Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tässä tutkimuksessa kehitimme, tunnettu ja validoitu

in vitro

toimiva superparagmagnetic rauta-oksidi perustuvat magneettikuvaus varjoaine konjugoimalla kaupallisesti saatavilla rautaoksidi nanohiukkasten, Molday ION rodamiini -B karboksyyli (MIRB), jossa on deimmunized hiiren monoklonaalinen vasta-aine (muJ591) kohdistaminen prostataspesifisen kalvon (PSMA). Tämä toiminnallinen varjoaine on tarkoitettu erityisiä ja ei-invasiivisia havaitseminen eturauhassyövän solut, jotka ovat PSMA positiivisia, merkkiaine sekaantunut eturauhassyövän etenemisen ja etäpesäkkeiden. Kaksivaiheinen karbodi-reaktio konjugoida vasta-aineen nanohiukkasten oli tehokas ja saimme alkuaine rautapitoisuus 1958 ± 611 vasta-ainetta kohti. Immunofluoresenssimikroskopia ja virtaussytometrialla osoitti, että konjugoidut muJ591: MIRB spesifisti sitoutuu PSMA-positiivisten (LNCaP-solut). MuJ591: MIRB monimutkainen alennettu soluadheesiota ja solujen lisääntymistä koskevat LNCaP ja aiheutti apoptoosin, mikä testattiin anneksiini V määrityksessä, mikä viittaa antituumorigeenistä ominaisuudet. Mittaukset T2 relaksaatioaikaa muJ591: MIRB kompleksi käyttämällä 400 MHz Innova NMR ja multi-kaiku spin-kaiku sekvenssin 3T MRI (Achieva, Philips) osoitti merkittävää T2 relaksaatioaika vähentämistä varten muJ591: MIRB kompleksi, alennetun T2-relaksaatioaika funktiona rautapitoisuus. PSMA-positiivisten solujen käsitelty muJ591: MIRB osoitti huomattavasti lyhyempi T2 rentoutumista aikaa saadaan käyttämällä 3T MRI. Väheneminen T2 rentoutumista aikaa muJ591: MIRB, yhdistettynä sen spesifisyys vastaan ​​PSMA + LNCaP, ehdottaa sen mahdollisuuksia biologisesti tietyn MR varjoaine.

Citation: Bates D, Abraham S, Campbell M, Zehbe I, Curiel L (2014) kehittäminen ja karakterisointi Vasta-aineen leimatun Super-Paramagneettinen rautaoksidi varjoainetta Targeting syöpäsolujen magneettikuvaukseen. PLoS ONE 9 (5): e97220. doi: 10,1371 /journal.pone.0097220

Editor: Roberto Furlan, San Raffaele Scientific Institute, Italia

vastaanotettu: 13 joulukuu 2013; Hyväksytty: 16 huhtikuu 2014; Julkaistu: 12 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Bates et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Ontario Institute for Cancer Research läpi tutkimuksen apurahan (10NOV-446) ja National Sciences and Engineering Research Council of Canada. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

viimeisten 10 vuoden aikana ilmaantuvuus eturauhassyövän kasvaa jatkuvasti jäljellä toiseksi yleisin syöpä diagnosoidaan miehillä maailmanlaajuisesti. Kanadassa yksin, se muodostaa noin 27% vasta diagnosoitu syöpien vuonna 2012 [1]. Eturauhassyövän kasvua ja leviämistä ovat usein hyvin hitaasti ja jää huomaamatta varhaisessa vaiheessa syöpä. Nykyinen havaitsemisen ja hoidon suunnittelu vahvasti perustuva käytöstä prostataspesifisen antigeenin (PSA) ilmentävillä soluilla. Kuitenkin alhainen spesifisyys Tämän testin on johtanut ylihoito varhaisen ja vähemmän aggressiivinen syöpä ja alle hoitoon veltto mutta aggressiivinen syöpä, joka johtaa suuri sairastuvuus [2]. Lisäksi nykyiset hoidot ovat suuri sairastuvuus ja mahdolliset jälkikäsittelyä pahenemisvaiheita, jotka vaarantavat potilaan elämänlaatua ja selviytymistä [3], [4].

Tutkimukset ovat osoittaneet, että ottamalla kohteeksi eturauhasspesifinen kalvoantigeeni (PSMA) ilmentävien solujen, sekä paikallisia ja aggressiivisia olosuhteita voidaan käsitellä [3], [5] – [17]. PSMA on erittäin tunnettu eturauhassyöpä biomarkkerina lokalisoitu eturauhassyövän solukalvon, mikä viittaa niiden hyödyllisyydestä

in vivo

eturauhassyöpäspesifisten kohdistusstrategioihin [8], [9], [13] – [17]. PSMA-geeni on kloonattu, sekvensoitu ja kartoitettu kromosomiin 11q14, ja se ilmaistaan ​​suuri osa pahanlaatuisten eturauhasen epiteelisolujen, mutta ei normaalissa verisuonten endoteelin [6]. Itse asiassa, PSMA on suurin yksittäinen vakiintunut erittäin rajoittunut eturauhasen epiteelisolujen kalvo antigeenin, kun taas PSA ja eturauhasen hapan fosfataasi ovat erittyviä proteiineja [9], [17]. Immunoterapeuttiset ja havaitseminen lähestymistapoja, jotka käyttävät anti-PSMA-vasta-aineita on ehdotettu erinomaisia ​​välineitä sekä havaitsemisen ja eturauhassyövän hoitoon [8], [9], [13].

PSMA-reseptorit paikantuvat pääasiassa apikaalisella solukalvon eturauhasen epiteelin ja olennainen rooli etenemisen eturauhasen maligniteettien luultavasti edistämällä antiapoptoottisia signalointi, varmistaen solujen sietokyvyn ja edistää solujen lisääntymistä [6], [18]. Kohdistaminen tämän reseptorin kanssa anti-PSMA J591-vasta on osoittautunut tehokkaaksi havaitsemiseksi ja terapeuttisia työkalu eturauhassyövän [10] – [12]. Ollakseen kliinisesti sovelletaan, hiiren monoklonaalinen (mAb) anti-PSMA-reseptori on de-immunisoitiin korvaaminen hiiren immunoglobuliini-sekvenssien kanssa ihmisen immunoglobuliini-sekvenssien, jolloin tuloksena on ei-immunogeeninen, humanisoitu vasta-aine, huJ591 [9], [13] – [15]. HuJ591 mAb on laajasti käytetty vaiheen I kliinisissä tutkimuksissa, joissa on osoitettu olevan hyvin siedetty ilman haittavaikutuksia isännän immuunivastetta [9], [14], [15].

endorectal magneettikuvaus (MRI) on yleistymässä osa paikallista työstämisen eturauhassyövän. Dynaaminen tutkimukset käyttäen gadolinium-DTPA varjoaineita ovat osoittaneet hyödyllisiä parantamiseksi kasvaimen kuvien [19] – [27]. Noninvasiiviset havaitseminen PSMA ilmentävien solujen voidaan parhaiten suorittaa toiminnallinen varjoainetehosteisiin MRI tekniikoita. Varjoaineita parantaa kontrastia kudosten muuttamalla relaksaatioajat kudosten näkyvyyden parantamiseksi rakenteiden kautta MRI. Tällaiset havaitsemismenetelmät vaativat kehittämistä funktionaalisen MRI varjoaineita, esimerkiksi yhdistää anti-PSMA-vasta-MRI varjoaineet. Molday ION Rhodamine-B Karboksyyliterminaalisia (MIRB) on kaupallisesti saatavilla oleva rauta-oksidi pohjainen nanohiukkasten joka vähentää T2 relaksaatioaika imevää kudosten ja siten havaitaan tappiota signaalin MR kuvia [28], [29]. Rautaoksidi ydin MIRB nanohiukkasten voidaan kemiallisesti aktivoida reagoimaan aminoterminaalisen proteiinien tai vasta-aineiden muodostamiseksi peptidisidoksella, jolloin saatiin vasta-aine /proteiini: MIRB konjugaatin monimutkainen. Tuore tutkimus osoitti, että MIRB voidaan merkitä kantasoluja, syöpäsolut ja immuunisolujen säilyttäen korkea elinvoimaisten solujen ja havaittavissa MRI [28]. MIRB n helppous konjugointi proteiinin tai vasta-aineen, sen korkea lastaus Raudan MR kuvantamisen, ja hyvä solu siedettävyys tekevät siitä hyvä ehdokas toiminnallisen vasta–leimattu MR varjoaine.

Tässä tutkimuksessa kehitimme toiminnallinen super-paramagneettinen rautaoksidi (SPIO) -pohjaisen MR-varjoaine, joka erityisesti kiinnittyy PSMA reseptoreihin MR kuvantaminen eturauhasen syöpäsoluja. Esitämme menetelmän kehittämiseksi tämän toiminnallisen MR varjoainetta käyttäen kaupallisesti saatavilla SPIO, Molday ION Rhodamine-B karboksyyli (MIRB), joka on konjugoitu anti-PSMA-reseptorin vasta-ainetta J591. Olemme tunnettu ja validoitu tämä vasta-aine: SPIO-nanohiukkasten monimutkainen havaitsemiseen PSMA positiivisen eturauhassyövän kasvainsoluihin käyttämällä immunofluoresenssilla, virtaussytometrialla ja 3T kliininen MRI. Uusi varjoainetta voidaan käyttää erityisiä ja ei-invasiivisia tunnistus eturauhasen syöpäsolujen kanssa PSMA, merkki osallisena eturauhassyövän etenemisen ja etäpesäkkeiden [10] – [17], [30], [31].

Materiaalit ja menetelmät

Antibodies, MR varjoaineet ja reagenssit

Hiiren J591 mAb, pitoisuutena 5 mg /ml ja joilla tiedetään spesifisiä PSMA hankittiin Dr. Neil H Bander laboratoriossa (laboratorion Urologisessa Oncology, Weill-Cornell Medical College, New York, NY, USA) kautta institutionaalisten materiaalin siirtosopimuksen. Isotyyppikontrollia vasta-aineen synteesin ja soluviljelmäkokeita oli hiiren IgG1 (hiiren monoklonaalinen IgG1 Klooni # 11711; Cat #: MAB002, R puskuri vain (negatiivinen kontrolli) samalla tavalla digestoituun. Kaikki näytteet ajettiin Varian Vista Pro CCD samanaikaisesti ICP-OES väline (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA).

pyyhkäisyelektronimikroskopialla (SEM) ja energiaa hajottavaa röntgen (EDX) spektroskopia

Monimutkainen muJ591: MIRB immobilisoitiin Nucleopore kalvon (Cat #: 800280, Whatman, Florham Park, NJ, USA) ja kuumennettiin 57 ° C: ssa kuumaa ilmaa uunissa 25 min kosteuden poistamiseksi. Immoblized kompleksi sitten asennetaan ja ruiskutusker–päällystetty hiilellä. Pyyhkäisyelektronimikroskooppilla hankittiin 5000 ja 10000-kertainen suurennus käyttäen Hitachi Su-70 Schotty Field Emission SEM (Hitachi korkean teknologian America Inc, Dallas, TX, USA), jonka tarkkuus on 1,5 nm 1 kV. Samaa järjestelmää käytetään sekä energiaa hajottavaa röntgen (EDX) spektroskopialla 5000 × suurennus vahvistaa läsnäoloa orgaanisen aineen ja SPIO nanohiukkasia.

Hiukkasten koon analyysi

hiukkaskoko muJ591: MIRB konjugaatti määritettiin dynaamisella valon sironta. MuJ591: MIRB konjugaatti dispergoitiin 0,9% suolaliuoksessa proteiinipitoisuus 0,01% w /v. Mittaukset suoritettiin käyttäen Zetasizer Nano ZS väline (Malvern Instruments, Worcestershire, UK). Partikkelikoko Tulokset raportoidaan harmoninen intensiteetti keskimäärin hiukkasläpimitta (tai Z-keskiarvo) ja ne ilmaistaan ​​nanometreinä.

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) analyysi

onko muJ591 : MIRB konjugaatti syntyvät leimausreaktioissa säilytti super-paramagneettisen vaadittavista ominaisuuksista MR varjoainetta, mittasimme T2 relaksaatioaika NMR. Näytteet yhtä kokonaisproteiinipitoisuus (0,04 ug /ul) on muIgG: MIRB ja muJ591: MIRB kompleksit valmistettiin erikseen 600 ul: aan deuteriumoksidia ja siirrettiin Wilmad NMR putkiin (Cat #: Z272019, Sigma Aldrich, St. Louis, MO , USA). T2 rentoutumista kertaa saatiin optimoinnin jälkeen magneettikentän Innova Unity 500 NMR kone ja näytteet ajettiin kohti valmistajan suosituksen.

Fluorimetric analyysi

Voit testata, onko konjugointireaktioon aiheutti fluoresenssin parannus tai sammutuksen Rhodamiinilla B fluoroforilla MIRB konjugaatit teimme fluorimetrisella analyysi. MIRB nanohiukkasten ja muJ591: MIRB komplekseja näytteet yhtä suurella rauta pitoisuus analysoitiin fluoresenssin intensiteetti ja aallonpituus ruuhka intensiteetti (λ

max) käyttäen Synergy4 Fluorimetristä levylukijaa (BioTek, Winooski, VT, USA). Huippu λ

max ja λ

max shift määritettiin piirtämällä fluoresenssin voimakkuutta arvot eri heräte ja emissioaallonpituudet.

Soluviljely

PSMA-positiivisten LNCaP-soluja (CRL -1740) ja PSMA-negatiivinen DU145 solut (HTB-81) hankittiin American Type Cell Culture, Manassas, VA, USA. Kaikki solut kasvatettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa käyttäen RPMI-1640-alusta täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% antibiooteilla /antimykootteja. Soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin 75 cm

2 ilmauskansi, canted kaula falcon pulloihin (Cat #: 353136, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), jossa media täydennettiin joka kolmas päivä.

Vasta: MIRB kompleksin spesifisyyttä PSMA

solut ympättiin alkupitoisuutena 1000 (ja DU145) ja 2000-solujen (ja LNCaP) per kuoppa 96-kuoppalevyille ja kasvatettiin 3 päivää ennen suorittamista kokeista. Immunofluoresenssitutkimukset Sitten suoritettiin sekä LNCaP ja DU145-hoidon jälkeen 0,1 ug /ul muJ591: MIRB 1 h lisäyksen kanssa tai ilman sekundaarisen vasta-aineen konjugoituna AlexaFluor-488 fluorofori. Sitten soluja inkuboitiin lämpimällä 0,5% BSA: ta RPMI-elatusaineessa kannustaa solujen sisäistää vasta-aineeseen. Sitten solut visualisoitiin eri ajankohtina (15 min, 30 min, 1 h, 1,5 h, 2 h, 4 h, 6 h ja 12 h) mukaisesti standardin käänteinen fluoresenssimikroskoopilla (Axiovert 200, Carl Zeiss. Göttingen, Saksa ) on kiinnitetty suljetun piirin kamera (12-bittinen, Q-Imaging, Surrey, Kanada).

virtaussytometria-analyysi suoritettiin perustuu muunnelmaa menetelmästä, joka on kuvattu julkaisussa Peldschus K et al (2010) [ ,,,0],32]. Solut irrotettiin käyttäen trypsiiniä-EDTA: ta (Invitrogen, Carlsbad, CA), joka oli inaktivoitu läpi pesemällä 10% FBS: ää RPMI-1650. Sen jälkeen solut pestiin kahdesti käyttäen seerumitonta RPMI-1640, ennen kuin lisättiin 250 ui muIgG, muIgG: MIRB, muJ591, muJ591: MIRB (proteiinipitoisuus 0,05 ug /ul) ja sen jälkeen 1 tunnin inkubaation jäillä. Käsittelemättömien kontrollien inkuboitiin vastaavan määrän seerumittomassa elatusaineessa. Soluihin sitoutunut vasta-aine-konjugaatteja merkitty havaitseminen käyttäen Phycoerthyrin-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG: tä (Cat # 550589, BD Pharmingen). Virtaussytometria suoritettiin sitten käyttäen FACSCalibur laitteella (Becton Dickson, Franklin Lakes, NJ, USA). Fluoresenssimittaus annettiin niin geometriset keskiarvot ja mediaanit 10000 tapahtumien ja piirretään kaaviot. Kokeet tehtiin kolmena rinnakkaisena ja vertasimme signaalin voimakkuuden muutos välillä käsittelemättömiä soluja ja soluja käsiteltiin muIgG, muIgG: MIRB, muJ591 tai muJ591: MIRB.

Soluadheesio

Soluadheesio hoidon jälkeen levyjen kanssa muJ591 ja muJ591: MIRB arvioitiin. MuJ591: MIRB monimutkainen ja muJ591 mAb valmistettiin 1 x fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) pitoisuutena 0,01 ug /ml. Sitten esipäällystetty 96-kuoppaisille levyille 100 ul: muJ591: MIRB monimutkainen ja muJ591 mAb neljänä rinnakkaisena, ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa immobilisoimiseksi kompleksin levyn pinnalla. Yön yli inkuboinnin jälkeen, olemme imeä ulos liuoksesta ja estää kuopissa 1% BSA: ta 1 x PBS: ssä vähintään 10 minuutin ajan ja imettiin uudelleen. Non-käsitelty kuoppia käytettiin kontrollina. Noin 100000 LNCaP tai DU145-solut ympätään sitten esipinnoitettujen ja ohjaus kuoppiin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 40 minuuttia. Solut pestiin lopuksi seerumittomalla RPMI-1640, kunnes solut päällystämättömän kuoppiin pysäytetty irrottamalla. Kaikki solut kiinnitetään käyttäen jääkylmää metanolia ja värjättiin 0,1% kristalliviolettia. Suodatettu 2% SDS: ää lisättiin, ja levyjä inkuboitiin sekoittaen huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, minkä ajan jälkeen, absorbanssilukemia 550 nm: ssä tehtiin käyttämällä PowerWave XS levynlukijaa (BioTek, Winooski, VT, USA). Vertasimme absorbanssi lukemat muJ591- ja muJ591: MIRB levyillä suhteessa käsittelemättömään kontrolliin kuoppiin analysoida tarttumista.

Solujen proliferaatio ja apoptoosi

soluproliferaation arviointi, resatsuriinia -pohjainen fluorimetrinen määritys (Cat # AR002, R A, B ja T2 ovat sovitusparametreja [34]. Parametrinen kuvantaminen T2 relaksaatioaika saatiin kaikissa kuvissa vasta näytteitä ja vasta-käsiteltyjä soluja. Keskimääräinen T2 relaksaatioaika kullekin vasta-aineelle ja elävien solujen näyte saatiin T2 arvot jokaisen pikselin näissä muuttujien kuvia.

Tilastollinen

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Graphpad Prism-ohjelmiston ( GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA). Kaikki tiedot testattiin normaaliuden ja tasalaatuisuus varianssien käyttämällä Shapiro-Wilks testi ja Bartlettin testi vastaavasti ennen valitsemalla sopiva parametrinen tai ei-parametrinen tilastollinen testi. Tuloksena oleva p-arvo on alle 0,05 pidettiin merkittävänä. Parametrinen aineistoja analysoitiin Studentin t-testejä tai yksisuuntainen ANOVA, jota seurasi asianmukaista post hoc kuten Tukey HSD. Ei-parametrinen aineistoja analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista Kruskal Wallis ANOVA seuraa Nemenyi n jälkikäteen, ja Friedmanin testejä seuraa pareittain vertailun käyttäen Wilcoxonin testi Bonferronin säätö.

Tulokset

Vasta-: MIRB monimutkainen molekulaarinen

ICP-AES käytettiin arvioitaessa määrän alkuainerautaa, joka on läsnä konjugoidun muIgG: MIRB ja muJ591: MIRB komplekseja. Havaitsimme, että muJ591: MIRB kompleksit oli 1958 ± 611 (n = 8) alkuainerautaa vasta-ainetta kohti, kun taas muIgG: MIRB kompleksit oli 2906 ± 631 (n = 8) alkuainerautaa vasta-ainetta kohti. Rauta nanohiukkasten läsnäolo muJ591: MIRB kompleksi vahvistettiin lisäksi energiaa hajottavaa röntgenspektroskopia (kuvio 1). Läsnäolo raudan vahvisti myös nopea T2 relaksaatioaika saatiin NMR-analyysi 400 MHz, joka oli 12,9 ± 0,7 ms muJ591: MIRB monimutkainen ja 10,2 ± 0,6 varten muIgG: MIRB monimutkainen.

. Pyyhkäisyelektronimikroskooppikuva (SEM) immobilisoidun muJ591: MIRB kompleksit ja B. energiaa hajottavaa X-ray (EDX) kartoitus Fe, C, O ja N päällekkäin SEM. Läsnäolo MIRB nanohiukkasia voidaan havaita rauta signaalin (kiinteä nuoli) ja vasta-aineen, kuten orgaanisen aineksen signaalin (katkoviiva). Suuri valkoinen rakenteet ovat suoloja kuivattiin puskuriin.

läsnäolo muJ591: MIRB kompleksi immobilisoidaan suolakiteitä puskurista voidaan havaita, että päällekkäin EDX-SEM-kuvia (kuvio 1). EDX kartoitus osoitti, että läsnä hiilen, typen ja vedyn, jotka viittaavat orgaanisten komponenttien (vasta-aine) sekä raudan MIRB nanohiukkasten.

Keskimääräinen hiukkaskoko varten muJ591: MIRB konjugaatit olivat 34,75 ± 14,41 nm jossa polydispersiivisyysindeksi (PDI) arvo 0,23 ± 0,01. Vertailun vuoksi teimme partikkelikoko mittaukset MIRB nanohiukkasten yksin ja saadaan 34,64 ± 10,83 nm PDI 0,25 ± 0,02, jotka kuuluvat raportoitujen arvojen valmistajan (35 nm).

Vasta-: MIRB monimutkainen spesifisyys

Immunofluoresenssimikroskopia käytettiin sen määrittämiseksi, onko PSMA positiiviset LNCaP-solut spesifisesti havaita muJ591: MIRB monimutkainen. Kuvio 2 esittää 2 h hoidon jälkeen aika-piste sekä LNCaP ja DU145-soluja käsiteltiin muJ591: MIRB monimutkainen. AlexaFluor-488 värjäystä sallittua sijaintia vasta-aineen sisällä solukomponenttien ja solun alueilla PSMA-ilmentävien LNCaP-soluja (kuvio 2A). Rodamiini-B-fluorofori (punainen), joka on kiinnitetty MIRB on erityisesti havaittu PSMA-ilmentävien LNCaP-soluja (kuvio 2C). Ei punaista tai vihreää fluoresoivaa signaalia ei havaittu DU145 ohjaus solulinjassa (kuvio 2B ja 2D), mikä viittaa korkean spesifisyyden muJ591: MIRB kompleksin havaitsemiseksi PSMA-positiivisten syöpäsolujen.

Fluoresenssimikroskopia perustuva havaitseminen PSMA- positiivinen eturauhassyöpäsolulinja kanssa muJ591: MIRB monimutkainen: Toissijainen vasta-värjäystä konjugoituna AlexaFluor-488 osoittaa sitoutumista J591-vasta-ainetta (A) LNCaP ja että (B) DU145 ohjaus solut ole sitovia; ja (C) Rhodamiinilla B fluorofori havaittiin LNCaP (PSMA-positiivinen) eikä (D) DU145 soluja (PSMA-negatiivinen).

fluoresenssisammutuksen ja päästöjen lisälaite on raportoitu metalli-fluorofori konjugaatti järjestelmiä [35]. Olemme todenneet, että loisteputki sammutusta tapahtunut järjestelmässämme vertaamalla fluoresenssin intensiteetti ja huippu λ

max MIRB yksin ja muJ591: MIRB monimutkainen (kuva 3). Λ

max MIRB yksinään 575 nm, kun taas muJ591: MIRB monimutkainen, λ

max havaittiin kaksi erillistä piikkiä välillä 560-575 nm. Lisäksi fluoresenssivoimakkuudet huippuarvo λ

max-arvot olivat 40 ± 2% alhaisemmat muJ591: MIRB monimutkainen verrattuna MIRB yksin. Tämä vähennys huippuarvo muutos huippu λ

maksimiarvot Rhodamiinilla B fluoroforin viittaavat siihen, että konjugointi voi sammuttaa fluoresenssia kapasiteettia Rhodamine-B fluorofori kompleksille.

Effect vasta konjugaation suhteelliseen fluoresenssin voimakkuus Molday ION Rhodamiinilla B monimutkainen (n = 3).

spesifisyys ja omaksumista muJ591: MIRB verrattiin vahinkoa konjugoidun muJ591 ja hallita muIgG tutkittiin elävien eturauhassyöpään solulinjoja käyttämällä virtaussytometria. LNCaP-solut, joita käsiteltiin muJ591 tai muJ591: MIRB osoitti merkittävää fluoresenssi-intensiteetin muutos on FL-2 verrattuna käsittelemättömiin soluihin tai MIRB vain hoidon ja molemmat oli samanlainen muutos (kuvio 4A). Muutos on muJ591 ja muJ591: MIRB hoito LNCaP osoittavat, että on olemassa erityinen ja korkea otto-vasta-aineen ja vasta-aine-nanohiukkasten monimutkaisempi PSMA-positiivisten solujen ja että se ei muutu sen jälkeen, kun konjugaatio nanohiukkasten. Ei-spesifinen sitoutuminen, kuten testattu muIgG ja muIgG: MIRB ei havaittu (taulukko 1). Ohjaus DU145 soluja vailla PSMA ei osoittanut muutosta intensiteettiä mitään hoitoa (kuva 4B).

spesifisyys ja omaksumista muJ591: MIRB, muIgG: MIRB, muJ591 ja muIgG eturauhassyöpäsolujen. A. LNCaP esitteli muutos, joka osoitti otto muJ591 ja konjugaatin muJ591: MIRB eikä ottoa kontrollien muIgG vasta-aine tai muIgG: MIRB vasta-konjugaattia. B. Ohjaus DU145 solut eivät näytä ottoa.

Vasta: MIRB monimutkainen toiminnallisuus

määrittää mahdolliset antiproliferatiivisia, proapoptoottisten ja antituumorigeenistä vaikutukset muJ591: MIRB konjugoitu nanohiukkasia. Lautasille päällystetty sekä muJ591 ja muJ591: MIRB absorbanssi lukema oli alennettu tarttuvuutta LNCaP-soluissa kylvetään jälkeen pinnoite (kuvio 5A, p 0,01). Ei ollut eroa vaikutus välistä tarttuvuutta muJ591 vasta-aineen ja muJ591: MIRB kompleksi (p = 0,7). Pinnoite oli myös vaikutusta DU145-solujen tarttuvuuden, mutta se oli vähäisempää (kuvio 5B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että vaikutus muJ591 vasta-solun tarttuvuus pysyi vaikuta vasta leimauksen MIRB.

. Vähensi tarttuvuus LNCaP-soluja (Studentin t-testi, ** p 0,01, n = 4), havaittiin alennuksen absorbanssin aiheuttamaa sekä muJ591 mAb ja muJ591: MIRB pinnoite. B. Tarttuminen pienensi myös tämä pinnoite DU145 soluissa, mutta vaikutus ei ollut niin ilmeinen.

Resatsuriini-pohjainen fluorometrisen määritykset suoritetaan 2, 6, 12, ja 24 h jälkikäsittely määritti anti-proliferatiiviset vaikutukset muJ591: MIRB PSMA-positiivisia LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa. Aika-riippuva väheneminen solujen lisääntymisen ja LNCaP-solujen ja ei muutosta PSMA-negatiivinen DU145-soluja havaittiin (kuvio 6). Tämä viittaa siihen, että muJ591: MIRB oli erittäin spesifisiä rajoittamisessa soluproliferaatioon ja LNCaP.

Vaikutus soluproliferaatioon LNCaP ja DU145 eturauhassyövän soluissa muJ591: MIRB hoito eri ajankohtina saatu normalisoitua resatsuriini fluoresoiva yksikkö (RFU) arvo käsiteltyjä soluja käsittelemättömiin soluihin. LNCaP-solut osoittivat merkitsevästi vähemmän RFU kuin kontrollivehikkelillä käsiteltyjen LNCaP aloittaen 6 h ajan pisteen, kun taas mitään merkittäviä muutoksia ei havaittu muJ591: MIRB käsiteltyjen DU145 soluissa. Studentin t-testi, * p 0,05 pidetään merkittävinä, n = 4.

oli huomattavasti korkeampi anneksiini V-positiivisten solujen muJ591: MIRB käsiteltyjen LNCaP-soluja verrattuna kontrollin (kantaja tai muIgG : MIRB) käsiteltiin LNCaP-soluja. Kuvio 7 esittää prosentteina elävien ja kuolleiden LNCaP-soluissa arvioitiin anneksiini V virtaussytometrialla läsnä ollessa muJ591: MIRB ja valvonta hoidot;