Krooninen sairaus

tiivistelmä

S100A8 ja epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) proteiinien ovat proto-onkogeenien, jotka on vahvasti ilmaistu useissa syöpätyyppeihin. EGFR edistää solujen lisääntymistä, erilaistumista, muuttoliikettä ja selviytymistä aktivoimalla molekyyli polkuja. Osallistuminen proinflammatoristen S100A8 kasvaimen solujen erilaistumista ja eteneminen on suurelta osin epäselvä eikä tutkittu munuaissyövän (KC). S100A8 ja EGFR ovat mahdollisia terapeuttisia biomarkkereita ja syöpälääkettä tavoitteet KC. Tässä tutkimuksessa selvitimme molekyylimekanismeihin vuorovaikutuksen profiilien molempien molekyylien potentiaalia syöpälääkkeiden. Lupasimme transkription profilointiin Saudi KCS käyttäen Affymetrix HuGene 1,0 ST taulukot. Havaitsimme 1478 merkittävästi ilmaistuna geenejä, mukaan lukien S100A8 ja EGFR yli-ilmentyminen, käyttäen cut-off p-arvo 0,05 ja taita muutos ≥2. Lisäksi vertasimme ja vahvistaneet havainnot ekspressiotietojen saatavilla NCBI: n GEO tietokantaan. Huomattava määrä geenejä, jotka liittyvät syöpään osoitti osallistuminen solusyklin etenemisen, DNA korjaus, kasvain morfologia, kudosten kehitystä ja solujen eloonjäämistä. Atherosclerosis signalointi, leukosyyttien ekstravasaatio signalointi, lovi signalointi, ja IL-12 signalointi olivat merkittävästi häirinneet signalointireittejä. Tässä tutkimuksessa esitetään alustava transkription profilointiin Saudi KC potilaista. Analyysimme mukaan erillisiä transcriptomic allekirjoituksia ja sellaisia ​​keinoja taustalla molekyylitason mekanismeja KC etenemisen. Molecular telakointi analyysi paljasti, että estäjä ”midostauriini” on joukossa valittu lääkekohteita, paras ligandin ominaisuuksia S100A8 ja EGFR, mistä seurasi, että sen sitoutuminen inhiboi alavirran signalointia KC. Tämä on ensimmäinen rakenne-pohjainen telakka tutkimus valitun proteiinin tavoitteet ja syöpälääke, ja tulokset osoittavat, S100A8 ja EGFR houkutteleva syövänvastainen tavoitteita ja midostauriini kanssa tehokas lääke ominaisuuksia terapeuttinen intervention KC.

Citation: Mirza Z, Schulten HJ, Persia HM, Al-Maghrabi JA, Gari MA, Chaudhary AG, et ai. (2015) Molecular vuorovaikutus on Kinase Inhibitor MIDOSTAURIININ kanssa syöpälääke Targets, S100A8 ja EGFR: Transkription Profilointi ja Molecular Docking Study for munuaissyöpä Therapeutics. PLoS ONE 10 (3): e0119765. doi: 10,1371 /journal.pone.0119765

Academic Editor: Jaydutt V. Vadgama, Charles R. Drew University of Medicine and Science, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 09 syyskuu 2014; Hyväksytty: 16 tammikuu 2015; Julkaistu: 19 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Mirza et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat kuningas Abdullah City Science and Technology, Riad, Saudi-Arabia (KACST, Strategic Project ID. 10-BIO1258-03 ja 10- BIO1073-03) ja Deanship Research, kuningas Abdulaziz University (Project ID: HiCi-1434-117-2). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on maailmanlaajuinen merkittävä terveysongelma. Säätelyhäiriötä molekyyli signalointireiteissä on tunnusmerkki syövän taudin alkamisen ja etenemisen [1-3]. Munuaissyöpä (KC) osuus on noin 1,5 prosenttia kaikista syöpäkuolemista. Erityisesti, KC on yhteinen lihavilla miespuolisesta väestöstä [4]. Kirurginen kasvaimen resektion on standardi parantava hoito. Metastaattinen KC on lähes nonresponsive perinteisiin systeemisiä hoitoja ja lähes kaikki potilaat kuolevat etäpesäke. Puute lupaava biomarkkereita tehokas kohdennettu kemoterapia aiheuttaa suuren haasteen KC hallintaan. Parempi ymmärrys molekyylitason mekanismeja tehokkaasti KC ovat laajentaneet ikkuna kehittää tehokkaita hoitomuotoja kehitettäessä [5,6]. Suurikapasiteettinen microarray alustat soveltuvat hyvin tunnistamiseksi uuden aiheuttama tai tukahdutetaan sairauteen liittyvien syyllinen geenejä [7]. Molekyylit osoittaa suoraa osallistumista biokemiallinen tai sääntelyyn johtava väylä taudin mahdollisia syövän vastaisia ​​kohde. Drug /molekyyli vuorovaikutuksella nämä tavoitteet voidaan joko tutkittava yhdessä kiteyttämällä tai testattu telakka simuloinnin indentify molekyylivuorovaikutusten tarvitaan järkevä huumeiden suunnittelu [8]. Suurikapasiteettinen telakka on avain sisäänkäynti lääkekehityksen [9,10]. Transcriptomic profilointi ja toimivien reittien analyysi KC ovat tunnistaneet useita merkittävästi ilmentyvät eri geenejä, mukaan lukien S100A8 ja EGFR. Yritimme arvioida niiden mahdollisuuksia KC huumeiden tavoitteen

in silico

telakointi tunnettujen proteiinikinaasiestäjinä. Kaiken kaikkiaan tämä tutkimus osoittaa rakenne-pohjainen virtuaaliseulonnan ja ligandi-proteiini telakointi syöpälääkkeiden esim midostauriini, enzastaurin, ja gefitinibi, syövän vastaisten tavoitteiden S100A8 ja EGFR.

S100A8 on pieni (10 kDa) proinflammatoristen proteiinin S100 perhe, joka pyrkii muodostamaan heterodimeerisiä komplekseja S100A9 (S100A8 /A9) [9 ], jotka läpikäyvät konformaatiomuutoksia Ca

2+ sitova ja toimivat solunsisäisen Ca

2 + anturit [10]. Fysiologisissa olosuhteissa, nämä Ca

2 + sitova EF käsi tyyppi proteiineja ilmentävät konstitutiivisesti ydinsoluissa [11-13]. Kuitenkin alle patologisia tiloja kuten tulehdusta ja syöpää, lisääntynyt ilmentymä S100A8 nähdään epiteelisolujen [14,15]. Alkuvaiheen kuolema S100A8 knock-out hiiristä osoittaa olennaisuuden tämän geenin hengissä [16]. Kohottamiseen S100A8 löytyy eri karsinoomat mukaan lukien rinta- [15], eturauhas- [17,18], keuhko [19], mahalaukun [20], maksan [21], haiman [22] ja peräsuolen syövän [23,24]. Äskettäin julkaistu tutkimus osoittaa solujen kasvua edistävää aktiivisuutta ja sitoutumista reseptoriin glykaation lopputuotteita (RAGE) matalissa S100A8 pitoisuuksilla [15]; kuitenkin, sen suora rooli tuumorigeneesissä on epäselvä ja sitä on vielä selvitetty. On raportoitu, että primaaristen kasvainten erittävät liukoisia tekijöitä, jotka indusoivat ekspressiota S100A8, että endoteelisolujen ennen kasvaimen etäpesäkkeiden [19]. Aktivoimalla p38 MAPK-reitin, se lisää liikkuvuutta verenkierrossa syöpäsolujen [25]. Siksi kohdistaminen S100A8 voitaisiin käyttää estämään kasvaimen solujen vaeltamiseen ja kasvuun. Useat todistelinjat viittaavat elintoimintojen S100A8 aikana tuumorigeneesin ja, vaikka se on tarkka rooli kasvaimen microenvironment vielä epäselvää, eri kasvain edistäviä vaikutuksia on ehdotettu. Vaikka tutkimus on rajoitettu sen ilmentämiskuviota syöpä, sen osallistuminen onkogeneesiin ja sen mahdollisuuksia terapeuttinen biomarkkereiden. Parhaan tietomme mukaan ei tutkimus on raportoitu mutta sen ilme kuvio tai sen rooli KC etenemiseen.

EGFR on yksi neljästä jäsenen erbB reseptorityrosiinikinaasien. Reseptori on yli-ilmentynyt tai mutantit monissa syövissä, korostaen sen asemaa terapeuttinen syövän biomarkkereiden. Se on mukana erilaisissa solun toimintoja, kuten proliferaatiota, angiogeneesiä ja tukahduttaminen solukuoleman. Koska transmembraaniproteiini, EGFR kulkee ratkaiseva signaaleja epiteelisolujen pinnalta solunsisäinen verkkotunnuksen kontrolloidun soluproliferaation, migraation ja adheesion. Yliekspressoitu EGFR lähettää useita signaaleja solun nopeuttaa kasvua ja solujen pitkäikäisyyttä, ja sillä on keskeinen rooli syövän synnyn eri syöpätyyppien [26-29]. Parempi käsitys molekyyli signalointireittien on avannut uusia strategioita ja keinoja syövän hoitoon. Näin ollen, EGFR sammuttaa sen signaalitransduktion aiotaan estää kasvua ja selviytymistä syöpäsoluja.

S100A8 ja EGFR eivät tärkeä rooli pahanlaatuisen ja siten pitää mahdollisina huumeiden kohteita syöpähoitojen kehittämiseen [26 -30]. Syy valita midostauriini, enzastaurin, ja gefitinibi kuten estäjän S100A8 ja EGFR on viimeaikainen tutkimus osoittaa, että EGFR-kohdistettuja hoitoja käytetään estäjät ovat tehokkaita monissa syöpäpotilailla [31-36]. Gefitinibi, estäjä EGFR kinaasin toiminta, hyväksyttiin Yhdysvaltain FDA keuhkosyövän hoitoon [37]. S100A8 ei omista kinaasialue tai ATP: n sitoutuminen taskussa, mutta se osallistuu proteiinin fosforylaatioon [38] ja on ylävirran polku molekyyli EGFR. Siten lääke, joka kykenee estämään sekä EGFR ja S100A vastaa mahdollisten terapeuttisten vaikutusten.

Kun löytö proteiinikinaasin aktiivisuuden 1954, paljon estäjät on havaittu [39]. Koska hyvin samankaltaisia ​​niiden rakenteen ja toiminnan puitteissa ”kinome” [40], tunnistaminen tehokkaita proteiinikinaasin estäjiä (PKIs) on suuri haaste. Tällä hetkellä estäjät käsittävät yli 30% lääkeaineesta löytämisen ohjelmien tuloksena hyväksymisestä kymmeniä estäjät kuten syöpälääkkeet tai ainakin testaus kliinisissä tutkimuksissa [41]. Tässä tutkimuksessa määritimme telakoimalla simuloinnin mahdollinen tehokkuus kolme tällaista huumeiden nimeltään midostauriini, enzastaurin, ja gefitinibi.

(i) MIDOSTAURIININ (CID 104937; tunnetaan myös PKC412 ja bentsoyylistaurosporiini) on monen tavoite estäjä käytetään akuutti myelooinen leukemia hoitoon. Se on puolisynteettinen alkaloidi johdettu bakteeri- staurosporiinille käytetään hoitamaan potilaita, joilla CD135 (FMS-tyyppistä tyrosiinikinaasi 3-reseptori) mutaatioita [42]. Midostauriini estää kasvua tai aiheuttaa apoptoosia useiden syöpätyyppien, lohkot angiogeneesiä ja herkistää syöpäsolut säteilylle, perustellaan sen käyttöä syövän hoidossa [43]. Prekliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että midostauriini toimii synergisesti syöpälääkkeillä, vahvistavat toistensa vaikutusta syöpää vastaan ​​[44]. (Ii) Enzastaurin on synteettinen asyklinen Bisindolylmaleimide osoittaa antineoplastista aktiivisuutta. Se on pieni suun seriini /treoniini-kinaasi-inhibiittorina PKCβ ja AKT polkuja. Se estää proteiinikinaasi Cβ, joka on tunnettu stimulaattori neo-angiogeneesin induktion kautta verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF). Sitova proteiinikinaasi Cβ ATP-sitoutumiskohdan VEGF todennäköisesti vähentää kasvainsolujen verenkiertoa ja estää kasvun. Lisäksi sen anti-VEGF-tekijän vaikutuksia, alhainen pitoisuus enzastaurin hillitsee syöpäsolulinjoissa [45]. Menetys GSK3p ja AKT fosforylaatio on raportoitu myeloomasolujen hoidon enzastaurin [46]. (Iii) Gefitinibi (IRESSA) valikoivasti kohdistettu ATP halkeama kuluessa EGFR tyrosiinikinaasialueeseen [47]. Se katkaisee EGFR signalointi kohdesolujen ja siksi on tehokasta ainoastaan ​​syöpäsoluissa, joissa on mutatoitu ja yliaktiivinen EGFR.

Molecular telakka ennusteiden optimoitu rakenne ja suhteellinen orientaatio sekä proteiinin ja ligandin molekyylin. Tässä tutkimuksessa pyrittiin arvioimaan mahdollisuuksia S100A8 ja EGFR kuten KC huumeiden tavoitteen

in silico

molekyyli telakointi tunnetun proteiinikinaasiestäjinä MIDOSTAURIININ, enzastaurin ja gefitinibi testata tehokkuutta näiden syöpälääkkeiden alla nämä tähtikuvioita.

Materiaalit ja menetelmät

potilaat ja näytteet

tutkimus tehtiin potilailla Saudi-Arabiasta diagnosoitu munuaissyöpä. Näytteet kerättiin kuningas Abdulaziz University Hospital, Bakhsh sairaala ja King Faisal Specialist Hospital Research Center, Jedda vuosina 2010-2012. Geeniekspressioanalyysiä varten, tuore kasvain ja normaalin kudoksen yksilöt otettiin kirurgiset resektiota kasvaimen ja normaali munuaisten kudoksiin, vastaavasti ja pantiin välittömästi RNAlater (Invitrogen-Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Out of 18 tuumorinäytesylinterin, vain kaksi läpäissyt kriteerit (RNA eheyden numero (RIN) 5) käytettävä array ilmentymisanalyysiä. Yksi potilas oli 61-vuotias Saudi mies, diagnosoitu selkeä cell munuaissyövän Ydinteollisuudessa II ja kasvaimen kokoa 4,5 x 3 x 4 cm. Toinen potilas oli 47-vuotias Saudi nainen, diagnosoitu kromofobista leikettä munuaissyövän of Fuhrman n luokan II.

Eettinen hyväksyntä.

Kaikki potilaat mukaan tutkimukseen kunhan kirjallinen lupa. Tutkimus tarkasteli ja hyväksynyt huippuyksikköä Genomic Medicine Research (CEGMR) paikallisten eettisten komitea (hyväksymisnumero 08-CEGMR-02-ETH).

RNA ja signaalinkäsittelyn

kokonais-RNA uutettiin tuoreeltaan säilynyt munuaisten kudosnäytteiden kanssa Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaan lukien kolonniin DNaasikäsittelyä mukaan valmistajan suosituksia. Laatu puhdistettua RNA varmistettiin Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Keskiarvo RIN varten käsitellyistä näytteistä oli 8,0 vain kaksi syöpänäytteissä ja neljä normaalia munuaisen kudoksissa. RNA-pitoisuudet määritettiin käyttäen NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). RNA-näytteet (250 ng) prosessoitiin valmistajan suositusten (Life Technology, Grand Island, NY). Sen jälkeen pirstoutuminen ja merkintöjä, näytteet hybridisoitiin 45 ° C: ssa 17 tuntia Human Gene 1.0 ST GeneChip- paneelit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Nämä paneelit ovat käsitteellisesti perustuvat ihmisen genomista sekvenssi kokoonpano UCSC hg18, NCBI Build 36 ja kuulusteltiin joukon 764885 antureista 28869 selityksin geenejä.

geeniekspressioanalyysissä

Olemme suorittaneet ilmentymisen profilointi kaksi munuaiskarsinoomia ja neljä normaalia munuaisen kudoksissa. Koska meillä on rajallinen määrä näytteitä, riippumattomien aineistot yleisesti saatavilla sisällytettiin geeniekspressioanalyysissä prosessi. Käytimme valitut KC ekspressiotietojen NCBI: n GEO tietokantaan (liittymistä no: GSE781, GSE7023, ja GSE6344) vertailevan analyysin ja vahvistuksen. Otoskoko GSE781, GSE7023, ja GSE6344 olivat 34, 47, ja 40 vastaavasti. Affymetrix. CEL tiedostot tuotiin Partek Genomics Suite versio 6.6 (Partek Inc., MO, USA). Aineisto normalisoitiin käyttäen RMA normalisointi. Varianssianalyysi (ANOVA) sovellettiin kokonaisen tietoaineiston ja luettelo differentiaalisesti ilmentyvien geenien sitten luotu käyttämällä vääriä löytö määrä (FDR) 0,05 2-kertainen muutos katkaista. Valvomatta kaksiulotteinen keskimääräinen sidos hierarkkinen klusterointi suoritettiin käyttäen Spearmanin korrelaatiota kuin samankaltaisuus matriisi.

Toiminnalliset ja Pathway analyysi

määrittää biologiset verkot, vuorovaikutus ja toiminnallinen analyysi kesken säädellään eri tavalla geenien KC , polku analyysit suoritettiin käyttäen Ingenuity Pathways Analysis ohjelmisto (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA). Tilastollisesti ilmentyvät eri aineistojen kanssa probesets ID, Gene symboli ja Entrez geeni ID kuin klooni tunniste, p-arvo ja taita muutos arvot ladattiin IPA. Toiminnallinen /reitin analyysi IPA tunnistaa biologisia toimintoja ja /tai sairauksia ja polkuja, jotka ovat merkittävimmin muuttunut varten ilmentyvät eri geeniperimä. Merkitys välisen yhteyden ekspressiotietojen ja kanoninen reittejä laskettiin suhde ja /tai Fisherin testiä.

Molecular Docking

Suoritimme molekyyli- telakoinnin tutkimukset (i) roolin tutkimiseksi of S100A8 kuten tulehduksen välittäjäaineiden ja perustaa niiden osallistumista tulehdukseen liittyvä syövät molekyylitasolla ja (ii) tutkia roolia EGFR signaloinnin leviäminen, angiogeneesi ja tukahduttaminen solukuoleman aiheuttavan syöpää. 3-D rakenteiden tunnistettu syöpälääkkeen tavoitteet haettiin Protein Data Bank (PDB ID: S100A8 dimeeri, 1MR8 ja EGFR tyrosiinikinaasialueeseen, 2GS2). Molekyylirakenteet estäjien haettiin pubchem yhdisteestä tietokannasta (midostauriini CID 104937; enzastaurin CID 176167: n ja gefitinibin kanssa CID 123631) (Fig. 1). Sitoutunut ligandi käytettiin koettimena sitoutumiskohtaan verkkoon sukupolvi. Rakenne visualisointi ja tunnistaminen huumeiden sitoutumiskohdan tehtiin käyttäen PyMol [48] (Fig. 2). PyMOL käytettiin analysoida ja tuottaa esitys koko proteiini-ligandi-kompleksin.

Surface esitys kahden ATE rakenteita käytetään telakointi analyysiä. Kuvio valmistettu käyttäen PyMol. (1) MR8 ketju A (vihreä) + ketju B (syaani) (2) 2GS2 ketju (keltainen), lääkeaineen sitoutuminen onkalo magenta.

Telakka laskelmat tehtiin Molecular Docking Server [49] . Merck molekyyli voimakenttä 94 (MMFF94) [50] käytettiin energian minimointi lääkemolekyylejä käytetään ligandina: midostauriini, enzastaurin ja gefitinibi. Gasteiger osittainen maksuja lisättiin ligandia atomia. Polaarittomat vetyatomit yhdistettiin, ja pyörivä joukkovelkakirjat määriteltiin. Molecular telakointi kunkin ligandin suoritettiin yksilöllisesti (S100A8)

2 homo-himmennin (1MR8), ja EGFR tyrosiinikinaasialueeseen (2GS2) proteiini malleja, ennustaa sidontasuunta ja vuorovaikutusta. Essential vetyatomit, Kollman yhdistyneet atomi tyyppi maksuja, ja solvatisoituvat parametrit lisättiin tuella AUTODOCK välineet [51]. Autogrid ohjelmaa käytetään tuottamaan affiniteetti (grid) kartat 20 × 20 × 20 ruudukon pistettä ja 0,375 sitoutumiskohdan ruudukon sukupolven väli [52]. AUTODOCK parametri asetus- ja etäisyys riippuvia dielektristä toiminnot käytettiin van der Waalsin ja sähköstaattinen ehdot laskentaa, tässä järjestyksessä. Telakointisimulaatioiden saavutettiin käyttämällä Lamarckian geneettisen algoritmin (LGA) ja Solis Kastelee paikallinen hakumenetelmä [53]. Suunta, alkuasentoon, ja vääntö kulmat ligandimolekyylejä asetettiin satunnaisesti. Jokainen telakointi koe oli saatu 10 eri ajoa, jotka asetetaan loppuu kuitenkin enintään 250000 energiaa arviointeja. Väkilukuun asetettiin 150. Etsinnän aikana, translationaalinen vaihe 0,2 Å, ja quaternion ja vääntö vaiheet 5 sovellettiin nykyisessä sarjassa telakka analyysin.

saatavuus tukitietojen

tietojoukot tukevat tämän tutkimuksen tulokset ovat saatavilla NCBI: n Gene Expression Omnibus (GEO), tunnistettiin GSE781, GSE7023, ja GSE6344 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term= GSE781).

tulokset

pääpaino tämän tutkimuksen tarkoituksena oli löytää uusia syöpälääkkeen tavoitteen transcriptomic profilointia sekä tunnistaa mahdollisia proteiini-lääkeaineinteraktioita molekyylisuodatuksen telakointi analyysi. Havaitsimme S100A8 ja EGFR tärkeinä proteiinit KC ja pyritty osoittamaan syöpälääkkeen kohde- potentiaalia.

tunnistaminen erilaisesti ilmaisi geenien

profiloitu tuore munuaisen kudosnäytteet ja verrannut niitä normaaliin kontrollinäytteitä. Selviä eroja havaittiin myös välillä kasvainten ja normaaleissa kudoksissa paljastava erillisiä ekspressioprofiileja kunkin kudoksen tyyppejä. Vertailu genominlaajuisten ilmentymä KC paljasti 1478 ilmentyvät eri geenit, 943 säädelty ja 535 alassäädetty, jossa on ≥ 2 kertainen muutos ja vääriä löytö määrä p 0,05 (Fig. 3, taulukko 1, S1 taulukko). Tunnistetut differentiaalisesti ilmentyvien geenien meidän aineisto verrattiin analysoitava uudelleen aineisto (GSE-781, -6344 ja-7023) noudetaan GEO tietokannasta. 876, 1200 ja 1258 differentiaalisesti ilmentyvien geenien havaittiin merkittävä GSE781, GSE6344 ja GSE7023 aineisto vastaavasti katkaista arvosta kertaluokkamuutos 2 ja p-arvo 0,05. Kuten odotettua, oli satoja geenejä osoittavat samanlaisia ​​ekspressiokuviota lukien S100A8 ja EGFR, molemmat geeni oli yli-ilmentyy kaikissa aineisto tutkittavan paitsi GSE7023, jossa kertainen muutos oli 1,948 varten S100A8 ja 1,893 EGFR. Kohonnut ilmaus S100A8 ja EGFR meidän CEGMR aineisto ja GEO aineisto on vahvistaa meidän havainto (taulukko 2, S2 taulukko).

Väylät ja verkot taustalla munuaissyövän

ymmärtää mekanismit, joiden geenit muuttavat monenlaisia ​​fysiologisia prosesseja, selvitimme biofunctions, molekyyli- verkko ja reitit liittyy KC. Mielenkiintoista, biologisen prosessin, solu liike oli merkittävästi yliedustettuna sekä alassäädetty ja säädelty geeni luettelot osoittaa, että etäpesäke on luultavasti liittyy eri tasapaino päälle- ja pois päältä. Funktionaalinen analyysi KC liittyvien geenien löytyi yli liittyvien geenien ekspressiota solusyklin etenemisen, DNA: n korjautumiseen, solukuoleman, kasvaimen morfologia ja kudosten kehitystä. Pathway analyysi osoitti merkittäviä häiriöitä tietyissä signaalireitteihin lukien ateroskleroosi signalointi, LXR /RXR aktivointi, leukosyyttien ekstravasaatio signalointi, maksan fibroosi /maksan stellate soluaktivoitumisessa lovi signalointi, ja IL-12 signalointi ja tuotantoa makrofageissa (Fig. 4, taulukko 3) . Laaja polku analyysi säädellään eri tavalla geenit voivat tarjota uusia hypoteeseja taustalla kasvaimen invaasion ja metastasointiin KC.

Red edustaa yli-ilmentymisen ja vihreä ali.

Telakka tutkimukset

Molecular telakoinnin tutkimukset ennustivat mahdolliset yhteisvaikutukset meidän ehdotetun proteiinilääkettä kohdistaa valitun huumeiden molekyylejä. Tämä on rakenteellinen mallinnus lähestymistapa tutkia mahdollisia sitovia syöpähoitojen. Ymmärtää molekyylien vuorovaikutus välillä huumeiden ja S100A8, sarja molekyylitason telakka-analyysi suoritettiin käyttäen kolmiulotteisen rakenteen, (PDBID: 1MR8), jossa on kolme syöpälääkkeitä so midostauriini, enzastaurin ja gefitinibi. Ligandi sitoutumiskohta oli sarana-alueen, joka sisältää kaksi EF-käden motiiveja. Samalla tavalla, myös simuloitu telakointi edellä mainittujen lääkkeiden kanssa tyrosiinikinaasidomeeniin EGFR. Kokonsa, stereokemia ja rakenteelliset erot ligandit näytteillä vaihteli intensiteetti sitovan proteiinin kanssa aminohapoista. Ennustettu parametrit arvioidaan sitoutumisen vapaan energian, (Ki), kokonaisenergia VDW + Hbond + desolvation + sähkölle, yhteensä molekyylien välistä energia- ja vuorovaikutuksessa pinta-ala arvioitiin arvioida suotuisa sitovan ligandin lääkeainemolekyylien kohdeproteiiniin. Molecular visualisointi suoritettiin käyttäen PyMol. Täydellinen interaktioprofiileihin (H-sidoksia, polaarinen, hydrofobinen, pi-pi, kationi-pi ja muita yhteystietoja), ja vetysidosten (HB tontti) vuorovaikutuksia tutkittiin (kuviot. 5 ja 6, taulukko 4).

ligandin bond, ei-ligandin sidoksen, vetysidoksen ja niiden pituudet ovat merkitty midostauriini, enzastaurin ja gefitinibi. Jossa A, B, C esitetään vuorovaikutus S100A8 (1MR8) kanssa huumeita, ja E, F osoittaa vuorovaikutus EGFR (2GS2) kanssa midostauriini ja gefitinibin vastaavasti.

Red edustaa proteiinia sarjakuva; harmaa edustaa Vuorovaikutus sivuketju sylinteriin; ja vihreä edustaa lääkettä pallo ja tikku mallin.

telakoinnin tutkimukset paljastavat läsnä on yksi midostauriini molekyylin substraattia sitovaan kohtaan S100A8 dimeerin (ATE koodi 1MR8). On havaittu, että lääke molekyyli on haudattu alustaan ​​sitovaa hydrofobinen kanava S100A8 ligandia sitovan domeenin. Useimmat vuorovaikutuksessa tähteet ovat luonteeltaan hydrofobisia. Vuorovaikutus ja pääsee pinta-ala-analyysi paljastaa, että ontelo mukana sitoutumiskohdan huumeiden molekyyli- käytettävissä pinta-ala 123,017 Å

2 ja liuottimelle pinta-ala 509,834 Å

2. Konformaatioiden on sitoutumiskohta S100A8 samoin kuin lääkkeissä ei muuttunut, kun sitova jäykkä telakka Simulointi toteutettiin. Sitova ontelo on sama kaikille kolmelle lääkkeitä.

valittu kiderakenne aktiivisen EGFR kinaasin domeenin, jonka pituus on 330 tähdettä (PDB-koodi 2GS2) telakointi tutkimuksessa. Lääke sitova ontelo EGFR tyrosiinikinaasin verkkotunnus on enemmän kuin kanava ja on syvempi verrattuna S100A8 asia ja on molekyyli- ja liuotinpääsyisellä pinta-ala 181,409 Å

2 ja 875,519 Å

2 vastaavasti. Onkalo on vuorattu useimmiten polaarisia sekä joitakin ei-polaariset tähteet. Enzastaurin eivät osoittaneet mitään sitoutumisen valittuun tyrosiinikinaasidomeeni. Gefitinibi on aiemmin tunnettu estäjä EGFR ja sen co-kiderakenteen on määritetty ja esitetty ATE (3UG2), mutta telakointi tutkimukset paljastivat, että midostauriini on sopivampi sitomiskumppanin EGFR kuin gefitinibin.

(S100A8 )

2 (1MR8) kanssa midostauriini.

MIDOSTAURIININ sitoutuu tällä ligandin sitoutumiskohdan ja muodostaa H-sidoksen kriittinen aminohappotähde ligandia sitova alue paikalle S100A8 eli Gin 69 (B) välille muodostuu N1 ligandin ja terminaalin O Gin. Tähteet mukana ligandin kolonmuodostusta kaksi polaariset tähteet Gln 69 (B) ja Glu 70 (B) ja muut hydrofobiset tähteet Ile 60 (B), Ile 73 (A), Ile 73 (B), Ile 76 (A), Ile 76 (B), Val 80 (A) ja Leu 72 (B) kuten kuvassa. 2. Yli 20 hydrofobisia kontakteja ja van der Waals vuorovaikutuksia ovat myös huomattava. Inhibiittori esittelee suotuisa sitoutumisominaisuuksia ennustetun ilmainen sitovan energiaa 9,77 kcal /mol ja arvioitu Inhibitiovakion, Ki 68,48 nM. Nämä tulokset ovat lupaavia ja ovat ylivoimaisia ​​muihin telakointi tuloksia tehty tässä nimenomaisessa tutkimuksessa.

(S100A8)

2 (1MR8) kanssa enzastaurin.

Lääke sitoutuu proteiiniin molekyyliin tyydyttävästi joiden arvioitu vapaa sitovia energia-4,19 kcal /mol ja Ki 844,18 uM. Se osoittaa sitova kanssa S100A8 dimeerin mutta ilman muodostumista eikä mitään H-sidoksia eikä napa-yhteydet. Se näyttää viisi hydrofobisia kontakteja välittyy alifaattinen ei-polaaristen aminohappojen Leu 72 (B), Ile 73 (B), Ile 76 (A), Ile 76 (B), ja Val 80 (A). Muita havaittavissa vuorovaikutukset ovat Lys 77 (A) ja Gin 69 (B).

(S100A8)

2 (1MR8) gefitinibin kanssa.

Sitovat kyky gefitinibin on hyvä, mutta siellä ei H-sidoksia muodostuu ja vapaa energia sitoutuneen rakenne on-4,21 kcal /mol. Yksi huomattava polaarinen vuorovaikutus on Lys 77 proteiinia ketjun A. On noin kymmenen hydrofobisia vuorovaikutuksia lääkeaineen sitoutumiskohta vuori hydrofobiset tähteet-Ile 73 (A), Ile 73 (B), Ile 76 (A) ja Val 80 (A ). Halogeeniatomit F ja Cl lääkkeen osoittavat ei-kovalenttisella vuorovaikutuksella. Valkuaista ligandikompleksit, halogeenisidoksia ovat energeettisesti ja geometrisesti verrattain yhtä suuri kuin vetysidoksen jos luovuttaja-vastaanottaja suuntatoimintoa on johdonmukaista. Tämä molekyylien välinen vuorovaikutus on osoitettu olevan vakiintumassa ja konformaationaalinen determinantin komplekseja [54]. F näyttää veden välittämä sidos ja Cl osoittaa vuorovaikutus Gln 69 (A). Pari muut heikot vuorovaikutukset havaittiin myös.

EGFR kinaasidomeeniin (2GS2) kanssa midostauriini.

MIDOSTAURIININ on ensisijaisesti estäjä telakat hyvin EGFR tyrosiinikinaasialueeseen ilmaisella sitovia energian -6,58 kcal /mol ja esto vakio 15.13 uM. Neljän H-sidoksia mahdollisesti vaikuttaneet välillä proteiinin ja ligandimolekyylissä. Cys 773 SY esittää H-liimaus N4 huumeiden klo atomienväliset etäisyydellä 3,28 Å. Lisäksi atomi 0δ2 Cys 773 todennäköisesti muodostaa toisen H-side H-atomi ligandin. Samansuuntainen H-sidoksen on nähty Asp 776. Jäännökset Arg 817, Thr 830 ja Asp 831 on mukana napa-vuorovaikutus ligandin. Hydrofobisten vuorovaikutusten välittyvät Cys 773 ja Leu 820. Muut yhteisvaikutukset lääkeaineen kanssa välittyvät Lys 721, Glu 738, Asp776, Arg 817, Leu 820, Thr 830 ja Asp 831.

EGFR kinaasidomeeni (2GS2 ) kanssa enzastaurin.

typistetty rakenne osoittaa positiivista vapaa energia sitoutumisen ymmärtää, että sitoutuminen ei ole mahdollinen, koska suurin osa hajoaa vuorovaikutuksen energiat on positiivista arvoa. Tulos voidaan osittain selittää sillä, että enzastaurin on lähinnä seriini /estäjä mutta olemme telakoituna sen EGFR tyrosiinikinaasialueeseen. Muuten parannettu telakointi ominaisuuksia voidaan mahdollisesti saavuttaa lisäämällä simuloinnin ruudun koon.

EGFR kinaasidomeeniin (2GS2) gefitinibin kanssa.

Meidän telakointi analyysi yhteensä kolme H-sidoksia nähdään, kaksi Thr 830 (atomienväliset etäisyys 2,99 ja 3,89 Å) ja yksi Glu 738 (3,48 Å). Glu 738, Asn 818 ja Asp 831 näyttö polaarisia vuorovaikutuksia. Leu 764, Cys 773 ja Leu 820 hydrofobisia vuorovaikutuksia. Kaksi vesivälitteisiä halogeenisidoksia nähdään kanssa F. Useat muut yhteisvaikutukset ovat huomanneet Val 702, Lys 721, Glu 738, Thr 766, Cys 773, Arg 817, Asn 818, Leu 820, Thr 830 ja Asp 831. monomeerinen ( V948R) gefitinibi /erlotinibi kestävä kaksinkertainen mutantti (L858R + T790M) EGFR kinaasialue on aiemmin yhteistyössä kiteytettyä gefitinibin (ATE ID: 4I22) [55].

keskustelu

Munuaissyöpä käsittää heterogeeninen kasvaimet monipuolisia molekyyli- ja kliinisiä tekijöitä kuten heijastuu vaste erityisiä hoitoja. Ymmärtämään mekanismeja, joilla geenejä muuttavat monenlaisia ​​fysiologisia prosesseja, teimme transkriptionaalinen profilointi tutkimuksen tunnistaa merkittäviä geenejä ja tutkittiin niiden biologiset toiminnot, ja tunnistaa KC liittyvien molekyylien verkko ja reittejä. Satojen erilaisesti ilmaisi geenien tunnistimme S100A8 ja EGFR mahdollisina biomarkkeri KC ja pyrkineet osoittamaan syöpälääkkeen kohde- potentiaalia.

In silico

telakointi analyysi osoitti, että midostauriini ja gefitinibin sitoutuu S100A8 sekä EGFR ja ennustettavasti estää alavirran signalointia KC. Kuitenkin enzastaurin sitoutuu vain S100A8 dimeerin. Meidän havainto johtaa olettamusta, että S100A8 ja EGFR ovat lupaavia antisyöpälääkeaine tavoitteita ja midostauriini voi olla potentiaalinen estäjä. Tämä hypoteesi varmasti on vielä validointi.

S100 proteiineja osallistua erilaisiin toimintoihin kuten proteiini fosforylaatio, entsymaattinen aktivointi, kalsiumtasapainoa, ja vuorovaikutus solun tukirangan komponentteja [38]. Useimmat geeneistä, jotka koodaavat S100 proteiineja ovat ryhmittyneet on alueella ihmisen kromosomin 1q21, joka on altis kromosomaalisen uudelleenjärjestelyihin, mikä viittaa siihen, välinen yhteys S100A8 /A9-proteiinien ja etäpesäkkeiden ja kasvaimen muodostumista [38,56]. S100A8 on solujen kasvua edistävää aktiivisuutta pieninä pitoisuuksina sitoutumalla RAGE. Tämä sitoutuminen parantaa solujen mesenkymaaliset ominaisuuksia, indusoi epiteelin-mesenkymaalitransitioon ja pelaa tärkeä rooli syövän eteneminen ja metastaasit syövässä [15,22]. Epänormaali ilmaisuja S100A8 proteiinien havaittiin erilaisia ​​syöpiä, kuten maha-, keuhko-, rinta-, maksa-, haima- ja suomuinen ruokatorven karsinoomat [15,17,20-23,57-60]. Nämä tutkimukset osoittavat potentiaalia S100A8 syöpää tavoite.