PLoS ONE: ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut, jotka ilmentävät CD44 rikastetaan kantasolun Properties
tiivistelmä
Background
Syöpä kantasolu teoria hypothesizes että syöpien pahentaneet syövän kantasolut (CSC) tai kasvain aloittamisen soluihin (TIC) jolla itseuudistumiseen ja muut varsi solu- Vertailukelpoisten kohteiden taas eriytettyä kuin varsi /aloittamista soluilla on rajallinen elinikä. Tutkia, onko hypoteesi on sovellettavissa keuhkosyöpä, tunnistaminen keuhkojen CSC ja esittelyä tätä kapasiteettia on olennaista.
Menetelmät /Principal löytäminen
Ilmaisu profiilit viisi kantasolujen merkkiaineita (CD34, CD44, CD133, BMI1 ja Oct4) seulottiin virtaussytometrialla 10 keuhkosyövän solulinjat. CD44 tutkittiin tarkemmin testaamalla varten
in vitro
ja
in vivo
tumorigenecity. Muodostumista pallomaisten elinten ja
in vivo
kasvainten aloittamista kyky osoitettiin CD44
+ solujen 4 solulinjoissa. Serial
in vivo
kasvaimen transplantability nude-hiirissä osoitettiin käyttämällä H1299 solulinjaa. Ensisijainen ksenografteissa aloitetaan CD44
+ solut koostuivat sekoitettu CD44
+ ja CD44
– solujen samanlainen suhde kuin vanhempien H1299 solulinja, joka tukee
in vivo
erilaistumista. Semikvantitatiivinen Real-Time PCR (RT-PCR) osoitti, että molemmat vasta lajiteltu CD44
+ ja CD44
+ peräisin olevia soluja CD44
+ – aloittanut kasvaimet ilmaisivat pluripotenttisuuden geenien
Oct4 /POU5F1
,
Nanog
,
Sox2
. Nämä stemness merkkiaineet eivät ilmennä CD44
– soluja. Lisäksi juuri lajiteltu CD44
+ solut olivat resistenttejä sisplatiinihoitoon pienemmillä apoptoosin tasoa kuin CD44
– soluja. Immunohistokemiallinen analyysi 141 resektoitiin ei-pienisoluisen keuhkosyövän osoittivat kasvainsolujen ilmentymisen CD44 on 50,4% kasvaimista, kun taas ei CD34: ää, ja CD133 ilmentyminen havaittiin kasvainsoluissa. CD44-ilmentyminen liittyy okasolusyöpä mutta yllättäen, pidempi eloonjäämisen havaittiin CD44-ilmentävien adenokarsinoomia.
Päätelmä /merkitys
Kaiken tuloksemme osoittivat, että kantasolujen kaltaisia ominaisuuksia rikastetaan in CD44-ilmentävät alaryhmien joidenkin keuhkosyövän solulinjat. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään roolin CD44 kasvaimen solujen uusiutumista ja syövän eteneminen
in vivo
ympäristössä.
Citation: Leung EL-H, FISCUS RR, Tung JW, Tin VP -C, Cheng LC, Sihoe AD-L, et al. (2010) Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut, jotka ilmentävät CD44 rikastetaan kantasolun Properties. PLoS ONE 5 (11): e14062. doi: 10,1371 /journal.pone.0014062
Editor: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Kiina
vastaanotettu: 05 toukokuu 2010; Hyväksytty: 26 lokakuu 2010; Julkaistu: 19 marraskuu 2010
Copyright: © 2010 Leung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ tukivat Seed rahaston Basic Research (HKU 10400863 MP Wong), pieni kohdeapuraha (HKU 200907176141 EL Leung) ja ulkomailla tutkijakoulutuksen apurahan Kiinasta Lääkintöhallitus, University of Hong Kong, myönnetään EL Leung. Tätä työtä tuki myös osittain National Institutes of Health Avustukset R01HL087948, National Cancer Institute Grant R21CA131522 (Y. Ma). DOE rahoitus DOE-FG02-08ER64608 Nevada Cancer Institute (L. M. Fink), Startup rahoitus Nevada Cancer Institute ja University of Southern Nevada (R. R. FISCUS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Keuhkosyöpä on johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti. Yleinen ennuste on huono ja alhainen 5 vuotta säilymiseen esitetään kovin myöhään, taudin pahenemiseen ja puute parantavaa systeemisen hoidon. Äskettäin syövän kantasolut (CSC) teoria esittää, että syöpiä ylläpitävät alapopulaatioista syöpäsolujen hallussaan kantasoluja tai kantasolujen ominaisuuksia. Nämä solut voivat aloittaa kasvaimen muodostumisen, erottaa pitkin multi-voimakas reittejä, ja ne ovat suhteellisen resistenttejä tavanomaisille kemoterapiaa [1]. CSC on osoitettu hematologisten ja joitakin kiinteitä kasvaimia kuten rinta-, aivo-, koolon-, keuhko- ja maksan syövät [2], [3], [4], [5], [6]. Eri kantasolujen merkkiaineiden normaaleissa kudoksissa on käytetty CSC tunnistamista ja eristämistä. Esimerkiksi CD133 on useimmin osoitettu markkeri syövät maksan, aivojen, paksusuolen ja keuhkojen, jne [3], [4], [5], [6]. CD44
+ /CD24
– /matala profiili luonnehtii CSC rinta- ja eturauhassyövissä [7], [8]. Expression of avaimen ”stemness” geenit alkion (ES) ja indusoi-pluripotentteihin varsi (iPS-solut) Oct4 ja BMI1 [9], [10] on tavattu CSC eri syövistä [11], [12].
merkki profiilia keuhkojen CSC vielä löytäjäänsä. Uusimmat tutkimukset, NSCLC solulinjoja ja raikas keuhkojen kasvain kudosten ehdottaa CD133 kuten keuhkojen CSC markkeri [3], [11], [13], [14], [15], [16]. Biokemialliset tutkimukset osoittivat, että CD133 lla toiminnallinen rooli solukierron säätelyssä ja lisääntymistä, mutta ei kasvaimen aloittamista [17]. Tutkimukset paksusuolen syövän osoitti, että CD133
+ soluja on korkeampi DNA-pitoisuus [18] ja tulla CD133
– aikana etäpesäkkeiden, mutta molemmat CD133
+ ja CD133
– soluja aloittaa kasvain SCID-hiirissä [ ,,,0],19]. CD133
– väestöä paksusuolen syövän ja melanooma havaittiin myös olevan kasvaimia synnyttäviä SCID /nude-hiirten [19], [20]. Markkereita, kuten ESA, CXCR4, ALDH ja ABCG2 on käytetty CD133 eristämiseen CSC alkaen keuhkosyövässä [13], [21], [22]. CD34 ja Sca-1 ovat käyttökelpoisia tunnistamiseen hiiren keuhkon kantasolujen mutta Sca-1 ei ilmenny ihmisen kudoksissa [23]. Tutkia tarkemmin keuhko CSC merkkiaineita, olemme seulottu ilmaisun profiilia CD34, CD44, CD133, BMI1 ja Oct4 10 keuhkosyövän solulinjat virtaussytometrillä. Olemme osoittaneet, että CD44
+ mutta ei CD44
– soluja valikoiva syöpäsolulinjasta voitaisiin laajentaa ja sarjoittain lisätyistä
in vitro
ja
in vivo
. Ehdotamme, että CD44-ilmentäviä soluja rikastetaan kantasolujen ominaisuuksia. Tutkimuksemme ei osoita, että kaikki CD44
+ solut ovat todellisia CSC kuitenkin ehdotamme, että CD44 voisi olla merkki kasvaimen aloittamisesta kyky joissakin keuhkosyövän soluja. Ekspressiokuviota CD44 myös kliinisissä keuhkosyövässä.
Tulokset
Kantasolujen merkki ilmaisun profiilia NSCLC solulinjojen
Analysoimme ilmentymisprofiilin oletettujen pinnan ( CD34, CD44, CD133) ja ydin- markkereita (BMI1, Oct4) kantasolujen 10 keuhkosyövän solulinjoja käyttämällä virtaussytometrialla (taulukko 1). Pintamerkkiainetta, CD34, CD44 ja CD133 ilmaistiin eri taajuuksilla. CD44 oli merkittävä markkeri ilmaiseman H1299 ja H23. A549, H441 ja H1648 ei osoittanut ekspressiota pinnan merkkiaineiden tutkittu. CD133 ilmaistiin HCC1833 vain. Ei korrelaation ilmaisun taajuuden välillä havaittiin mitään 2 markkereita. Molemmat ydin- markkereita, BMI1 ja Oct4, ilmennettiin useimmissa syöpäsoluissa kaikissa solulinjoissa tutkittu. Edustavia kaaviot virtaussytometria analyysi CD44 ja CD133 ilmentyminen näytettiin kuviossa 1. Immunoblottausmääritys ja immunohistokemia (IHC) analyysit suoritettiin myös solulinjoja, jotka sisälsivät CD44
+ ja CD133
+ populaatioiden (kuvio 2A). Immunoblot osoitti CD44-proteiinin ilmentymistä H1650, HKULC2, H1299, HKULC4, HCC827 ja H23. CD133-proteiini on vain ilmaistu HCC1833 ja PLC8024, jota käytettiin positiivisena kontrollina solulinja CD133 [4]. IHC osoitti myös CD133 ilmentyminen HCC1833 muttei H1299, ja päinvastoin CD44 ilme. Siten tulokset molempien analyysien vastasivat virtaussytometrialla tietoja.
edustaja kaaviot virtaussytometria analyysi CD44 (FITC) ja CD133 (PE) ilmentyminen keuhkosyövän solulinjoissa HKULC2, HCC827, HKULC4, H23, HCC1833, H1299 ja H1650. Kuolleita soluja, solu roskat ja dupleteiksi saatiin erotettua pois. Korvaus taustafluoresenssia suoritettiin mittaamalla kohde signaaleja yksivärisiä valvonnan ja negatiiviset kontrollit. Tulokset esitettiin 2D kaaviokuvia, piirtämällä joko PE tai FITC-signaaleja vastaan merkityksetön kanavan ECD® (tunnetaan myös PE-Texas Red). Keskimääräinen prosenttiosuudet 3 yksittäisistä analyysit esitetään taulukossa 1.
. Edustavia immunoblottia H1650, HKULC2, H1299, HKULC4, HCC827, H23, HCC1833 ja PLC8024 kokonaisproteiinin lysaatin käyttäen vasta-aineita CD44 ja CD133. Aktiini käytettiin latauskontrollina. Blotti edustaja kolmesta erillisestä kokeesta. B. Yleiskuva näyttää tiheyden SB muodostumisen CD44
+ ja CD44
– H1299 solujen viljelemisen jälkeen RPMI EGF, FGF ja insuliini täydentää 21 päivää (ylempi paneeli), ja morfologia SB viikon välein (keskimmäinen paneeli). Solut ensimmäisen sukupolven SB olivat eriteltyjä ja analysoitiin virtaussytometrillä (alempi kuva). CD44
+ ja CD44
– (81,58%: sta 9,68%) suhde oli samanlainen kuin vanhempien H1299 soluja (81,3%: sta 18,7%, taulukko 1). SSC, Side Scatter Channel. C. edustaja aloilla pesäkkeen muodostumisen lajittelematonta, CD44
+ ja CD44
– H1299 solujen pehmeässä agarissa viljelyn jälkeen 21 päivää. Sisäkkeet näyttää suurennettuna näkymät edustajan pesäkkeiden vastaavista soluista otettu samoissa suurennos. CD44
– alaryhmä verrokkeja vähemmän pesäkkeitä verrattuna sekä CD44
+ ja lajittelemattoman alaryhmiä. (**, P 0,01). Histogrammit edusti keskimäärin 3 riippumatonta havaintoja eri kokeesta.
Sferoidiviljelmiä muodostumista kyky NSCLC solulinjojen
Seuraava arvioitu sferoidiviljelmiä runko (SB) muodostuminen kyky FASC fraktioimatonta solut mukaan CD44 ja CD133 ilmentyminen 7 solulinjoissa. 500 lajittelematonta, merkki
+ ja merkki
– soluja, tässä järjestyksessä, viljeltiin kuin liima ja seerumitonta olosuhteissa EGF, bFGF ja insuliini täydentää 21 päivää. Prosenttiosuus SB muodostumisen kunkin solulinjan laskettiin satunnaiskentän valinta 21. päivänä ja tulokset esitettiin graafisesti histogrammit (Täydennyskuvio S1). Lajittelemattoman soluja kaikista 7 solulinjat pystyivät muodostamaan SB. SB myös muodostettu CD44
+ alaryhmien 6 solulinjojen jossa CD44 ilmentyi, mutta ei CD44
– osapopulaatioiden. Lisäksi HKULC2, H1299 ja H1650, joka sisälsi aloittaa pienemmällä osuudet CD44
+ solujen synnytti huomattavasti enemmän SB kuin lajittelemattomien soluihin (* p 0,05, ** p 0,01). Sillä HCC1833, CD133
+ mutta ei CD 133
– solut muodostivat SB. Kasvu SB numerot CD133
+ verrattuna lajittelemattomien soluihin ei ollut tilastollisesti merkitsevä. 21 päivän jälkeen, kaikki SB alkaen H1299 CD44
+ solut hajotetaan yksittäisiksi soluiksi ja suspendoidaan uudelleen elatusaineet. Jopa kolme peräkkäistä kertaa perustettiin, mikä osoittaa
in vitro
itsensä uudistamista CD44
+ soluja. Virtaussytometrianalyysi ensimmäisen sukupolven SB soluja H1299 osoitti 81,58% of CD44
+ soluja, jotka läheisesti muistutti 81,3%: n vanhempien soluja, osoittamalla, että
in vitro
tumorigenecity alkaen CD44
+ solut johti jälkeläisten kanssa samaa profiilia CD44 ilmentymisen (Fig. 2B). Kyky muodostaa klooneja määritys pehmeässä agarissa osoitti myös, että vasta eristetty H1299 CD44
+ solut muodostivat merkitsevästi enemmän pesäkkeitä kuin CD44
– soluja 3 viikon ajan (** p 0,01), joka tukee parannettu kyky uusiutua ja CD44-valittujen solujen (Fig. 2C).
in vivo
kasvaimeen aloittamista ominaisuudet CD44
+ solujen ja kasvu edelliseen elinsiirtojen tehokkuuden nude-hiirissä
kyky markkeri-valitut solut aloittaa
in vivo
kasvain tutkittiin ihon alle siirrettäväksi nude-hiiriin. Sillä H1299, HKULC4, H1650 ja HCC827, niinkin vähän kuin 10000 CD44
+ solut pystyivät aloittaa kasvaimia 30-68 päivää (taulukko 2), mutta ei tuumorin muodostettiin sama määrä lajittelemattomien tai CD44
– soluja 90 päivän kuluttua. Lajittelemattoman solujen H1299, kasvaimen aloittamisesta voitaisiin saavuttaa 200000 solut (3/4 hiirtä), kun taas CD44 + -solujen, kasvaimia aloitettiin 10000 (1/4 hiiret), 50000 (3/4 hiiret) ja 100000 solua (4 /4 hiirtä). CD44
– soluja, ei kasvaimen muodostettiin jopa käyttämällä 200000 soluja (0/4 hiiret) (Fig. 3A-edustaja kasvaimia, taulukko 2). Olemme leikeltiin hiiret ja tutkinut kaikki elimet ja löytänyt etäpesäkekasvainten muodostumista lajitellut tai lajittelemattoman soluja Tarkkailujaksolla. Sillä HKULC2 ja H23, vaikka SB muodostuminen havaittiin, ei ksenografti- kasvain muodostettiin käyttäen 200000 lajittelematonta, CD44
+ tai CD44
– soluja. Samoin 200000 lajittelematonta, CD133
+ tai CD133
– HCC1833 solut eivät muodosta kasvaimia.
. Edustavia kuvia ensisijaisen ksenograftikasvaimissa. Kasvaimen aloittamisesta saavutettiin 200000 lajittelematonta soluja (3/4 hiiret). Vuodesta CD44
+ soluja, kasvaimia aloitettiin 10000 (1/4 hiiret), 50000 (3/4 hiiret) ja 100000 solua (4/4 hiiret). Ei kasvain muodostettiin 200000 CD44
– soluja (0/4 hiiret). PBS, suolaliuos injektiota ohjaus. B. Virtaussytometriaa analyysi eriteltyjä ensisijaisen ja toissijaisen ksenografteissa osoitti vastaavia CD44
+ ja CD44
– alaryhmä suhdelukuja vanhempien H1299 soluja. X-akseli: CD44 lauseke, FITC kanava; Y-akseli: Kuolleet solut värjättiin PI, PE kanava. C. Semi-kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi ensisijainen ksenograftien osoittivat ilmentymistä CD44 vakiolomakkeella (CD44s) ja pluripotenttisuus geenit (
POU5F1
,
Nanog
,
Sox2
) in CD44
+ mutta ei CD44
– alaryhmiä. D. IHC analyysi ksenograftien peräkkäisistä sukupolvien vastaanottajan hiiret osoittivat CD44 ilmentymistä solukalvon jakeluun. Isäntäsolut peräisin hiirestä läsnä kasvain strooman ei värjätään. Kasvain kasvukäyrät ensimmäisen, toisen ja kolmannen asteen ksenograftikasvaimissa muodostama lajittelemattomia CD44-lajitellaan H1299 solut piirretty havainnoimalla ja mittaamalla kasvainten muodostumiselle viikoittain jopa 9 viikkoa, afterwhich hiiret karhittava välttää liikakasvuun kasvaimia.
seuraavaksi kokeet testataan, onko kasvain aloittamista kapasiteettia voitaisiin lisättyjen
in vivo
. Koska H1299 CD44 + osoitti lyhin viive kasvaimen muodostumisen (taulukko 2), me erottaa H1299 primaarikasvaimen osoittaa
in vivo
serial tranplantability. Ainoa toimiva syöpäsolujen eriteltyjä H1299 ksenografteista valittiin sarja- kasvaimen siirrettäväksi toissijainen, ja sen jälkeen, kolmannen asteen saajahiiret. Kasvaimet muodostettiin CD44
+, mutta ei CD44
– soluja (taulukko 3). Erityisesti vaikka osuudet elävien CD44
+ soluja (47,73% perus, 0,91% keskiasteen) (kuvio 3B) on vähennettävä sarjasiirteillä, tehokkuus kasvaimen aloittamisesta kasvoi sukupolvet kasvaimen. Latenssi kasvaimen muodostumisen 5000 CD44
+ soluja progressiivisesti lyhennettiin 30 päivän ensimmäisen sukupolven, 21 päivää toisen ja 14 päivän tertiäärisen sukupolvi, vastaavasti. Solujen lukumäärä aloitettava kolmannen asteen kasvaimet pienenivät 1.000 CD44
+ solut.
analysoimiseksi erilaistumista kapasiteettia CD44
+ soluja, korjatun kasvaimet olivat eriteltyjä ja alistettiin virtaussytometria-analyysi. CD44
+ :CD44
– suhde primaarikasvaimen oli 80.72:17.0, ja toissijaisen kasvain oli 85.4:12.53. Nämä olivat samaa luokkaa kuin vanhempien solut (81.3: 18,7), mikä osoittaa niiden kaltaiset CD44 ilmaus hierarkia peräkkäisiä sukupolvia ksenograftien (Fig. 3B). Tarkempi analyysi primaarikasvaimen RT-PCR paljasti ilmentymisen pluripotenttisuuden merkkiaineiden
POU5F1
,
Nanog
ja
Sox2
in CD44
+ mutta ei CD44
– alapopulaatiot (Fig. 3C).
Kuva. 3D esitetään edustavat IHC värjäytymistä CD44 ja kasvaimen kasvukäyrät ensisijaisen ja sarjatuotantona siirrettyjen ksenograftit. Kuten alla kasvaimen kasvukäyrä, ensisijainen ja sarjamuotoisesti siirrettyjen kasvainten aloitetaan 50000 CD44
+ solut kasvoivat nopeammin kuin 200000 lajittelematonta soluja.
CD44
+ solujen ilmaista pluripotenttisuus ja epiteelikasvaimet-mesenkyymikasvaimia-Transition (EMT) merkkejä ja hallussaan erilaistumisen potentiaalin
ilmaisu pluripotenttisuuden geenien ja hankkiminen mesenkymaalisten piirteitä on osoitettu osoittavat kantasolujen fenotyyppiä. Osoitimme co-ilmentymisen sikiön proteiinien Oct4, Nanog ja Sox2 IF tutkimuksia SB välillä CD44
+ H1299 soluja. Semi-kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin myös vasta lajiteltu CD44
+ ja CD44
– H1299 soluja. Expression of
Oct4
,
Nanog
,
Sox2
ja mesenkymaaliset markkereita
SNAI1
,
CDH2
ja
VIM
näytettiin CD44
+ soluja, mutta olivat alhaisemmat tai havaitsematon CD44
– soluja. Koska ero ilmaus standardin (
s
) ja variantti muotoja (
v3
,
V5
,
v6
ja
v10
) ja CD44 on osoitettu kanta- tai erilaistuneita soluja, tutkimme kuvio
CD44
mRNA RT-PCR: llä. Sekä vakio- ja varianttimuodot havaittiin CD44
+ mutta ei CD44
– soluja, mikä viittaa säilyttäminen
CD44
mRNA ero silmukoinnin potentiaalit CD44
+ verrattuna CD44
– alaryhmästä (Fig. 4A B).
. Immunofluoresenssimenetelmällä luonnehdinta SB välillä CD44
+ alaryhmästä, joka osoittaa koekspressoimalla Oct4, Nanog ja Sox2. DAPI, valvonta; Green, Oct4-FITC; Punainen, Sox2-Texas Red; Sininen, pseudovärin of Nanog PE-konjugoidun vasta-aineen. B. Semi-kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi osoitti pluripotenttisuus geenejä,
SNAI1
,
CDH2
,
VIM
,
CD44s
ja
CD44 v3 , 5,6,10
ilmaisun CD44
+ soluja. CD44
– H1299 soluista puuttuu nämä lauseke paitsi
CDH2
ja
VIM
. C. CD44
+ solut olivat resistenttejä apoptoottisen vaikutusten 5 uM sisplatiinin verrattuna CD44
– in H1299 ja H1650-solujen 24 tunnin inkuboinnin. Histogrammit edusti keskimäärin kolme erillisiä kokeita lajittelematonta, CD44 + ja CD44- soluihin ennen ja jälkeen sisplatiinihoitoon.
CD44
+ soluja sisplatiini-resistenttejä
Juuri lajiteltu CD44
+, CD44
– ja lajittelemattoman solujen H1299 ja H1650 viljeltiin seerumittomassa RPMI ja altistettiin 5 uM sisplatiinihoitoon 24 tunnin ajan. Histogrammi kuviossa. 4C edustaa keskimäärin kolme yksittäisten kokeiden molemmissa solulinjoissa. Apoptotic ja ei-elävät solut mitattiin anneksiini V ja PI-värjäyksellä käyttäen virtaussytometria, vastaavasti. Sillä H1299, sisplatiini-hoitoa lajittelematonta tai CD44
+ soluja ei johtanut merkittävään kasvuun apoptoottisten solujen verrattuna niiden käsittelemätön kontrolli, joka osoittaa suhteellisen sisplatiinin vastus. CD44
– solut osoittivat merkittävää kasvua apoptoosin (*** p 0,001) hoidon jälkeen osoittaa sisplatiinin herkkyys. Verrattaessa keskuudessa ryhmissä, CD44
– solut osoittivat merkitsevää (### p 0,001) apoptoosin verrattuna sekä lajittelemattomia CD44
+ soluja, mikä osoittaa, että CD44
– soluja olivat sisplatiinipohjaisen herkkä ja 3 ryhmään. Vastaavia tuloksia havaittiin myös H1650, osoittaa suhteellinen sisplatiini vastus lajittelemattomia CD44
+ soluja. Lisäksi resistenttejä H1299-solut stabiilisti valitaan pitkän aikavälin sisplatiinihoitoon oli suurempi pohjapinta prosenttiosuus (96,2%) ja CD44
+ soluja verrattuna emo-soluihin (82%). Samalla tavoin H1650, pohjapinta CD44
+ osuus on kasvanut 61,5%: sta 92,9%. Tulokset osoittivat kestävyys ja selviytymisen etu CD44
+ soluja krooninen sisplatiinihoitoon (Täydennyskuvio S2).
immunohistokemiallinen analyysi syövän kantasolujen merkkiaineiden NSCLC yksilöiden
arvioimiseksi
in vivo
proteiinin ilmentymistä CD44 ilmaisun, IHC suoritettiin puettu kasvaimen ydintä 141 ensisijaisen keuhkokarsinoomia ja reaktiivista tai sikiön keuhkojen kudoksiin. Vuonna kontrollisilkkipaperia, solukalvon ilmentymistä CD44 havaittiin tyvisolut hengitysteiden tai metaplastiset squamous keuhkoputken epiteelin, ja uudistava cuboidal penumosyy- vaurioituneiden keuhkojen. Ei ilmentymistä havaittiin terminaalisesti erilaistuneita epiteelisoluissa kuten värekarvallisten tai ei-Värekarvallinen columnar soluja keuhkoputkien epiteelin tai tyypin I tasainen penumosyy- vuori alveolaarinen tilat. Ensimmäisen kolmanneksen ihmisen sikiön keuhkojen, CD44 ilmentyi epiteelin primitiivisen hengitysteiden (Fig. 5A). Vuonna keuhkosyövässä, ilmentyminen oli läsnä keuhkorakkuloiden makrofageissa ja pienistä lymfosyyteistä joka toimi sisäisiä positiivisia kontrolleja. Täysin, 62/141 (50,4%) tapauksista osoitti CD44 ilme. SCC oli merkitsevästi yhteydessä kohtuullisesta voimakkaaseen lauseke (21/27, 77,8%) verrattuna AD (41/96, 42,7%) (p = 0,002) (kuvio 5B). SCC maltilliseen hyvin erilaistumista, CD44 ilmentyi paljon voimakkaammin pohjapinta verrattuna erääntyvät kasvainsolujen (Fig. 5B), yhdenmukaisia odotetun kantasolujen markkinaraon. Kun vain AD tutkittiin CD44 ilme osoitti heikkoa yhdessä tupakoimattomien (p = 0,024). AD, Log Rank testi osoitti, että potilailla, joilla on negatiivinen tai heikko CD44 lauseke oli huomattavasti huonompi yleistä (p = 0,015), mutta ei ilman taudin etenemistä. SCC, ei ole merkittävää yhteyttä selviytymisen tasoon CD44 ilmentymisen havaittiin. Ei yhdessä muiden kliinis muuttujat, kuten potilaan ikä, sukupuoli, kasvaimen, koko, vaihe, imusolmuke tila, tai patologinen vaiheessa havaittiin (Täydentävä taulukko S2). CD133 ilmentyminen havaittiin vain hajallaan pienissä soluissa stroomaan sikiön ja reaktiivisen aikuisen keuhkojen kudoksia. Pohjapinta bronkiolaarinen epiteelin, elvyttäminen penumosyy- tai kasvainsolut olivat negatiivisia. CD34 havaittiin endoteelin ja reaktiivisia stroomasolujen joissakin kasvaimissa, mutta ei syöpäsoluja. Sen varmistamiseksi, että värjäytymisen puuttuminen ei johtunut alueellinen vaihtelu solun jakautuminen, tulokset todensi toistamalla IHC analyysi täynnä osissa syövän valikoiva tapauksissa.
. CD44 ilmentyminen pseudoglandular vaiheessa alkion keuhkojen (vasemmalla) ja uudistamiseksi penumosyy- keuhko- epämääräistä keuhkorakkulavaurio (oikealla). Inset esittää CD44
+ tyvisoluihin normaaleissa keuhkoputken epiteelissä. B. Edustavia tapauksia adenokarsinoomat (AD) maltilliseen (vasemmalla) ja vahva (oikealla) CD44 ilmentyminen solukalvon jakeluun. Joissakin tapauksissa okasolusyöpää (SCC), CD44 ekspressio oli erityisen merkittävä kasvainsoluissa kehällä (nuoli) kuin keskiosissa (tähdellä) kasvaimen saaria, jotka katsotaan yleisesti kantasolujen sivustoja. Hajallaan pieniä lymfosyyttejä ja marcophages osoitti myös CD44 ilmentymistä kasvain strooman. C. Kaplain Meier selviytymisen analyysin AD-potilaiden (yläpaneeli) ja SCC (alempi paneeli) ryhmiteltynä CD44
+ (kasvainten kohtalaista /voimakas ilmaus) tai CD44
– (poissa /heikko, polttoväli värjäytyminen) . PFS, ilman taudin etenemistä kuukausina; OS, ovrall selviytymistä kuukausina.
Keskustelu
hypoteesi, että syöpiä ylläpitävät alapopulaatio varren tai progenitorisolujen kaltaisia soluja, kun taas ei-varsi /progenitorisolujen on rajallinen elämä span nostaa esiin mahdollisuuden, että kohdistaminen tiettyjä komponentteja säätelyreittejä syövän kantasolujen ylläpito voisi tarjota keinon syövän valvontaa. Tämä on alustava vaihe tutkimaan, onko tämä hypoteesi on sovellettavissa keuhkojen karsinoomat, on tarpeen tunnistaa ja eristää syövän aloittamista soluihin käyttäen sopivia markkereita. Vaikka optimaalinen lähestymistapa tähän tarkoitukseen on vielä tutkitaan, virtaussytometria analyysi ja lajittelu Merkittyjen-positiivisten solujen on tällä hetkellä laajimmin käytetystä menetelmästä [24]. Muun muassa pinnan markkereita tutkittu, olemme osoittaneet, että CD44
+ -soluja rikastetaan kasvaimen lisäys kapasiteettia ja CD44 on potentiaalinen CSC markkeri NSCLC solulinjoissa. Tuoreessa tutkimuksessa metastaattisen keuhkosyövässä pahanlaatuisissa pleuraeffuusio, CD44 on myös raportoitu mahdollisena kantasolu markkeri vaan luonnehdinta kantasolun kaltaisia ominaisuuksia perustui
in vitro
molekyylitason analyysi ja solujen laajentamiseen vain [ ,,,0],16]. Tutkimuksessamme
in vitro
ja
in vivo
tumorigenecity of CD44
+ solujen osoitettiin. Lisäksi meidän vierassiirrekokeissa osoittivat asteittaista lisäämistä elinsiirtojen tehokkuutta peräkkäisissä kasvain sukupolvien lyhentäminen latenssiaika ja laski vähän solujen annoksen siirteen. Yhä kasvainmuodostusta kapasiteettia myös raportoineet Du et al. joka tutki CD44
+ alapopulaatioista koolonkarsinoomasoluissa [25]. Rintojen epiteelisolujen saada läpikäymään EMT osoitettiin hankkia kantasolun ja tuumorigeeniset merkit [26]. Tutkimuksessamme CD44
+ solut myös ekspressioon liittyviä markkereita syytetään EMT kuten
SNAI1
,
CDH2
ja
VIM
. Vain CD44
+ solut ilmensivät pluripotenttisuuden geenien
POU5F1
,
Nanog
ja
Sox2
[10], [27], [28], [29], vaikka nämä merkit katosivat CD44
– soluja, mikä viittaa siihen, että EMT voidaan mukana ylläpitää stemness. Lisätutkimukset ovat tarpeen selvittämiseksi taustalla olevan mekanismin ja näiden välinen vuorovaikutus transkriptio monimutkaisia proteiineja ja CD44 ilme.
viljeltiin H1299 ja H1650 solut, CD44
+ solut osoittivat alemman perustason apoptoottisia tasolla ja suhteellinen vastustuskyky sisplatiiniin kohtelu verrattuna CD44
– soluja. Tämä osoittaa niiden vastustuskykyä chemotoxicity ja kyky ylläpitää kudosten homeostaasin, ominaisuuksia uskotaan liittyvän kudoksen kantasolujen fenotyyppiä. Toisaalta, kun CD44
+ solut siirtämistä
in vitro
osoitteeseen
in vivo
ympäristössä liipaisu merkitty soluhävikkiä läpi apoptoosin, joka on 100-kertainen vähentäminen syöpäsolujen pystyi aloittaa kasvaimia nopeammin peräkkäisessä hiirillä sukupolvien osoittaa luotettavuutta kantasolujen kaltaisia subpopulaatio sisältyvät valittujen solujen. Tämä voi merkitä myös, että vain osa CD44
+ soluja tarvitaan kasvaimen aloittamista, ja että lisääntyvä tumorigenecity of CD44
+ solujen johtui
in vivo
rikastuminen CSC. Edelleen merkki tutkimukset ja hienostunut valintakriteerit ovat tarpeen yksityiskohtaisempia
in vitro
CSC eristäminen.
CD133 on yleisimmin raportoitu markkeri ja sitä on käytetty eristämään CSC tuoreista keuhkosyövässä [13] [15], mutta meidän tutkimuksessa, kaikkein syöpäsolulinjoissa ei ollut merkittävää CD133-ilmentymisen joko semikvantitatiivisella RT-PCR: llä (tuloksia ei ole esitetty), IHC, immunoblottauksella (Fig. 2A), tai virtaussytometrialla analyysi (taulukko 1). Käyttäen samaa anti-CD133-vasta-aineen, Chen et al. havaittiin vain 0,7% CD133 ilmentyminen H1299, kun taas mitään ekspressio havaittiin myös tutkimuksessa [11]. Keskuudessa tutkittu solulinjat, vain HCC1833 osoitti SB muodostumista CD133-valinta, mutta
in vivo
tumorigenecity ei voitu osoittaa. Muiden hiirten lajit, joita immunologisesti suvaitsevaisempia ksenografteissa voisi paljastaa erilaisia tuloksia. Ei tietoa HCC1833 ovat saatavilla kirjallisuudessa vertailun. Stuelten et al havaitsi myös harvinaisia CD133 ilmentyminen NCI60 syöpäsolun paneelin [30]. CD44 ilmentyminen havaittiin kuitenkin kahdella solulinjoissa, havaintonsa poikkesivat meidän. Havaitsimme 0% ja 95,9% sekä CD44 A549- ja H23, mutta 84,41% ja 30,95%: lla, havaittiin, joita tutkijat [30]. Emme voi selittää erot, mutta tiedot muiden syöpien ovat myös raportoineet discrepant havaintoja. Esimerkiksi eräässä tutkimuksessa raportoitu 38-72% of CD133 + solujen munasarjasyövän solulinja SKOV3 vaikka prosenttiosuus saapuvat Stuelten et al oli vain 0,78%. Eri merkki prosenttiosuudet on myös havaittu paksusuolen ja maksan syöpäsoluja [30], [31], [32]. Epäjohdonmukaisuutta CSC merkki profiilin ilmaus keskuudessa eri tutkimusten voisi liittyä yksittäisiin syöpään vaihtelua, mutta ne voivat myös johtua eri teho todetaan, koostumusta tai toiminnallisia ominaisuuksia syövän varren tai esisolujen populaatiot. Koska spesifinen merkki, todellinen prosenttiosuus CSC kasvaimen, erityisesti, että vakiintuneet syöpäsolulinjoissa on kiistanalainen [24]. Vaihtelu ympäristö- ja selektiivinen paineet kokema syöpäsolut
in vitro
ja
in vivo
saattaa laukaista tai tukahduttaa erilaisia reittejä molekyyli verkkoja, jotka säätelevät CSC toimintoja, ja se ei ole selvää, onko CSC markkeri profiili voisi vaihdella olosuhteiden. Vaikka olemme osoittaneet, että CD44
– solut ovat kykenemättömiä kasvain jatkumisen, tarkempia menetelmiä CSC valinta ja kuvaaminen on selvästi tarpeen. Olisi syytä tutkia, onko CD44 voitaisiin yhdistää muiden mahdollisten CSC markkereita, kuten ALDH, CXCR4, ABCG2, puoli väestö merkki, ESA jne tehostamiseen ja spesifisyys CSC valinta [13], [21], [22], [33].
CD44 on kalvoon sitoutunut glykoproteiini, joka välittää runsaasti erilaisia toimintoja. Viimeaikaiset tutkimukset ovat antaneet tukea rooliaan CSC merkki. Esimerkiksi kloonilaajenemisen ja ksenografti aloittamisen kapasiteetti CD44
+ – valittu peräsuolen syövän CSC voitiin estää CD44 Knockdown [25]. Homotsygoottinen CD44 poistoista suolen krypta solujen eloonjäämistä ja heikennettyjä tumorigenecity vaikuttamatta lisääntymistä ensisijainen hiiren paksusuolisyöpä malli [34]. Mekanistisesti, invasiivinen ja metastaattinen kasvua voidaan välittää vuorovaikutuksen kautta solun pinnan CD44 soluväliaineen komponenttien, kuten hyaluronaania myöhempien muutosten indusoituvat solun tukirangan koneiden syöpäsolujen [35]. CD44 ilmentyy pinnalla koolonkarsinoomasoluissa on osoitettu sitoutumisen helpottamiseksi sisäkalvon P- tai L-selektiinin ja lisätä kasvaimen pääsy haematogenous leviämistä [36]. CD44 on myös verkottaa monet signalointikaskadien jotka välittävät kasvainta parantavia toimintoja. Se toimii yhteistyössä reseptorin naapurimaiden EGFR tai muiden erbB-perheen reseptorien tyrosiini- kinaasien [37], ja voi aktivoida solujen lisääntymistä polkuja välillisesti ligandin esitys kuten Hajontatekijän reseptoriinsa c-MET [38]. Kasvainsolun eloonjäämistä, voitaisiin lisätä aktivaation kautta anti-apoptoottisia reittejä, kuten PI3K /AKT cascade [39], [40] ja Bcl2: n ja Bcl-xL transkriptiotekijöiden [41]. Raportti pienisoluisessa keuhkosyövässä osoitti, että aktivaatio CD44-MAPK-PI3K signalointi lisäsi ilmentymisen uPA /uPAR ja MDR1, mikä parantaa invasiivisia ja monilääkeresistentin syövän fenotyypit [42]. On ehdotettu, että variantti muotoja CD44, erityisesti CD44v6 joka ohimenevästi ilmaistiin alkion keuhkojen kehitystä, välittää kasvainsolun maahanmuutto- ja invaasion ja voi riittää CSC merkki [43].