Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta vuosikymmenten pyritään kehittämään tehokas hoito ja tunnistaa lupaavia uusia lääkkeitä, eturauhasen syöpä on tappava, kun se etenee kastraatio-resistenttejä. Tutkimukset osoittavat mis-sääntelyä useiden väyliä kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC), jotka kuvastavat kasvainten ja vihjaa, että kohdistaminen androgeenireseptorin (AR) koulutusjakson ei välttämättä yksin riitä hoitamaan CRPC. Tässä tutkimuksessa, esitämme näyttöä siitä, että Wnt /β-kateniinin polku saattaa aktivoitua eturauhassyöpäsoluissa jälkeen androgeenipuutteen edistämiseksi androgeenista riippumattomaan kasvuun, osittain tehostamalla vuorovaikutuksen β-kateniinin kanssa TCF4. Androgeenista riippumaton eturauhassyöpä solut olivat alttiimpia aktivoida Wnt-reportteri, ja inhibitio Wnt /β-kateniinin reitin lisääntynyt herkkyys näiden solujen toisen sukupolven antiandrogeeni, enzalutamide. Yhdistetty hoito enzalutamide ja Wnt /β-kateniinin estäjä oli kohonnut kasvua tukahduttaminen sekä androgeeniriippuvaisissa ja riippumattaman eturauhassyövän solut, mikä viittaa terapeuttisia mahdollisuuksia tämän lähestymistavan.

Citation: Lee E, Ha S, Logan SK (2015) Levenevien androgeenireseptorin ja Beta-kateniinin Signaling eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 10 (10): e0141589. doi: 10,1371 /journal.pone.0141589

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 04 elokuu 2015; Hyväksytty: 09 lokakuu 2015; Julkaistu: 28 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Institutes of Health R01CA112226 (SL) ja American Cancer Society RSG-11-108-01-CDD (SL). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Lyhenteet : AR, androgeenireseptorin; APC, adenomatoottisen polypoosin coli; CRPC, kastraatio kestävä eturauhassyövän; DHT, dihydrotestosteroni; GSK3, glykogeenisyntaasikinaasi 3; iCRT3, estäjä kateniinin reagoivat transkription 3; PI3K, phosphatidylinostitol-3-kinaasi; PTEN, fosfataasi ja tensin homologin; TCF4, Transkriptiotekijän 4; UBE2C, Ubiquitin-konjugointientsyymiä E2C

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin syöpä miehillä [1]. Koska keskeinen rooli androgeenireseptorin (AR) signalointia taudin etenemistä, nykyinen perinteinen lähestymistapa hoitoon eturauhasen syöpä on androgeenista vajaushoidon usein yhdistettynä antiandrogeeni hoitoon. Huolimatta alkuperäisen kasvaimen regressio, aggressiivinen tauti etenee kastraatio kestävät eturauhassyöpä (CRPC), joiden hoito on suuri haaste kentällä. Uudet lääkkeet kohdistaminen AR-reittiin, kuten toisen sukupolven antiandrogeeni, enzalutamide [2], ja abirateronin joka estää kasvaimeen tuotantoa androgen [3] on FDA: n hyväksymä hoitoon CRPC. Huolimatta lupaus näiden ja muiden terapeuttisten, ne ulottuvat elämä vain 6-8 kuukautta [4, 5], mikä osoittaa, että tarvitaan uusi lähestymistapa hoitoon edenneen taudin.

Koska monimutkainen signalointi verkkojen kehittynyttä sairaus, esto yhdellä reitillä saattavat aiheuttaa odottamattomia vastauksia [6, 7]. Tässä yhteydessä on ehdotettu, että eturauhasen kasvaimet voivat myös aktivoida vaihtoehtoisia signalointireittien kompensoimiseksi seurauksia AR inhibition [8, 9]. Vuorovaikutus PI3K ja AR polkuja on hyvin tutkittu, ja itse asiassa vastavuoroisia palautteen kahden reittejä PTEN-poistettu eturauhasen syöpä on raportoitu, mikä osoittaa, kuinka tärkeää on kohdistettu sekä väyliä PTEN-poistettu tauti [10]. Viime aikoina säätelyä glukokortikoidireseptorin (GR) raportoitiin enzalutamide-resistenttejä kasvaimia [11], ja niiden on osoitettu olevan tarpeen resistenttejä fenotyypin. Siksi terapeuttisia lähestymistapoja että samanaikaisesti kohdistaa useita eri reittejä pitkin voi olla tehokas hoidettaessa CRPC [6].

Viime Genomikartoituksen tiedot ovat osoittaneet misregulation Wnt-väylän eturauhassyövän taudin etenemiseen. Vertaileva analyysi kaksi erillistä koko-exome sekvensointi sarjaa dataa, yhden primaarikasvaimista [12] ja toinen tappava kastraation kestävästä etäpesäkkeitä [13], paljasti, että APC (adenomatoottisen polypoosin coli) geeni usein mutatoitunut ensisijainen kasvaimia mutta lisää merkittävästi mutatoitunut kehittynyt sairaus [14]. Itse asiassa, myöhemmin tiedot osoittavat, että Wnt-reitti on yksi huomattavasti mutatoitu reittejä CRPC [13]. Tämän mukaisesti WNT16B eritystä kasvain mikroympäristössä edistänyt hoito-resistenssi eturauhassyövässä aktivoimalla Wnt /β-kateniinin reitin [15]. Viime aikoina on raportoitu, että 18%: ssa tapauksista metastaattisen kastraatiotason resistenttien eturauhassyöpä näytteillä muutoksia Wnt koulutusjakson signalointi [16]. Nämä raportit viittaavat siihen, että Wnt /β-kateniinin reitti voi olla yksi korvaavia reittejä aktivoituu eturauhassyöpä vastauksena androgeenien puute hoitoa. Tukee tätä ajatusta, ilmaus aktivoiva mutaatio β-kateniinin hiiren eturauhasen käytössä jatkuva eturauhasen kasvua kastraation jälkeen [17].

Meidän ryhmämme aiemmin julkaistu proof of concept tutkimukset osoittavat, että pieni molekyyli estäjä Wnt /β-kateniinin reitissä iCRT3 (lyhennetään C3) saattavat heikentää AR mRNA: n ilmentymisen ja transkriptio alavirtaan kohdegeenien häiritsemällä β-kateniinin /TCF vuorovaikutus AR promoottori. Osoitimme myös, että C3 voivat häiritä AR ja β-kateniinin proteiinin vuorovaikutus. Myöhemmin proteiini vuorovaikutuksen tutkimukset suoritettiin, kun läsnä on suuria määriä androgen vakauttamiseksi AR proteiinin tasot niin, että niitä ei laskivat läsnäollessa β-kateniinin estäjä [18].

Työ on kuvattu tässä käsikirjoitus näyttelyissä että toiminta Wnt /β-kateniinin reitti on alhainen eturauhasen syöpäsolujen todennäköisesti johtuu mieluummin β-kateniinin vuorovaikutus AR sijaan TCF4 näissä soluissa. Huomaamme, että suppressio AR aktiivisuuden androgeenipuutteen, antiandrogeeni hoitoa tai AR Knockdown edistänyt Wnt /β-kateniinin-kohdegeenin ilmentymisen ja tämän korreloi lisääntynyt vuorovaikutus TCF4 ja β-kateniinin. Parannettu aktivointi Wnt /β-kateniinin reitin aiheutti kasvun androgeeniriippuvaisen LNCaP-solujen puuttuessa androgeenin tai läsnä ollessa antiandrogeenin. Aktivointi Wnt /β-kateniinin reitin tutkittiin myös androgeeni-riippumaton alalinja LNCaP, LNCaP-abl (abl). Abl soluja syntyy jatkuvalla passage androgeenien tyhjennetty kasvualusta ja valittu niiden kyky lisääntyä androgen riistää kunnossa [19]. Abl solut olivat alttiimpia Wnt /β-kateniinin aktivoinnin kuin LNCaP-soluja, ja inhibitio β-kateniinin aktiivisuuden pieni molekyyli inhibiittoria tai siRNA lisääntynyt enzalutamide herkkyyttä abl-soluissa. Lisäksi yhdistetty hoito enzalutamide ja Wnt /β-kateniinin estäjä ilmeni kohonneita kasvun estäminen sekä LNCaP ja abi soluja, mikä osoittaa terapeuttista potentiaalia tämän lähestymistavan.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

LNCaP (ATCC, CRL-1740) ja LNCaP-abl (abl) [19] (lahja Z. Culig) soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä (Cellgro), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Hyclone), ja 10% hiilellä käsiteltyä FBS: aa (CFBS, seerumin köyhdytettyä steroidien, mukaan lukien androgeenien), vastaavasti, ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Cellgro). 22Rv1 (ATCC, CRL-2505) ja HEK293 (ATCC, CRL-1573) soluja viljeltiin DMEM: ssä (Cellgro), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini-streptomysiiniä. Seuraavat yhdisteet käytetään hoitamaan solut: C3 (ChemDiv, C523-1410), enzalutamide (Selleck Chemicals) ja GSK-3-estäjällä (CHIR99021; Stemgent). Soluproliferaatiomäärityksiä, qRT-PCR, immunoblottaus, immunosaostus ja siru määritykset, LNCaP-solut hormonin riistää 5% CFBS media 2-3 päivää ja sitten käsiteltiin androgeenien kanssa tai ilman edellä olevien yhdisteiden.

Stable integraatio eGFP Wnt-reportteri eturauhassyöpäsoluissa

Lentivirusvektorit eGFP Wnt reportteri, 7xTcf-eGFP /SV40-mCherry hankittiin Addgene (24304). Pakkaus solut (HEK293T /17) (ATCC, CRL-11268) transfektoitiin väliaikaisesti 6 ug eGFP Wnt reportteri-konstrukti, 4 ug pakkausten plasmidia (psPAX2) ja 2 ug kuoren ilmentävät plasmidin (pMD2.G) käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Media ehdollistettu transfektantit kerättiin 24 ja 48 tuntia. LNCaP, abl ja 22Rv1 solut infektoitiin inkuboimalla elatusaineessa yön yli ja annettiin palautua päivässä. Infektoidut solut siirrostettiin ja valitaan mCherry ilmaisu virtaussytometriaa käyttämällä.

Quantitative reaaliaikainen RT-PCR: llä (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy-kittiä (Qiagen), ja käänteistranskriptoitiin sitten 55 ° C: ssa 1 h käyttäen Superscript III käänteistranskriptaasia ja oligo- (dT) 20-alukkeita (Invitrogen). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen geenispesifisiä alukkeita ja 2XSYBR vihreä Taq-ready mix (Sigma). Data analysoitiin DDCT menetelmällä käyttäen RPL19 kontrollina geenin ja normalisoitiin hallita näytteet, jotka oli asetettu sattumanvaraisesti 1.

Immunoblot, immunosaostus ja immunovärjäämällä

immunoblot-analyysillä, solut hajotettiin Triton-puskurissa ja täydennetty 1 mM PMSF, 1 mM Na

3Vo

4, 10 mg /ml leupeptiiniä ja 10 mg /ml aprotiniinia. Proteiini lysaatit altistettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblotattiin seuraavat vasta-aineita: AR (441), β-kateniinin (H-102), TCF4 (H-125, Santa Cruz Biotechnology); aktiivinen β-kateniinin (klooni 8E7, Millipore); tubuliinin (Covance). Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin käyttäen ECL Western blotting tunnistus reagenssit (GE Healthcare). Kuva J (NIH) ohjelmaa käytettiin kvantifioimaan proteiinin tasoja.

immunosaostuskokeissa solut hajotettiin, kuten yllä on kuvattu. Primaaristen vasta-aineiden edellä mainitut lisättiin vähintään 1,5 mg kokonaisproteiinia, ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, minkä jälkeen lisättiin Protein A /G-agaroosi-helmiä (Santa Cruz Biotechnology) 2 tuntia. Immuuni- komplekseja pestiin perusteellisesti Triton puskurilla ja liuottaa käyttäen Laemmli-näytepuskuria (Bio- Rad). Normaalin hiiren lgG: tä (Santa Cruz Biotechnology) tai normaalia kaniinin seerumia (Sigma) käytettiin kontrolleina.

Immunofluoresenssivärjäystä, solut kiinnitettiin 4% formaldehydiä PBS: ssa 20 minuutin ajan, pestiin PBS: llä kolme kertaa, läpäiseviksi 0,2% Triton-X-PBS: ssa 20 minuutin ajan, blokattiin 5% normaalia vuohen ja 5% normaalia hevosen seerumia PBS: ssä 1 h, ja niitä inkuboitiin vasta-aineen aktiivisen β-kateniinin (Millipore) laimennettuna blokkauspuskuriin, yön yli 4 ° C. Seuraavana päivänä solut pestiin PBS: llä kolme kertaa ja inkuboitiin sitten sekundaarisia vasta-aineita konjugoituna FITC: n kanssa (Vector Lab) huoneen lämpötilassa 1 tunti. Tämän jälkeen solut pestiin PBS: ssä kolme kertaa ja asentaa DAPI asennus liuosta (Vector Lab). Analysoida eGFP ja mCherry tasoja soluissa stabiilisti integroitu 7xTcf-eGFP /SV40-mCherry konstrukteja, solut kiinnitettiin, pestiin ja tehtiin läpäiseviksi, kuten yllä on kuvattu, ja asentaa DAPI kiinnitysratkaisu.

Soluproliferaatiomääritys

CyQuant soluproleferaatiomäärityksessä, 3-4 x 10

3-solut maljattiin kuhunkin kuoppaan mustalla 96-kuoppalevylle. Solut maljattiin hormonia riistää väliaineessa, joka sisälsi 5% CFBS ja viljeltiin 2-3 päivää, ja sitten käsiteltiin osoitetulla reagenssit kussakin kokeessa. Reagenssit lisättiin kahden päivän välein enemmän media ja sama määrä ajoneuvon lisättiin kontrolliryhmään. 2-3 päivän välein, CyQuant määritys (Invitrogen, C35006) suoritettiin valmistajan ohjeiden ja analysoitiin SpectraMax M5 levylukijaa (Molecular Devices) käynnissä Softmax- Pro® ohjelmistoa.

Kromatiini immunosaostuksella (chip) määritys

ChIP suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Proteiinit olivat kaksinkertaisesti silloitetun DSP (Pierce) 20 minuutin ajan ja 1% formaliiniin 10 min. Solut hajotettiin, ytimet talteen ja uudelleensuspendoitiin sonikointipuskurissa, ja sonicationed 12 min (30 sek. Päällä, 30 s. Pois) on Bioruptor sonicator (Diagenode, malli XL). Sonikoitiin lysaatit olivat valmiiksi raivattu 2 h proteiini A /G -agaroosihelmien blokattiin lohen sperman DNA (Millipore). Supernatantteja inkuboitiin sitten yön yli seuraavilla vasta-aineilla: seosta, jossa AR (441) ja AR (N-20), tai β-kateniinin (H-102). Ohjaussiru suoritettiin normaalin hiiren IgG ja kaniinin normaalilla IgG seerumia. Immunokompleksit pestiin sitten ja ristisidoksia päinvastaiseksi. DNA eristettiin Qiagen PCR puhdistuskittiä ja qPCR suoritettiin. Suhteellinen rikastus laskettiin prosentteina 4% tulon normalisoitu IgG.

RNA-interferenssin (RNA-i) B

β-kateniinin ja AR knockdown, siGENOME SMARTpool siRNA vastaan ​​β-kateniinin tai AR käytettiin (Dharmacon). APC Knockdown, altaan kolmen Silencer® Select siRNA vastaan ​​APC (Ambion, s1433, s1434 ja s1435) käytettiin. Solut transfektoitiin HiPerFect transfektioreagenssin (Qiagen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. 1 X 10

5 solua maljattiin kuhunkin kuoppaan 24-kuoppalevyllä hormoni-puutteellisissa väliaineessa, joka sisälsi 5% CFBS ja seosta HiPerFect reagenssin ja siRNA: ita lisättiin suoraan solujen yläosaan. -Soluja viljeltiin 2 päivää ja sitten käsiteltiin osoitetulla reagenssit kussakin kokeessa. CyQuant proliferaatiomäärityksessä, 3-4 x 10

3-solut maljattiin kuhunkin kuoppaan mustalla 96-kuoppaisille levyille hormoni-puutteellisissa väliaineessa, joka sisälsi 5% CFBS ja seosta HiPerFect reagenssin ja APC-siRNA: ita lisättiin suoraan päälle solut. -Soluja viljeltiin 2 päivää ja sitten käsiteltiin osoitetulla reagenssit kussakin kokeessa. CyQuant määritys suoritettiin 2-3 päivää välein kuten edellä on kuvattu.

solulinjat stabiilisti tyhjentynyt β-kateniinin muodostettiin lentivi- pGIPZ shRNA vastaan ​​β-kateniinin (Open Biosystems, RHS4430-98912789) tai kontrolli shRNA (Open Biosystems, RHS4743). Infektion jälkeen solut maljattiin hyvin alhainen tiheys ja valittu 10 päivä 1 ug /ml puromysiiniä (Sigma). Jokainen resistenttejä solu- pesäke kerättiin ja laajennettiin valinnassa media seuloa beeta-kateniinin proteiinin tasot. Kaksi solulinjaa maltilliseen vähentäminen β-kateniinin valittiin testaamaan enzalutamide herkkyys (sh-β-cat-1 ja -2) minimoida voimakkaan kasvun estovaikutus β-kateniinin pudotus (25).

tulokset

androgeenien hoito tukahduttaa Wnt-reportterin aktiivisuuden androgeeniriippuvaisissa LNCaP

tutkia Wnt /β-kateniinin signalointia eturauhassyövässä, me seurataan endogeeniset Wnt /β-kateniinin aktiivisuus Wnt–reportteri ylävirtaan eGFP (7xTcf-eGFP /SV40-mCherry). Konstrukti ilmaisee myös mCherry alla konstitutiivisesti aktiivinen SV40-promoottori osoittaa positiivisesti tartunnan saaneiden solujen [21]. LNCaP, LNCaP-abl (abl) ja 22Rv1 eturauhassyövän solut infektoitiin lentiviruksen sisältävät reportteri-konstrukti ja solut stabiilisti integroitu konstrukti valittiin virtaussytometrialla käyttämällä mCherry ilmaisua. Wnt reportterigeenin aktiivisuus testattiin käyttäen GSK-3-estäjällä (GSK3-i, CHIR99021), joka on voimakas Wnt-aktivaattori [22, 23]. eGFP Wnt toimittaja aktiivisuus lisääntyi, kun läsnä on GSK3-i, joka on esitetty lisääntynyt transkriptio eGFP LNCaP-abl-soluja, jotka ilmentävät stabiilisti toimittaja. EGFP-transkriptio on vähentynyt, kun läsnä on siRNA kohdistaminen β-kateniinin (kuvio 1A). Käyttämällä tätä reportteri, tutkimme aktiivisuus Wnt /β-kateniinin väylän androgeeniriippuvaisissa LNCaP, ja androgeenista riippumaton LNCaP-abl ja 22Rv1 soluja [24, 25]. Huolimatta runsaita aktiivisia, ydin- β-kateniinin (kuvio 1 B), kolme solulinjat osoittivat alhainen perustason aktiivisuus Wnt-reportterin (kuvio 1 C). Hoito GSK-3-estäjällä (3 uM) aktivoitu Wnt-reportterin aktiivisuus androgeeni-riippumaton abl ja 22Rv1-soluissa (kuvio 1 D), mikä viittaa siihen, että kohonneet β-kateniinin oli tarvitse aktivoida Wnt /β-kateniinin-reagoiva transkription. Kuitenkin hoito androgeeniriippuvainen LNCaP-solujen 3 uM GSK3-i oli hyvin vähän vaikutusta Wnt toimittaja (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi Wnt-toimittaja ei ole aktivoitu, kun läsnä oli suurempia pitoisuuksia GSK-3-estäjällä (6 tai 9μM) (kuvio 1D). Kuviossa 1E on esitetty suhteelliset mRNA-tasoja eGFP kussakin kunnossa, lisääntynyt eGFP transkriptio GSK-3-estäjällä käsiteltyjen abi soluja, mutta ei LNCaP.

, kateniinin knockdown vähentynyt Wnt-reportteri aktivoinnin GSK-3-estäjällä. abl solut infektoitiin eGFP Wnt-reportterin (7xTcf-eGFP /SV40-mCherry) ja transfektoitu si-ohjaus tai si – kateniinin. -Soluja viljeltiin 2 päivää ja sitten käsiteltiin vehikkelillä, 2 uM tai 3 uM GSK-3-estäjällä 24 tuntia. Suhteellinen mRNA-tasot eGFP osoittaa Wnt aktiivisuutta analysoitiin qRT-PCR.

B

, tasot ydin- kateniinin (vihreä) LNCaP, abl ja 22Rv1 eturauhassyövän solut määritettiin immunofluoresenssivärjäyksen.

C

, edustaja fluoresenssi kuvat osoittavat alhaista eGFP Wnt reportteri aktiivisuus LNCaP, abl ja 22Rv1 solut: Wnt aktiivisuus (vihreä), esimerkiksi solujen (mCherry, punainen), ja ydinvoiman sijainti (DAPI, sininen ).

D ja E

, androgeenin riippumaton abl ja 22Rv1 solut ovat alttiimpia aktivointi Wnt-reportteri. Soluja käsiteltiin GSK-3-estäjällä 24 tuntia ja niille suoritettiin fluoresenssi kuvantaminen (

D

) tai qRT-PCR mitata suhteelliset mRNA-tasot eGFP (

E

). In

A-E

, kokeet suoritettiin normaalissa kasvualustan kunkin solulinjan, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät.

F ja G

, Hormonien riistäminen parannettu aktivointi Wnt-reportteri LNCaP-soluissa, mikä vähentää, androgeenien hoitoon. Soluja käsiteltiin 9 uM GSK-3-estäjän täydellinen (i) tai hormonia riistää media /ilman 10 nM di-hydrotestosterone (DHT) 24 h (ii ja iii). Sitten solut altistettiin fluoresenssin kuvantamisen (

F

), tai qRT-PCR mitata suhteelliset mRNA-tasot eGFP (

G

). Esitetyt tiedot on tyypillinen kolmen erillisen kokeen ja ilmoitettu virhe on keskihajonta.

Koska β-kateniinin vuorovaikutuksessa AR käytettäessä androgeeniriippuvainen tavalla [26-28], päättelimme, että androgeenipuutteen saatetaan parantaa β-kateniinin vuorovaikutus TCF, mikä lisää Wnt-reportterin aktiivisuutta. Tueksi tämän ajatuksen, hoito LNCaP-solujen GSK-3-estäjällä säännöllisesti hormonia sisältävä media (ehto i) verrattuna hormonin menettänyt media (ehto ii) lisännyt reportterin aktivoitumisen (kuvio 1 F) on hormoni riistää kunnossa. Hoito di-hydrotestosterone (DHT) vähentynyt tämän toimittaja aktivointi (kuvio 1 F, kunto iii), mikä viittaa siihen, että androgeenireseptorin hoito tukahduttaa Wnt reportteriaktiivisuutta LNCaP-soluissa. Suhteellinen taso eGFP mRNA kussakin ehto kuvassa 1G.

esto AR aktiivisuuden parantaa Wnt /β-kateniinin reagoiva transkriptio

Koska havaitsimme aktivoitunut Wnt-toimittaja hormonin vailla ehtoja, me arveltu, että esto AR toimintaa voitaisiin parantaa Wnt /β-kateniinin reagoivaa transkriptio. Testata tätä ajatusta, AR aktiivisuus tukahdutettu joko hormonien puutteen, antiandrogeeni hoito (enzalutamide; [2]) tai siRNA-välitteisen AR ehtyminen. Soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla GSK-3-estäjällä aiheuttaa Wnt /β-kateniinin-reagoiva transkription ja suhteellinen mRNA-tasoja Wnt-reportterin (eGFP) ja endogeenisen Wnt /β-kateniinin kohdegeenin,

Axin2

, analysoitiin. Kontrollisoluihin verrattuna, suurempi induktio Wnt-reportteri ja

Axin2

mRNA-tasot havaittiin LNCaP viljeltyjen solujen hormoni vailla media, läsnä ollessa enzalutamide tai käsitelty AR siRNA (kuvio 2A-2C). Vaihtoehtona GSK-3-estäjällä hoito myös toisti kokeen käyttäen APC Knockdown aktivoida Wnt /β-kateniinin reitin. APC on osa β-kateniinin tuhoa monimutkainen ja APC poistamista tai menettämisestä toiminnon mutaation on osoitettu vakauttaa β-kateniinin ja aktivoida Wnt /β-kateniinin reagoiva transkriptio [29, 30]. Yhdenmukainen tulokset GSK-3-estäjällä käsiteltyjen solujen (kuvio 2A-2C), APC pudotus alulle korkeammat aktivointi Wnt-reportterigeenin ja

Axin2

transkription hormoni-puutteellisissa tai enzalutamide käsiteltyjen solujen (kuvio 2D ja 2E ), mikä viittaa siihen, että AR tukahduttamisen edistää Wnt /β-kateniinin-aktivaation LNCaP. Kuitenkin abl solut osoittivat korkeita Wnt toimittaja ja

Axin2

ilmaus GSK-3-estäjän että vasta hieman korkeampi ilman DHT tai esiintyminen enzalutamide (kuvio 2F ja 2G) lukuun ottamatta

Axin2

, joka ei ollut vaikutusta enzalutamide hoitoon verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 2G). Ehtyminen AR siRNA osoitti kasvua Wnt reportterigeeniaktiivisuutta ja

Axin2

mRNA sekä LNCaP ja abl-soluissa (kuvio 2C ja 2 H) viittaa siihen, että ehtyminen AR proteiinin aiheuttaa vapauttamaan lisää β-kateniinin osaksi cellular allas käytettävissä aktivoida Wnt /β-kateniinin reitin.

LNCaP-soluja käsiteltiin 6 uM tai 9 uM GSK-3-estäjällä (

AC

); abl-soluja käsiteltiin ja 2 uM tai 3 uM GSK-3-estäjällä (

F-H

).

A ja F

, Soluja hormoni-riistää 3 päivää ja sitten käsiteltiin ajoneuvon tai lisäämällä pitoisuutta GSK-3-estäjän kanssa /ilman 10 nM DHT 24 tuntia.

B ja G

, Soluja käsiteltiin ajoneuvon tai konsentraation kasvaessa GSK-3-estäjällä kanssa /ilman 10 uM enzalutamide (Enz) 24 tuntia.

C ja H

, transfektoitiin si-ohjaus- tai si-AR, viljeltiin 2 päivää ja sitten käsiteltiin vehikkelillä tai konsentraation kasvaessa GSK-3-estäjällä 24 tuntia.

D ja E

, LNCaP-solut transfektoitiin si-ohjaus tai kasvavia määriä si-APC ja joko hormoni-riistää 2 päivää ja sitten käsiteltiin ajoneuvon tai 10 nM DHT 24 h (

D

), ja viljellyt täydellisessä mediassa 2 päivää ja sitten käsiteltiin ajoneuvon tai 10pM enzalutamide 24 h (

E

). Suhteellinen mRNA tasot osoitti geenien analysoidaan qRT-PCR. Esitetyt tiedot on tyypillinen kolmesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta ja osoitetun virheen on keskihajonta.

Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että androgeeni-riippuvaisten LNCaP-solujen inhibitio AR voi mahdollistaa kasvainsolujen aktivoida Wnt /β-kateniinin reitin. Olosuhteissa hormonin puutteen tämä voi tapahtua altistettaessa Wnt-signaaleja todennäköisesti esiintyy kasvaimen mikroympäristössä [15, 31, 32]. Sen sijaan, androgeenistä riippumaton abl soluja, jotka ovat peräisin LNCaP-solut, näyttävät valmis ja Wnt /β-kateniinin-aktivaation sekä läsnä ollessa ja puuttuessa AR aktiivisuuden, mikä osoittaa, että vuorovaikutus AR ja Wnt /β-kateniinin reittejä voi olla muutettu eteneminen androgeeniriippumattomuuteen.

Hormoni puutteesta parantaa β-kateniinin vuorovaikutus TCF4

Koska β-kateniinin vuorovaikutuksessa AR tai TCF aktivoida AR tai Wnt /β-kateniinin reagoivan transkriptio, vastaavasti, eturauhasen syöpä [33, 34], tutkimme β-kateniinin käyttöasteen AR ja TCF sitoutumiskohtien käyttämällä kromatiinin immunosaostuksella (chip) määritykset. LNCaP-soluja käsiteltiin DHT, GSK-3-estäjän tai molempia 4 tuntia hormoni-menettänyt media. Suhteellinen mRNA tasot Wnt /β-kateniinin (eGFP Wnt-toimittaja ja

Axin2

) ja AR-kohde (

PSA

) geenejä kussakin kunnossa analysoitiin (kuvio 3A). β-kateniinin käyttöasteen TCF tai Ar sitoutumiskohtiin tutkittiin myös (kuvio 3B), voiko β-kateniinin rekrytointi korreloi kohdegeenin ilmentymisen. Kuten odotettua, Wnt-reportteri ja

Axin2

mRNA-tasot olivat lisääntyneet GSK-3-estäjällä käsiteltyjen solujen, mutta vähentynyt läsnä ollessa DHT ja GSK-3-estäjällä (kuvio 3A). Yhdenmukainen mRNA-tasoja, β-kateniinin rekrytoitiin TCF sitoutumiskohtien Wnt-toimittaja ja

Axin2

GSK-3-estäjällä, mutta ei soluissa yhteistyössä käsitelty GSK-3-estäjän ja DHT (kuvio 3B). Transkriptio

PSA

tapahtui vastauksena DHT, ja tämä ei vaikuttanut yhtäaikainen käsittely DHT ja GSK-3-estäjällä (kuvio 3A). β-kateniinin täyttöaste havaittiin

PSA

tehostajana kun DHT hoidossa, mutta väheni samanakaiseen hoidon DHT ja GSK-3-estäjällä (kuvio 3B), mikä viittaa siihen, että tässä yhteydessä β-kateniinin ei ole olennaista for

PSA

transkriptio. AR analysoitiin myös; näytetään käyttöasteen

PSA

vastauksena DHT hoitoa, mutta ole sitovaa havaittiin TCF sivustojen Wnt /β-kateniinin kohdegeenien mitään hoitoa (kuvio 3C).

, Expression of Wnt /kateniinin kohdegeenien (eGFP toimittaja ja

Axin2

) ja AR kohdegeenin (

PSA

) analysoitiin. LNCaP-soluja hormoni-puutteellisissa ja 3 päivää ja sitten käsiteltiin vehikkelillä, 10 nM DHT, 9 uM GSK-3-estäjän tai molempien yhdistelmä 24 tuntia.

B ja C

, kateniinin tai AR sitova kohdegeenien analysoitiin kromatiinin-immunosaostus. LNCaP-soluja hormoni-puutteellisissa ja 3 päivää ja sitten käsiteltiin vehikkelillä, 100 nM DHT, 9 uM GSK3-i tai molempia 4 tuntia.

D ja E

, kateniinin vuorovaikutusta TCF4 tai AR analysoitiin samanaikainen immunosaostus. LNCaP-soluja hormoni-puutteellisissa ja 3 päivää ja sitten käsiteltiin vehikkelillä, 100 nM DHT, 9 uM GSK-3-estäjän tai molempia 4 tuntia. Proteiini lysaatit joko immunoblotattiin ilmoitetun vasta-aineita (

D

) tai altistetaan yhteistyössä IP tutkimukset (

E

) kvantifiointi β-kateniinin ja aktiivisen β-kateniinin proteiinin tasot on esitetty alla paneelit in (

D

). Suhteellinen densitometrisesti normalisoidaan pelkkää kuljetinta, asetetaan 1. Esitetyt tiedot edustaa kolmen erillisen kokeen ja osoitetun virhe on keskihajonta.

Voit selvittää AR ja β-kateniinin täyttöaste kohde geenit korreloi β-kateniinin sitoutumisesta joko AR tai TCF4 proteiini, teimme yhteistyötä immunosaostusmäärityksissä. LNCaP-soluja käsiteltiin, kuten on kuvattu ChIP määrityksiä edellä, ja proteiini lysaatit immunosaostettiin β-kateniinin vasta-aine. Kuvio 3D osoittaa, että AR stabiloidaan DHT hoidossa. Kun koko tasot β-kateniinin olivat muuttumattomana 4 tuntia GSK-3-estäjällä hoito GSK-3 inhibition hieman lisääntynyt proteiinin ilmentymistä aktiivisen muodon β-kateniinin (fosforyloitumaton seriinin 37 ja treoniinia 41, [35]), riippumaton läsnäolo DHT (kuvio 3D). Kaiken DHT hoito lisäsi AR /β-kateniinin vuorovaikutus ja laski TCF4 /β-kateniinin vuorovaikutus verrattuna ajoneuvon käsittelyä (kuvio 3E), kuten on raportoitu aiemmin [34, 36]. Yhdenmukainen sirun tulokset (kuvio 3B), GSK-3-estäjällä tehosti TCF4 /β-kateniinin vuorovaikutus mutta kombinatoorista hoidon DHT pienentynyt tätä vuorovaikutusta (kuvio 3E). Lisäksi solut, joita käsiteltiin DHT osoitti parannettu AR /β-kateniinin vuorovaikutus, joka väheni, kun läsnä oli GSK-3-estäjällä (kuvio 3E) ja joka on vähentynyt AR on on

PSA

edistäjän läsnäollessa GSK-3-estäjällä ja DHT (kuvio 3C). Ei tiedetä, miksi AR sitoutumisen

PSA

ja vuorovaikutus β-kateniinin pienenevät, kun DHT on yhteistyössä käsitellään GSK-3-estäjällä, mutta tämä alentuneen AR

PSA

tehostajana oli vielä riittävä

PSA

transkriptio (kuvio 3A, PSA mRNA tasot DHT vs DHT + GSK3-i).

Yhteenvetona sekä siru ja yhteistyö IP määrityksen tulokset viittaavat siihen, että β- kateniinin vuorovaikutus TCF4 (kuvio 3E) ja rekrytointi Wnt /β-kateniinin kohdegeenien (kuvio 3B) lisättiin puuttuessa androgen, sopusoinnussa parannettu Wnt /β-kateniinin reagoiva transkriptio alle hormoni-köyhdytettyä olosuhteissa (kuviot 1F, 2A ja 2D).

esto AR ja Wnt /β-kateniinin reittejä lisää kasvua tukahduttamisesta LNCaP

Koska yksi soluvasteiden Wnt-polku on edistää leviämisen [37, 38], testasimme jos parannettu aktivointi Wnt /β-kateniinin reitin ilman androgeenin tai esiintyminen enzalutamide (kuvio 2A, 2B, 2D ja 2E) edistää myös soluproliferaatiota. LNCaP-soluja viljeltiin hormonin vailla media oli kasvua pidätettiin odotetaan [39], mutta GSK-3-estäjällä hoitoon tai APC pudotus johtuvan kasvun samanlainen DHT jälkeen (kuvio 4A ja 4E). Enzalutamide hoito myös tukahdutettu kasvua LNCaP kuten aiemmin havaittu [2] mutta tämä kasvua estävä vaikutus oli helpottunut, kun GSK-3-estäjällä hoitoon tai APC taintumisen (kuvio 4B ja 4F). Tutkimme myös transkription M vaiheen solusyklin sääntelyn geenin,

UBE2C

, on aikaisemmin osoitettu olevan tärkeitä kasvun androgeenista riippumattoman eturauhassyövän soluissa [40]. GSK-3-estäjällä hoito johti ylösajon

UBE2C

transkription samanlainen kuin DHT jälkeen (kuvio 4C), sekä de-tukahduttaminen

UBE2C

in enzalutamide co-käsiteltyjen solujen (kuvio 4D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Wnt /β-kateniinin aktivointi edistää kasvua LNCaP-solujen puuttuessa androgeenin tai läsnä ollessa enzalutamide, mukana säätelyä

UBE2C

. Solujen käsittely estäjä Wnt /β-kateniinin reitin, iCRT3 (C3) [41], vähentynyt kasvua edistävä vaikutus GSK-3-estäjän annos-reagoiva tavalla (kuvio 4G ja 4H), lisäksi osoittaa, että Wnt /β-kateniinin polku ohjaa androgen riippumaton kasvu LNCaP.

AF

, GSK-3-estäjällä hoitoon tai APC knockdown edistää kasvua LNCaP solujen hormoni riistää tai enzalutamide ( Enz) käsiteltiin media.

A ja B

, Solut hormoni-riistää 3 päivää ja sitten vehikkeliä, 10 nM DHT tai 6 uM GSK3-i (

), tai 10 nM DHT kanssa /ilman 10pM Enz tai 6 uM GSK3-i (

B

) joka toinen päivä.

C ja D

, Soluja käsiteltiin kuten on kuvattu (

) tai (

B

) 24 tuntia ja sitten suhteellisen mRNA-tasoja on

UBE2C

analysoitiin qRT-PCR.

E ja F

, transfektoitiin si-ohjaus tai si-APC, hormoni-riistää 2 päivää ja sitten käsiteltiin ajoneuvon tai 10 nM DHT (

E

), tai 10 nM DHT /ilman 10pM Enz (

F

) joka toinen päivä.

G ja H

, Solujen käsittely Wnt /β-kateniinin estäjä (C3) vähentää kasvua edistävää vaikutusta GSK3-i. LNCaP-soluja hormoni-riistää 3 päivää ja sitten käsiteltiin ajoneuvon tai 6 uM GSK3-i (

G

), tai 10 nM DHT plus 10pM Enz (

H

) kanssa /ilman kasvavia pitoisuuksia C3 kahden päivän välein.

I

, Co-hoito Enz ja C3 osoittaa lisääntynyt kasvun estämistä LNCaP-solujen.