Krooninen sairaus

tiivistelmä

Analyysit NY-ESO-1-spesifisiä spontaaneja immuunivasteita syöpäpotilailla paljasti, että vasta-aine ja sekä CD4

+ ja CD8

+ T-solu vasteita indusoitui yhteen syöpäpotilailla . Tutkia, onko tällainen integroitu immuunivaste myös spontaanisti indusoi muita kasvaimen antigeenejä, olemme arvioineet vasta-aine- ja T-soluvasteita itse /kasvaimen antigeeni p53 munasarjasyöpä potilaiden ja terveiden yksilöiden. Olemme havainneet, että 21% (64/298) munasarjasyövän potilailla, mutta ei terveillä luovuttajilla osoitti IgG-vasteita villityypin p53-proteiini. Vaikka mikään 12 potilailla, joilla on korkea titteri p53-vasta-ainetta osoitti spontaani p53-CD8

+ T-soluvasteiden seuraava yksittäinen

in vitro

herkistymistä merkittäviä p53-spesifinen IFN-γ tuottavien CD4

+ T -soluja havaittiin potilaalla 6: sta. Yllättäen samalla tasolla p53-spesifisten CD4

+ T-soluja, mutta ei CD8

+ T-soluja havaittiin myös 5/10 seronegatiivisilla syöpäpotilailla ja 9/12 terveillä luovuttajilla. Tärkeää on, että p53-spesifisten CD4

+ T-solut terveiden luovuttajien alkunsa CD45RA

– antigeeni-kokenut T-solujen populaation ja kirjataan luonnollisesti prosessoitujen villityypin p53-proteiini. Nämä tulokset esiin mahdollisuuden, että p53-spesifisten CD4

+ T-solujen heijastaa poikkeavuudet p53 esiintyy terveillä henkilöillä ja että he voivat olla rooli prosesseissa immuunitutkimusohjelmasta tai immunosäätelyssä p53 liittyviä neoplastisia tapahtumia.

Citation: Tsuji T, Matsuzaki J, Ritter E, Miliotto A, Ritter G, Odunsi K, et al. (2011) Split T Cell Tolerance vasten Self /Tumor Antigen: Spontaanit CD4

+ mutta ei CD8

+ T soluvasteita p53 syöpäpotilailla ja Terveet luovuttajat. PLoS ONE 6 (8): e23651. doi: 10,1371 /journal.pone.0023651

Editor: Mauricio Martins Rodrigues, Federal University of São Paulo, Brasilia

vastaanotettu 4 maaliskuuta, 2011; Hyväksytty: 22 heinäkuu 2011; Julkaistu: 12 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Tsuji et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Cancer Research Institute munasarjasyöpä työryhmä Grant ja syövän rokotteen Collaborative rahoittama Cancer Research Institute ja Ludwig Institute for Cancer Research Oy rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista, tai valmistelu käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Lisääntyvä todistusaineisto osoittaa, että sekä kasvain antigeenispesifisten CD4

+ ja CD8

+ T-solut on kriittinen rooli hävittämisessä syöpä [1], [2]. Olemme laajalti tutkittu spontaani tai rokotteen aiheuttama immuunivaste syöpää kiveksen antigeeni NY-ESO-1 prototyyppi Kasvainantigeenin ihmisen [3], [4], [5], [6], [7], [8 ]. Luonnossa esiintyvä NY-ESO-1-CD4

+ ja CD8

+ T-solu vasteita havaitaan tyypillisesti vain potilailla, joilla oli seerumin vasta vastaan ​​NY-ESO-1, mikä osoittaa, että spontaani immuunivasteet NY-ESO- 1 syöpäpotilailla NY-ESO-1 ilmentävien kasvainten pitkälle integroitu [3], [4]. Äskettäin on osoitettu, että rokotuksen jälkeen NY-ESO-1-proteiinia ja CpG, NY-ESO-1-spesifisten CD4

+ T-solujen tuli havaittavissa ensin, sen jälkeen ulkonäkö vasta-aineen ja CD8

+ T-solut , mikä viittaa rooli NY-ESO-1-spesifisten CD4

+ T-solujen helpottaa vasta-aineen ja CD8

+ T-soluvasteita, kun immunoterapia [8]. Lisäksi olemme viime aikoina havaittu, että rokotus MAGE-A3-proteiinin aiheuttama integroitu MAGE-A3-spesifistä vasta-ainetta, CD8

+ ja CD4

+ T-soluvasteiden [9]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaasta, jotka saivat MAGE-A3 proteiini muotoiltu -adjuvanttisysteemiin AS02B, CD8

+ T-soluvasteiden esiintyi vain potilailla, joille kehittyi erittäin korkea tiitteri vasta-aine ja vahvat CD4

+ T-soluvasteita . Tällainen korrelaatio vasta-aineen ja T-soluvasteita ei ole käsitelty muilla ihmisen kasvaimen antigeenejä.

Viimeisten vuosikymmenten immuunivasteet p53 on tutkittu laajasti [10], [11], [12 ], [13]. P53-proteiini löydettiin meidän laboratoriossa immunogeeninen kasvain-spesifisen antigeenin serologinen tutkimus kasvainta kantavien hiirten [14], ja samanaikaisesti kahdessa muissa laboratorioissa käyttämällä muita menetelmiä [15], [16]. Myöhemmin havaittiin, että p53-geenin usein mutatoitunut erilaisissa syövissä, mikä johtaa heterozygoty, dysregulaatio p53 palautteen verkkojen, ja johtaa lopulta hitaammin p53 liikevaihdon ja siten kertymistä mutantti p53-proteiinin kasvainsoluissa. Ihmisillä, p53 kertyy jopa 70% kasvainten potilaiden tiettyjen syöpien, kuten paksusuolen tai pään ja kaulan syöpä, ja tämä kertyminen on erittäin immunogeeninen tapauksessa spontaanisti laukaisee korkea-tiitteri spesifejä vasta-aineita [12]. Todellakin, p53 on yksi useimmin havaittu tunnistamia antigeenejä luonnollisesti esiintyviä vasta-aineita syöpäpotilaiden seulonta cDNA-ekspressiokirjastojen peräisin ihmisen kasvaimista autologisen vasta-aineella (Serex) ja ELISA: lla laboratoriossamme [17], [18] , [19], [20]. Luonnollisesti esiintyvät p53 seerumin vasta-aineiden syöpäpotilailla tiedetään tunnistaa villin tyypin N-päähän tai C-päähän sekvenssit p53, mutta ei keskiosan proteiinin, jossa 90% mutaatioita esiintyy. Me ja muut ovat myös tutkineet T-soluvasteita vastaan ​​villityypin p53 ja monia epitooppeja sekä CD8

+ ja CD4

+ T-solu on määritetty käänteisellä immunologian lähestymistapoja ja toistuva T-solujen stimulaation kanssa syntetisoitujen peptidien [10 ], [21], [22]. Viimeaikaiset tulokset T-solun immunomonitorointia munasarjojen ja peräsuolen syövän potilaiden rokotettu p53 päällekkäisiä peptidejä osoitti vahvaa induktion p53-spesifisten CD4

+ T-soluvasteita, jotka olivat jopa havaittavissa

ex vivo

analyysit ääreisverenkierron mononukleaariset solut (PBMC: t) rokotuksen jälkeen aiheuttamatta mitään havaittavaa p53-spesifisten CD8

+ T-solujen [23], [24].

esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet spontaanin vasta-aine- ja T-solujen vasteita p53 munasarjasyöpää sairastavilla potilailla, joiden kasvaimet usein kerääntyä p53-proteiini [25], ja terveillä luovuttajilla. Vertaamaan

in vivo

immunogeenisuutta p53 kanssa, NY-ESO-1, me seurataan p53-spesifisten CD4

+ ja CD8

+ T-soluvasteita käyttäen immunomonitorointia menettelyjä, jotka kehitettiin seurata spontaani NY-ESO-1-spesifisten T-soluvasteiden. Näitä standardoituja menetelmiä aiemmin osoitettu havaita NY-ESO-1-tiettyjen kiertävien CD4

+ ja CD8

+ T-soluvasteita ainoastaan ​​NY-ESO-1-seropositiivisilla potilailla, joilla on NY-ESO-1-ilmentävä kasvain, mutta ei terveillä luovuttajien harvoin, lähtöaineiden [4], [26]. Käyttäen tätä protokollaa, huomasimme, että IFN-γ tuottavien CD4

+ T-solut vastaan ​​villityypin p53-sekvenssit havaittiin usein seropositiivisille syöpäpotilailla. Yllättäen spontaani p53-CD4

+ T-solu vasteita samaa suuruusluokkaa todettiin myös useimmilla seronegatiivisilla potilailla ja terveillä luovuttajilla. Sen sijaan ei ole spontaania CD8

+ T-solu-vasteita villityyppisen p53: n eikä vastaan ​​potilaiden omien p53-sekvenssit havaittiin tahansa luovuttajien testattu, mikä viittaa siihen, että spontaani aktivoituminen CD8

+ T-solu-vasteita p53 on voimakkaasti ohjataan

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

potilaiden ja terveiden luovuttajien näytteitä

PBMC ja seerumi saatiin munasarjasyöpä potilaille Roswell Park Cancer Institute, hyväksytyn protokollan Institutional Review Board. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta. PBMC: t ja seerumin terveistä luovuttajista, saatiin New York Blood Center.

Measurement seerumin p53-spesifistä vasta-ainetta

Rekombinantti villityypin p53 on tuotettu, ja p53-spesifinen seerumin vasta-ainetaso mitattiin aiemmin on kuvattu [20]. Vastavuoroisesti tiitteri arvioitiin optisen tiheyden sarjalaimennettua ja kontrollit, kuten on kuvattu [20].

Päällekkäiset peptidien

sekvenssit päällekkäisiä peptidejä villityypin p53-proteiini, jota käytetään presensitization ja havaitsemiseen on esitetty taulukossa S1. Kaikki peptidit syntetisoitiin Biosynthesis (Lewisville, TX) ja liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) 10 mM konsentraatio, ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Ne suunniteltiin olevan 25 aminohappoa pitkä, paitsi # 1 (19-meeri) ja # 30 (22-meeri) ja on 15 aminohappoa päällekkäisyyksiä. Aminohapon kodonin 72 villityypin p53 usein osoittaa Arg Pro polymorfismin [27]. Tämän hoitamiseksi polymorfismi, kaksi eri peptidien Arg tai Pro asemassa 72 valmistettiin peptidi # 6 ja sekoitettiin klo 01:01 suhteessa.

Presensitization

In vitro

presensitization suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [28]. CD8

+ ja CD4

+ T-solut erotettiin PBMC käyttämällä Dynabeads (Invitrogen-Dynal AS) ja olivat itsenäisesti stimuloidaan CD8

CD4

– soluja, jotka pulssitettiin yön yli 1 allas ( # 1- # 30), 2 allasta (# 1- # 15 ja # 16- # 30), tai 3 allasta (# 1- # 10, # 11- # 20, ja # 21- # 30) päällekkäisten peptidejä, ja solujen lukumäärä sen jälkeen, kun erottaminen ja säteilytetyn. Soluviljelmiä täydennetty 10 U /ml IL-2 ja 20 ng /ml IL-7 kahdesti viikossa. Samanaikaisesti osa CD4

+ T-solujen polyklonaalisia laajennettiin fytohemagglutiniini (PHA, Remel), kun läsnä on alhaisen annoksen IL-2 ja IL-7, voidaan käyttää kohdesoluina (T-APC) ELISPOT määritys. Joissakin kokeissa, CD4

+ T-solut edelleen erotettiin CD45RA

+ ja CD45RA

– osajoukot fykoerytriinin (PE) konjugoidulla anti-CD45RA monoklonaalinen vasta-aine (mAb) (BD Biosciences) ja anti-PE -magnetic helmiä (Miltenyi Biotec).

Detection of p53-spesifisten T-soluvasteen

p53-spesifinen IFN-γ tuotantoa arvioitiin ELISPOT-määrityksellä päivänä 9-12 CD8

+ T-solut ja päivä 18-25 CD4

+ T-soluja. Ensinnäkin, T-solut arvioitiin niiden reaktiivisuuden suhteen 6 altaat 5 peptidejä (# 1- # 5, # 6 # 10, jne.). Joissakin kokeissa, uima-allas 17 päällekkäisten peptidien NY-ESO-1 käytettiin merkityksetöntä peptidejä. Jos IFN-γ tuotantoa havaittiin vastaan ​​peptidin altaat, riippumaton peptidit allas testattiin sen määrittämiseksi, yhden peptidin tunnustettu. Kaikki tulokset ELISPOT määrityksiä esitettiin keskimääräisenä IFN-γ täplän muodostavat solut rinnakkaisista kuopista ilman vähentämällä määrä tausta paikkoja vastaan ​​unpulsed kohdesoluja. Vasteet katsotaan positiiviseksi, jos määrä paikkoja vastaan ​​peptidi (t) -pulssitettuja kohdesoluja oli 3 kertaa enemmän kuin vastaan ​​unpulsed kohdesoluja ja yli 25 pistettä /50000 efektori-T-soluja. Joillakin potilailla, p53-spesifisten T-solujen havaittiin solunsisäisen sytokiinin värjäystä ja CD107a ilmentymisen määrityksissä. Solunsisäisen sytokiinin värjäystä IFN-γ, IL-4, ja TNF-α suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [28]. Sillä CD107a ilmentymisanalyysien presensitized CD8

+ T-soluja stimuloitiin uudelleen, kun läsnä oli 40 pl /ml PE-konjugoitua anti-CD107a mAb (BD Biosciences) ja 0,66 pl /ml GolgiStop (BD Biosciences). Joissakin kokeissa p53-peptidi-spesifisten CD4

+ T-solut eristettiin flow-sytometria lajittelu CD154 ilmentävien solujen jälkeen restimulaation p53: n kanssa peptidien ja ne polyklonaalisia laajennettiin PHA kuten aiemmin on kuvattu [28]. Tunnustamista luonnollisesti käsitelty p53-proteiinin ja sytokiinien tuotannon p53-spesifisten CD4

+ T-solulinjat tutkittiin käyttämällä autologista monosyyteistä johdettujen dendriittisten solujen (mo-DC) pre-pulssi yön yli p53 päällekkäin menevää peptidiä (3,3 uM), rekombinantti-p53-proteiinin (20 ng /ml) tai kontrolli-NY-ESO-1-proteiinia (20 ug /ml). Sytokiinien tasot supernatanteissa mitattiin sandwich-ELISA: lla käyttäen seuraavia mAb paria: leimaamatonta ja biotinyloitua anti-IFN-γ (BD Biosciences), leimaamatonta ja biotinyloitua anti-GM-CSF-mAb: t (BD Biosciences), leimaamatonta ja biotinyloitua anti -IL-4-mAb: t (BD Biosciences), leimaamatonta ja biotinyloitua anti-IL-13 mAb: t (eBioscience), leimaamatonta ja biotinyloitua anti-IL-10 mAb: t (eBioscience), leimaamatonta ja biotinyloitua anti-TGF-β-mAb: t (eBioscience ), leimaamaton ja biotinyloitua anti-IL-17 mAb: t (eBioscience), ja leimaamattoman ja biotinyloitua anti-IL-9-mAb: t (eBioscience). Standard sytokiinien proteiinit saatiin eBioscience.

Tulokset

Anti-p53-vasta-ainevaste

arvioimiseksi spontaani immuniteetin p53, mittasimme seerumin vasta-ainetiitterit p53 ja NY-ESO -1 proteiinit 298 kehittynyt epiteelin munasarjasyöpä potilasta ja 153 terveille henkilöille ELISA. Kuten on esitetty kuviossa 1, 21%: lla potilaista, mutta yksikään terveiden yksilöiden osoitti merkittävää anti-p53 seerumin vasta-, joka oli hyvin samankaltainen kuin taajuus anti-NY-ESO-1-vasta-ainevasteita ei havaittu (21%). Nämä taajuudet spontaani vasta-vasteita p53 ja NY-ESO-1 ovat samaa luokkaa kuin raportoitu munasarjasyöpä potilaille eri tutkimuksissa [29]. Sitä vastoin pienempi määrä potilaita (7%) osoitti merkittävää seerumin vasta syövän /kiveksen antigeeniä MAGE-A3 (tuloksia ei ole esitetty). Taajuus potilaista, jotka osoittivat sekä NY-ESO-1 ja p53 seerumin vasta-aineiden oli 4,7%, joka on lähellä laskettua taajuuden taajuuksilla kutakin antigeeniä vastaan, olettaen, että induktio nämä vastaukset on riippumaton (0,21 (21% vastaan ​​p53) x 0,21 (21% vastaan ​​NY-ESO-1) = 0,044 (4,4% vastaan ​​molemmat antigeenejä)).

seerumit 298 munasarjasyöpä potilasta ja 153 terveillä henkilöillä arvioitiin vasta-aine villityyppisen p53 ja NY -ESO-1-proteiinit ELISA: lla. Vastavuoroisesti tiitterit lasketaan kuvattu viite [20].

havaitaan paikallistamattomasti spontaani CD8

+ T-soluvaste syöpäpotilailla ja terveillä luovuttajilla

immunomonitorointia spontaanin T soluvasteita, on tärkeää valita menetelmä, joka voi erottaa

in vivo

herkistettyjä T-solut

in vitro

aiheuttama T-soluja. Voit seurata spontaanisti indusoima T-soluvasteita p53 käytimme yksittäinen

in vitro

herkistymistä protokolla, joka on kehitetty ja validoitu havaitsemiseksi spontaani NY-ESO-1-spesifisiä T-soluvasteita ainoastaan ​​NY-ESO- 1 seropositiivisilla syöpäpotilaita, mutta ei terveillä henkilöillä. Käyttäen tätä protokollaa, NY-ESO-1-CD8

+ T-soluja usein havaittu NY-ESO-1 seropositiivisilla munasarjasyöpä potilaille, mutta ei terveistä yksilöistä Tässä tutkimuksessa kohortissa (Kuva S1 (A)). Sen sijaan, useita kierroksia stimulaation ammattimaisten antigeeniä käsittely solut (APC: t), kuten mo-DC voi aiheuttaa NY-ESO-1-spesifisten T-solujen koskemattomista NY-ESO-1-spesifisten esiasteiden terveiltä luovuttajilta [30], [31 ]. Koska usein itsestään tapahtuvia seerumin vasta vasten p53 munasarjasyöpää sairastavilla potilailla, ensin analysoidaan p53-CD8

+ T-soluvasteita näillä potilailla. Sen perusteella, että spontaani NY-ESO-1-spesifisten T-solut ovat havaittavissa vain seropositiivisilla potilailla, 12 munasarjasyöpää sairastavien potilaiden spontaani vasta-vasteita p53 valittiin arviointia varten T-soluvasteiden. CD8

+ ja CD4

+ T-solut eristettiin PBMC kuvatulla materiaaleja ja menetelmiä, ja niitä erikseen stimuloidaan p53 peptidilisätty CD4

-CD8

– soluja. Kun on viljelty noin 10 päivää, määrä IFN-γ tuottavat p53-spesifisten CD8

+ T-solut arvioitiin ELISPOT-määrityksellä. Kuten kuviossa 2A, kaksi edustavaa seropositiivisilla potilailla esiintyi havaittavaa anti-p53 CD8

+ T-soluvaste meidän standardin immunomonitorointia protokollaa. Vastaavasti, ei ole merkittävää IFN-γ tuotantoon CD8

+ T-soluja havaittiin 10 ylimääräistä seropositiivisten potilaiden (kuvio 2B). Kymmenen seronegatiivisilla munasarjasyöpä potilasta ja 12 tervettä luovuttajien testattiin myös niiden spontaani CD8

+ T soluvasteen p53 ja odotetusti, ei ollut viitteitä p53-CD8

+ T-soluja (kuvio 2B). On mahdollista, että p53-spesifisten CD8

+ T-solujen puuttuu IFN-γ tuottavat kyky ja että ne ovat havaittavissa ilmentymistä muita molekyylejä. Sen testaamiseksi, p53-CD8

+ T-solut olivat havaittavissa muiden aktivaation aiheuttama molekyylien 5 seropositiivisten ja 5 seronegatiivisilla potilasta analysoitiin TNF-α tuotanto ja CD107a ilmaisun jälkeen restimulaation peptidien kanssa. Kuten kuviossa 2C on esitetty, ei ole p53-CD8

+ T-soluvaste havaittiin perustuu TNF-α ja CD107a ilmaisun.

(A) CD8

+ T-solut vasta-aineen positiivinen munasarjasyöpä potilasta presensitized uima-allas 30 p53 päällekkäisiä peptidejä. Jälkeen 9-12 päivää, p53-spesifinen IFN-γ tuottavat T-solut arvioitiin ELISPOT-määrityksissä. Virhepylväät edustavat keskihajonta (SD) kahden rinnakkaisen kuopan. Autologisia T-APC: t, joita käytettiin kohdesoluina ELISPOT määrityksiä. (B) CD8

+ T-solu vasteita 7 seropositiivisilla ja 5 seronegatiivisilla munasarjasyöpä potilasta ja 12 tervettä luovuttajien näkyvät. (C) presensitized CD8

+ T-solut analysoitiin solunsisäisen TNF-α-värjäys ja CD107a ilmentymisen määrityksissä jälkeen restimulaation p53-peptidien-pulssi, merkityksetön (NY-ESO-1) peptidien-pulssi tai unpulsed kohdesoluihin.

Nämä tulokset osoittavat, että spontaani IFN-γ-tuottavien CD8

+ T-solu-vasteita villityypin p53 ei ollut havaittavissa edes seropositiivisille syöpäpotilailla meidän presensitization protokollan toisin kuin usein havaita NY -ESO-1-spesifisten CD8

+ T-soluvasteita in NY-ESO-1-seropositiivisissa potilaissa (kuvio S1 (A)). Kertyminen mutatoidun p53-proteiinin kasvainsoluissa tiedetään korreloivan vasta-ainevaste [32]. Koska mutatoitunut peptidien katsotaan olevan immunogeeninen puuttumisen vuoksi toleranssi ja immunogeenisyys mutantti-p53: n indusoimaan CD8

+ T-soluvasteita on osoitettu hiirissä [33], [34], seuraavan kerran haetaan CD8

+ T-solu- vasteet p53. Tehdä tämän, eksonit 5-7 p53-geenin kasvaimen kudokset ja normaalin lymfosyyttien munasarjasyöpä potilaiden sekvensoitiin tunnistaa mahdolliset p53 mutaatioita kasvain (tuloksia ei ole esitetty). Niistä mutaatiot havaitaan, kolme usein esiintyviä mutaatioita, S127F, R273C, ja R282W, valittiin etsimään CD8

+ T soluvasteen epitooppeja kattaa nämä mutaatiot. CD8

+ T-solujen kolmella potilaalla, joilla oli kasvain S127F, R273C tai R282W mutaatio stimuloitiin peptidit, jotka sisältävät potilaan p53-mutaation tai peptidit, jotka sisältävät vastaavan villityypin sekvenssin. Ei mutatoitunut peptidi-spesifisten CD8

+ T-soluvaste havaittiin näillä kolmella potilaalla (tietoja ei esitetty).

CD4

+ T-soluvasteita syöpä- potilaiden ja terveiden yksilöiden

havaitsemiseksi luonnossa esiintyvien CD4

+ T-solu vasteita p53, CD4

+ T-solut seropositiivisilta syöpäpotilaiden stimuloitiin päällekkäisten peptidien pulssitettiin autologisten T-solujen-köyhdytettyä PBMC käytettiin APC: itä. Sen jälkeen, kun 20 päivää viljelyn, kun läsnä on alhaisen annoksen IL-2 ja IL-7, IFN-γ-tuottavien CD4

+ T-solut laskettiin, jonka ELISPOT-määrityksessä alapoolista päällekkäisten peptidien ja yksittäisten peptidien suhteen reaktiivisista alapoolista . Toisin kuin huomaamaton p53-spesifisten CD8

+ T-solujen merkittäviä IFN-γ tuottavat p53-spesifisten CD4

+ T-soluvasteita alapoolista päällekkäisten peptidien havaittiin 6 ulos 12 seropositiivisten potilaiden (kuvio 3A ja tuloksia ei esitetty), jossa on verrattavissa suuruus itsestään CD4

+ T-solu vasteita NY-ESO-1 in NY-ESO-1 seropositiivisilla munasarjasyöpä tutkimuspotilaat kohortissa (Kuva S1 (B)). Seuraavaksi me arvioitiin spontaanit CD4

+ T-solu vasteita p53 10 seronegatiivisilla potilaiden ja 12 terveiden yksilöiden. Yllättäen, vaikka myös presensitization menetelmä ei havaitse NY-ESO-1-spesifisten CD4

+ T-solut terveiden yksilöiden (kuvio S1 (B)), sama menettely havaittu merkittävää IFN-γ-tuottavien CD4

+ T soluvasteita 5/10 seronegatiivisilla potilaiden ja 9/12 terveen yksilön testattu (kuviot 3B ja C tuloksia ei ole esitetty). Valikoiduilla potilailla, p53-spesifisten CD4

+ T-solut olivat havaittavissa TNF-α tuotantoa seuraavat solunsisäisen sytokiinin värjäystä (kuvio S2).

CD4

+ T-solut vasta-aineita (A) ja negatiivinen (B) munasarjasyöpä potilaiden ja terveiden luovuttajien (C) on presensitized allas (s) p53 päällekkäisiä peptidejä. Sen jälkeen 18-25 päivää, p53-spesifinen IFN-γ tuottavien T-soluja vastaan ​​arvioitiin peptidilisätyt tai unpulsed (

φ

) kohdesolujen ELISPOT määrityksiä. Virhepalkit edustavat SD kahden rinnakkaisen kuopan. Autologisia T-APC: t, joita käytettiin kohdesoluina ELISPOT määrityksiä. T-soluvasteiden arvioitiin ensin vastaan ​​alapoolista peptidien (ensimmäinen koe) ja sitten vastaan ​​riippumattomia peptidin reaktiivisen subpool (toinen määritys). Terveen luovuttajan esitetyn (C), CD4

+ T-soluja, jotka oli presensitized kanssa # 1- # 10 tai # 21- # 30 peptidi ei havaittu merkitsevää vasteita (dataa ei esitetty).

Kuva 4 on yhteenveto tunnistamat epitoopit CD4

+ T-solut seropositiivisilta ja seronegatiivisilla syöpäpotilaiden ja terveillä luovuttajilla. Kuten kuviossa 4 on esitetty, epitoopit löytyy sekä seropositiivisten ja seronegatiivinen syöpäpotilaiden ja terveistä luovuttajista jakautunut koko sekvenssi p53-proteiinin. Tietyt peptidit, kuten # 9, # 13 ja # 26 aiheuttama useammin CD4

+ T-solu vasteita 4 (20% reagoivien), 6 (30%) ja 7 (35%) luovuttajien vastaavasti. Jotkut seronegatiivisilla syöpäpotilaiden ja terveiden luovuttajien osoitti usean epitoopin CD4

+ T-soluvasteiden, kuten nähdään seropositiivisille syöpäpotilailla. Pohtia todettu usein polymorfismin kodonin 72, käytimme seos kahdesta variantin peptidien peptidin # 6 (taulukko S1), jotka voivat aiheuttaa

de novo

vasteita potilailla, joilla on p53 homotsygoottinen genotyyppi kodonin 72. ei kuitenkaan T-soluvasteen vastaan ​​# 6 peptidejä havaittiin tässä tutkimuksessa, mikä osoittaa, että lyhyen aikavälin kulttuuri protokolla ei näyttänyt aiheuttavan

de novo

CD4

+ T-soluvasteita. Vaikutuksen taso ja jakelu epitooppien olivat samanlaisia ​​syöpäpotilaiden ja terveiden yksilöiden. On hyvin tunnettua, että tunnistamia epitooppeja p53-spesifinen vasta-aine on rajoitettu N-päähän ja C-päähän proteiinin alueelle [32], [35]. Kuitenkin, ei ole korrelaatiota karttoja epitoopit CD4

+ T-solujen ja vasta-aineiden (kuvio 4). Lisäksi mutaatio p53-proteiinin syöpäsoluissa esiintyy usein keskialueella geenin [32]. Kuitenkin, ei ole yliedustus CD4

+ T-soluepitooppien tällä alueella, mikä viittaa siihen, että vasteet eivät välittämä ristireaktiivisuus mutatoidun peptidin CD4

+ T-soluja. Löytää mutaatio-CD4

+ T-solut kolmella potilaalla on p53-ilmentävä kasvain, CD4

+ T-solut potilaita presensitized peptidien kanssa, jotka sisältävät potilaiden sukulais mutaatio. Vaikka yksi potilas, jonka kasvain oli S127F-mutaation osoitti heikkoa CD4

+ T-solu-vasteita sekä mutatoitu ja vastaavan villityypin peptidejä, ei ole merkittävää mutaatio-CD4

+ T-soluvasteen voitiin havaita (tuloksia ei ole esitetty).

suuruus CD4

+ T-solu vasteita munasarjasyöpää sairastavilla potilailla tai ilman p53-spesifinen seerumin vasta-aineella ja terveen luovuttajan vastaan ​​p53 päällekkäisiä peptidejä on piirretty. Kukin symboli edustaa yhtä yksilön. Kaikki vastaukset on esitetty olivat merkittäviä verrattuna määrän taustalla paikkoja. 6/12 seropositiivisia (vaaleanpunainen symbolit) ja 5/10 seronegatiivisia (sininen symbolit) munasarjasyöpä potilaiden ja 9/12 terveiden yksilöiden (musta symbolit) osoitti positiivisen CD4

+ T-solu vasteita p53 peptidilisätyt kohdesolujen verrattuna unpulsed kohdesoluihin.

alkuperä ohjelmistoon p53-spesifisten CD4

+ T-solujen

toisin havaitsemiseen p53-spesifisten CD4 + T-solut seropositiivisilla ja seronegatiivisilla syöpäpotilailla sekä terveiltä luovuttajilta, meidän presensitization protokolla sallii vain havaitsemisen NY-ESO-1-spesifisiä IFN-γ tuottavien CD4

+ T-solujen in NY-ESO-1 seropositiivisilla syöpäpotilailla mutta ei seronegatiivisilla syöpäpotilailla ja terve yksilöt kun PBMC johdettuja koko CD4

+ T-solut presensitized kanssa NY-ESO-1 päällekkäisiä peptidejä. Olemme kuitenkin raportoi äskettäin, että NY-ESO-1-CD4

+ T-solut voidaan indusoida CD45RA

+ naiivit CD4

+ T-solut terveiden luovuttajien jälkeen

in vitro

presensitization poistamalla CD25

+ säätelijä-T-solujen [36], [37]. Nämä tulokset osoittavat, että NY-ESO-1-CD4

+ T-solujen esiasteiden läsnä terveiden ihmisten ovat alttiita tukahduttaminen säätelevien T-solujen, mutta syöpäpotilailla,

in vivo

aa pohjustetuista NY-ESO -1-CD4

+ T-solut tulevat vastustuskykyisiksi tälle tukahduttaminen [36], [37]. Detection of IFN-γ-erittävät p53-CD4

+ T-solut terveillä henkilöillä kerta

in vitro

herkistymistä läsnä säätelijä-T-solujen viittaa siihen, että ne ovat jo pohjustettu

in vivo

. Voit selvittää aktivoinnin tilan p53-spesifisten CD4

+ T-solujen terveiltä luovuttajilta, naiivi ja antigeenin kokenut CD4

+ T-solut erotettiin perustuvat CD45RA- ilmaisun ja stimuloitiin p53 päällekkäisiä peptidejä. Induktio p53-spesifisten CD4

+ T-solut arvioitiin ELISPOT määrityksiä. Kuten kuvioissa 5A ja 5B, toisin kuin oli havaittu NY-ESO-1-spesifisten CD4

+ T-solut, p53-spesifinen IFN-γ-tuottavien CD4

+ T-solut olivat havaittavissa alkaen CD45RA-

– antigeeni-kokenut väestö terveiden luovuttajien. Lisäksi, pienempi vasteet olivat myös indusoida CD45RA

+ naiivia T-solujen populaation (kuvio 5A). Koska CD45RA- ei ole ehdoton markkeri naiiveja T-soluja, on vielä mahdollista, että p53-spesifisten CD4

+ T-solujen CD45RA

+ T-solujen populaatio oli jo aktivoitu

in vivo

[ ,,,0],38]. Kuitenkin tämä tulos osoitti, että ainakin osa p53-spesifisten CD4

+ T-solut on esikäsitelty

in vivo

jopa terveillä henkilöillä.

(A-B)

in vivo

pohjustamiseen p53-spesifisten CD4

+ T-solut terveillä henkilöillä. CD4

+ CD45RA

+ naiivi ja CD4

+ CD45RA

– antigeeni-T-soluja eristettiin virtaussytometrialla ja presensitized p53 päällekkäisiä peptidejä. Jälkeen 20 päivää, p53-spesifinen IFN-γ-tuottavia T-soluja arvioitiin ELISPOT-määrityksissä. Autologisia T-APC: t käytettiin APC: itä. (C) tunnustaminen luonnollisesti prosessoidun p53-proteiinin. p53-CD4

+ T-solulinjat vastaan ​​p53 # 1- # 15 peptidejä allas tai # 16- # 30 peptidejä pool vahvistettiin 3 terveiltä luovuttajilta kuvatulla materiaalit ja menetelmät. Ne stimuloitiin autologisen mo-DC pre-pulssitettiin p53 peptidien, p53-proteiinin, tai NY-ESO-1-proteiinia. IFN-γ tuotantoa arvioitiin ELISPOT-määritykset (vasemmalla) ja ELISA: lla (oikea). Virhe pylväät edustavat SD kahden rinnakkaisen kuopan.

karakterisointi p53-spesifisten CD4

+ T-solujen

edelleen karakterisoimiseksi p53-spesifisten CD4

+ T-solut terveillä luovuttajia, p53-spesifisiä T-solulinjoja muodostettiin eristämällä CD154, jotka ilmentävät CD4

+ T-solut, kun restimulaation p53: n kanssa peptidien seurasi polyklonaalinen laajennus PHA (tuloksia ei ole esitetty). Tämä CD154 ilmentyminen perustuvaa menetelmää käytettiin havaitsemaan useita CD4

+ T-solujen osajoukot analysointiin sytokiinin valmistamiseksi kuvion [28]. Neljä CD4

+ T-solulinjat muodostettiin vastaan ​​p53 peptidipoolien 3 terveiltä luovuttajilta. Kaikki CD4

+ T-solulinjat on tuotettu GM-CSF, joka on valmistettu sekä Th1- ja Th2-solut, stimulaation jälkeen peptidilisätyt mo-DC: iden (taulukko 1). Tasot muut sytokiinit CD4

+ T-solulinjat on esitetty taulukossa 1. Yhdenmukaisesti tehokasta havaitsemista p53-spesifisten CD4

+ T-solujen IFN-γ-ELISPOT-määrityksissä, kaikki p53-spesifisten CD4

+ T-solulinjat terveiltä luovuttajilta tuotetaan suuria määriä IFN-γ. Sen lisäksi, että IFN-γ, merkittäviä määriä IL-13 ja pieniä määriä IL-4 myös on tuotettu, mikä osoittaa, että T-solulinjat olivat seos Th1- ja Th2-solujen. Kaksi CD4

+ T-solulinjat tuotettiin pieniä määriä immunoregulatorisia sytokiinin, IL-10. Yksi CD4

+ T-solulinja on tuotettu pieniä, mutta merkittäviä määriä IL-9, joka on valmistettu Th9 ja säätelee IL-4: n ja TGF-β, mahdollisesti osoitus läsnä TGF-β signalointia erilaistumisen aikana p53 erityisiä CD4

+ T-soluja. Kuitenkin, TGF-β ei havaittu supernatantista (tulostietoja ei ole esitetty). Lisäksi, IL-17, joka on tuotettu Th17, ei havaittu mitään CD4

+ T-solulinjat (tietoja ei esitetty). Seuraavaksi tunnustamista luonnollisesti prosessoidun p53-proteiini tutkittiin käyttäen autologisia mo-DC kuten APC: itä. Kuten kuviossa 5C esitetään, kaikki CD4

+ T-solulinjat tehokkaasti tunnustettu p53-proteiini-pulssi kohdesoluihin havaitaan IFN-γ eritystä. Tämä tulos osoittaa p53-spesifisten CD4

+ T-solujen havaittavissa terveiltä luovuttajilta pystyvät tunnistamaan luonnollisesti käsitelty p53-proteiinin ja on epätodennäköistä, että ne aktivoituvat

in vivo

muiden proteiinien samanlaiset sekvenssit.

keskustelu

kertyminen mutatoidun p53-proteiinin kasvain havaitaan usein monissa kasvaimia ja aiheuttaa humoraalisia immuunivasteita, jotka osoittavat vahvaa immunogeenisuus p53 [12]. Näin ollen, p53 on pidetty lupaava kohde rokote useita syöpätyyppejä. Silti, raportoimme tässä epäonnistuminen havaitsemaan

in vivo

aa pohjustetuista p53-CD8

+ T-solu vasteita syöpäpotilailla, joilla on spontaani vasta p53 sekä p53-seronegatiivisilla potilaiden ja terveiden luovuttajien käyttämällä single

in vitro

herkistymistä protokollaa. Sitä vastoin samaa protokollaa usein havaittu NY-ESO-1-spesifisten CD8

+ T-solujen in NY-ESO-1-seropositiivisista syöpäpotilaille samassa aineistossa, joka osoittaa, että luonnollinen immunogeenisyys indusoida spontaania CD8

+ T-soluvasteita voi olla erilainen p53 ja NY-ESO-1 jopa seropositiivisilla potilailla näitä antigeenejä. Kerrottiin, että vaikka sykliini B1-CD8

+ T-solujen tuli havaittavissa kerta

in vitro

stimulaatio, p53-CD8

+ T-solut vastaan ​​6 HLA-A * 02 sitova lyhyt peptidejä ei voitu havaita 5 sykliini B1-reaktiivinen ja 5 ei-reaktiivinen potilailla käyttämällä samaa menetelmää [39]. Tuloksemme laajentavat havaintoja seuraamalla CD8

+ T-soluvasteita koko alueelle proteiinin avulla päällekkäisiä peptidejä ja sisällyttämällä kanssa immunomonitorointia spontaanin vasta-ainetta ja CD4

+ T-soluvasteita. Useat rokotuskokeet kuten p53 transduktoitu- DC tai pitkä päällekkäisiä peptidejä ovat raportoineet induktio T-soluvasteiden rajoitetusti kliinistä hyötyä [23], [24], [40], [41].