvain immuniteetin [10], [12] – [16].

näytön luokan 3 Semaforiinien kasvainkudoksessa pakat (esimerkkejä on esitetty kuviossa. S1C) tunnistimme Sema3E nimenomaan ilmaistu korkealaatuisesta munasarja- endomet- karsinooma, alatyyppi munasarjan epiteelin syövät (Fig. 1). Kliinisesti, useimmat diagnoosit korkealaatuisesta munasarjasyöpä huono-ennusteen kanssa tuumorimetastaasin ja reagoivat huonosti kemoterapiaan korostunut tarve ymmärtää täysin synnyssä epiteelin munasarjojen syöpien ja niiden etenemistä [17]. Käyttäen ihmisen munasarjan endomet- masolulinjassa ja johdettu alilinjat erilaisilla invasiivisen /muuttavia ominaisuuksia [18], tutkimme keskinäiset Sema3E molekyyli- ja solutason signalointimekanismeja ja kasvaimen invasiivisuus. Me raportoimme tässä, että Sema3E kasvainsoluista voi toimia itseään Plexin-D1 aiheuttavan EMT ja samanaikaisesti helpottaa solujen vaeltaminen ja pahanlaatuinen etenemisen.

A, B RNA

in situ

-hybridisaatiolla antisense

Sema3E

koetin ja immunohistokemia polyklonaalisella vasta-aineella vastaan ​​Sema3E osoittavat ero ilmentymistä mRNA ja proteiini vastaavasti solujen koko kudosleikkeiden korkeasta ja huono laatu ihmisen munasarjan epiteelin syövät. Hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 10-kertainen) in high-invasiivisia /muuttavien P4 soluja verrattuna P0 soluihin. Sen sijaan Sema3F yleisesti pidetään tuumorisuppressorina oli säädellä vähentävästi P4 soluissa [10], [19]. Vaikka muuttuja plexin ja neuropi- ilmentymistä havaittiin, Plexin-D1 ja Npn 1 olivat yhtä ilmaistu matalan invasiivisia P0 ja korkea-invasiivisia P4 soluissa (kuviot. 1E ja S2B). RNA

in situ

-hybridisaatioanalyysin viljellyillä yhden munasarjojen endomet- syöpäsoluja vahvistivat nämä tulokset (Kuva. S2A). Tämä viittaa Sema3E ilmentymistä munasarjojen endomet- syöpäsoluissa voisi olla mukana hankintaan solun invasiivisen /leviämiskyky.

Euroopan P61-Sema3E isoformi todennäköisesti toimia autokriini tavalla läpi Plexin-D1 parantaa invasiivisen /leviämiskyky munasarjasyövän endomet- syöpäsolujen

in vitro

pitoisuudesta riippuvalla tavalla

roolin tutkimiseksi Sema3E välittämisessä invasiivisuus ja /tai muuttavien kyky aikana syövän etenemiseen, suoritimme voitto ja tappio funktion tutkimukset OEC soluissa. Ensin yliekspressoitujen Sema3E vanhempien Sema3E-negatiivinen, matala-invasiivisia P0 soluissa. Nämä stabiilit solulinjat (nimetty P0-3E-

1, P0-3E-

3 ja P0-3E-

10) osoitti vaihteleva astetta Sema3E ilmaisun mitattuna semikvantitatiivinen RT-PCR, immunoblottauksella ja RNA

in situ

-hybridisaatio (Fig. 2A). Toiseksi Sema3E ilmaisun erittäin invasiivisia P4 soluissa stabiilisti pudotettiin RNAi-välitteinen ehtyminen. Saimme kaksi kloonia, nimetty P4 /si3E-

1 ja P4 /si3E-

2 kohdistettu eri RNAi-sekvenssit osoittivat 75% ~90% lasku Sema3E verrattuna vanhempien P4 soluihin (Fig. 2B, oikea paneelit ). Ohjaus OEC kloonit transfektoitiin joko tyhjä vektori (-mock) tai salattu RNAi sekvenssit (-ohjaus). Virtaussytometria-analyysi ja trypaanisiniekskluusiolla kokeet osoittivat, että solujen elinkelpoisuus ja lisääntymistä ei muuttunut P0-3E ja P4 /si3E kloonia (Fig. S2C ja D).

. Modified P0 solulinjoja (P0-3E-

x) ilmaisevat eriasteista Sema3E mitattuna semikvantitatiivinen RT-PCR-analyysi (vasen yläosa) ja Western-blottauksella (alhaalla vasemmalla). Expression arvot normalisoitiin

GAPDH

ja œ-Tubulin mRNA ja proteiini, vastaavasti. RNA

in situ

hybridisaatiokoetinten mukaan Sema3E vuonna P0-3E-

1 verrattuna P0 soluihin (oikealla). B. Western blottaus Sema3E ja Plexin-D1 P4 /si3E klooneja (RNAi-1, -2 kohdentamiseksi kaksi eri sarjoissa Sema3E) ja P0-3E-

1 /siD1 klooneja (RNAi-1, -2 kohdistaminen kaksi erilaista sarjoissa Plexin-D1). C, D, E, F. Brightfield mikrovalokuvia päässä haavan paranemista muuttoliike määrityksiä eri P0-3E (C), P0-3E-

1 /siD1 (D), ja P4 /si3E (E) solulinjat on alussa (0 h) ja 16 tunnin kuluttua pintanaarmu. Haavan reunat oli merkitty valkoisia viivoja (0 h) tai mustia viivoja (16 h). Mittakaava, 0,5 mm. Yhteenveto keskimääräinen vaeltavat nopeus (im /h) kullekin kloonin piirretään (F) sekä keskihajonta (n≥12). *,

P

0,05, pariksi

t

-testi. G, H Kuvat ovat (G) ja yhteenvetokaaviota (H) siirtokuoppaan kammion invaasiomääritys (n≥6). Scale bar, 30 mikrometriä. I. furiinin estäjä, dekanoyyli- RVKR-kloorimetyyliketoniryhmä, muuttaa muuttavien kyky P0-3E-

1 soluja haavan paranemista ja siirtokuoppaan kammion muuttoliike määrityksiä. DMSO: ta käytettiin kontrollina. Valkoinen viiva, 0 h haavan paranemista; musta viiva, 16 h kuluttua pintanaarmu. **,

P

0,005, *,

P

0,05, pariksi

t

-testi, n = 5. Mittakaava, 0,5 mm. J. TranswellTM kammio invaasiomääritys varten P0 soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti P61-Sema3E isoformi (P0-3Ep61-

1 ja P0-3Ep61-

2) verrattuna P0-3E-

1-solut ja P0 soluja. **,

P

0,005, pariksi

t

-testi, n = 4. Mittakaava, 0,3 mm.

invasiivisen /vaeltavia kyvyt OEC kloonit arvioitiin

in vitro

haavan paranemista, 3-ulotteinen (3D) -matrigel muuttoliike, ja siirtokuoppaan kammio invaasio määrityksiä. Vuonna arpeutumisprosessit määritys, P4-mock ja P0-3E-

1-soluissa alkoi täyttää haavan jo 4 tunnin kuluttua alusta, kun taas P0-mock-solut osoittivat hidas liikkuvuudessa jopa 16 tunnin kuluttua. P0-3E kloonit liikkui on Sema3E annoksesta riippuvalla tavalla siten, että P0-3E-

1 ja P0-3E-

9-solut, jotka ilmentävät suhteellisen suuria määriä Sema3E, siirtää nopeammin ja kauemmas kuin P0- 3E-

3 ja P0-3E-

10 solua, jotka ilmensivät pienempiä määriä Sema3E (Fig. 2C ja F). Toisaalta ehtyminen Sema3E P4 soluissa hidasti vaeltavia nopeus ja etäisyys (Fig. 2E ja F). Samanlaisia ​​muutoksia havaittiin Matrigel migraatiokokeessa ja siirtokuoppaan kammion invaasiomääritys: P4 ja P0-3E-

1-solut osoittivat merkitsevästi enemmän invasiivisia potentiaali verrattuna P0-3E-

10, P4 /si3E tai vanhempien P0 soluihin, joissa Sema3E tasot ovat heikentyneet tai puuttuvat (kuviot. 2G, H ja S2E). Siksi yli-ilmentyminen Sema3E matalan invasiivisia OEC solujen parantaa solujen vaeltavia ja invasiivisia kyvyt

in vitro

joka tekee riippuvaisella tavalla, ja knockdovvn Sema3E vähentää muuttavien /invasiivisia kykyjä korkean invasiivisia OEC soluissa .

Sema3E sitoutuu suoraan Plexin-D1 intrasellulaarista signaali alkionkehityksen aikana tai kasvaimen angiogeneesiin [20]. Me määrittää, onko Plexin-D1 OEC soluissa vaaditaan Sema3E välittämä muuttavien /invasiivinen kyky, joka ei liity angiogeneesiin. Kaksi vakaa Knockdown klooneista, P0-3E /siD1-

1 ja P0-3E /siD1-

2, tuotettiin RNAi kohdentamalla erillisten Plexin-D1 sekvenssit, jotka vähennetään Plexin-D1-pitoisuutta 85% -95% määritettynä western blotting (Fig. 2B, vasen paneeli). Knockdovvn Plexin-D1 ei vaikuttanut ilmentymisen Sema3E, eikä elinkelpoisuutta tai solujen lisääntymistä (kuviot. 2B, S2C ja S2D). Kuitenkin invasiivisen /vaeltavien fenotyyppi myönnetty yli-ilmentyminen Sema3E purettiin menetys Plexin-D1 (Fig. 2D, F, G, H). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Sema3E koituu vaeltava kyky OEC soluihin Plexin-D1 autokriinisellä tavalla.

Täyspitkä luokan 3 semaforiini proteiinit voivat konvertaasia -välitteisen pilkkomisen, jolloin syntyy useita isomuotoja, joissa ero toimintaan [ ,,,0],15], [21]. Rintasyöpäsoluissa, P87-Sema3E proteiini pilkotaan furiinin osaksi P61 ja P26 isoformit, ja se on P61-Sema3E joka indusoi angiogeneesiä invasiivisia kasvua [15]. Kun suoritetaan Sema3E immunoblottaus on Sema3E ilmentävien OEC solujen, huomasimme, että P61-kokoinen bändi sijasta täyspitkän p87-Sema3E havaittiin, vaikka kaikki P0-3E kloonit transfektoitiin täyspitkän Sema3E cDNA rakentaa ( kuva 2A). Tutkimme, onko tämä P61-proteiinin vastasi furiinin jalostettuja Sema3E. Immunoblottaus osoitti, että furiinin oli läsnä kaikissa OEC soluissa (Kuva. S3A). Kun furiinin aktiivisuus estyi dekanoyyli- RVKR-kloorimetyyliketoniryhmä, ilmentäminen P61-Sema3E väheni merkittävästi, kun taas täysikokoinen P87-Sema3E tuli selväksi (Fig. S3B). Lisäksi Sema3E-välitteisen muuttavien /invasiivisia toimintoja olivat vaarassa, kun läsnä on furiinin inhibiittorin (Fig. 2I). Sen mahdollisuuden tutkimiseksi, että P61-Sema3E yksinään riittää edistää muuttavien /invasiivisia kyky OEC solujen myönnetyn Sema3E, loimme P0-3Ep61 klooneja, jotka ilmensivät vain P61-Sema3E isoformi. Molemmat

in vitro

(kuviot. 2J, S3C ja S3D) ja

in vivo

(Fig. 3C) tutkimukset osoittivat, että ilmentyminen P61-Sema3E yksinään riitti edistää muuttavien /invasiivisia kyky OEC soluja. RNAi-välitteinen knockdovvn Plexin-D1 OEC soluissa stabiilisti ilmaistu P61-Sema3E pienentynyt leviämiskyky myönnetty P61-Sema3E (tuloksia ei ole esitetty). Tuntemattomasta syystä, emme voineet tuottaa OEC soluista jotka ilmentävät pysyvästi mutantti p87-Sema3E resistenttejä furiinilohkaisu-. Siksi testasimme väliaine COS-soluista ohimenevästi transfektoitu joko P61-Sema3E tai p87-Sema3E solu- motiliteettia Sema3E-negatiivisten /Plexin-D1-positiivisia P0 soluja. Todellakin, eksogeeninen P61-Sema3E-väliaine annosriippuvaisesti edistää solujen vaeltamiseen ja tämä vaikutus on heikentynyt, kun Sema3E oli kulunut loppuun elatusaineesta esi-inkubointi anti-Sema3E vasta-aineella (Fig. S3E ja F). Kun käsittelemätöntä p87-Sema3E-elatusaine levitettiin, ei parannusta solumigraation havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että P61-Sema3E, mutta ei täyspitkä p87-Sema3E, edistää Plexin-D1 riippuvainen vaeltavia kyky OEC soluissa.

. Gross ja mikroskooppisia muutoksia keuhkoissa laskimoon (i.v.) injektio NOD /SCID OEC solulinjojen ilmaista erilaisia ​​Sema3E /Plexin-D1 toimintaa. Nuolenkärki osoittaa mikroskooppinen kasvain pesiä lähellä verisuonten puu. Mittakaava, 50 pm. B. immunohistokemia of Sema3E, sytokeratiinista, ja TTF1 keuhkojen etäpesäkkeitä NOD /SCID-hiiriin i.v. pistetään P0-3E-

1-soluissa. C. Tiivistelmä

in vivo

metastaattisen kokeellisia tuloksia. Määrä hiiriä mikro-metastaattinen tumorous vaurion keuhkojen (vasemmalle vinoviiva) verrattuna hiirien kokonaismäärä tutkittiin (oikealle vinoviiva) on esitetty. Keskimääräinen keuhkojen paino vaihteli ryhmien välillä (*,

P

0,05, Studentin

t

-testi).

Sema3E /Plexin-D1 signalointi edistää etäpesäke munasarjasyöpä endomet- syöpä

in vivo

vieressä arvioitiin

in vivo

metastaattisen kapasiteetti OEC solujen eri Sema3E /Plexin-D1 aktiivisuus NOD /SCID-hiiriin. Suonensisäisen Sema3E-negatiivisten P0 soluja missään vaiheessa johti tuumorimetastaasissa jossakin elimessä tutkittiin 8 viikon kuluttua solujen suonensisäisen injektion. Sen sijaan, injektio Sema3E ilmentävien OEC kloonien aiheuttama metastaattista kasvaimen kasvua keuhkoissa on osoituksena se kasvoi koko keuhkojen paino (Fig. 3C), brutto intrapulmonaariseen verenvuoto (Fig. 3A, ylälevyissä), ja läsnäolo mikroskooppisen kasvain pesiä lähellä verisuonten puut (Fig. 3A, pohja-paneelit). Keuhkojen kasvaimet alkunsa injektoidusta OEC solut kuten on osoitettu positiivinen immunoreaktiivisuus ihmisen Sema3E ja sytokeratiini (markkereita ihmisen soluja), mutta ei TTF-1, markkeri penumosyy- (Fig. 3B). Lisäksi Sema3E annoksesta riippuvainen ja Plexin-D1-riippuvaisen metastaattinen vaikutus havaittiin. Suurempi osuus keuhkojen mikro-etäpesäkkeitä kehitetään hiiriä, joihin injektoitiin OEC solut, jotka ekspressoivat korkeita tasoja Sema3E (P0-3E-

1, P0-3Ep61, P4-soluja), kun taas solut, joilla on alhainen Sema3E /Plexin-D1 aktiivisuus (P0 -3E-

10, P4 /si3E, P0-3E-

1 /siD1) oli alhaisempi kasvaimia (Fig. 3C). Myös P61-Sema3E yksin pystyi antamaan keuhkojen mikro-etäpesäke vanhempien P0 soluissa

in vivo

(Fig. 3C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että P61-Sema3E kautta Plexin-D1 signalointi vastaa annetaan annoksesta riippuvan stimulaation keuhkojen metastaattisen kasvun OEC soluja.

Sema3E /Plexin-D1 signaloinnin muuttaa dynaamisen yhden OEC solun morfologia, sopusoinnussa muutos solun liikkuvuus

havaitut muutokset OEC solun morfologiassa, joka korreloi aktiivisuuden Sema3E /Plexin-D1-signalointia. Solut, joilla on korkea Sema3E ilme ja nopea soluliikkuvuus kuten P0-3E-

1 ja P4-soluja yleensä kara-muotoinen, kaksinapaisen tai usean kulmikas fibroblastit ulkonäkö (Fig. 4A ja B), kun taas P0, P0 -3E-

10, P4 /si3E ja P0-3E-

1 /siD1 soluja, jotka oli alhainen Sema3E /Plexin-D1 aktiivisuus ja alhainen leviämiskyky, ylläpidetään korkeampi prosenttiosuus pyöreitä muotoja, joiden mukulakivi kaltainen ulkonäkö (Fig. 4A ja B). Tutkimme tämän korrelaation yksityiskohtaisesti, jäljittämällä yksittäiset OEC solujen muuttoreitit ja suorittamalla Ajastettu kuvaus aikana haavan paranemista määrityksessä. Toisin kuin vaikutelmia syntyvät vakaassa tilassa kuvia, Ajastettu kuvaus paljasti dynaaminen malli cytomorphological pyöräily välillä pyöreä, kaksisuuntainen ja monikulmaisia ​​muotoja, jotka havaittiin kaikissa OEC solut tutkittiin (Kuva. 4C). Huomasimme, että Sema3E /Plexin-D1 aktiivisuus vaikutti merkittävästi aikaa OEC solut havaittiin pyöreäksi. Siten P0 ja P0-3E-

1 /siD1 säilyy pyöreä morfologia yli P4 ja P0-3E-1-solut, jotka nopeasti siirtynyt läpi pyöreä muoto ja eteni nopeasti polarisoitunut karan muoto (Fig. 4C ja E) . Lisäksi yksittäinen solu jäljittämistä paljasti, että OEC soluja Sema3E /Plexin-D1 signalointi taipumus pysyä liikkeellä yhteen suuntaan pitkän matkan, mutta solut matalan Sema3E /Plexin-D1 aktiivisuus usein keskeytetty ja muuttivat vaellusreitillä (Fig. 4D ). Tämän seurauksena P4 ja P0-3E-

1 solut voivat liikkua nopeasti yhteen suuntaan pitkän matkan, kun taas P0 ja P0-3E-

1 /siD1 solujen pysähtynyt, jatkuvasti muuttunut suuntiin eivätkä kyenneet liikkuvat pitkälle yhteen suuntaan (Fig. 4D). Tämä korreloi hyvin yleistä vaeltavia kykyjä eri Seam3E ilmentävien OEC solujen arpeutumisprosessit määrityksessä. Enemmän kiehtovan, The cytomorphological siirtyminen kierroksen kara muoto, joka on hyvin liittyy hankintaan soluliikkuvuus muistuttaa ilmiö ns epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) [22], mikä viittaa siihen, että Sema3E /Plexin-D1 signalointia OEC soluja voisi osallistua EMT prosessissa.

. Edustavia kuvia kolmesta eri solun muotoja OEC solujen pyöreinä kaksinapainen ja multi-kulmikas. B. kvantifiointi prosenttiosuus kunkin morfologian käytettäessä potilailla (n≥400) OEC kloonien vaihteleva aktiivisuus Sema3E /Plexin-D1. C, D, E Aikaväli jäljitys (jopa 200 minuuttia 20 minuutin jäljitys välein) morfologiset dynamiikkaa yhden OEC solujen haavan paranemista (C). Yhden OEC muuttavien polut piirrettiin (D). Nuolet alku ilmoitetaan kunkin jäljittämisen, ja värilliset pisteet osoittavat asento jäljittää solun kunakin ajankohtana. Jokainen vaihe muuttavien sekvenssi merkitty numeroilla samat kuin (C). Pylväsdiagrammi in (E) yhteenveto keskimääräinen aika-aikaväli kuluu kunkin OEC solu kussakin erillisessä solujen muoto. *,

P

0,05, pariksi

t

-testissä.

Sema3E /Plexin-D1 signaaleja PI3K ja MAPK aiheuttaa ydin- Snail1 translokaation ja epiteelin to-mesenkymaalitransitioon

aikana EMT, solut usein menettävät epiteelin molekyylimarkkereita ja hankkia markkereita mesenkyymisolujen [23] – [26]. Meillä on siis tutkinut molekyyliprofiilin eri OEC kloonien onko Sema3E aiheuttamaa morfologisia muutoksia liittyi EMT tapahtumaan. E-kadheriinin, epiteelin markkeri oli säädellä vähentävästi Sema3E ilmentäviä OEC solujen Sema3E-pitoisuudesta riippuvasti, kun taas mesenkymaalisten markkereita vimentiinista ja fibronektiiniä oli voimistunut (Fig. 5A, B, ja tuloksia ei esitetty). Sitä vastoin, RNAi-knockdown Plexin-D1 Sema3E ilmentäviä soluja poistetaan Sema3E aiheuttamaa molekyylitason muutosten ominaisuus EMT (Fig. 5A ja C). Samanlaisia ​​Sema3E liittyvät muutokset EMT markkereita havaittiin, kun solut tutkittiin konfokaalisella immuno-fluoresenssimikroskopiaa (kuviot. 5C ja S4A). Lisäksi immunovärjäyty- filamenttisieni aktiinille Sema3E ilmentävien solujen tunnistettu filopodia ja lamellipodioihin muodostumista tyypillisiä EMT-indusoidun solun tukirangan muutoksia, mutta tämä ei havaittu soluissa, joilla on alhainen Sema3E /Plexin-D1 ilmentymisen (Fig. 5C, yläpaneelit).

, B. ilmentäminen solujen merkkiaineiden EMT korreloi tasoilla Sema3E /Plexin-D1 aktiivisuuden muutettu OEC soluissa mitattuna semikvantitatiivinen RT-PCR (A) ja Western-blottauksella (B). Sen sijaan jäsenet Snail perheen transkriptiotekijöitä, jotka säätelevät kehityshäiriöitä EMT ovat tasaisesti ilmaistaan ​​modifioitu OEC solulinjoissa. Signaalin intensiteetti normalisoitiin

GAPDH

(A) tai œ-Tubulin (B), tässä järjestyksessä, ja on merkitty suhteet. C, D. Konfokaalimikroskopia OEC solujen osoittaa siirtymistä epiteelin (E-kadheriinin) ja mesenkymaalista (vimentiinista) merkki ilmaisun ja selvä ydinvoima translokaatio Snail1 muutettuna OEC soluissa näytteille suurempi Sema3E /Plexin-D1 aktiivisuutta. Immunoreaktiivisuus rihmamaisia ​​aktiini ja ydinvoiman DAPI värjäystä käytettiin yleisesti merkkiaineiden solujen morfologia. Mittakaava, 20 um. E. Nuclear lokalisointi Snail1 liittyy korkea laatu ihmisen OEC kudoksen, mutta ei matala-asteista ihmisen OEC kudoksissa. Snail1 ei havaittu munasarjojen endometrioosi. Asteikko bar, 10 mikrometriä. F. E-kadheriinipromoottorin aktiivisuus, mitattuna normalisoitu lusiferaasiekspressio muutetussa OEC linjat, säätyy alas soluissa korkean Sema3E /Plexin-D1 signalointi. Tämä riippuu Snail1 translokaation jälkeen knockdovvn Snail1 tai mutatoidun E-box estää transkription tukahduttaminen. Virhe palkit osoittavat s.e.m., n = 9 **,

P

0,01, *,

P

0,05, pariksi

t

-testi. G. Western blotit havainnollistavat RNAi-välitteinen knockdovvn Snail1 in Sema-3E ilmentävien P0-3E-

1 soluihin lenti-virusinfektio. H. knockdovvn Snail1 ilmaisun P0-3E-

1-soluissa vähenee muuttoliikkeen haavan paranemista määrityksessä. I. knockdovvn Snail1 vuonna P0-3E-

1-soluissa indusoi siirtyminen kara muotoinen, vimentiinistä positiivinen pyöristetty, E-kadheriinin positiivisia solun morfologiassa. Asteikko bar, 10 mikrometriä. J, K. Farmakologisesti aiheuttama säilyttäminen ydinvoiman Snail1 mukaan leptomycin B (20 ng /ml) kasvaa leviämiskyky ja indusoi karan muotoisen solun morfologian P0 soluissa. Asteikko bar, 10 pm.

Merkittävä säätelijä EMT alkionkehityksen aikana ja syövän etenemistä on Snail perheen sinkkisormi transkriptiotekijöiden, joista Snail (Snail1) ja Slug (Snail2) ovat kaikkein intensiivisesti tutkittu [27] – [29]. Monet epiteelisyöpäsolujen aiheuttaa EMT kautta lisäävä säätely Snail1 välitteisen transkription [22]. Kuitenkin Sema3E ilmentyminen OEC solut eivät muuta mRNA: n tai proteiinin tasot Snail1 (tai Snail2 ja Twist) (Fig. 5A ja B). Funktio Snail1 voitaisiin vaihtoehtoisesti moduloida sen solunosasijaintia jotta tumaansiirtymiseen sytosolin Snail1 tarvitaan saavutettavuutta kohde promoottorien [30], [31]. Tutkimme, onko Sema3E /Plexin-D1 signaali moduloida solunosasijaintia Snail1 in OEC soluissa. Immuno-fluoresenssimikroskopialla osoitti sekapopulaatioon OEC solujen Snail1 joko pääasiassa tumassa tai sytoplasmassa. Kuitenkin ydinvoiman lokalisointi Snail1 korreloi positiivisesti Sema3E /Plexin-D1 aktiivisuutta. Soluissa, joilla on korkea Sema3E /Plexin-D1 aktiivisuus, kuten P0-3E-

1-soluissa, useimmat näytteillä hallitseva lokalisoituminen tumaan Snail1 (64% ± 8% [keskiarvo ± keskihajonta kolmesta kokeesta]), kun taas useimmat solut alhainen Sema3E /Plexin-D1 aktiivisuus näkyy pääasiallisesti sytosolin jakautuminen Snail1 (esimerkiksi: P0, 78% ± 6% sytosolinen Snail1 lokalisointi) (Fig. 5D). Lisäksi immunohistokemialla Snail1 ihmisen munasarjan endomet- karsinoomia paljasti, että korkea-asteen kasvaimet oli suurempi osuus syöpäsolujen ydin- Snail1 ja heikompilaatuisen kasvaimet olivat pääasiassa soluliman Snail1 lokalisointi (Fig. 5E). Sitä vastoin ei Snail1 ilmentymistä havaittiin endometrioosi kysta-vuori soluja (Kuva. 5E). Nämä havainnot viittaavat siihen, että Sema3E /Plexin-D1 signalointi munasarjojen endomet- syöpäsoluissa voi aiheuttaa EMT kautta tumaansiirtymiseen of Snail1.

onko Snail1 on alavirtaan reagoiva elementti Sema3E /Plexin-D1 signalointi OEC solujen yhteydessä EMT ja solun liikkuvuus, testasimme ovatko transkription säätely alaspäin epiteelisolukerroksen merkki E-kadheriinin vastauksena Sema3E /Plexin-D1 signalointi riippuu Snail1. Kuten on esitetty kuviossa. 5F, lusiferaasi promoottorin aktiivisuuden määritys osoitti, että solut, joilla on korkea Sema3E /Plexin-D1 aktiivisuudesta tukahdutettu promoottorin aktiivisuutta E-kadheriinin (esimerkiksi verrata P0-3E-

1-solujen P03E /siD1 tai P0 solut). Sen sijaan mutaatio E-box (kohde tunnustettu Snail1) tai RNAi-knockdovvn Snail1 johti menetykseen sorron E-kadheriinipromoottorin aktiivisuus myönnetty Sema3E /Plexin-D1. Lisäksi, knockdovvn Snail2 in P0-3E-

1-soluissa ei disinhibit tukahdutettu promoottorin aktiivisuutta E-kadheriinin (kuvio. 5F). Olemme myös havainneet, että RNAi-knockdown Snail1 in Sema3E-ilmentävät solut aiheuttivat kara-muotoisten solujen tansformed osaksi pyöreämpiä muoto ja ilmaisuja E-kadheriinin ja vimentiinin samanaikaisesti muuttuneet (kuvio. 5G ja I), mikä osoittaa, että Snail1 tarvitaan Sema3E n aiheuttamaa EMT. Lisäksi parannettu leviämiskyky myönnetty Sema3E vuonna P0-3E-

1 soluja väheni, kun Snail1 oli RNAi-vähene, vaan muuttumattomana RNAi-ehtyminen Snail2 (Fig. 5 H). Päinvastoin, pakko säilyttäminen Snail1 tumassa, jonka leptomycin B käsittely Sema3E-negatiivinen P0-solujen lisääntynyt solujen vaeltavien kyky ja tuloksena transformaation kara-muotoisten solujen (Fig. 5J ja K). Tämä viittaa siihen, että Snail1 translokaation tumaan toiminnot alavirtaan Sema3E signaloinnin välittäjänä solumorfologian ja liikkuvuuteen. Time-lapse jäljittäminen Snail1 solunosasijaintia versus solun muotoon ja vaeltavia nopeus paljasti korrelaatio Snail1 ydinvoiman lokalisointi ja kara solujen muoto sekä lisääntynyt muuttavien nopeuden (Kuva. S4b, C ja D). Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että Sema3E /Plexin-D1 signalointi munasarjojen endomet- syöpäsoluissa voisi säädellä Snail1 translokaatio tumaan jotta aiheuttaa EMT ja samanaikaisesti lisätä solun liikkuvuus.

Solunsisäinen signalointireitin (t), jotka saattavat säännellä Sema3E /Plexin-D1 välittämää translokaatiota Snail1 ja myöhempien EMT in OEC soluissa tutkittiin testaamalla vaikutuksesta useita tunnettuja estäjät solun liikkuvuuteen ja Snail1 solunosasijaintia. P38-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (SB203580), proteiinikinaasi C: n (GF109203X), ja N-terminaalista Jun-kinaasia (SP600125) in Sema3E ilmentäviä OEC solujen ei ollut vaikutusta Sema3E-lisätyn solumigraatio tai Snail1 tumaanohjaussignaali. Sen sijaan esto fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) (LY294002 ja wortmanniini) tai ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK) /mitogeeni aktivoitua proteiinikinaasi (MAPK) (PD98059) aktiivisuus johti sytosolin säilyttäminen Snail1 ja samanaikainen lasku leviämiskyky myönnetyn Sema3E (Fig. 6A, B ja C). Immunoblottaus osoitti myös, että Sema3E ilmaisu korreloi fosforyloidun ERK1 /ERK2 ilmaisua, mikä vähentynyt kun PD98059 hoitoon (Fig. 6D). Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että PI3K ja ERK /MAPK ovat tärkeimmät solunsisäinen signalointi komponenttien transdusoivaa Sema3E /Plexin-D1 välittämä Snail1 tumaansiirtymiseen.

, Cell siirtokuoppaan invaasiomääritys of P0-3E-

1-soluissa paljastaa merkittävä lasku muuttavien solujen toimintaa seuraava farmakologinen esto PI3 kinaasi (LY294002, tai wortmanniinin) ja ERK /MAPK (PD98059) muttei p38 mitogeeni aktivoitua proteiinikinaasi (SB203580), PKC (GF109203X), tai Jun-N-terminaalista kinaasin ( SP600125). Scale bar, 30 mikrometriä. **,

P

0,01, *,

P

0,05, pariksi

t

-testi.