Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Useat tiedot suosia androgeenireseptorin epäsuorasti eturauhasen syöpä aloittamisen kautta induktio useita geeniaktivaatiota ohjelmia. Tavoitteena on selvittää tunnistaa mahdolliset biomarkkereita varhaisen diagnoosin eturauhassyövän (PCA) joukossa androgen geenien (ARG) ja arvioida vertaileva näiden geenien ilmentymistä normaalissa eturauhasessa ja normaalissa eturauhasessa liittyvä androgeeni-herkkiä kudoksia, jotka eivät (tai harvoin) aiheuttaa syöpää.

Methods

ARG valittiin ei-neoplastisten aikuisen ihmisen eturauhasen epiteeli- RWPE-1-solut, jotka ilmentävät stabiilisti eksogeenisen ihmisen androgeenireseptorin, käyttäen RNA-mikrosiruja ja validointi qRT-PCR. Expression of 48 ennalta geenien kvantifioitiin kudosnäytteistä (rakkularauhaset, eturauhasen siirtymä- alueet ja eturauhasen syöpiä, eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun saatu kirurgisista näytteistä) käyttäen TaqMan® pienitiheyksisen taulukot. Diagnostinen esityksiä näistä mahdollisista biomarkkereiden verrattiin että geenien tiedetään liittyvän PCA (eli pCA3 ja DLX1).

Tulokset ja keskustelu

Ylittämällä ilmaisun opintoja 26 Hyväksytty PCa ja normaali välivyöhykkeen näytteitä, ja 35 Hyväksytty rakkularauhanen ja PCa näytteitä, 14 geenejä tunnistettiin. Vastaavasti, 9 geeniä yli-ilmennetään 15 eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun näytteitä, verrattuna PCa näytteitä. Kaiken valitsimme 8 kiinnostavat geenit arvioida niiden diagnostista suorituskykyä verrattuna kuin pCA3 ja DLX1. Niistä 3 geenit: CRYAB, KCNMA1 ja SDPR, oli yli-ilmentynyt kaikissa 3 viitaten ei-syöpä kudoksiin. Alat ROC käyrät näistä geeneistä saavutti niille pCA3 (0,91) ja DLX1 (0,94).

Johtopäätökset

Havaitsimme ARG pienemmällä ilme PCA ja merkittäviä diagnostisia arvoja kohdella eri syöpä- ja ei-syöpä eturauhasen kudosten, samanlainen kuin pCA3. Koska niiden ilme kuvio, ne voitaisiin katsoa mahdollisesti suojaavan eturauhassyöpä. Lisäksi ne voisivat täydentää tunnettuja geenejä yli-ilmennetään PCa ja mukana sekä niiden multiplex diagnostisia työkaluja.

Citation: Altintas DM, Allioli N, Decaussin M, de Bernard S, Ruffion A, Samarut J, et al. (2013) ilmentyvät eri androgeenisäädellyn Geenit androgeenin Sensitive kudosten Paljasta Mahdolliset biomarkkerit Early Eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (6): e66278. doi: 10,1371 /journal.pone.0066278

Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia

vastaanotettu: 14 helmikuu 2013; Hyväksytty: 03 toukokuu 2013; Julkaistu: 28 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Altintas et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustukset Ranskan League Against Cancer alla ”Equipe Labellisée” ohjelma, National Cancer Institute (INCA) ja kansallisten ja alueellisten Cancer ohjelmat. DA oli vastaanottaja PhD apurahan Ranskan opetus-, tutkimus- ja teknologia (MENRT Grant). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Taustaa

Eturauhassyöpä (PCA) on miehillä yleisin syöpä ja toiseksi yleisin kuolinsyy [1]. Nykyinen diagnoosi perustuu histologinen tutkimus eturauhasen neula-core koepaloja. Lisääntynyt seerumin PSA (prostataspesifisen antigeenin) on laajasti käytössä lääkärit, vaikka ei erityisiä, päättää eturauhasen koepaloja ja havaitsemaan eturauhassyövän [2]. Itse asiassa, eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) ja muut ei-syöpä eturauhasen olosuhteissa, kuten akuutti tai krooninen eturauhastulehdus, voi nostaa PSA-tasot. Tämä johtaa tarpeettomiin eturauhasen koepaloja koska yli 60% koepaloja ehdottamaa PSA-testi lopulta kääntää ylös negatiivinen. Lisäksi PSA-testi ei erottele kliinisesti merkittäviä indolent kasvaimia, jolloin ylidiagnostiikka ja joskus ylihoito. Näin ollen on tarvetta uusien biomarkkereiden jotka auttavat kliininen päätöksenteko noin koepala ja hoidon aloittamisesta.

Tavallinen strategia syövän biomarkkereiden löytö on verrata eturauhassyövän hyvänlaatuinen eturauhasen kudosta. Näin todettiin lupaava biomarkkereiden pCA3 (eturauhassyöpä geeni 3) differentiaalisella näyttö vertaamalla syövän normaali ja hyvänlaatuinen liikakasvu eturauhasnäytteissä [3]. Suurikapasiteettisia tekniikoita, kuten mikrosiruanalyysi ja massaspektrometria, ovat lisänneet alan eturauhassyövän biomarkkereiden löytö. Koska ensimmäinen julkaisut lopussa 90 s ja alussa 2000 s, monia biomarkkereita tai ”allekirjoitus” profiilit kunkin patologisen tilan, esim normaali

versus

syöpä, on ehdotettu eturauhassyövän diagnoosia (Revue [4], [5]). Ovatko nämä mahdolliset uudet biomarkkerit ovat kliinisesti merkittäviä jäännökset kuitenkin epävarma, sillä yksikään saavuttaa kehitysvaihe pCA3 [6].

Eturauhasen on yksi androgeenin herkkä kudoksia. Tarkemmin sanottuna molemmat alkion kehitys eturauhasen ja eturauhasen säilyttämään aikuisikään ovat riippuvaisia ​​normaalista kudoksesta kyllästystä androgeenien. Androgeenit toimia erityisellä reseptorin, AR (androgeenireseptorin), joka kuuluu tumareseptorisuperperheen. AR osallistuu PCa kasvuun [7], [8], mutta myös sen aloittamisen [9] kautta induktion useiden geenien [10], [11], [12], [13]. Olipa nämä geenit voidaan pitää potentiaalisina biomarkkereita varhaisen diagnoosin eturauhassyövän ansaitsee arvioitava. Siksi ehdotetaan kaksivaiheista strategiaa varten eturauhassyövän diagnoosia biomarkkereiden löytö. Ensin arveltu, että mahdollisia biomarkkereita varhaisen diagnoosin eturauhassyövän voitiin tunnistaa keskuudessa androgen geenien (ARGs). Valitsimme ARGs kuolemattomissa RWPE-1 epiteelisolujen eturauhasen soluja, jotka ilmentävät stabiilisti AR [14], käyttäen RNA mikrosiruja ja validointi qRT-PCR. Toiseksi arvioimme vertaileva ilmentymistä näiden ARGs normaalissa eturauhasessa ja normaalissa eturauhasessa liittyvä androgeeni-herkkiä kudoksia, jotka eivät (tai harvoin) aiheuttaa syöpää. Käytimme Hyväksytty näytteitä rakkularauhasten, eturauhasen siirtymä- alueiden ja eturauhasen syöpiä potilailta leikattu radikaaleille prostatectomies ja validoitu diagnostisia esityksiä osoittamalla niiden kyky erotella normaalin eturauhasen, BPH ja syöpä kudoksiin, ja vertaamalla sitä, että tunnettujen biomarkkerit eturauhasen syöpiä (pCA3, DLX1).

Methods

Transcriptomic analyysi RWPE-1-AR solut stimuloidaan R1881

Käytimme vakaa solulinjasta RWPE-1-AR että konstitutiivisesti ekspressoi eksogeenista AR kuten muualla on kuvattu [14]. -Soluja pidettiin keratinosyyttien kasvualustassa (Invitrogen 17005-042), johon on rEGF (rekombinantti epiteelisolujen kasvutekijää) ja BPE (naudan aivolisäkeuutetta) (Invitrogen 37000015), antibiootteja ja antimykootteja. RWPE-1-AR-soluja stimuloitiin ei-metaboloitavissa androgeenien, R1881 (10-9 M), kasvualustaan ​​riistää BPE. Kolme riippumatonta soluviljelmäkokeita kullekin käsittelylle kunnossa (ajoneuvo tai R1881 3 h ja 24 h) tehtiin mikrosiruanalyysillä. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen RNeasy® mini -kittiä (74104, Qiagen). RNA-pitoisuus mitattiin OD käyttämällä Nanodrop spektrofotometriä.

Tarkista vastaus R1881 että stimuloidut solut, ilmaus paneelin tunnettu kohde AR geenit analysoitiin kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla (qPCR) kullekin tilalle. CDNA on saatu 1 ug retrostranscribed RNA: ta (Promega M1701) monistettiin käyttäen QuantiTect SYBR® Green PCR Kit (Qiagen 204145). Primers edellyttäen Qiagenelta: Hs_KLK3 /PSA (QT00027713), MME (QT00048755), Hs_TMPRSS2 (QT00058156), Hs_MMP2 (QT00088396), Hs_MCM10 (QT00030338), ja Hs_TPB (QT00000721) kuin taloudenhoito geeni.

laatu uutettu RNA arvioitiin käyttämällä Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). RNA eheys numerot kaikista näytteistä oli 10. Käänteiskopiointireaktioita, merkintöjä ja -hybridisaatiolla Affymetrix Human 133 plus 2,0 Arrays suoritettiin ProfileXpert palvelun (Bron, Ranska) mukaan Affymetrix ™ protokollia (Expression Analysis Technical Manual 2008, Affymetrix). Yksi ug kokonais-RNA: ta käytettiin valmistamiseksi biotinyloidun cRNA ja 15 ug cRNA hybridisoitiin. Affymetrix Fluidics Station 450 käytettiin pesuun ja värjäystä. Arrays skannattiin käyttäen GeneChip- Scanner 3000 (Affymetrix). Affymetrix CEL tiedostot analysoitiin R käyttäen Bioconductor sarja paketteja. Raaka koetin signaalit olivat taustakorjatut, normalisoitu ja tiivistää käyttäen RMA menettelyä. Lineaarisia malleja sovellettiin käyttäen Limma kokonaisuutta, jotta geenien tunnistamiseen potentiaalisesti merkittäviä muutoksia ilmentymisessä reaktiona vaikutusaikaprofiilin tai R1881 hoito jokaisen kesto (malli kaava: ~ Kesto + Kesto: R1881). Empiirinen Bayes menetelmää käytettiin laskea moderoitu p-arvot korjattiin sitten monimuuttujille käyttäen Benjamini ja Hochberg vääriä löytö määrä (FDR) ohjaamalla menettely. Microarray data on talletettu ja kuvattu, mukaisesti MIAME ohjeiden, geenien ilmentyminen Omnibus tulonumerolla GSE29232 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE29232 ).

arvioimiseksi, että suhteellinen RNA-ekspressiotasot 14 säädellään-transkriptit olivat yhdenmukaisia ​​microarray data, RT-qPCR suoritettiin kolmena kappaleena samasta RNA kuin microarray kokeiluja käyttäen QuantiTect SYBR® Green PCR Kit (Qiagen 204145). Alukkeet tarjoamia Qiagen: Hs_EGFR (QT00085701), Sox2 (QT00237601), Hs_NDRG1 (QT02290232), Hs_MME (QT00048755), Hs_TFPI2 (QT00062804), Hs_CDK5R1 (QT00231644), Hs_SCNN1G (QT00063217), Hs_RHOB (QT00227409), Hs_PRDM1 (QT00060494), Hs_IL7R (QT00053634), Hs_SERPINB2 (QT00077497), Hs_PAX9 (QT00023317), Hs_FST (QT01665853), Hs_ADAMTS1 (QT00098588) ja Hs_TPB (QT00000721) kuin taloudenhoito geeni normalisoimiseksi raakadataa. Korrelaatioita microarray ja qPCR tuloksia tehtiin käyttäen Spearmanin testi ja lineaarinen regressioanalyysi.

tunnistaminen ehdokas biomarkkereiden geenien

Mahdolliset kandidaattigeenit valittiin seuraavin perustein: 1) androgeenisäädellyn: harkitsee log2 fold-muutos raja-arvo on 1,2 ja FDR (väärä löytö rate), jossa

P

0,05; 2) ilmentyy huomattavasti korkeampi hoidon jälkeen (3 h ja /tai 24 h ajan); 3) Gene ontogeny luokat ja asiaan väyliä käyttäen Ingenuity Pathway Analysis (IPA®) ohjelmisto (Ingenuity Systems). Yhteensä 36 geenikohteet valittiin vahvistus (ero) ilmentyminen potilaan näytteissä.

Tissue yksilöitä

Ethics selvitys.

Ei interventiotutkimuksella biolääketieteellisen tutkimuksen protokolla pehmo- näytteiden säilyttäminen jälkeen eturauhasen leikkaus on perustaa Centre Hospitalier Lyon-Sud ja eettinen komitea Lyon (CPP Sud-Est 2) erikseen hyväksy sitä tätä tutkimusta varten. Siksi potilaiden myönsi urologian osastolla Centre Hospitalier Lyon-Sud ilmoitettiin ja antoi vapaaehtoista, allekirjoitettu tietoinen suostumus ennen mitään kudosnäytteen säilyttämisen ja tutkimuskäyttöön.

kudosnäytteitä.

eturauhassyöpä (PCA), eturauhasen siirtyminen vyöhyke (PTZ) ja rakkularauhanen (SV) jäädytetyt kudokset saatiin radikaali prostatectomies. Gleason pisteet (GS) käytetään eturauhassyövän kudoksen luokittelu. PTN patologinen tuumorin luokitus määräytyi UICC TNM luokittelu 2002 (6

painos). Jäädytetyt kudokset potilailta BPH saatiin höyläysleikkaus eturauhasen. Puuttuminen syövän BPH näytteistä arvioitiin patologi kokeneita alan eturauhasen sairauksia. Patologinen ominaisuudet syöpäpotilaiden tutkimukseen sisältyvät esitetty yhteenvetona taulukossa 1.

Vertailun ilmentämistutkimuksissa PCA, SV ja PTZ Hyväksytty kudosnäytteitä, jotka on saatu samasta kirurgisista näytteistä, The Koska syöpäsolujen SV ja PTZ tarkistettiin tiukka histologinen tutkiminen kudosten vieressä ne palaset varattu jäädytettyä ja RNA. Diagnostisia tarkoituksia varten käytettiin 50 PCa kudosnäytteitä: GS 6 (

n = 1

), GS 7 (3 + 4) (

n = 12

), GS 7 (4 + 3 ) (

n = 24

), GS 8 (

n = 6

), ja GS 9 (

n = 7

).

RNA ja käänteistranskriptio

Jäädytetyt kudokset varastoitiin nestemäisessä typessä, kunnes RNA Kokonais-RNA uutettiin homogenoidusta kudoksista Trizol® (Invitrogen), ja arvioitiin eheys käyttäen 2100 Bioanalyzer® (Agilent). 1 ug kokonais-RNA: ta muutettiin cDNA: ksi käyttäen First-Strand cDNA Synthesis Kit® (Invitrogen). Saatua cDNA: ta käytettiin välittömästi reaaliaikaisen qPCR.

TLDA reaaliaikaisia ​​qPCR

Applied Biosystems TaqMan tekniikka (TaqMan® low-density paneelit: TLDAs) käytetään kvantitatiivista analyysiä geeniekspression. Periaate suurikapasiteettisten reaaliaikainen qPCR järjestelmä perustuu 384-hyvin -mikronestekorttia (8 erillistä lastaussatamiin, joissa jokaisessa on 48 erillisissä kuopissa) [15]. Jokainen 2-il kuoppa sisältää erityisiä, käyttäjän määrittämiä alukkeiden ja koettimien, jotka kykenevät spesifisesti havaitsemaan yhden geenin. Kukin cDNA-näyte (100 ng cDNA: ta vastaava), lisättiin yhtä suuri tilavuus 2 x TaqMan Gene. Expression Master Mix® (Applied Biosystems) yhteensä 100 ul porttia kohti. Varovaisen sekoittamisen ja sentrifugoinnin, seos siirrettiin lastaus porttiin TLDA kortin. Array sentrifugoitiin kahdesti 1 minuutin ajan, kukin 1200 rpm, jakaa näytteet lastaussatamasta kuhunkin kuoppaan. Kortti suljettiin sitten ja PCR-amplifikaatio suoritettiin käyttämällä 7900HT Fast Real-time PCR System® (Applied Biosystems) noudattaen protokollaa valmistajan kuvaamia.

Tässä tutkimuksessa mRNA-tasoja 48 geenien mitattiin. Jokainen levy oli 18S-aluke /koetin kuin endogeeninen kontrolli. Lisäksi HMBS, RPL13A, ACTB, TBP, ja UBB mitattiin mahdollisina taloudenhoito geenejä. Kaksi teknistä kaksoiskappaleet tehtiin kullekin eri näytettä.

Tilastollinen

Reaaliaikainen data.

Kynnys (Ct) on automaattisesti antama SDS2.2® ohjelmistopaketti (Applied Biosystems). Suhteelliset määrät (RQ) määritettiin käyttämällä yhtälöä: RQ = 2-ΔΔCt. Kaikki tiedot luotiin kahtena kunkin geenin ilmentymisen näytettä kohti. Taqman Array kortit tietoja samanaikaisesti analysoitiin ero ilmentymisen käyttäen Integromics Realtime StatMiner 4.0® paketti, joka integroi Bioconductor R ohjelmisto. Eri vaiheet työnkulkuprosessiin PCR data-analyysi: laadunvalvonta, valitsemalla vakain endogeenisen ohjaus-, data- normalisointi ja suhteellinen kvantifiointi, saavutettiin tämän bioinformatiikan työkalulla. Kontrolleina läsnäolo eturauhasen solujen eturauhasen näytteet, kahden eturauhasen-spesifisiä markkereita, jäsenet kallikreiinin perheen, ts KLK2 ja KLK3 /PSA, käytettiin normalisointi. Kertainen muutoksia geenien ilmentyminen esittivät Log10RQ (Log10RQ = 0, jos mitään ilmaisua muutosta; Log10RQ = 1, jos näyte on ilmaistu 10 kertaa suurempi kuin kalibraattorin näytteen Log10RG = -1 jos näyte on ilmaistu 10 kertaa vähemmän kuin kalibraattorin näyte). Studentin t-pariksi testiä käytettiin vertailua Hyväksytty näytteitä. Parametrinen Wilcoxonin testiä käytettiin vertailua ei-sovitettu näytteitä. Benjamini ja Hochberg False Discovery Hinta otettiin merkitsevyystasoksi. Merkitys pidettiin

P

0,01.

arviointi diagnostista suorituskykyä.

Vastaanotin toimineiden (ROC) käyrät laskettiin arvioidakseen diagnostinen teho kunkin erillisen muuttujan yksimuuttujaisesti jonka pinta-ala (AUC) ROC-käyrän. Arvot ROC käyrät olivat -ΔCt normalisoitiin käyttäen geometrinen keskiarvo TBP, KLK2 ja KLK3. 95%: n luottamusväli (95% IC) AUC-arvot laskettiin, kuten on kuvattu (13). Tätä ilmaisua tutkimuksessa potentiaaliset biomarkkerit pidettiin arvokkaana jos AUC ≥0.9 (13). Kaikki nämä tilastolliset laskelmat tehtiin käyttäen STATA®11.0 ohjelmistoa (College Station, Texas).

Tulokset ja keskustelu

androgeenisesti geenien ilmentymisen profiilit ja potentiaalisten mRNA biomarkkereiden

Meidän tavoitteena oli tunnistaa androgeeniriippuvaisissa geeniaktivaatioon ohjelmien mahdollisesti mukana alkuvaiheissa eturauhasen syövän synnyn. Tämän vuoksi päätimme käyttää solumallin mahdollisimman lähellä normaalia eturauhasen solujen sijaan eturauhassyöpäsolulinjoissa, jossa molekyyli tapahtumat ovat todennäköisesti edustaa loppuvaiheissa eturauhassyövän kehitystä. Käytimme ei-syöpä RWPE-1-soluja on aiemmin saatu kuolemattomaksi ei-neoplastisten aikuisen ihmisen eturauhasen epiteelisolujen ihmisen papilloomavirus 18 [16]. Huolimatta kuolemattomaksi, nämä solut osoittautuivat käyttäytyä kuin lähes normaalin eturauhasen soluissa: säilyttäminen Y-kromosomi, normaali ilmaus sytokeratiineja ja E-kadheriinin, kasvun kiihtyminen sekä PSA ja AR ilmaisun vastauksena androgeenien [17], [18]. He myös säilytti kyky kehittää erityisesti Matrigel 3D kulttuureissa, hyvin polarisoitunut ontto sferoideina läpi ja lopulta acinar erilaistumista vastauksena kasvutekijöiden ja seurauksena vuorovaikutukset soluväliaineessa [17], [18], [ ,,,0],19].

vahvistamiseksi androgeeniriippuvaisissa geenin aktivoinnin ohjelmiin, käytimme stabiilisti transfektoitu RWPE-1-solujen villityypin AR-geenin [14]. Saatu RWPE-I-AR solut voimakkaasti androgen-herkkien tarkistettu proliferaatiomäärityksillä. Nämä solut käsiteltiin ei metaboloituva synteettisen androgeenin R1881: ssa 3 h ja 24 h. Androgeenin indusoima stimulaatio ensin tarkistaa kvantitatiivisen RT-PCR-paneelin tunnettuja kohde AR geenejä, mukaan lukien KLK3 /PSA, MME (makrofagi metalloelastaasi) ja TMPRSS2: (tietoja ei näytetty). Extracted cDNA soluista käsitelty tai ei kanssa R1881 sitten hybridisoitiin päälle Affymetrix Human 133 plus 2,0 paneelit.

Transcriptomic profilointi tunnistettu käyttäen log2 kertamuutosta raja-arvo on 1,2, 75 geenien näytteille säätelyä ylöspäin ja 33 geenien näytteille alassäätö in R1881 saaneilla RWPE-1-AR-soluissa 3 tunnin aikana suhteessa kontrolleihin (ajoneuvo käsitelty), ottaen huomioon FDR (väärä löytö rate), jossa

P

0,05. Transcriptomic profilointi tunnistettu 208 geenien näytteille ylössäätöä ja 116 geenien näytteille alassäätö in R1881 saaneilla RWPE-1-AR-solujen aikana 24 h suhteessa kontrolleihin, ottaen huomioon FDR kanssa

P

0,05.

validointi suoritettiin kokeita vahvistaa tarkkuutta array geenin ilmentymisen mittauksen valittu selostukset ilmentyvät eri 3 h ja /tai 24 h ajan R1881 hoidon (7 säädelty ja 7 alassäädetty) käyttäen LightCyclerTM reaaliaikaista qPCR : EGFR, Sox2, NDRG1, MME, TFPI2, CDK5R1, SCNN1G, RHOB, PRDM1, IL7R, SERPINB2, PAX9, FST, ja ADAMTS1. Tulokset vahvistivat, että suhteellinen RNA-ekspressiotasot olivat yhdenmukaisia ​​mikrosiru (taulukko S1).

määrittää ja asettaa tärkeysjärjestykseen biomarkkereiden ehdokkaiden joukossa geenien havaittiin ilmentyvät differentiaalisesti jälkeen 3 h ja /tai 24 h R1881 hoitoon, me pohjainen

in silico

analyysejä biologiset ominaisuudet pidetään merkittävin sekä kirjallisuuskatsauksesta ja kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA®). Analyysit tämän ohjelmiston palautti seuraavat tiedot: 1 /asiaan liittyviä toimintoja aineisto ja 2 /vaikutti signalointi ja metaboliareitteihin liittyvä aineisto. Sen lisäksi korkea kertamuutosta mikrosirulähestymistavassa aineisto 3 h ja /tai 24 h R1881 käsikirja, geenit suunniteltiin kohteisiin, jos niillä on vähintään yksi näistä toiminnalliset merkintöjä tai sairaus yhdistysten Ingenuity Knowledge tietokanta: mahdollinen tunnistus virtsassa , tunnettu kudoksen ilmentymistä ja erityisesti differentiaalikaavojen eturauhassyövässä solulinjoissa, eturauhasen hyvänlaatuinen kudoksissa ja /tai eturauhassyövän ja /tai voimakas yhdessä karsinogeenisia prosesseja. Olemme myös suosivat sääteli geenejä alassäädetty olevista yritetään helpottaa mahdollista tulevaa käyttöä kliinisessä työssä. Kolmekymmentä kuusi geeniä täsmäsi näillä kriteereillä (taulukko 2) ja käytettiin jatkotutkimuksiin.

kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi ihmisen syöpä- ja ei-syöpä eturauhasen täsmäsi kudoksiin

tutkimiseksi edelleen ilmaisu androgeenivaikutuksen geenien tunnistetaan mikrosiruanalyysillä, kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi suoritettiin valitut kohteet käyttämällä ihmisen PCa ja eturauhasen siirtymävyöhyke (PTZ) täsmäsi kudoksiin. PTZ valittiin, koska sen tiedetään harvoin aiheuttaa eturauhasen syöpä [20]. Tavoitteena oli löytää biomarkkerit voidaan erottaa toisistaan ​​syöpä- ja ei-syöpä eturauhasen kudoksia. Valitsimme laajamittainen RT-PCR RNA kvantifiointi on TaqMan® alhaisen tiheyden pakat (TLDAs; Applied Biosystems), jotka mahdollistavat, näytettä kohti, samanaikainen analyysit jopa 48 tavoitteet räätälöityjä kortteja. Kvantitatiivinen RT-PCR valittiin pohjaksi vertailussa, koska se mahdollistaa mRNA: n määrän, joka on prosessi, aiemmin käytetty arvioimaan kudoksen ilmentymistä [21], [22], [23], [24], [25], [26] ja virtsan määrät [22] pCA3 (eturauhassyövän geenin 3), geeni halusimme käyttää kontrollina positiivinen geeni. PCA3 on todellakin nyt tunnustettu arvokkaaksi biomarkkereiden eturauhassyövän (Revue [27], [28]) ja sen on osoitettu erikseen ilmaistaan ​​jopa 95% Eturauhassyövän [3], [29]. PCA3 vuoksi käytettiin positiivisena kontrollina, mikä PCa- erityinen ilmaisu paneeli. TMPRSS2 [30] ja DLX1 [31], [32] ovat myös mahdollisia PCa biomarkkerit, kuten on esitetty tarkastelemalla microarray tietoja käyttämällä Oncomine tietokantaan, ja niiden ilmentyminen arvioitiin samalla positiivisina kontrolleina. Lisäksi arvioimme ilmentyminen 6 mahdollisten housekeeping-geenejä: 18S, ACTB, HMBS, RPL13A, TBP, ja UBB, sekä 2-geenien katsotaan olevan eturauhasen-spesifisten geenien: KLK2 ja KLK3 /PSA. Globaalina markkeri androgen-herkkien kudosten (eturauhanen ja rakkularauhaset), myös valittu AR geeni analyysi (taulukko 2).

Onko PCa ja PTZ kudokset ilmentävät samanlaisia ​​RNA määriä ei tunneta. Normalisointi jonka taloudenhoito geeni siis perusteltua. Viimeaikaiset selvitykset osoittivat, että taloudenhoito geenit voivat itse asiassa aiheuttaa vakavia eroja kudosten, solulinjoja tai kliinisissä näytteissä [33]. Siksi ensimmäinen pyrittiin määrittämään, mihin potentiaaliin siivous geenit stabiilisti ilmentyvät eri olosuhteissa keskuudesta 6 valitsimme. TBP havaittiin vakain endogeeninen kontrolli käyttämällä NormFinder algoritmi StatMiner® paketin ja käytettiin normalisointia geenin seuraavat osat tutkimuksen. Eturauhasen-geenejä KLK2 ja KLK3 /PSA myös paljastaa selkeä osoitus vakauteen ja käytettiin yhdessä TBP kuin endogeeninen kontrolli (geometrinen keskiarvo).

Vertasimme ilmaus kaikki valitut geenit 26 Hyväksytty normaalissa eturauhasessa PTZ ja PCa kudokset, saatu eturauhasen yksilöitä. Näin ollen 26-geenien havaittiin olevan huomattavasti (

P

0,01) yli-ilmentyy normaalissa eturauhasessa siirtyminen alueelle verrattuna PCa (kuvio 1A ja kuvio S1). Kekseliäisyyttä Pathway Analyysi osoitti, että 17 ja 21 näistä 26 geeneistä kuuluvat 2 merkittävästi edustettuina biologisiin toimintoihin: cellular liikkuvuus (solujen kulkeutumista erityisesti) ja syövän (epiteelikarsinooman erityisesti), tässä järjestyksessä. Sitä vastoin vain pCA3 ja DLX1 geenit määritettiin olevan korkeampi (yli 50- ja 60-kertaiseksi) PCA kudoksissa verrattuna vastaaviin normaaleihin PTZ kudoksissa (

P

0,01) (kuvio 1A). On syytä huomata, että ACTB (koodaus beeta-aktiini), yleensä pitää potentiaalisena taloudenhoito geeni, havaittiin myös yliekspressoituvan PTZ. Itse asiassa, ACTB on androgeenisäädellyn [34], [35] ja on aiemmin raportoitu ekspressoitua eri välillä syöpä- ja ei-syöpä eturauhasen kudosten [36].

Y-akseli: log10 RQ (suhteellinen määrät); X-akseli: geenejä, joiden ilmentyminen oli tilastollisesti merkitsevää eroa: A) 26 vastaaviin normaaleihin eturauhasen siirtyminen alueelle ja eturauhassyöpänäytteissä B) 27 eturauhassyöpänäytteissä ja 15 näytettä eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun C) 35 Hyväksytty rakkularauhanen ja eturauhassyöpänäytteissä.

hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu (BPH) on mielenkiintoinen malli, johon verrattuna PCA asiaan. Nämä kaksi patologisten tilojen todellakin jakaa useissa kohdissa, mukaan lukien erityiset paikalliseen ympäristöön (sama verenkiertoa tapahtumassa mitogeeneihin), androgen-herkkyys ja hallitsematon solujen lisääntymistä. Sitä vastoin PCA, BPH peräisin PTZ ja on ajateltu koskaan lähde pahanlaatuisen muutoksen. Expression valittujen geenien vuoksi verrattiin 26 aiemmin testattu PCa yksilöitä ja 15 etuyhteydettömille BPH näytettä, jossa puuttuessa syöpäsolujen varmistettiin patologi asiantuntija eturauhasen patologian alan. Käytimme samaa 3 normalisointi geenit (TBP, KLK2 ja KLK3 /PSA), joka osoittautui olevan stabiili mukaan NormFinder algoritmin. Tällä tavoin voimme tunnistaa 9-geenien merkittävästi (

P

0,01) yli-ilmentyy BPH verrattuna PCa (kuvio 1 B ja kuviossa S2): AR, AUTS2, CDK5R1, CRYAB, FOXA2, KCNMA1, MME, SCEL, ja SDPR. CDK5R1 (ja vain tämä geeni) on myös todettu olevan yli-ilmentynyt BPH kudoksissa verrattaessa sen ilmentymisen normaalissa eturauhasessa PTZ. Se koodaa niin sanottua p35-proteiini, joka toimii olennaisen aktivaattori CDK5, vahva säätelijä hermosolujen siirtoa. Proteiini p35 on heikosti ilmaistu PCa kudosnäytteitä ja osoittautui olla mukana eturauhasen solujen apoptoosin [37]. Parhaan tietomme erityismääräys BPH ei ole koskaan raportoitu. Viisi geenejä tunnistettiin yli-ilmentynyt PCA verrattuna BPH: ALCAM, CLDN7, DLX1, pCA3 ja RASD1 (kuvio 1 B). PCA3-geeni, joka on erittäin spesifinen eturauhas- syöpäsolujen, on raportoitu olevan yli-ilmentyneen 66-100-kertaisesti eturauhassyövän

vs.

normaalissa eturauhasessa ja 140-kertaisesti eturauhassyövän

versus

BPH [ ,,,0],3], [21]. Tutkimuksessamme havaitsimme vahvaa yliekspressio PCa 50-210 kertainen verrattuna normaalissa eturauhasessa ja BPH, vastaavasti. DLX1 oli sama ekspressiokuvio, kuten aiemmin on havaittu [31]. ALCAM ja CLDN7 molemmat koodaavat proteiineja lokalisoitu solujen välinen liittymissä erilaisia ​​epiteelin ja on aikaisemmin ehdotettu androgeenisäädellyn ja yli-ilmentynyt PCA [38], [39]. RasD1 alun perin kuvattu deksametasoni-indusoituva ras-sukua oleva proteiini ja mahdollinen toimija estää poikkeavan solun kasvua useissa solulinjoissa [40]. Mukaan kekseliäisyyttä Pathway Analysis®, joukossa 14 geenit siis todettu ilmentyä erilailla BPH ja eturauhasen syöpä, kaikki olivat mukana huomattavasti edusti toiminnallinen verkko – solujen kasvua ja lisääntymistä – paitsi pCA3 (vähän tiedetään sen toimintaa, mutta pCA3 valvonnassa PCa solujen eloonjäämistä, osittain moduloimalla AR signaloinnin [41]) ja CDK5R1 (melko mukana, yhdessä 8 muiden geenien, joka merkittävästi edustettuina biologinen toiminto: solukuoleman ja eloonjääminen).

Quantitative RT-PCR-analyysi ihmisen syöpä- eturauhasen ja rakkula Hyväksytty kudosten

edellä vertailevia ilmentämistutkimuksissa pystyimme tunnistamaan geenejä yli-ilmentynyt syövättömät eturauhaskudoksiin verrattuna eturauhassyöpää. Huolimatta niiden mahdollinen diagnostinen arvo, nämä geenit voivat myös olla merkitystä, koska otaksuttu markkereita prosessien suojaavan syövän muutosta. Niiden korkea ilmentyminen BPH ja normaali PTZ voi liittyä huono tai null syövän näissä kudoksissa, kun taas niiden heikko ilmentyminen eturauhasessa saattaa mahdollistaa syöpä aloittamista suurella taajuudella. Tällainen mekanismi on hiljattain ehdotettu toisessa eturauhasen liittyvien kudosten: rakkularauhanen [42]. Kirjoittajat käytetään 2-vaiheista strategiaa valitsemalla ensin geenien merkittävästi korkeammat ekspressiotasot rakkularauhaset sijaan normaalissa eturauhasessa ja toiseksi ylittämällä tätä luetteloa tunnistettujen geenien toisaalle, koska niiden ilmentyminen hiljennettiin PCA mukaan promoottori DNA: n metylaatio. Kahdeksan kiinnostavat geenit on siten otettu [42]. Tämä tutkimus on sopusoinnussa tämän julkaistu yksi että me myös käyttää 2-vaiheista strategiaa joka antoi meille mahdollisuuden onnistuneesti valita ehdokas androgeenisäädellyn geenejä, joiden ilmentyminen mitattiin PCa näytteiden ja verrattuna viite eturauhaskudoksiin tiedetään harvoin tai ei koskaan aiheuta syöpään vaikka niiden yhteinen embryologic alkuperä ja karsinogeeninen altistumista. Samoin tiedetään, että huolimatta piirteitä jakaa yhteisiä eturauhasen ja rakkularauhaset, mukaan lukien erityisesti androgeeniriippuvainen kasvuun ja toiminta, syövän ja rakkularauhaset ja eturauhanen on silmiinpistävän erilainen [42]. Tärkeää on, tämän perusteella erot voitaisiin korreloida mekanismeista eturauhasen syövän synnyn [42]. Lisäämällä kudokset normaalista rakkularauhaset ollen katsottiin tässä tutkimuksessa, vahvistaa ilmaisun vertailun eturauhassyöpä ja viittaus hyvänlaatuinen kudos, erittäin suojattu syöpää muutosta.

Siksi arvioitiin geeniekspression 35 Hyväksytty rakkularauhanen ja PCa kudoksia käyttäen samaa valitun geenin (taulukko 2). Puute rakkularauhanen osallistuminen eturauhassyöpään oli huolellisesti patologisesti varmistettu ennen käyttöä tutkimuksessa. TBP havaittiin vakain endogeeninen kontrolli käyttämällä NormFinder algoritmi StatMiner® paketin ja käytettiin normalisointi geenin. Kuten odotettua, eturauhasspesifisen KLK2 ja KLK3 geenit on ali-ilmentynyt vuonna rakkularauhanen verrattuna eturauhasessa (

P

0,01). Kymmenen muita geenejä myös yliekspressoituvat merkittävästi PCa verrattuna rakkularauhanen: ALCAM, LOX, BNIP3, CLDN8, AQP3, FOXA2, ja NDRG1 sekä odotettavissa TMPRSS2, DLX1 ja pCA3 (kuvio 1C ja kuvio S3). Sen sijaan, 18-geenien havaittiin yliekspressoituvat merkittävästi rakkularauhanen verrattuna PCa: CRYAB, KCNMA1, AKR1C1 /2, TFP12, SDPR, CD24L4, SERPINB1, FLRT3, DACT1, SCNN1G, FST, RHOB, SGK1, LAMA3, AKR1C3 , SEPP1, RGS2 ja ACTB (

P

0,01).