Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

LDL-reseptorin kaltainen proteiini-1 (LRP-1) on endosyyttisissä reseptori välittävä puhdistumaan eri solunulkoisten molekyylien mukana levittämiseen syövän solut. LRP-1 siten esiintyi houkuttelevana reseptori kohdentamiseksi invasiivisen käyttäytymisen pahanlaatuisia soluja. Kuitenkin viimeaikaiset tulokset viittaavat siihen, että LRP-1 voi edistää kehitystä ja kasvua syövän etäpesäkkeiden in vivo, mutta tarkka osuus reseptorin aikana syövän etenemistä on vielä selvittämättä. Puute mekanistinen oivalluksia solunsisäinen signalointi verkot myötävirtaan LRP-1 on estänyt ymmärrys on edistetty syöpä.

Menetelmät /Principal Havainnot

kautta lyhyen hiusneula-RNA-välitteinen hiljentäminen lähestymistapaa, olemme määritelleet LRP-1: n pääasiallinen säätelijä ERK ja JNK signalointia kasvainsolun yhteydessä. Co-immuunisaostuskokeissa paljasti, että LRP-1 muodostaa solunsisäinen telakka sivusto MAPK sisältäviä komplekseja. Käyttämällä farmakologiset aineet, konstitutiivisesti aktiivinen ja hallitseva-negatiivinen kinaasien, osoitimme, että LRP-1 pitää pahanlaatuisia soluja tarttuvaan tilaan, joka on suotuisa hyökkäys aktivoimalla ERK ja estämällä JNK. Olemme lisäksi osoittaneet, että LRP-1-riippuvaisia ​​sääntely MAPK signalointi järjestää tukirankaproteiinin arkkitehtuuria ja välittää liima monimutkainen vaihtuvuus syöpäsoluissa. Lisäksi olemme havainneet, että LRP-1 on lieassa aktiini verkkoon ja fokaalisen adheesion sivustoja ja valvoo ERK ja JNK kohdistamista Talin-rikas rakenteita.

Johtopäätökset

tunnistettu ERK ja JNK kuin tärkein molekyyli releet jonka LRP-1 säätelee fokaalisen adheesion purkaminen pahanlaatuisten solujen tukemaan hyökkäystä.

Citation: Langlois B, Perrot G, Schneider C, HENRIET P, Emonard H, Martiny L, et ai. (2010) LRP-1 Edistää syöpäsoluinvaasiota tukemalla ERK ja Inhiboivaa JNK signalointireitteihin. PLoS ONE 5 (7): e11584. doi: 10,1371 /journal.pone.0011584

Editor: Bill Hooker, Calypte Biomedical Corporation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 huhtikuu 2010; Hyväksytty: 20 Kesäkuu 2010; Julkaistu: 14 heinäkuu 2010

Copyright: © 2010 Langlois et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Centre National de la Recherche scientifique (CNRS), La Ligue Nationale Contre le Cancer (Comite de la Marne), CPER (Contrat de Projets Etat-alue) 2007-2013 ja Fonds National pour la Santé ACI (Action Concertée Incitative) 2008 (Canceropole Grand-Est Project). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

low-density lipoprotein (LDL) reseptorin kaltainen proteiini-1 (LRP-1) on ekspressoituvat endosyyttisissä reseptorin kuuluvat LDL-reseptori-perheeseen [1]. Ensin kuvataan lasti reseptorin välittävä ottoa ja lysosomaalisen hajoamisen α2-makroglobuliinireseptori [2], LRP-1 sitten havaittiin olevan osallisena sisäistämisen yli 30 toiminnallisesti ja rakenteellisesti jotka eivät liity solunulkoisen ligandeja. Näihin kuuluvat proteaasit, proteaasi-inhibiittori-kompleksien, makromolekulaariseen proteiinien ja kasvutekijöiden. Aluksi syntetisoitiin 600 kDa esiaste, LRP-1 käsitellään edelleen trans-Golgin jonka furiinitunnistuskohdasta-konvertaasi ilmentämiseen solun pinnalla kypsillä kaksi muodoksi muodostuu 515 kDa solunulkoisen alayksikköä (α-ketju), ei-kovalenttisesti sidottu 85 kDa: n β-ketju, joka sisältää transmembraanidomeeni ja sytoplasminen häntä. LRP-1 α-ketju satamissa neljä ligandia sitova klustereiden mukana erityistunnustamista solunulkoisen ligandien ja kokoonpanoa Multiproteiinikompleksit solun pinnalla. Solunsisäinen domeeni LRP-1 β-ketju voi rekrytoida molekyylejä mukana endosyyttisten koneiden ja sytoplasman modulaattorit signalointipolkujen [3].

monimuotoisuutta ligandien saattaa selittää, miksi LRP-1 on tunnistettu kriittinen tekijä erilaisissa patologisissa yhteyksissä kuten ateroskleroosi ja hermostoa rappeuttavien häiriöiden kuten useimmin kuvatut [4], [5]. Yhä useammat todisteet vahvisti oletetun roolin LRP-1 in ratkaiseva tapahtumien aikana syövän etenemisen [6]. LRP-1 todellakin raportoitu välittävän puhdistumaan eri matriisimetalloproteinaasien kuten MMP-2, MMP-9 ja MMP-13 [7], [8], [9] ja säätelemään plasmiinilla aktivaatioputouksen endosytoosin of kudos- tyypin (tPA) tai urokinaasityyppinen (uPA) plasminogeeniaktivaattorit [10], [11]. Ottaen huomioon sen hyvin tunnetun funktion säätelyyn matriisin proteolyysin [12], LRP-1 ehdotettiin alun perin uutena kasvaimen vaimennin. Heikko ekspressiotaso LRP-1 havaittiin korkealaatuista ihmisen syöpäsoluja ja kudosten tuntui tukea tällaista hypoteesia [13], [14]. Kuitenkin yleinen toiminta LRP-1 karsinogeneesis- näyttää olevan paljon monimutkaisempi kuin ensimmäinen ajatus. Viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet myönteistä vaikutusta LRP-1 maahanmuuttoa ja invaasion tapahtumien eri solutyyppejä [10], [15], [16], mukaan lukien pahanlaatuisten syöpäsolujen [17], [18], [19], [20 ]. LRP-1 ilmentymisen on myös raportoitu olevan hypoksian reagoiva ja tukemaan metastaattisen levittämistä hiiren tuumoriksenograftien [21]. Lisäksi LRP-1 osoitettiin yllä mitogeenisesta ja /tai promigratory vaikutukset useiden liukoisen tekijöiden läsnä peritumoraalista ympäristössä, mikä tukee pro-kasvaimien synnyn rooli reseptorin [15], [22], [23]. Olemme viime aikoina osoittaneet, että LRP-1 välittää karsinoomasolulinjoissa hyökkäystä hienovaraisesti ohjaamalla liimalla monimutkainen vaihtuvuus [17]. Näin ollen näyttää siltä, ​​että mekanismeja, joilla LRP-1 ohjaa kasvaimen etenemistä ei liity ainoastaan ​​sen endosyyttisiin toiminto.

Beyond endosytoosin, LRP-1 erottui sen kyky laukaista solunsisäisen signalointireittien säätelevät solujen lisääntymistä, erilaistumista , muuttoliike tai eloonjääminen [15], [24], [25], [26]. Lyhyen sytoplasmansisäisen domeenin (ICD) sisältää kaksi NPxY motiivit fosforylaatio tyrosiinikinaaseja, jotka sitten kykenevät sitomaan fosfotyrosiini-sitovan domeenin (PTB) sisältävä proteiineja. Hiivan kahden hybridin määritykset ja proteomiikan analyysi paljasti, että Shc (Src homologia 2 domeenin sisältävä proteiini), Fe65, DAB1 (vammaiset 1), PI3K (fosfatidyyli-inositoli-3-kinaasi) tai PIP-4,5-kinaasin (fosfatidyyli-inositoli -4,5-kinaasi) homologi voi liittyä LRP-1-ICD [27], [28]. Näin ollen vasteena solunulkoisten ärsykkeisiin, LRP-1 voi rekrytoida solunsisäisen tukirakenteen proteiineja laukaista alavirran signalointia. LRP-1 on tunnistettu molekyyli- signalointi kumppani verihiutaleiden kasvutekijän reseptorin (PDGFR), mikä johtaa muuttavien ja proliferatiivinen signalointi- ja ateroskleroottisten leesioiden kehittymistä [4], [29]. Viime aikoina promigratory vaikutus plasminogeeniaktivaattori-inhibiittori PAI-1 näytti vaatia LRP-1-riippuvainen aktivaatio JAK (Janus-kinaasi) /STAT (signaalin anturi- ja aktivaattori transkription) signalointireitin [30]. Lisäksi Ma ja kollegat ilmoitti, että LRP-1 saattaa säännellä hiiren alkion fibroblasteja muuttoliikkeen tukahduttamalla Rac1 ja ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK) reittejä [31].

syövän alalla, on merkittävä puute tietämys solunsisäisen signaloinnin myötävirtaan LRP-1 ja ymmärrystä sen mahdollisen osallistumisen syövän etenemiseen. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tunnettu molekyylitasolla signalointi releet mukana LRP-1-välitteistä stimulaatiota syöpäsoluinvaasiota ja tunnistaa LRP-1 β-ketjun tärkein telakka sivusto fokaalisen adheesion (FA) komponentit ja mitogeeniaktivoidut proteiini (MAPK) sisältävä komplekseja.

tulokset

tunnistaminen LRP-1 säätelijänä MAPK signalointireiteissä kasvainsolun yhteydessä

roolin arvioimiseksi LRP- 1 sääntelyssä solunsisäistä viestintää, käytimme aikaisemmin validoitu menetelmä tuottaa shLRP-1 klonaalisia soluja, jotka stabiilisti yli-ilmentävät tiettyä hiusneula järjestyksessä kohdistuvista LRP-1 [17]. Kuten on esitetty kuviossa. 1, havaitsimme ~90% down-regulation endogeenisen LRP-1 ilmentymisen shLRP-1-soluissa verrattuna shCTRL soluihin, sekä mRNA: n (Fig. 1A) ja proteiinin tasot (Fig. 1 B). Siksi analysoitiin vaikutuksia LRP1 hiljentäminen aktivoinnista useita mahdollisia LRP-1-säännelty signalointireitteihin. Aktivoituminen todetaan kaksi suurta MAPK väyliä, eli ERK-1/2 ja SAPK /JNK (stressi-aktivoitu proteiinikinaasi /c-jun N-terminaalisen kinaasin), tarkasteltiin ensin (Fig. 1 C). Huomasimme, että taso fosforyloidun ERK-1/2 oli valikoivasti laski LRP1-vaiennetaan soluihin ja lisätä JNK-1/2/3 fosforylaatio havaittiin upon LRP-1 hiljentäminen. Kuitenkin fosforylaation tasoja Akt: n ja p38 MAPK ei muutu merkittävästi LRP-1-puutteellisten karsinoomia. Nämä tulokset osoittavat, että LRP-1 voi toimia solunsisäinen signalointi-modulaattorin, aktivoimalla ERK ja estämällä JNK signalointireittejä.

(A) kokonaismäärä RNA: t puhdistettiin FTC133 ohjaus klonaalinen solulinja (shCTRL) tai klonaalisen soluja, jotka stabiilisti yli-ilmentävät shRNAs ja LRP-1 (shLRP-1). Transkription taso LRP-1 arvioitiin RT-PCR: llä. p-aktiini-alukkeet käytettiin normalisointi ohjaus. (B) Kokosolun uutteita jokaisesta solulinjasta tehtiin immunoblot-analyysillä anti-LRP-1 β-ketjun vasta-aine (5A6). p-aktiini-vasta-ainetta käytettiin normalisointi. (C) shCTRL ja shLRP-1 klonaalisia soluja viljeltiin 24 tunnin ajan gelatiinilla päällystetyille pinnoille 10% FBS: ää sisältävässä väliaineessa. Koko-solu-uutteet immunoblotattiin käyttämällä fosfo-ERK, fosfo-JNK, fosfo-Akt ja fosfo-p38-vasta-aineita. Vasta-aineet ERK, JNK, p38 ja β-aktiini käytettiin varmistamaan yhtäläiset lastaus ja normalisointi. Geeli ja immunoblot esitetään edustavat vähintään kolmea erillistä kokeita. Numerot alla geeli ja immunolots osoittavat kertaiseksi inductions mukaan comparaison kanssa shCTRL soluihin.

LRP-1 välittää seerumin indusoiman aktivaation ERK-1/2 ja perustava eston JNK-1/2 /3

LRP-1-säätelyyn solunsisäisen signaloinnin voi joko riippua sitoutumiseen solunulkoisen ligandien tai rekrytointia solunsisäisten tukirunkoja. Arvioimme LRP-1-säätelyyn sekä ERK (Fig. 2A 2D) ja JNK väyliä (kuva. 2E 2 H) vastauksena seerumin stimulointi ja liivate pinnoite. LRP-1-välitteisen aktivaation ERK-1/2-fosforylaation havaittiin vain, kun läsnä on seerumia (Fig. 2A ja 2B vs 2C ja 2D). Sen sijaan, aktivointi JNK-1/2/3 in LRP-1-vaimennettu soluissa eivät riipu seerumin läsnä ollessa (kuvio. 2E-2H). Molemmissa tapauksissa sääntelyn MAPK by LRP-1 ei vaikuttanut gelatiinia pinnoite (Fig. 2A, 2C, 2E ja 2G). LRP-1-reseptorin siis käynnistää solunulkoisen-ligandista riippuvan aktivaation ERK-1/2, ja se toimii konstitutiivinen estäjä JNK-reitin.

shCTRL ja shLRP-1-solut maljattiin muovista tai liivatteesta päällystetyt astiat 24 tuntia poissa tai läsnä FBS. Koko-solu-uutteita alistettiin Western-blot-analyysi tutkia aktivointi ERK (A-D) ja JNK (E-H) puuttuessa tai läsnä FBS: ää. Vastaavat aktivoitumisnopeudet ERK (B, D) ja JNK (F, H) määritettiin intensiteettisuhteet fosfo-proteiinin vastaava yleiseurooppalainen proteiinia ja ilmaistaan ​​suhteellinen yksiköissä +/- SD, joiden arvo on 1 katsoneet shCTRL solut. NS, ei merkittävää; *,

P

0,05.

LRP-1 muodostaa telakka sivusto Src, ERK ja JNK sisältäviä komplekseja

LRP-1 C-terminaali end voivat olla vuorovaikutuksessa rakennustelineet molekyylien mukana signaalin siirtoon [28]. Coimmunoprecipitation suoritettiin kokeita sen testaamiseksi, solunsisäiseen domeeniin LRP-1 kykenee rekrytoimaan tavoitteita osallisena säätelyssä ERK ja JNK signaalireaktioteissä kasvainsolu yhteydessä. Kuten on esitetty kuviossa. 3, pystyimme onnistuneesti immuunisaostumassa LRP-1 β-ketju vastaan ​​nousseen vasta solunulkoista LRP-1 α-ketju. Sekä ERK ja JNK kinaasit yhteistyössä immunosaostettiin LRP-1 β-ketjuun. Tutkimme myös fosforyloitumisaste näiden kinaasien. Fosforyloitua muotoja ERK-1/2 havaittiin liittyy LRP-1, jossa fosforyloitu JNK ei. Src, kinaasin hyvin tiedetään aktivoituvan alavirtaan mitogeeni ja matriisin reseptoreihin, havaittiin myös LRP-1 β-ketju, joka sisältää komplekseja.

Immunosaostukset on LRP-1-sisältäviä komplekseja (IP: LRP-1 -α) suoritettiin käyttäen anti-LRP-1 α-ketju (8G1) vasta-aineiden ja immunokompleksien immunoblotattiin (IB) käyttämällä 8G1, anti-LRP-1 β-ketju (5A6), anti-ERK-1/2 anti-fosfo-ERK-1/2, anti-JNK-1/2/3, anti-fosfo-JNK-1/2/3 ja anti-Src-vasta-aineita. Epäspesifinen IgGs käytettiin negatiivisena valvonta immunosaostus.

LRP-1-riippuvaisia ​​ERK aktivointi edistää kohdunkaulan soluinvaasiota

Olemme hiljattain kuvattu avainrooli LRP-1 kasvaimen eteneminen [17]. Itse asiassa, kuten on esitetty kuviossa. 4A, LRP-1-vajaiden solujen osoitti kaksinkertaisesti vähentynyt invasiivisia kapasiteettia verrattuna ohjata klonaalisia soluja. Siksi tutkittiin, onko LRP-1-riippuvaista aktivoitumista ERK voisi edistää karsinoomasolulinjoihin hyökkäystä. Ensimmäinen, valvonta-soluja käsiteltiin U0126, selektiivinen MEK-1/2 (MAPK ERK kinaasi-puoli) tai transfektoitu dominanttinegatiivinen mutantti MEK-1. Tehokkuutta ERK-1/2 inhibition näissä olosuhteissa voidaan nähdä kuviosta. 4B. Ei muutosta JNK fosforylaatio havaittiin upon ERK esto (Fig. S1). Ohjaus soluinvaasion estyi, kun U0126 hoitoa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 4C ja 4D). Lisäksi shCTRL solut yli-ilmentävät kinaasia kuollut muoto MEK-1 oli vähemmän invasiivisia ominaisuuksia (Fig. 4C ja 4D). Nämä tulokset osoittavat, että ERK Indikointimoduulia aktivoidaan karsinoomasolulinjassa hyökkäystä. Toiseksi pelastamaan aktivoitu ERK väylän LRP-1-vaiennetaan solujen konstitutiivisesti aktiivinen ERK-2 yliekspressoitui. Aktivaatiotilasta ERK-1/2 arvioitiin immunoblottauksella (Fig. 4E). Kuten on esitetty kuviossa. 4F ja 4G, kyky LRP-1-vajaiden solujen hyökätä osittain palautettu kun ERK-2 yliekspressoitui. Koska tyrosiini-kinaasi Src voi mahdollisesti aktivoida ERK signalointi alavirtaan LRP-1 (Fig. 3), solujen invaasio määrällisesti läsnä ollessa Src-estäjällä. Kuitenkin Src esto ei vaikuta invasiivisia kapasiteetin sekä shCTRL ja shLRP-1-soluissa (kuvio. 4H), mikä sulkee Src osuus LRP-1-välitteisen ERK aktivaation aikana karsinoomasolujen invaasio.

Matrigel Invasion määritys suoritettiin shCTRL ja shLRP-1 karsinooman soluja perusolosuhteissa (A), sen jälkeen, kun modulaatio ERK toiminnan shCTRL (B-D) ja shLRP-1-soluissa (E-G), tai kun läsnä on Src-estäjällä ( H). (C, D) kapasiteetti shCTRL solujen hyökätä matrigeeliä kvantitoitiin jälkeen inhibitio ERK aktiivisuuden käyttämällä U0126 hoitoon (10 tai 25 uM) tai ekspressiota kinaasin-dead-mutantin ja MEK-1 (dn-MEK). (F, G) Invasiivinen ominaisuudet shLRP-1-soluissa tutkittiin sen jälkeen, kun konstitutiivisen aktivaation ERK-2 (ca-ERK). Tehokkuutta ERK inhibition shCTRL (B) ja ERK-aktivaation shLRP-1-soluissa (E) kontrolloitiin käyttäen fosfo-ERK, ERK ja β-aktiini-vasta-aineita. Anti-HA käytetään ohjaamaan tason ilmentymisen ilmentynyt HA-merkittyjen proteiinien. (H) Kasvaimen soluinvaasiota mitattiin esto Src-riippuvaisen aktiivisuuden käyttämällä 10 uM Src-estäjän I (Src asukasta). Kuvat ovat näkyvät kunkin kunnossa (D, G). Tulokset on saatu kolmesta erillisestä kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Invasion määritettiin laskemalla solut kahdeksassa satunnaisesti mikroskooppikentäs- kuoppaa kohti. Tulokset ilmaistiin keskiarvoja +/- SD normalisoinnin jälkeen verrattuna ajoneuvon, eli DMSO lääkehoitoja tai lipofektamiinin (lipo) transfektiota varten. NS, erot vastaava valvonta eivät olleet merkittäviä. *,

P

0,05.

esto JNK välittämää LRP-1 yllä syöpäsolujen invaasiota

Samalla tavoin meidän tutkittava, missä määrin LRP- 1-estoa JNK-reitin voisi tukea karsinoomasolulinjassa hyökkäystä. JNK1 ja MKK-7 (MAPK-kinaasin-7) olivat siten koekspressoidaan shCTRL soluissa (Fig. 5A). Invasion of shCTRL solujen väheni 25%, kun yli-ilmentävät villityyppistä JNK (Fig. 5B ja 5C), mikä viittaa siihen, että JNK esto vaaditaan edistämään hyökkäystä. Seuraavaksi käytimme selektiivinen JNK-inhibiittori SP600125 ja määräävän-negatiivinen mutantti JNK palauttaa JNK inhibitio in LRP-1-puutteellisten karsinoomien (Fig. 5D). Emme havainneet mitään merkittävää modulaatio ERK-fosforylaation näissä olosuhteissa (Fig. S1). Mielenkiintoista, puutteelliset valmiudet LRP-1-vaimennettu solujen hyökätä lisääntyi merkittävästi alle JNK esto (Fig. 5E ja 5F). Nämä tulokset tukevat käsitystä, että inhibitio JNK-signalointireittiä välittämä LRP-1 edistää kohdunkaulan solujen invaasiota.

Cell invasion määritykset suoritettiin shCTRL (B, C) ja shLRP-1-soluja ( E, F), kun modulointi JNK aktiivisuuden (A, D). (B, C) ShCTRL solut transfektoitiin ekspressiovektorilla, joka koodaa villityypin MKK-7 /JNK-1, ennen kuin soluinvaasion kvantifioitiin. (E, F) Invasiivinen ominaisuudet LRP-1-vaimennettu solut mitattiin sen jälkeen, kun SP600125 hoidon (5 tai 10 uM) tai transfektio määräävän-negatiivinen mutantti JNK-1 (dn-JNK). JNK-aktivaation shCTRL (A) ja JNK inhibitio shLRP-1-soluissa (D), määritettiin käyttämällä fosfo-JNK, JNK ja β-aktiini-vasta-aineita. Anti-HA ja anti-FLAG käytettiin ohjaamaan ilmentymistä yli-ilmentyneen merkittyjen proteiinien. Kuvat ovat näkyvät kunkin kunnossa (C, F). Tulokset on saatu kolmesta erillisestä kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Invasion määritettiin laskemalla solut kahdeksassa satunnaisesti mikroskooppikentäs- kuoppaa kohti. Tulokset ilmaistiin keskiarvoja +/- SD normalisoinnin jälkeen verrattuna ajoneuvon, eli DMSO lääkehoitoja tai lipofektamiinin (lipo) transfektioihin. *,

P

0,05.

LRP-1-säätelyyn MAPK ohjaa kiinnittymisen karsinoomasoluja

raportoi äskettäin, että LRP-1 hiljentäminen vakavasti heikentynyt hyökkäyksen pahanlaatuisten solujen peräkkäin vahvan muuttamista soluväliainekonstruktissa vuorovaikutus vaihtuvuus. Siksi oletetaan, että LRP-1-riippuvainen ohjaus sekä ERK ja JNK väyliä edistää moduloida solu-matriisi vuorovaikutuksen tukemiseksi invasiivisuus. Kuten odotettua, shLRP-1-soluja, jossa ERK: lla aktiivisuus on vähentynyt, näytetään nopeutunutta kiinnityksen gelatiinilla päällystetyille pinnoille, verrattuna ohjata klonaalisia soluja (Fig. 6A). Lisäksi yli-ilmentyminen kinaasi-inaktiivinen MEK-1 mutantti shCTRL soluissa lisännyt tarttumista korko (Fig. 6B), kun taas konstitutiivisesti aktiivinen ERK-2 laski kapasiteettia LRP-1-vajaiden solujen liittää (Fig. 6C). Todellakin, kun 60 min kiinnitys, kiinnittyneet solut kasvoivat 2-kertainen, kun ERK-reitin estäminen (Fig. 6B). Samaan aikaan kiinnitys, prosenttiosuus kiinni LRP-1-vaimennettu solut laskettiin 2-kertainen alle ERK aktivointi (Fig. 6B ja 6C). Samoin yli-ilmentyminen villin tyypin MKK-7 /JNK-1 kontrollisoluissa johti 2-kertaa parempi sitoutuminen 60 minuutin kuluttua (Fig. 7A). Lisäksi lisääntynyt kiinnitys verrattuna vuoteen LRP-1-vajaiden solujen purettiin ilmaus määräävän-negatiivinen muoto JNK-1 (Fig. 7B). Nämä tulokset tukevat käsitystä, että LRP-1 pitää pahanlaatuisten solujen välissä liima tila, joka on suotuisa hyökkäyksen kautta ERK aktivaation ja JNK esto.

(A) shCTRL (valkoiset laatikot) ja shLRP-1 (harmaa laatikot )-solut ympättiin gelatiinilla päällystetyille levyille ja ei kiinnittyneet solut heitettiin pois sen jälkeen, kun 30, 60 tai 90 min. Adheesiomäärityksiä suoritettiin myös shCTRL solut yli-ilmentävät kinaasi-dead-mutantin ja MEK-1 (dn-MEK) (B) ja shLRP-1 yli-ilmentävät konstitutiivisesti aktiivinen ERK-2 (ca-ERK) (C). Kunkin ehdon, tulokset ilmaistaan ​​prosentteina vastaavan valvonnan kiinnittyneitä soluja 90 minuuttia. Jokainen arvo on keskiarvo +/- SD neljälle erilliselle kokeelle, jossa kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena. *,

P

0,05.

shCTRL (valkoiset laatikot) ja shLRP-1 (harmaa laatikko)-solut ympättiin gelatiinilla päällystetyille levyille ja ei-adherentteja soluja heitettiin pois 30, 60 tai 90 min. Adheesiomäärityksiä suoritettiin shCTRL solut yli-ilmentävät villityyppistä MKK-7 /JNK1 (A) ja shLRP-1 yli-ilmentävät dominantti negatiivinen mutantti JNK-1 (dn-JNK) (B) kinaaseja. Kunkin ehdon, tulokset ilmaistaan ​​prosentteina vastaavan valvonnan kiinnittyneitä soluja 90 minuuttia. Jokainen arvo on keskiarvo +/- SD neljälle erilliselle kokeelle, jossa kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena. *,

P

0,05.

Aktiini verkosto nopeasti valtaavat karsinoomia on pelastettu LRP-1-vaiennetaan soluissa aktivoituminen ERK tai esto hyperactivated JNK

Tutkimme lisäksi, onko LRP-1-riippuvaisia ​​sääntely MAPK signalointi voisi järjestää koordinointia aktiini ja tarttuvuus dynamiikka aikana pahanlaatuisten solujen invaasion. Siksi analysoitiin solun jakautumista säikeisen aktiini jälkeen modulaatio ERK ja JNK toimintaa (Fig. 8). Adherentit ohjaus soluilla polarisoitu morfologia filopodial solu laajennuksia ja pääasiassa cortically jakautunut aktiini-verkon (Fig. 8A). Jyrkästi, LRP-1-hiljentäminen aiheuttama polveutuvat morfologia lukuisia stressi kuituja, näkyvä poikittaislangat ja kehittynyt haarautunut aktiini-verkon (Fig. 8F). Esto ERK signaloinnin ohjaus syöpäsoluissa U0126 hoitoon (Fig. 8B vs 8A) tai dominoiva negatiivinen MEK: n muotoa 1 (Fig. 8D vs 8C) indusoi voimakkaasti morfologisia muutoksia samanlaisia ​​kuin jotka on saatu LRP-1 hiljentäminen. Sama tulos havaittiin jälkeen ilmaus villityypin MKK-7 /JNK-1 hallinnassa karsinoomasolut (Fig. 8E vs 8C). In LRP-1-vaiennetaan solujen inhibitio JNK-signaloinnin SP600125 (Fig. 8G vs 8F) tai yliekspressio kinaasin-aktiivinen JNK-1 (Fig. 8J vs 8H) palautti mesenkymaalisten kaltainen morfologia villityypin karsinoomasoluja. Lisäksi konstitutiivisesti aktiivinen ERK-2 (Fig. 8I vs 8H) oli riitä kääntämään polveutuvat morfologia aiheuttama vaiennettaisi LRP-1. Nämä tulokset osoittivat, että LRP-1 hiljentäminen indusoi suuria aktiinisytoskeletonin uudelleenjärjestelyjä, jotka liittyvät suoraan ERK inhibition ja JNK hyperactivation.

shCTRL (A-E) ja shLRP-1 (F-J)-solut ympättiin gelatiini-päällystetyn levyt 120 min. ERK tai JNK toiminta oli moduloitu. Ohjaus-soluja käsiteltiin 25 uM U0126 (B) tai transfektoitiin kinaasia kuollut mutantti MEK-1 (dn-MEK) (D) estää ERK-riippuvaisen reitin ja JNK aktivaatio saatiin yli-ilmentymisen sekä villityypin MKK-7 ja JNK-1 (E). For LRP-1-vajaiden solujen inhibitio JNK-reitin saavutettiin käyttämällä SP600125 käsittely (10 uM) (G) tai yliekspressio määräävän-negatiivinen muoto JNK-1 (J), kun taas aktivoituminen ERK-reitin saatiin käyttämällä ekspressiovektoria konstitutiivisesti aktiivista ERK-2 (I). DMSO (A, F) toimi kontrollina lääkehoidot (B, G) ja Lipofectamine (C, H) toimi kontrollina transfektiokokeissa (D, E, I, J). Solut värjättiin aktiinifilamenttien (punainen) ja tumat vastavärjättiin DAPI (sininen). Kuvat edustavat vähintään kolmea erillistä kulttuureissa. Bars, 20 um.

LRP-1-riippuvaista aktivoitumista ERK ja esto JNK on välttämätöntä FA purkamista nopeasti valtaavat karsinoomien

Kun otetaan huomioon vaikutukset LRP-1 hiljentäminen liimasta ja morfologiset ominaisuudet karsinoomasolut (kuviot. 6, 7 ja 8), tutkimme, onko LRP-1-välitteisen valvonta MAPK on tarpeen FA turn-over. Siten solujen jakautumista polttoväli komplekseja analysoitiin shCTRL ja shLRP-1-soluissa, kun ero aktivoinnin ERK ja JNK reittiä (Fig. 9A 9j). LRP-1-hiljentäminen johti kertymistä lukuisia ja erittäin jäsennelty polttoväli komplekseja solussa reuna (Fig. 9F vs 9A). Puuttuminen ERK aktivaation ohjaus solujen U0126 (Fig. 9B vs 9A) tai kinaasi-inaktiivinen muoto MEK-1 (Fig. 9D vs 9C) lisäsi ja koko Talin sisältävien paikallisissa kontakteissa samassa määrin kuin havaittiin in LRP-1-vaiennetaan soluja (Kuva. 9F). Näin ollen, yli-ilmentyminen villin tyypin MKK-7 /JNK-1 LRP-1 ilmentävien ohjaus stimuloitujen solujen kertymistä taliini sisältävän reuna-tartunta rakenteiden (Fig. 9E vs 9C). Sen sijaan, useita taliini-rikas rakenteet on huomattavasti vähennetty LRP-1-vaiennetaan solujen valikoivan JNK-inhibiittori (Fig. 9G vs 9F) tai ekspressiota määräävän-negatiivinen JNK-1-mutantti (kuvio. 9J vs 9H ). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun konstitutiivisesti aktiivinen ERK-2 ilmennettiin LRP-1-vajaiden solujen (Fig. 9I vs 9H). Nämä tiedot osoittivat, että JNK aktivointia tai ERK esto in LRP-1-vajaiden solujen voisi palauttaa ensimmäisen jakelun kiinnitysalueisiin. Prosenttiosuus positiivisten solujen FA myöhemmin määritetty, kuten on jo kuvattu [17]. Kuten on esitetty kuviossa. 9K ja 9L määrä LRP-1-ilmentävien syöpäsolujen positiivisia Talin-rikas kiinnitysalueisiin lisääntyi noin 1,4-kertainen alle ERK esto (U0126 ja dn-MEK) ja 1,7-kertainen alle JNK aktivointi (MKK-7 /JNK-1). Sitä vastoin lisääntynyt määrä paikallisissa kontakteissa aiheuttama LRP-1 hiljentäminen osittain päinvastaiseksi ERK aktivointi (ca-ERK) tai JNK esto (SP600125 ja dn-JNK). Näin ollen LRP-1 näkyy pääasiallisena välittäjänä tarttuvuus häiriöitä säätelemällä ERK ja JNK signalointireittejä.

(A-J) shCTRL (A-E) ja shLRP-1 (F-J) solut ympättiin gelatiinilla päällystetyille levyille 120 min. ERK signalointireitin estyi shCTRL soluissa käyttämällä 25 uM U0126 (B) tai kinaasi-dead MEK-1-mutantin (dn-MEK) (D) ja aktivoitu shLRP-1-soluissa konstitutiivisen aktivaation ERK-2 (ca -ERK) (I). MKK-7 /JNK1 vektoria käytetään laukaisemaan JNK-aktivaation shCTRL soluissa (E), kun taas JNK inhibitio LRP-1-vajaiden solujen saatiin käyttämällä 10 uM SP600125 (G) tai dead-kinaasin JNK-1 ( dn-JNK) (J). DMSO: ssa (A, F) toimi kontrollina lääkehoidot (B, G) ja lipofektamiini (C, H), toimi kontrollina transfektioita (D, E, I, J). Sitten solut värjättiin taliini (vihreä) ja tumat vastavärjättiin DAPI (sininen). Kuvat edustavat vähintään kolmea erillistä kulttuureissa. Bars, 20 um. (K, L). Prosentuaalinen positiivisten solujen paikallisessa tarttumisessa kvantitoitiin sen jälkeen, kun modulaatio ERK ja JNK toimintaa käyttämällä valikoivia lääkehoitojen (K) tai ilmoitetun MAPK-konstrukti (L). Kunkin ehdon, kolmesataa solut kolmesta erillisestä kokeesta arvioitiin. Tulokset ilmaistiin prosentteina verrattuna shCTRL soluja käsiteltiin DMSO: ta (K) tai lipofektamiinin (L). *,

P

0,05.

LRP-1 liittyy solun tukirangan ja FA komponenttien ja ohjaa rekrytointi aktiivisen MAPK keskeiselle komplekseja

selvennetään molekyylitason mekanismin, jonka LRP-1 ohjaa FA dynamiikka ja solun tukirangan organisaatiossa kautta MAPK asetus, immunopresipitaatiomäärityksiä tehtiin (Fig. 10). Tiedot esitetty kuvassa 10A paljasti, että α-aktiini, Talin ja paksilliini vuorovaikutuksessa LRP-1 β-ketjun nopeasti tunkeutuva syöpä soluja. Kiinnostavaa kyllä, myös havaitaan assosiaatio LRP-1 ja aktiivisen fosfo-SHP-2 (SH2 domain sisältävät proteiinityrosiinifosfataasi-2), PP2A (seriini /treoniini-proteiinifosfataasi 2A), ja PAK (p-21 aktivoidaan kinaasi), joka ovat keskeisiä säätelijöitä MAPK signalointi. Muita molekyyli- releet kuten Ras ja MEK havaittiin myös liittyvän LRP-1-ICD (Fig. S2). Koostumus Talin sisältävien kompleksit analysoitiin sitten in LRP-1-vaimennettu soluissa verrattuna ohjata kasvainsolujen (Fig. 10B). Kuten odotettua, lisääntynyt määrä taliini havaittiin LRP-1-vajaiden solujen. Lisäksi määrä paksilliini in Talin sisältävien kompleksit oli nimenomaan muuttunut alle LRP-1 hiljentäminen taas α-aktiniinin ollut. Mielenkiintoista on, että aktiiviset muodot ERK pääasiassa havaittu taliini sisältävien kompleksien LRP-1-ilmentäviä soluja. Lisäksi havaitsimme vahvaa kertymistä fosfo-JNK näiden komplekseja LRP-1 hiljentäminen.

shCTRL ja shLRP-1-solut maljattiin gelatiinilla päällystetyille pinnoille ja koko-solu-uutteet suorittamiseen käytetty immunosaostuskokeissa (IP). (A) immunosaostus LRP-1-sisältävät kompleksit tehtiin käyttämällä monoklonaalista anti-LRP-1-vasta-aineita (8G1). Immunokompleksit sitten immunoblotattiin (IB) käyttämällä spesifisiä vasta-aineita LRP-1 β-ketju, α-aktiini, taliini, paksilliinin, fosfo-SHP-2, PP2A ja PAK. (B) Talin sisältävät kompleksit immunosaostettiin ja analysoitiin Western-blot käyttäen anti-taliini, anti-fosfo-ERK, anti-fosfo-JNK, anti-α-aktiini ja anti-paksilliini vasta-aineita. Epäspesifinen IgG: itä käytettiin negatiivisena kontrollina ja immunosaostusmääritykset.

Keskustelu

Kun otetaan huomioon, ettei molekyyli tietoa LRP-1 syövän alalla, olemme tutkineet solunsisäisen signaloinnin verkkoon yhdistävät LRP-1 aggressiivisen käyttäytymisen syöpäsoluja. Tuloksemme korosti, että LRP-1 pitää pahanlaatuisia soluja tarttuvaan tilaan suotuisa hyökkäys ohjaamalla ERK ja JNK-riippuvainen reittejä.

ensimmäinen osoitti, että LRP-1 ilmentymisen kohdunkaulan soluissa laukaisee seerumin aktivaatiota ERK ja vastaa konstitutiivista eston JNK. Vastaa meidän tuloksia, aiemmat tutkimukset ovat raportoineet vähentynyt fosforylaatio ERK-1/2 in LRP-1-puutos ei-tuumorisoluissa [15], [32]. Toisaalta, Ma ja yhteistyökumppanit kertoivat, että LRP-1 voisi tukahduttaa ERK aktivointi ohjaamaan soluun liikkuvuutta [31]. Vuonna HT1080 fibrosarkoomasoluissa, Webb ja kollegat osoittivat, että LRP-1 puutos lisännyt fosforyloitu ERK taso, joka edistää solujen muuttoliike ja invaasiota [33]. Näissä tutkimuksissa aktivointi ERK in LRP-1-vajaiden solujen vaaditaan ilmentymisen uPAR, uPA-reseptori, joka sitoo vitronektiiniä. Nämä tulokset näyttivät olevan erittäin vitronektiiniin riippuva koska uPAR-vitronektiinissä vuorovaikutus on hyvin tiedetään olevan riittävä aloittamaan alavirran muutoksia solujen vaeltamiseen ja signaalitransduktion [34]. Kyky LRP-1 välittävän endosyyttistä ottoa uPAR ja alas-säädellä solun pinnalla määrä uPA: uPAR kompleksin usein mieleen selittää valvontaan ERK aktivaation LRP-1 [31], [33], [35 ]. Kuitenkin shRNA välittämää knock-down of LRP-1 ei vaikuta solun pinnan taso uPAR mallissamme [17]. Vaikka ERK aktivointi ilmoitettiin vastauksena ligandin sitoutumista LRP-1 [15], [19], [32], [36], selkeän yleiskuvan taustalla olevien mekanismien puuttuu edelleen.