Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mutaatiot

MCPH1

(Microcephalin) ja

ASPM

(epänormaali kara -kuten pienipäisyys liittyvä) geenit aiheuttavat ensisijainen pienipäisyys. Molemmat ovat centrosomal liittyviä proteiineja mukana mitoosia. Microcephalin on tärkeä rooli DNA: n vaurioita vasteen ja ASPM tarvitaan oikea jako proliferatiivisten neuro-epiteelisolujen kehittää aivoihin. Alennettu

MCPH1

mRNA ilmaisun ja

ASPM

mRNA yli-ilmentyminen on osallisena inhimillisen karsinoomia. Epiteelin munasarjasyöpä (EOC) on ominaista erittäin aneuploidi kasvaimia. Aikaisemmin olemme raportoineet alhainen Microcephalin ja korkea ASPM proteiinia tasoja ja yhdistysten kanssa kliinis-patologinen parametrit pahanlaatuisten solujen ascitic nesteistä. Vahvista nämä aikaisemmat havainnot suuremmassa mittakaavassa Microcephalin ja ASPM ekspressiotasot ja lokalisoinneissa arvioitiin immunohistokemiallisesti kahdessa ikäluokat; koulutus joukko 25 näytettä ja validointi joukko 322 EOC kudosnäytteistä. Tulokset korreloivat assosioituneille histopatologiset tulokset. Normaalissa munasarjan kudoksissa Microcephalin tumavärjäystä kuvio oli johdonmukaisesti vahva. Syövän kudoksissa, tunnistimme alhainen ydinvoiman Microcephalin ilmaisun korkealaatuista ja pitkälle kasvaimet (

p

0,0001 ja p = 0,0438 vastaavasti). ASPM oli kohtalainen tai korkea ydin- ja alhainen tai kohtalainen sytoplasmista ilmentymistä normaalissa kudoksessa. Sytoplasmisen ASPM ilme väheni kasvaimen ja vaihe vakavasta alatyypin EOC (p = 0,023 ja p = 0,011 vastaavasti). Sytoplasmisen ASPM kasvoi kasvain vaiheessa endomet- alatyyppi (p = 0,023). Lisääntyvä kasvain invasiivisuus (T3) ja imusolmukemetastaaseja (N1) myös korreloi lasku sytoplasman ASPM in EOC (p = 0,02 ja p = 0,04 vastaavasti). Olemme validoitu aiempia havaintoja vapautetuilla ilmentymisen Microcephalin ja ASPM in EOC vahvistamalla yhdistysten alhainen ydin- Microcephalin ja korkeat sytoplasman ASPM tasot suuremmassa mittakaavassa kasvainkudoksen tutkimus. Microcephalin ja ASPM voi osoittautua hyödylliseksi biologisten merkkiaineiden EOC.

Citation: Alsiary R, ​​Brüning-Richardson A, Bond J, Morrison EE, Wilkinson N, Bell SM (2014) Puretaan Microcephalin ja ASPM Expression korreloivat epiteelikasvaimet munasarjasyöpä Progression. PLoS ONE 9 (5): e97059. doi: 10,1371 /journal.pone.0097059

Editor: Xifeng Wu, MD Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 helmikuu 2013; Hyväksytty: 14 huhtikuu 2014; Julkaistu: May 15, 2014

Copyright: © 2014 Alsiary et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ ja Dr. Brüning-Richardson rahoitti Yorkshire Cancer Research [L328] drakhman Morrison, Bond ja Bell. Leedsin yliopiston tukee Dr. Bell, tohtori Bond ja Dr. Morrison. Dr. Alsiary jonka apurahan Saudi Arabian opetusministeriön korkeakoulu, tohtori Wilkinson Leeds opetussairaaloissa NHS Trust. Dr. Wilkinson omistaa rahoituksen hyvinvointi naiset. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Noin 225.000 uutta tapausta munasarjasyövän todettiin vuonna 2008 maailmanlaajuisesti sisältää 4% kaikista naisten syövistä [1], [2]. Suurin osa munasarjojen syöpiä ovat epiteelin, usein läsnä vaiheissa ja liittyy korkeaa kuolleisuutta [3]. Siksi tutkii toiminta ja ilmentyminen mahdollisten prognoosi- proteiinien on välttämätöntä etenemistä käsityksemme molekyyli patogeneesin epiteelin munasarjasyöpä (EOC). Tämä on erityisen toivottavaa suhteen tunnistamiseen diagnostisten biomarkkereita potilaan hoidossa [4].

MCPH1

ja

MCPH5

koodaavat Microcephalin ja epänormaalin karamaisen pienipäisyys liittyvä proteiini (ASPM) vastaavasti [5], [6].

MCPH1

ja

MCPH5

kaksi kymmenestä pienipäisyys geenien tunnistettu, jotka sekaantuneet peittyvästi ensisijainen pienipäisyys (MCPH) [7] – [13]. Pienipäisyys on tunnusomaista alentunut sikiön aivojen kasvua johtuvat mitoosi vikojen aikana alkion aivojen kehityksessä [14]. Microcephalin on ydin- ja sytoplasminen proteiini, joka koostuu 835 aminohaposta. Proteiini sisältää kolme BRCA1 C-terminaalissa verkkotunnuksia (BRCT), yksi

N

terminaalisesti sijaitseva ja kaksi

C

-pään [5]. Microcephalin on mukana DNA-vaurioita vastaus, jossa lisäksi rooli säätelijänä kromosomin kondensaation estämiseksi soluja pääsemästä mitoosin ennen DNA: n kahdentuminen on valmis [15] – [17]. Microcephalin tunnetaan myös BRIT1 (

BRCT

-Toista estäjä hTERT lauseke), joka alun perin tunnistettiin transkription repressori ihmisen telomeraasin käänteistranskriptaasin (hTERT), katalyyttinen alayksikkö ihmisen telomeraasin [18]. ASPM proteiini koostuu 3477 aminohaposta [6] organisoitu oletetun

N

terminaalista mikrotubulusta sitova alue [19], [20], kaksi Calponin -homologitoisto motiiveja, yli 80 isoleusiini-glutamiinia (IQ) toistoa [6], [21], jotka sitoutuvat tyypillisesti kalmoduliinista ja

C

-pään, joka koostuu yhdestä Armadillo kuin sekvenssin ja alueen, joka liittyy sytokineesiin [8], [22]. ASPM on rooli valvoa sukkularihmaston toiminto [6], [22]. ASPM sijaitsee karan navat metafaasissa ja ytimessä ja sentrosomimäärän aikana interphase [6], [22] – [27]. Lisäksi ASPM paikantuu keskiosalla aikana sytokineesi, mikä viittaa siihen, että se on rooli abscission [22], [27].

Useat riviä tulokset viittaavat Microcephalin ja ASPM osansa syövän synnyssä. DNA-tasolla, Rai

et al.

Todettu, että

MCPH1

kopioluku oli vähentynyt 40% (35/87) kehittyneen EOC ja 72% (39/54) rintojen syöpätapausta [16]. Samoin mRNA-tasolla

MCPH1

mRNA väheni 63% (19/30) ja EOCs [16]. Olemme raportoineet vähentänyt Microcephalin proteiinin tasot 29% (93/319) invasiivisen ductal rintakarsinoomia, jossa Microcephalin ilme pienenee yhä rintasyöpä luokka. Tärkeää on, Microcephalin oli itsenäinen ennustaja yleistä rintasyövän tautivapaalle [28]. Äskettäin kaksi muuta pientä rintasyöpää tutkimukset ovat vahvistaneet yhdistyksen alennettu Microcephalin ilmaisutapoja kasvainprogression ja ennusteen [29], [30]. Vähentynyt Microcephalin ilmentyvän myös raportoitu pienellä Eturauhassyöpätutkimuksessa [16], joka ehdotti, että negatiivinen korrelaatio välillä Microcephalin tasojen genomin vakautta ja kromosomipoikkeavuustestissä. Äskettäin inaktivointi

MCPH1

deleetiolla, promoottori metylaatio ja mutaatio tunnistettiin suullisen okasolusyöpä tutkimuksen [31]. Tämä tutkimus osoitti myös, että Microcephalin yli ilmaus estivät proliferaatiota, invaasio ja ankkurointi riippumatonta kasvua ja kasvaimen kasvua nude-hiirissä tukemaan tuumorisuppressori funktio Microcephalin [31].

Sen sijaan

ASPM

mRNA kohoamiseen kasvaimen ja transformoituja ihmisen soluihin [26], [32]. Lisääntynyt

ASPM

mRNA ja proteiini tasoilla havaittiin myös glioblastoma multiforme (GBM), missä ne liittyvät kasvaimen lisääntyvän [32], [33]. Lisäksi

ASPM

mRNA säätelyyn ylöspäin tunnistettiin 66% (162/247) maksasolukarsinoomat, havainto liittyy lisääntynyt invaasio, korkea vaiheessa ja varhaisen kasvaimen uusiutumisen [34]. Äskettäin ylösajon ASPM korreloi alentunut elossaololuku on myös tunnistettu haimasyövän [35].

Viime EOC tutkimus määritti korrelaatiota Microcephalin ja ASPM tasoilla kasvaimen ja eloonjäämisen solulinjoissa ja primaarisissa viljelmissä pahanlaatuisten solujen, jotka ovat peräisin munasarjojen askites näytteistä [36]. Tässä työssä olemme validoitu alkuperäisestä havainnot suuremmassa mittakaavassa, jossa käytettiin EOC kudosnäytteitä ja ovat tutkineet roolit Microcephalin ja ASPM in EOC etenemistä. Tuloksemme viittaavat siihen, että Microcephalin ja ASPM voivat olla käyttökelpoisia biologisten merkkiaineiden EOC hallintaan.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Asianmukaiset eettinen hyväksyntä saatiin Local Research Ethics komitea Leeds Sairaalaopetuksen NHS Trust, Leeds, Iso-Britannia, (REC viite 09 /H1306 /96). Kaikki osallistujat toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen ja kaikki tiedot analysoitiin anonyymisti.

Potilasnäytteet

kohortin 25 kasvaimen arkistointia formaliinikiinnitetyt, parafinoidut (FFPE) lohkot saatiin histopatologia osasto St James University Hospital, Leeds ja käytetään luomaan opetusjoukolla. Näyte asettaa tässä kohortissa edusti neljä suurta (yleisimpiä) EOC alatyyppeihin (vakavien, endomet-, mucinous ja karsinosarkooma) ja olivat pääasiassa 3. asteen kasvaimet. Kaikki lohkot tässä kohortissa yhdistettiin sitten yhdeksi talon kudos microarray (TMA). Normaali kohortti koostui 16 munasarjakudoksen otettujen näytteiden joko normaalista munasarjasta tai normaalista kudoksesta vieressä kasvain plus 4 normaali munanjohdin ja 4 normaaleja endometriumin näytteet olivat myös saatavilla.

Toinen riippumaton kohortin 322 EOC näytteistä saatiin alkaen Tissue Array Networks ja nimettiin validointi asetettu. Validointi joukko koostui 294 eri näytteitä viiden suuren EOC alatyyppiä (vakavien, endomet-, adenokarsinooma, mucinous ja kirkas solu), plus 8 normaali munasarjojen kudoksiin otettu normaalista munasarjasta ja 20 normaalista kudoksesta vieressä kasvain. 322 tapausta olivat edustettuina 616 ydintä, jossa on kaksinkertainen sydämiä varten syöpätapausta ja yhden ytimen normaalia kudosta. Tissue ytimet olivat 0,6 mm halkaisijaltaan, jonka paksuus on 5 um. Kliiniset tiedot (laatu, patologia diagnoosi, International Federation of Naistenklinikka ja synnytysten (FIGO) lavastus ja TNM lavastus [37]) olivat saatavilla tämän kohortin. Keskimääräinen ikä 294 potilaista oli 48 vuotta (vaihteluväli: 19-76 vuotta). Tulokset yhdessä iän saatiin sen jälkeen, kun tiedot on kaksijakoinen kahteen ryhmään ( 50 ja ≤50). Yksityiskohtainen potilaan ominaisuudet validointi asetettu esitetty yhteenvetona taulukossa 1.

Tissue Microarray Hakemisto Rakentaminen

In-house TMA rakennettiin 25 EOC näytteitä Leeds Institute of Cancer ja patologia laitos jälkeen kuvanneet Ellis

et al

[38]. Manuaalinen kudoksen ryhmittäjällä lyöntejä, jonka halkaisija on 0,6 mm (Beecher Instruments, Inc) käytettiin luomaan ydintä. Tissue ytimet valittiin edustavimmat kasvain alue kussakin kasvainblokki tarkistuksen jälkeen siihen liittyvän hematoksyliinillä ja eosiini värjätään liukuu erityisviranomainen naistentautien histopathologist (NW).

immunohistokemia havaitseminen Microcephalin ja ASPM

optimoimiseksi Microcephalin ja ASPM värjäys pöytäkirja, talon EOC TMA leikkeet värjättiin käyttämällä erilaisia ​​vasta-aineen laimennoksia ja antigeenin hakumenetelmät. Microcephalin ja ASPM värjättiin erikseen samoissa olosuhteissa lukuunottamatta vasta-haku ja laimennus. Lasit päällystettiin deparaffinised ja rehydratoitiin käyttäen ksyleenin ja etanolin sarjassa. Jos haluat estää vetyperoksidaasia aktiivisuutta, dioja liotettiin 3% H

2O

2 metanolissa. Antigeeni haku suoritettiin käyttäen Vector antigeeni haku puskuria (Vector Laboratories Ltd) painekattilassa 4 minuuttia Microcephalin ja 2 minuuttia ASPM. Leikkeitä blokattiin 01:10 vektori Kaseiiniliuos (Vector Laboratories) vähentää epäspesifistä värjäytymistä. On TMA osissa kanin anti-Microcephalin-vasta ab2612 (Abcam) käytettiin 1/300 ja kanin anti-

N

terminaalista ASPM vasta-216,1 [36] käytetään 1/400. Levyjä inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli kosteassa kammiossa. Kolmen pesun jälkeen TBS: llä Tween (0,1%) kalvot inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa kanin /hiiri-peroksidaasi-konjugoitua EnVision polymeeri (DAKO). Sen jälkeen pesua reaktio visualisoitiin lisäämällä 2% diaminobenzine + Kromogeeni in DAP substraattia puskurissa 10 minuutin ajan (DAKO). Osiot vastavärjättiin Mayerin hematoksyliinillä (VWR International Ltd). Negatiiviset kontrollit, ilman primaarisen vasta-aineen ja positiiviset kontrollit normaalin munasarjakudoksen sisällytettiin jokaisen erän Immunohistokemian.

Microcephalin ja ASPM Vasta Validation

Sen määrittämiseksi värjäytymisen spesifisyyden Microcephalin vasta-aineen FFPE näytteitä, immunisoivaa peptidiblokeerauskokeista koe suoritettiin EOC kudosnäytteiden sekä 25 erillistä in-house TMA. Vasta-aine neutraloitiin esi-absorption kanssa BRIT1 peptidi ab13737 (Abcam). Vasta-aine laimennettiin ennalta määrättyyn toimi pitoisuus (kuvattu edellä), ja niitä inkuboitiin kymmenkertainen ylimäärä peptidin yön yli 4 ° C: ssa ennen käyttöä kudokseen. Kudosleikkeiden neutraloitua vasta-verrattiin vastaaviin kudosleikkeiden värjätty vasta-aineella yksinään.

Olimme jo määritetty vasta spesifisyys ASPM vasta-216,1 aiemmissa työlle peptidiblokeerauskokeista immunofluoresenssilla kokeiluja [36]. Olemme edelleen vahvistaneet värjäysrintamaan vasta havaittu IHC värjäämällä saman talon EOC TMA toisella vasta-aineella (279,3) syntyy vastaan ​​

C

-pään of ASPM. Samanlaisia ​​värjäys tulokset saatiin molemmissa vasta vain pieniä eroja sytoplasmista värjäytymistä tasojen.

Lisätietoja validointi spesifisyys ja herkkyys vasta-aineita ja kontrolloida vaikutuksia formaliinia kiinnityksen ja antigeeni haku,

MCPH1

ja

ASPM

tippuu alas U-2 OS solulinja (ATCC, Manassas, VA, USA) siRNA aikaisemmin kuvatulla [17], [36], [22]. 72 tunnin kuluttua solut kerättiin talteen, pelletoitiin, formaliinilla ja suspendoitiin 1% agar sitten parafiiniin ja käytettiin kontrolleina vasta-validointi.

immunohistokemiallinen arviointi

Kaikki TMA leikkeet skannataan Aperio Scan Scope dia skanneri (Aperio Technologies) on 40x suurennos, käyttämällä morfometria työkaluja Imagescope ohjelmistot (Aperio). Sekä Microcephalin ja ASPM samanlaiset ytimet jokaisesta näytteestä pisteytettiin värjäytymisvoimakkuuksia ydin- ja sytoplasmista värjäytymistä (intensiteetti pisteet, 0 = ei värjäystä, 1 = heikko värjäystä, 2 = kohtalainen värjäytyminen ja 3 = voimakas värjäytyminen) sekä osuus solujen positiivisen ydin- tai sytoplasmista värjäytymistä ytimissä (osuuden pisteet). Analysoida Microcephalin värjäämällä puolikvantitatiivinen Allred (nopea) 8-yksikkö on ollut käytössä [39]. Osuus positiivinen ydin- tai sytoplasmista värjätään solut kussakin ytimessä määriteltiin 0 = ei värjäystä, 1 = 1% värjäystä, 2 = 1-10% värjäystä, 3 = 11-33% värjäystä, 4 = 34-66% värjäys, 5 = 67-100% värjäystä. Lopullinen pistemäärä saatiin lisäämällä intensiteetti pistemääriä osuuden tulokset, saavuttaa vähintään pisteet 0 ja maksimipisteet 8. Tapaukset tuloksella 4 tai alempi kutsuttiin alhainen, kun taas tapauksissa tuloksella 5 tai 6 olivat merkitty kohtalainen ja näytteet tuloksella 7 tai 8 katsottiin ilmentävät korkeita Microcephalin. Tietojen analysointi ASPM ilmentymisen hieman herkempiä data-analyysin järjestelmää on käytetty, jossa värjäytyminen intensiteetti kerrottuna prosenttiosuus solujen ydin- tai sytoplasmista värjäytymistä [40]. Siten alin pistemäärä on 0 ja korkein 300. Näytteet pistemäärällä 0 kutsuttiin negatiivisia näytteitä tuloksella 1-100 alhainen, näytteet tuloksella 101-200 kohtalainen ja näytteitä pistemäärällä 201-300 olivat pisteytettiin korkeat ekspressiotasot. Epäjatkuvien tietojen analysointi kaikki negatiiviset ja alhainen näytteet nimettiin alhainen ja kaikki keskisuuren ja korkean näytteet suuri- ASPM tasoilla.

Tilastollinen analyysi

epäparametrinen Kruskall-Wallis (KW) ja Wilcoxonin -Mann-Whitney (WMW) testiä käytettiin tunnistamaan yhdistyksen välillä Microcephalin ja ASPM kliinisiä muuttujia (sairauden vaihe, laatu, histologia tyyppi, etäpesäkkeitä, imusolmuke osallistuminen ja potilaiden iästä). Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia, ja

P

≤0.05 arvoja pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Microcephalin ja ASPM Vasta karakterisointi

Microcephalin ja ASPM vasta alun perin optimoitu käytettäväksi parafinoidut TMA osissa. Immunohistokemia nämä vasta-aineet osoittivat, että Microcephalin ja ASPM oli tumassa ja sytoplasmassa sekä normaalin (kuvio 1) ja EOC kudosnäytteistä (kuvio 2). Ydin- Microcephalin värjäyskuvio poistettiin, kun vasta-ainetta esi-inkuboida läsnä peptidin. Kuitenkin jotkut yhtenäinen alhainen tausta sytoplasmista värjäytymistä oli yhä läsnä kaikissa ytimet (kuva S1). Siksi ei ole sisällytetty sytoplasmisen Microcephalin värjäytymistä mitään myöhempää analyysia varten.

Normal munasarjojen epiteelin osoittavat vahvaa Microcephalin ilmentymistä sekä ytimet ja sytoplasmassa (A K). Normaali Endometrium osoittaa heterogeenistä vahva ydin- ja sytoplasmista Microcephalin värjäytymistä (C F) ja vahva ydin- ja heikko sytoplasmista ASPM värjäytymistä (I L). Kaikki kuvat ovat x15 suurennus.

seroosit adenokarsinooma TMA ytimet osoittavat ydin- ja sytoplasman Microcephalin (A ja B) sekä ASPM ilmaisun (C ja D) osalta. Valkoinen nuoli näyttää tumavärjäystä ja musta nuoli osoittaa sytoplasmista värjäytymistä. A ja B ovat 20x, C ja D ovat 40x suurennos.

värjäytyminen kuvio ASPM vasta-aineen 279,3 suoritetaan rinnakkain värjäystä vasta-aineella 216,1 paljasti, että sytoplasmista värjäytymistä oli samanlainen molemmille vasta-aineita. Kuitenkin 216,1 osoitti selvempää tumavärjäystä kuvio kuin 279,3 Sen vuoksi tätä vasta-ainetta käytettiin värjäämään EOC validointi asetettu. Tulokset värjäytymiskuvioissa edustava ytimien ja yhteenveto värjäyksen tulokset on esitetty kuvassa S2 ja Taulukko S1.

edelleen päteväksi vasta-aineiden värjäytyä parafinoidut kudoksissa, vasta-aineet testattiin parafiini -Embedded U-2 OS -soluihin ja ilman siRNA knockdown varten Microcephalin tai ASPM. Knockdown soluja molemmat geenit osoittivat erittäin heikkoa värjäytymistä suhteessa kontrolliin siRNA (kuva S3).

Microcephalin ilmentäminen Normaali ja EOC Kudosnäytteiden

Normal munasarja-, kohdun limakalvo ja munanjohtimen kudosnäytteiden kaikki paljastui vahva ydinvoima Microcephalin värjäytymistä. Suurin osa (90%) normaalia munasarjaepiteelisoluilla osoittaneet positiivisia Microcephalin värjäytyminen, kun tätä oli hieman pienempi (70-80%), kohdun limakalvolla ja munanjohtimen näytteet (kuvio 1A-F). Aluksi ilmaus Microcephalin arvioitiin talon koulutuksen asetettu TMA. Dikotominen analyysi harjoitussarjassa osoitti menetys Microcephalin ilmentymisen 16/22 (73%) tapauksista (taulukko 2). Vuonna EOC validointi asetettu, matala Microcephalin ilmentyminen todettiin 30% (89/294) ja EOC näytteistä (taulukko 3). Koska olimme erityisen kiinnostuneita Microcephalin ekspressiotasot ja sen liittämistä tuumorigeneesiä, tutkimme meidän IHC tiedoista mahdolliset korrelaatiot niihin liittyvät kliiniset tiedot. Mielenkiintoista, Dikotominen analyysi harjoitussarjassa osoitti menetys Microcephalin ilmentymisen aste 3 EOC kasvaimet (taulukko 2). Tämä havainto vahvistettiin validointi asetettu alhainen tumavärjäystä pääosin löydetty luokka 3 kasvaimet (48%; 53/110 p 0,0001). In heikompilaatuisen kasvaimet, kohtalainen tai suuri tumavärjäystä havaittiin (

p

0,0001) (kuva 3). Microcephalin ydinvoiman ilme laski myös lisääntynyt kasvain vaiheessa (

p

= 0,0438) (kuva 4). Potilaat yli 50-vuotiaita osoittaneet alemman ydin- Microcephalin tasoja (taulukko 3), mutta ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (

p

= 0,0581). Ei merkittäviä muutoksia Microcephalin ilmaisun tunnistettiin eri patologisten alatyyppejä (

p

= 0,486) (taulukko 3). Kuitenkin suurin osa (8/10, 80%) kirkasta solukarsinoomat näkyy kohtalainen tai voimakas Microcephalin immunovärjäyksen. Tämä saattaa johtua siitä, että 6/8 näistä tapauksista oli vaihe I ja tai että eri alatyyppeihin EOC noudattavat eri molekyyli- reittejä. Totesimme myös korkeat menetys Microcephalin vuonna vakavien ja mucinous adenokarsinooma (68/207, 33% ja 15/44, 34%: lla, taulukko 3). Kuva 5A-D osoittaa ekspressiota Microcephalin eri epiteelin munasarjasyöpä alatyyppejä.

Ai. Normaali munasarjojen epiteelin kudos suurella Microcephalin ilme. AII-iv. Adenokarsinooma TMA ytimet vahvassa Microcephalin ilmentymistä huono laatu kasvain (AII), kohtalainen Microcephalin palkkaluokan 2 (Aiii) ja alhainen ydin- Microcephalin ilmentymistä korkealaatuista kasvain (AIV). Kaikki kuvat ovat 40x suurennus. B. korrelaatio ydin- Microcephalin ilmaisu pienenee kasvaimen lisääntyvän (

p

0,0001 käyttäen ANOVA-testi).

Ai. Normaali munasarjojen epiteelin kudosten osoittavat korkeat Microcephalin ekspressiotasot. AII-4IV Adenokarsinooma TMA ytimet vahvassa Microcephalin (aii), kohtalainen Microcephalin (Aiii) ja alhainen ydin- Microcephalin ilmaisun (AIV) vaiheessa 1, 2 ja 3 kasvaimet vastaavasti. Kaikki kuvat ovat 40x suurennus. B. Heikko Microcephalin tasot tumassa liittyvät kehittynyt kasvain vaiheessa (

p

= 0,0438 käyttäen ANOVA-testi).

. Tyhjennä solu syöpä ja B. endomet- adenokarsinooma sekä vahvassa Microcephalin ilme. C. mucinous adenokarsinooma ja D. seroosit adenokarsinooma sekä esittämällä heikkoa Microcephalin ilme. Kaikki kuvat ovat x40 suurennus.

ASPM ilmentäminen Normaali ja EOC Tissue Näytteitä

normaali munasarjojen epiteelin, kohdun limakalvo ja munanjohtimen näytti muuttuvan ASPM lauseke, jossa kohtalainen tai korkea ydin- ilmaisun ja alhainen tai kohtalainen sytoplasmista ASPM värjäytymistä (kuvio 1G-L). ASPM ilmentämiskuviota EOC määritettiin immunohistokemiallisesti käyttäen opetusjoukolla 25 parafinoidut osissa. Värjäytymä Näiden kasvain näytteissä oli ydin- ja sytoplasman. Vuonna training set korkea tumavärjäystä (yhdistetty keski- ja voimakas värjäytyminen kuvio) havaittiin korkealaatuista kasvaimet (9/14, 64,3%), kun taas korkea sytoplasman ASPM oli läsnä kaikissa ydintä riippumatta luokka. Kuitenkin jakamalla värjäys osaksi heikko, keskipitkällä ja vahva paljasti kasvu ydinvoiman ASPM tasot asteen 3 kasvaimia. Kaiken osuus positiivisten tumavärjäystä luokiteltiin vahva (21%, 4/19), keskipitkän (31,6%, 6/19) ja heikko (47,4%, 9/19) (taulukko 4). Analyysi osoitti, että 10,5% (2/19) Näytteiden oli vahva sytoplasmista värjäytymistä ja 89,5% (17/19) oli kohtalainen sytoplasmista värjäytymistä. Alhainen sytoplasminen värjäys ei havaittu. Tarkempi analyysi paljasti suuntauksen lisääntynyt soluliman ja ydinvoiman ASPM värjäys asteen (taulukko 4).

validointi asettaa ydin- ja sytoplasmista värjäytymistä havaittiin myös. Värjäyskuvioiden vaihteli kasvaimen näytteitä ja esimerkkejä matalan ja korkean ASPM ilmaisu esitetään kuviossa 6A-D. Tilastollisesti merkitseviä tunnistettiin välillä ydin- ASPM ilmaisun ja kliiniset tiedot. Vaikka mielenkiintoisesti 52/294 (18%) tapauksista osoitti ydinvoiman ASPM ilmaisua, mikä lisäsi arvosanalla. Analyysi validointi asetettuun jatkuvan datan analyysi paljasti alhainen sytoplasman ASPM korreloi merkitsevästi korkealaatuista kasvaimia vakavien alatyyppi (p 0,001) (kuvio 7A). Epäjatkuvasti analyysi paljasti, että oli olemassa merkittävä korrelaatio alhainen soluliman ASPM ja korkea kasvaimen (p = 0,0138) sekä kasvaimen FIGO vaiheessa (p = 0,032) (taulukko 5). Edelleen analyysi epäjatkuvan tietojen jakoa edelleen syöpä alatyyppeihin paljasti, että sen lisäksi, että korrelaatio on alhainen sytoplasman ASPM korkea kasvaimen oli myös yhdistyksen alenevassa ASPM sytoplasman tasoilla yhä arvosana vakavien alatyyppi (p 0,0001) ( Kuva 7B) ja se kasvoi ASPM ekspressiotasoja yhä kasvain vaiheessa endomet- alatyyppi (p = 0,0229) (kuvio 7C). Merkittävä assosiaatio vähentämällä sytoplasminen ASPM värjäytymistä ja vaihe serous alatyyppiä on myös identifioitu (p = 0,0017) (kuvio 7D). Merkittävä assosiaatio soluliman ASPM tasoja ja potilaan iän ei havaittu (taulukko 5).

A ja B TMA ydin alhainen ydin- ja sytoplasmista ASPM ilme. C ja D. TMA ydin ydinvoiman ja sytoplasmista ASPM ilme. Valkoinen nuoli osoittaa tumaväriä, musta nuoli osoittaa sytoplasmisen tahra. A ja C ovat 6.2x ja B, D ovat 20x suurennus vastaavasti.

. Sytoplasmisen ASPM tasot vähenee arvosana vakavien EOC (jatkuva data, p 0,0001). B. Sytoplastiset ASPM tasoilla vähenee kasvaimen sisään vakavien alatyyppi (epäjatkuva tiedot, p = 0,0239). C. Sytoplastiset ASPM tasoilla kasvaa taudin vaiheessa endomet- EOC (epäjatkuva tiedot, p = 0,0229). D. Sytoplastiset ASPM tasojen lasku sairauden vaiheessa vakavien alatyyppi (epäjatkuva tiedot, p = 0,0017). E. Sytoplastiset ASPM tasoilla vähenee kasvaimen invaasiota (epäjatkuva tiedot, p = 0,02). F. Korkea sytoplasminen ASPM tasot korreloivat ilman imusolmuke osallistuminen (p = 0,04). Kaikki tiedot analysoidaan ANOVA testiä.

Suhde Histopatologisten Staging (FIGO ja TNM lavastus) ja Microcephalin ja ASPM ilmaisun

validointi asetettu Microcephalin todettiin vähentävän yhä kasvain vaiheessa käytettäessä FIGO pysähdyspaikan järjestelmä (

p

= 0,0438) (taulukko 3). Samoin ASPM sytoplasminen värjäys, laskivat kasvaimen vaiheesta käytettäessä FIGO pysähdyspaikan järjestelmä (

p

= 0,0032) (taulukko 5). Microcephalin ja ASPM ilmentymistasot arvioidaan tarkemmin yhteydessä sairauden vaikeusasteen määritetty taso kasvaimen invasiivisuus (T1, T2 ja T3). Nuclear Microcephalin ekspressiotasot laskivat, vaikka kasvain rajoittui munasarjat (T1; p = 0,0021). Verrattaessa Microcephalin ilmaisun T2 kontrolliryhmään, tulos tuli merkittävä (p = 0,0009). Kuitenkin, ei ollut merkitsevää eroa Microcephalin ilme, kun näytteet T1, T2 ja T3 ryhmiä verrattiin toisiinsa. Lisäksi Microcephalin ilmaisu ei merkittävästi korreloineet alueellisten imusolmuke osallistuminen (p = 0,1162) tai kaukana etäpesäke (p = 0,5251) (taulukko 3).

ASPM, yhdistyksen välillä soluliman värjäys tasojen ja kasvaimen invasiivisuus oli tunnistettu. Korkea sytoplasminen ASPM tasot löydettiin T1, joka laski merkittävästi T2 ja T3 (p = 0,0198) (Kuva 7E). Korkea sytoplasminen ASPM myös korreloivat ilman imusolmuke osallistuminen (N0) ja se laski imusolmuke osallistuminen (N1) (p = 0,04) (kuvio 7F) (taulukko 5).

Keskustelu

EOC usein ensin diagnosoitu pitkälle edenneessä puutteen oireiden ja luotettavien varhaisen havaitsemisen menetelmiä. Näin tunnistaminen diagnostisia ja prognostisia biomarkkereita EOC on suuri kliininen merkitys. Tässä tutkimuksessa tutkittiin ekspressiota kaksi MCPH proteiinien, Microcephalin ja ASPM, on EOC kasvain kudosnäytteitä. EOC näyttää korkea aneuploidia-. DNA-vaurioita vastaus proteiinit ovat elintärkeä suojaa perimän epävakaisuuden ja puutteita näiden proteiinien voi johtaa syöpään. Microcephalin on tunnettu rooli DNA: n korjaukseen ja ASPM karan toimintoa mitoosin aikana. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää Microcephalin ja ASPM ilmaisu liittyy kliinis parametrit potilailla, joilla on EOC. Molemmat proteiinit oli osoitettu olevan vapautettiin muiden syöpien tavalla, joka liittyi taudin etenemiseen [16], [28] – [30], [36].

Äskettäin raportoimme yhteenliittymän Microcephalin ja ASPM tasot pahanlaatuisten solujen peräisin askites nesteitä EOC joilla oli erilaisia ​​klinikka-patologinen parametrit [36]. Esillä olevassa, suuremmassa mittakaavassa tutkimus, ydin- ja /tai sytoplasminen Microcephalin värjäys todettiin kasvaimen soluihin. Tuloksemme harjoitussarjassa paljasti väheneminen ydin- Microcephalin ilmentymistä 73% (16/22) ja EOC kasvaimet; Tämä prosenttiosuus vähennettiin 30% (89/294) in validointi asetettu. Tämä ero kahden ikäluokat mahdollisesti heijastaa suurempi määrä Asteen 3 tapausta harjoitussarjassa (73%; 16/22) verrattuna validointi joukko (37%, 110/294). Tässä tutkimuksessa alhainen Microcephalin ilmentymistä todettiin korkealaatuista ja pitkälle kasvaimet (

p

0,0001 ja p = 0,0438 vastaavasti). Nämä havainnot vastaavat edellisessä tutkimuksessa munasarjojen askites näytteiden osoitti, että Microcephalin ilmentyminen väheni soluviljelmissä peräisin askites of EOC joilla on pitkälle edennyt kasvaimia [36]. Tuloksemme ovat sopusoinnussa tutkimuksia, raportointi pienentää

MCPH1

DNA kopioluku 72% (39/54) rintasyövistä [16] ja omaa havainnot vähensi Microcephalin ilmentymisen 93/319 (29%) rintasyövän näytteiden, erityisesti korkeamman asteen kasvaimissa [28].

Aiemmin olemme tunnistaneet korrelaatio epänormaali lokalisoinnin Microcephalin kanssa kasvaimen primaariviljelmissä pahanlaatuisten solujen peräisin askites nesteiden sairastavista potilaista EOC . Näissä soluissa, sytoplasmista Microcephalin kasvoi kasvaimen. Olemme ehdottaneet, että voi johtua

MCPH1

deleetiomutaatiot C-terminaalin BRCT verkkotunnuksia, jotka on aiemmin osoitettu johtavan Microcephalin siirtymässä ydinvoiman sytoplasmiseksi lokalisointi samanlainen

BRCA1

[41 ], [42], [43]. Tuoreessa tutkimuksessa kuvaavat eri

MCPH1

silmukointivariantit raportoitu mutaatio tai deleetio ydinvoiman lokalisointi signaaleja sisällä

MCPH1

geeni johti lokalisoinnin muutos ydinenergiasta sytoplasman [43].