Krooninen sairaus

tiivistelmä

epiteelikasvaimet munasarjasyöpäpotilailla (EOC) on aggressiivinen kasvain diagnosoidaan usein myöhäisessä vaiheessa, kun on vähän tai ei lainkaan mahdollisuuksia parannuskeinoa. Huolimatta edistysaskeleet kirurgisten ja kemoterapeuttisten strategioita, vain marginaalinen parannuksia potilaiden hoitotuloksiin on saatu. Näin ollen purkautumassa biologisten mekanismien taustalla EOC eteneminen on kriittinen parantaa potilaiden selviytymistä. Viime aikoina olemme raportoitu, että CD157 (ektoentsyymi säätelevät leukosyyttien läpi kulussa) ilmaistaan ​​EOC ja että korkea ekspressio molekyylin korreloi negatiivisesti sairauden lopputulokseen potilailla. Tässä osoitamme, että pakko yliekspressio CD157 in OVCAR-3, TOV-21G, A2780 ja OV-90 munasarjasyövän solulinjoissa edistää morfologisia ja fenotyyppisiä muutoksia ominaista häiriöiden välisissä liitoksissa, downregulation epiteelin markkereita ja säätelyä mesenkymaalisten niistä. Nämä muutokset solun muotoon ja fenotyypin tuoda vähentää herkkyys anoikis, lisääntynyt ankkurista riippumaton kasvu, soluliikkuvuus ja mesothelial hyökkäystä. Kääntäen, knockdovvn CD157 in OV-90 ja OC314 soluja siirtyy mesenkymaaliset fenotyyppi ja vähentää solujen muuttavien potentiaalia. Transcriptome profilointi analyysi korostettu 378 merkittävästi ilmentyvät eri geenit, jotka edustavat allekirjoitus CD157-yliekspressoivassa OVCAR-3 ja OV-90 soluihin. Modulointi valittujen geenien muuntuu muuttamiseen proteiinin ilmentymisen, jotka antavat solut erittäin pahanlaatuinen fenotyyppi. Kokonaiskuva päätellä analyysin moduloidun selostukset on, että korkea ilmentymä CD157 vahvistaa useita biologisia prosesseja suosimalla syövän etenemiseen (kuten kehitys- ja solun liikkuvuus), ja heikentää useat biologiset prosessit estävät kasvaimen etenemiseen (kuten apoptoosin, solukuolemaa ja reaktiota stressiin). Yhdessä nämä Pääteltiin CD157 etenemisen EOC metastaattinen sairaus, ja viittaavat siihen, että CD157 voi edustaa arvokasta terapeuttinen kohde.

Citation: Morone S, Lo-Buono N, Parrotta R, Giacomino A, Nacci G, Brusco A, et al. (2012) yli-ilmentyminen CD157 Auttaa epiteelikasvaimet munasarjasyöpä Progression edistämällä mesenkyymikasvaimia Differentiation. PLoS ONE 7 (8): e43649. doi: 10,1371 /journal.pone.0043649

Editor: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 23 heinäkuu 2012; Julkaistu: 20 elokuu 2012

Copyright: © Morone et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tukemana avustuksia Italian Association for Cancer Research (AIRC, MFAG6312 ja IG 11602 ja EO), Italian ministeriön yliopiston ja tieteellisen tutkimuksen (PRIN ja 60% Projects AF) ja kansainvälisen Foundation for Research in Experimental Medicine. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on aggressiivinen ja tappava gynekologinen maligniteetti. Yli 70% potilaista on pitkälle edennyt tauti ja huolimatta aggressiivinen hoito, 5-vuoden eloonjäämisaste sairastavien potilaiden EOC on alle 50%. Tämä huono ennuste johtuu vaikeudesta diagnoosin varhaisessa kliinisessä vaiheessa ja puute tehokas hoito myöhäisvaiheen kasvaimia. Ymmärtäminen biologiset mekanismit säätelevät etenemistä EOC on siis kriittinen suunnitella uusia hoitovaihtoehtoja ja parantaa potilaiden selviytymistä.

EOC ajatellaan syntyvän munasarjojen pintaepiteelissä että linjat munasarja. EOC solut voivat irtoa primaarikasvaimen ja, koska ei anatominen este on läsnä, levitä suoraan läpi vatsaonteloon ja sitten levittää pääasiassa kautta imunestejärjestelmän, kehittää tarvittavia puolustusmekanismeja hengissä alle kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa [1]. Kasvaimen ympäristö, paikallinen proteolyyttisen hajoamisen solunulkoisen matriisin (ECM) helpottaa siirtymistä kelluvat solut, joiden avulla ne voivat ankkuroitua Mesothelium ja sen jälkeen hyökätä sitä, luoda kasvaimia sekundaarisissa kohdissa. Kasvaimen levittäminen edellyttää fenotyyppinen muuntaminen epiteelisolujen, jotka eivät ole liikkuvia, osaksi mesenkyymisolujen. Tämä prosessi on merkittäviä yhtäläisyyksiä epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) esiintyvä alkionkehityksen aikana [2]. Todellakin, tyyppi 3 tai onkogeenisten EMT tunnustetaan yhä dynaaminen ja ohimenevä mekanismi, jolla solujen ensisijainen non-invasiivisen kasvaimet hankkia ominaisuudet olennaisia ​​muuttoliike, invaasio, metastaattisen levittäminen ja kestävyys apoptoosin [3]. EMT-ohjelma voi indusoida erilaisia ​​asiayhteyteen signaalien solut saattavat kokea kasvaimen mikroympäristössä; riippumatta liipaisinta signaalien aktivointi EMT liittyy huono kliinistä tulosta erilaisten kasvainten, mukaan lukien munasarjasyöpä [4]. Solunpintamolekyylien valvontaan osallistuvien prosessien kuten solu-solu, solu-ECM tarttuvuus, paikallinen vatsaonteloon muuttoliike ja hyökkäys vatsakalvon kelluvilla solujen tai solujen aggregaatteja (palloset) uskotaan olla johtavassa asemassa EOC etenemistä ja viime kädessä potilailla, lopputulosta.

CD157 /BST-1, joka on GPI-ankkuroitu perheen jäsen on NADase /ADP-ribosyyli cyclase, on ektoentsyymi joka katkaisee solunulkoinen nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi (NAD

+) , tuottaa syklinen ADP riboosia (cADPR) ja ADPR [5], [6]. Lisäksi CD157 määritellään toiminnalliset ja rakenteelliset vuorovaikutus muiden transmembraani- molekyylit siis hankkia kyky intrasellulaarista signaaleja [7] – [9]. Vaikka CD157 alunperin luonnehdittu strooman [10] ja myelooinen pintaglykoproteiinille [11] valvontaan osallistuvien solumigraation ja läpi kulussa [12], olemme hiljattain osoittaneet, että CD157 on myös ilmaistu 90% ensisijainen EOC ja että korkeat tasot CD157 liittyy kasvaimen nopeasta uusiutumisen potilailla, joilla EOC. Johdonmukaisesti näiden havaintojen esto CD157 aktiivisuuden, erityisellä monoklonaalinen vasta-aine (mAb)

in vitro

tai sen heikko ilmentyminen potilailla, liittyy alentunut kasvainsolun invaasiota ja muuttoliike. Yhdistys CD157 kanssa EOC aggressiivisuus on edelleen perusteltu havainto, että eksogeeninen ilmentymistä CD157 haja liikkuvia, CD157-negatiivinen EOC soluissa merkittävästi lisää solun liikkuvuus, edellytys kasvainsolujen invaasio ympäröiviin kudoksiin [13].

seuraus CD157 kasvaimen solun liikkuvuus ja invasiivisuus, ja sen yhteys huono tulos munasarjasyöpää sairastavilla potilailla, sai meidät tutkimaan tarkemmin sen biologista roolia EOC etenemisessä käyttäen muokattu munasarjasyövän solulinjoissa kuin kokeellisessa mallissa. Lopullisena tavoitteena oli ymmärtää, miten toiminnon CD157 voisi edistää aggressiivisempia munasarjasyövän ja onko CD157 voi olla avulias auttaessaan hoidettavista potilaista.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines ja reagenssit

ihmisen EOC solulinjat OVCAR-3 ja OV-90 ja ei-pahanlaatuinen keuhkopussin mesothelial solulinjassa Met-5A hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). EOC solulinjat TOV-21G ja A2780 toimittivat M. F. Di Renzo (University of Torino, Italia) ja OC314 saatiin S. Ferrini (Institute for Cancer Research and Treatment, Genova, Italia). Anti-CD157 mAb (SY /11B5, ystävällisesti F. Malavasi, University of Torino, Italia) tuotettiin kirjoittajien laboratorioissa ja affiniteettipuhdistetaan proteiini G (Sigma-Aldrich). Alexa-488 leimattua F (ab ’)

2 osa vuohen vasta-aineita hiiren IgG- tai kanin IgG olivat Molecular Probes (Milano, Italia). Anti-E-kadheriinin mAb oli peräisin BD Biosciences (Milano, Italia), anti-Snail, anti-Zeb1, anti-EpCAM, anti-VCAN, anti-BMP7, anti-tubuliinin, anti-β-kateniinin, anti-N- kadheriinin ja anti-β-aktiini-piparjuuriperoksidaasi (HRP) mAb olivat Santa Cruz Biotekniikka (Santa Cruz, CA), anti-Lamin B1 oli peräisin Abcam (Cambridge, UK). TRITC-leimattu phalloidin käyttää havaitsemaan F-aktiini oli Sigma-Aldrich. GM6001 (matriksimetalloproteaaseja estäjä) oli Enzo Life Science (Vinci Biochem, Vinci, Italia).

CD157 geenitransfektion ja ShRNA Lentivirusvektorikonstruktit Particle TRANSDUKTIO

Solut transfektoitiin eukarioottiekspressiovektoriin pcDNA3. 1, joka sisältää cDNA: n täyspitkän CD157 tai ei-insertti (mock), kuten on kuvattu [13]. Soluja kasvatettiin RPMI-1640 tai MCDB131 /M199 (tilavuus /tilavuus) viljelyväliaineessa (Sigma-Aldrich, Milano, Italia), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS, Biochrom Seromed, Milano, Italia). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO 2 ja testattiin

Mycoplasma

saastuminen.

CD157 ilmentyminen OV-90 ja OC314 solujen vaiennetaan lentiviraalinen toimituksen pLV-puro (Biosettia, San Diego, CA), joka koodaa lyhyen hiusneula-RNA (shRNA) kohdistaminen BST-1-mRNA: n (kohdesekvenssejä 5′-GAGTCAGACTGCTTGTATA-3 ’(shCD157) ja 5′-CCTGAGCGATGTTCTGTAT-3’ (shCD157 # 2), sekoitetun sekvenssin 5 ’ -TTCTCCGAACGTGTCACGTT-3 ’). Hiukkaset tuotetaan, kuten aiemmin on kuvattu [14]. Soluja inkuboitiin asianmukaisten lentiviruksen supernatantit ja Polybrene (8 ug /ml, Sigma-Aldrich). Transdusoidut solut koki valinnan 2 ug /ml puromycine (Santa Cruz Biotechnologies) 3 päivää.

(A) sqrt-PCR kohdunulkoisen CD157 ilmentymisen OVCAR-3-solut (ylhäällä). GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. Western blot-analyysi CD157 in OVCAR-3 /CD157 ja OVCAR-3 /mock soluja (alhaalla). Anti-β-aktiini mAb käytettiin latauskontrollina. (B-C) morfologia OVCAR-3 /mock ja OVCAR-3 /CD157 soluja. Edustavia pesäkkeet visualisoitiin jälkeen kristalliviolettia värjäyksen käyttämällä IX70 käänteismikroskooppi varustettu UC30 kameralla ja CellF analysointiohjelmisto (Olympus Biosystems) näkyvät. (B, asteikko bar: 200 uM, C, asteikko bar: 20 uM). (D) Konfokaalimikroskopia analyysi F-aktiini. Soluja kasvatettiin gelatiinilla päällystetyille peitinlaseille, kiinnitettiin 2% PFA, läpäiseviksi 0,2% Triton-X 100 ja värjättiin phalloidin-TRITC. Näytteet analysoitiin käyttäen Olympus FV300 laserkeilaukseen konfokaalimikroskoopilla. Solut kuvattiin käyttäen 60 × immersioöljyobjektiivilinssillä (1,4 NA). (Mitta-asteikko: 20 uM). Mikrovalokuvia B, C, ja D sitten toistettu mustavalkoisena. (E) OVCAR-3 soluja altistettiin solu-solu-adheesion määritys ja klustereita ( 5 solua) laskettiin 20 eri aloilla /malja. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM neljästä riippumattomasta kokeesta. ** P 0,01, kaksisuuntainen t-testi. (F) aggregaatit muodostetaan käyttämällä hanging drop-menetelmää ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa, jotka oli mekaanisesti hajotettu ja sitten valokuvattiin vaihekontrastimikroskoopilla (asteikko bar: 50 uM). (G) induktio anoikis in OVCAR-3 /CD157 ja OVCAR-3 /mock-solujen 72 tunnin kuluttua viljelyn poly-HEMA-päällystetyillä levyillä. Faasikontrastimikroskopiaan kuvat osoittavat muodostumista suuria kelluvia aggregaattien OVCAR3 /mock soluja ja pieniä aggregaatteja tai yksittäiseen soluja OVCAR3 /CD157 soluja (asteikko bar: 200 uM). (H) jälkeen 24, 48 ja 72 h kiinnittymisestä riippumattoman kasvun jälkeen solut kiinnitettiin, permeabilisoitiin, värjättiin propidiumjodidilla ja analysoitiin FACSCanto. Data-analyysi suoritettiin ModFit LT ™ solusyklin analyysi-ohjelmisto. Anoikis in OVCAR-3 /mock ja OVCAR-3 /CD157-soluja määritettiin mittaamalla prosenttia sub-G1-soluja. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05; ** P 0,01, kaksisuuntainen t-testi. (I) edustavia histogrammit solusyklin tilan mock ja CD157-positiivisia OVCAR-3 soluja 48 tunnin jälkeen kiinnittymisestä riippumatonta kasvua. (J) ankkurointi-riippumaton kasvu OVCAR-3 /CD157 ja mock-solut analysoitiin pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys. Kuvaaja keskimäärin muodostuneiden pesäkkeiden kolmesta itsenäisestä kokeesta ± SEM jälkeen 3 viikkoa inkuboinnin solujen pehmeässä agarissa. * P 0,05, kaksisuuntainen t-testi.

Western blot -analyysi

Yhteensä solulysaatit saatiin inkuboimalla RIPA lyysipuskuria (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl: a, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksikolaattia, 1 mM EDTA, 0,1% SDS: ää, jota oli täydennetty 1 mM Na

3Vo

4, 5 mM NaF, 50 ug /ml aprotiniini ja leupeptiiniä). Sytosolinen uutteet saatiin inkuboimalla soluja 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa hypotonista puskuriliuosta, joka sisälsi 20 mM Tris-HCI, pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl

2 ja 50 ug /ml Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich ). Suspensiota käsiteltiin 0,5% NP40-liuosta ja saatu homogenaatti sentrifugoitiin (3,000 rpm, 10 minuuttia 4 ° C: ssa). Tumauutteita valmistettiin inkuboimalla saatu pelletti edellä kuvatulla RIPA-lyysipuskuria 30 minuuttia. 30 minuutin kuluttua sentrifugoimalla nopeudella 14,000 rpm 4 ° C: ssa, proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Bradford-määritystä (Bio-Rad Laboratories). Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [13]. Lyhyesti, yhtä suuret määrät (30 ug) proteiinin uutteita soluista erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE) ei-pelkistävissä olosuhteissa ja elektro-siirrettiin polyvinylideenidifluoridimembraanille (PVDF), blokattiin sitten ja koetettiin osoitettu mAb. Inkuboinnin jälkeen sopivan HRP-konjugoitua vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnologies), immunoreaktiivisen vyöhykkeet havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla (Perkin Elmer, Monza, Italia). Kuvat otettiin kanssa ChemiDoc ™ XRS + System ja tiheysmittaus analyysi suoritettiin Image Lab ™ Software (Bio Rad, Milano, Italia).

Cell Colony Sironta määritys ja Soft Agar Colony Formation

Cells (500 /kuoppa) ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä ylläpidetään elatusaineessa, jota oli täydennetty 5% FCS: ää 14 päivän ajan, sitten pestiin, kiinnitettiin metanolilla 30 minuutin ajan, värjättiin kristallivioletilla (Sigma-Aldrich), ja visualisoitiin käyttämällä IX70 -käänteismikroskoopissa varustettu UC30 kameran ja CellF analyysin ohjelmistoa (Olympus Biosystems).

pehmeässä agarissa määrityksissä 6 x 10

2-solut sekoitettiin 0,45% agaria liuos RPMI, joka sisälsi 10% FCS: ää ja kerroksellinen päälle 0,9% emästä agarkerros 24-kuoppalevyillä. Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Sen jälkeen kun 2-3 viikkoa 37 ° C: ssa 5% CO

2-inkubaattorissa, pesäkkeet visualisoitiin käännettyä mikroskooppia ja laskettiin.

Cell-cell Adhesion ja Cell Aggregoitumismääritykset

solu-solu-adheesion kokeet suoritettiin, kuten on kuvattu [15]. Lyhyesti, yksisolususpensioita ympättiin 0,5% agaroosilla pinnoitettu viljelyastioihin (1 ml /kuoppa, 30 minuutin ajan 37 ° C), estää solun tarttumista, ja hitaasti ravisteltiin 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa.

soluaggregaatioon analyysit suoritettiin käyttämällä hanging drop-menetelmää, kuten on kuvattu [16]. Lyhyesti, soluja (5 x 10

3/25 ui RPMI 1640 -alustaa, jossa oli 5% FCS) ympättiin sisäpinnalle kannen petrimaljaan. Haihtumisen estämiseksi, 10 ml fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) laitettiin astiaan. Sen jälkeen kun oli inkuboitu yli yön 37 ° C: ssa, solu-aggregaatit mekaanisesti dispergoitiin ja valokuvattiin käyttäen faasikontrastimikroskoopissa.

Anoikis Pitoisuus

Solut (5 x 10

5 /kuoppa) viljeltiin 20 mg /ml poly-HEMA (polyhydroxyethylmethacrylate, Sigma-Aldrich) hoidetun 6-kuoppaisille levyille 24-72 tuntia. Sitten solujen aggregaatit dispergoitiin ja solut kiinnitettiin jääkylmällä 75% etanolia (tilavuus /tilavuus) yli yön 4 ° C: ssa. Soluja käsiteltiin 100 ug /ml RNaasi A: ta (Sigma-Aldrich, 30 minuuttia 37 ° C: ssa), värjättiin 10 ug /ml propidiumjodidilla (10 minuuttia 4 ° C: ssa) ja näytteitä analysoitiin FACSCanto (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Tietojen analysointi suoritettiin käyttämällä ModFit LT ™ solusyklin analyysi ohjelmisto (Verity Software House, Topsham, ME). Anoikis määritettiin mittaamalla prosenttia sub-G1-soluja.

Immunofluoresenssivärjäys ja konfokaalimikroskopialla

konfokaalimikroskopialla kokeissa soluja kasvatettiin alakonfluenssista gelatiinipäällystetyille peitinlaseilla, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (PFA) ja 30 minuutin ajan 20 ° C: ssa, pestiin ja läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa 1% normaalia vuohen seerumia ja 1% BSA: ta 15 minuutin ajan 20 ° C: ssa. Soluja inkuboitiin ilmoitetuilla primaaristen vasta-aineiden ja sen jälkeen Alexa Fluor-488-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita. Näytteet analysoitiin Olympus FV300 laserkeilauksen -konfokaalimikroskoopilla varustettu Blue Argon (488 nm) laser, vihreä Helium Neon (543 nm) laser, ja FluoView 300 ohjelmisto (Olympus Biosystems, Hampuri, Saksa). Solut kuvattiin käyttäen 60 × immersioöljyobjektiivilinssillä (1,4 NA) ja 10 × silmän linssi. Nomarski kuvat saatiin ero häiriöitä kontrasti (DIC) optiset komponentit asennetulle IX71 käännettyä mikroskooppia. Semikvantitatiivinen analyysi E-kadheriinin junktionaalinen värjäys suoritettiin laskemalla vähintään 10 kenttää näytettä kohti (vähintään 200 solua yhteensä) ja pisteytys niin positiivinen solujen määrä kahden jäljellä loisteputki solu-solu rajoilla.

RNA uuttaminen ja käänteistransskriptaasi-PCR

Kokonais-RNA (2 ug) uutetaan 70-80% konfluentteja viljelmiä käyttäen TRIZOL® reagenssia (Invitrogen, S. Giuliano Milanese, Italia) käänteiskopiointiin kanssa M-MLV Reverse transkriptaasia (Invitrogen) ja oligo-dT-alukkeita. cDNA monistettiin käyttäen KAPA2G Fast HotStart DNA Polymerase (Kapa Biosystems, Cambridge, MA). Kukin sykli koostui denaturoinnista 94 ° C: ssa 10 sekuntia, pariutuminen 10 sekunnin ajan ja laajentamisesta 72 ° C: ssa 1 sekunnin ajan. In puolikvantitatiivinen analyysi (SQRT-PCR), sopiva määrä syklin pysyen eksponentiaalisen vaiheen määritettiin kullekin alustalle. Käytetyt alukkeet on esitetty taulukossa S1. PCR-tuotteet analysoitiin sitten agaroosigeelielektroforeesilla.

SYBR Green Reaaliaikainen RT-PCR: llä (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen RNeasy mini -kittiä (Qiagen, Milano, Italia ) mukaan valmistajan ohjeita. qRT-PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green JumpStart Taq READYMIX (Sigma-Aldrich), ja ABI 7500 Fast Sequence Detection System (Applied-Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR-syklien olosuhteet suoritettiin kaikille näytteille, seuraavasti: 95 ° C: ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä 95 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja 60 ° C: ssa 1 minuutti. Käytetyt alukkeet on lueteltu taulukossa S2. PCR-reaktiot kullekin mallin tehtiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppaisilla levyillä. Vertailevan CT-menetelmää (Applied Biosystems) käytettiin määrittämään geenin ilmentymisen CD157-transfektoiduissa suhteessa arvon havaittiin vastaavan ohjaus-solut, käyttämällä TBP normalisoitumisena ohjaus.

(A) Konfokaalimikroskopia analyysi E- kadheriinin ja (B) β-kateniinin ilmentymistä OVCAR-3 /CD157 ja mock soluja. Soluja kasvatettiin gelatiinilla päällystetyille peitelasi, kiinteä, permeabilisoitiin ja värjättiin anti-E-kadheriinin ja anti-β-kateniinin vasta seurasi sekundaarisen Alexa Fluor-488-leimattua vasta-ainetta. Näytteet analysoitiin Olympus FV300 laserkeilauksen -konfokaalimikroskoopilla ja Nomarski ero häiriöitä kontrasti (DIC) optiikka. E-kadheriinin, joka on fluoresenssikuvan fuusioitui DIC kuva näkyy (asteikko bar: 50 uM). Semikvantitatiivinen analyysi E-kadheriinin junktionaalinen värjäys määritettiin laskemalla vähintään 10 kenttää /näyte (vähintään 200 solua yhteensä) ja pisteytys niin positiivisten solujen kanssa kahden jäljellä loisteputki solujen väliset rajat. Sillä β-kateniinin, fluoresoiva kuva näytetään. Upotus: monistettu yksittäistä ihmistä OVCAR-3 /CD157 solu näytteille hajanainen β-kateniinin värjäys suunnitelmassa keskittyä leikkaamalla tumaan. Tähdellä vastaavat nucleoli. (C) Western blotting E-kadheriinin ja β-kateniinin OVCAR-3 /CD157 ja mock soluja. Densitometrian määrällisesti ilmentymisen taso E-kadheriinin ja β-kateniinin suhteessa P-aktiini. (D) β-kateniinin tasoja ydin- ja sytoplasman murto OVCAR-3 /mock ja OVCAR-3 /CD157-soluja määritettiin western blot-analyysi. α-tubuliinin ja lamiinivektori B1 (LamB1) käytettiin soluliman ja ydin- lastaus valvonta, vastaavasti. Densitometrian määrällisesti ekspressiotaso β-kateniinin suhteessa asianmukaista valvontaa. (E) sqrt-PCR E-kadheriinin, N-kadheriinin, β-kateniinin ja E-kadheriinin transkriptiorepresso- in OVCAR-3 /CD157 ja mock soluja. Densitometrian määrällisesti ekspressiotasoja E-kadheriinin repressors suhteessa GADPH. (F) qRT-PCR Zeb1, etana ja Twist1. Vertailevaa CT-menetelmää käytettiin määrittämään geenin ilmentymisen CD157-transfektoiduissa soluissa suhteessa arvon havaittiin mock-soluissa, käyttäen TBP normalisoitumisena ohjaus. Histogrammit ilmoittaa keskiarvoja ± SEM kolmesta qRT-PCR itsenäisestä kokeesta, kussakin suoritettiin kolmena kappaleena. * P 0,05, *** P 0,001;

ns

, ei merkittävää; kaksisuuntainen t-testi. (G) Western blot-analyysi osoittaa tasolla Snail ja Zeb1 in OVCAR-3 /mock ja OVCAR-3 /CD157 soluja. Densitometrian määrällisesti ekspressiotaso molempien proteiinien suhteessa P-aktiini. Tulokset on esitetty kunkin paneelin edustavat kolmen erillisen kokeen tulokset olivat samanlaiset.

Haavan paranemista määritys

Solut ympättiin kuuden kuopan levyille konfluenssiin ja tyhjästä tehtiin sitten koko yksikerroksista, kuten aiemmin on kuvattu [13]. Kuvia haavoittuneet alueen kirjattiin aikoina ilmoitettu. Kukin koe suoritettiin neljänä rinnakkaisena ja toistettiin ainakin kolme kertaa.

Transmesothelial Migration määritykset ja konfokaalimikroskopialla analyysi

Met-5A-solut (2 x 10

5) leimattiin käyttäen CellBrite ™ Red solukalvon Värjäys mukainen pakkaus valmistajan ohjeiden (Biotium Inc. Hayward, CA), sitten ympättiin fibronektiinillä päällystetyn (10 ug /ml), peitelasit ja annettiin kasvaa konfluenssiin. Munasarjasyöpäsoluja (1,5 x 10

5) värjättiin 5 uM CFSE (karboksifluoreskeiini sukkinimidyyliesteri, Molecular Probes) ja ympättiin Met-5A yksikerroksista 6 h (OVCAR-3-solut) tai 2,5 tuntia (OV-90 -solut) 37 ° C: ssa. Tarttumattomat kasvaimen solut poistettiin varovasti näyte kiinnitettiin 2% PFA ja analysoidaan sitten käyttäen Olympus FV300 laserkeilaukseen konfokaalimikroskoopilla. Solut kuvattiin käyttäen 60 x immersioöljyobjektiivilinssillä (1,4 NA) peräkkäin skannausta XY-tasossa tallennettu pitkin Z-akselia (askelkoko: 1,25 um). Solut laskettiin päällä, mediaani ja alhaalta vaiheessa ja suhde solujen pohjalle vaiheessa yhteensä soluihin edustaa solujen prosenttiosuus, jotka kulkeutuivat läpi yksikerroksista [17]. Milloin on osoitettu, soluja käsiteltiin 1 tunnin ajan GM6001 (25 ug /ml), ennen kuin ymppäämällä päälle Met-5A mesothelial yksisolukerrokselle.

Gelatiini ja kaseiini Zymografia Analyysit

OVCAR-3 ja OV -90-transfektoidut solut ympättiin 48-kuoppalevyille ja kasvatettiin 80% konfluenssiin, sitten niitä inkuboitiin vielä 48 h FCS-väliaineessa. Matriksin metalloproteinaasien (MMP) MMP2 ja MMP9 aktiivisuus elatusaine analysoitiin 10% SDS-PAGE, joka sisälsi 1 mg /ml gelatiinia (gelatiinitsymografialla) [18], ja MMP7 aktiivisuus visualisoitiin käyttämällä 12% SDS-PAGE, joka sisälsi 1 mg /ml kaseiini (kaseiinitsymografialla) [19]. Geelit värjättiin Coomassie brilliant blue G-250 visualisoida proteaasiaktiivisuutta. Kuvat otettiin kanssa ChemiDoc ™ XRS + System ja tiheysmittaus analyysi suoritettiin käyttäen Image Lab ™ Software.

Sferoidiviljelmiä pilkkominen Pitoisuus

Pallot kertyi kanssa roikkuu pudottamalla ja niiden erittelemään fibronektiinilla päällystetty levyt (10 ug /ml) mitattiin sen jälkeen, kun 12 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa, kuten muualla on kuvattu [13]. Lyhyesti, 96-kuoppaisia ​​levyjä päällystettiin 10 ug /ml fibronektiiniä ja blokattiin BSA: ta (1 mg /ml) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Sferoideja (8-10 palloset /kuoppa) ympättiin seerumivapaassa RPMI-1640-väliaine. Voit seurata yksittäisiä palloset ajan, kukin kuoppa oli valokuvattu 30 minuutin kuluttua kylvö (aika 0) ja sen jälkeen 12 h. Pikselin alue palloset mitattiin hetkellä 0 ja 12 tuntia, ja kertainen muutos alueella laskettiin suhde pikselin alue palloset 12 tuntia ja hetkellä 0.

Microarray Hybridisaatio, Tiedonkeruu ja analyysi

Yhteensä RNA eristettiin kahtena 70-80% konfluentteja ohjaus solulinjoja (OVCAR-3 /mock ja OV-90 /mock) ja testaus solulinjoja (OVCAR-3 /CD157 ja OV- 90 /CD157), microarray -koetinvalmisteen, hybridisaatio, skannaus ja kuva-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Kaksi rinnakkaista, jossa väriaine swap, tehtiin jokaisesta näytteestä. Raakadataa laatiminen toteutettiin Bioconductor [21], käyttäen R tilastokieltä [22] käyttämällä leikkauksen P-arvo oikaistuna useita testausta Benjamini-Hochberg lähestymistapaa ( 0,01), jota seurasi suodatusta ekspressiotason (logFC 1 tai -1 ainakin yhdessä solulinjassa ilman selostukset kanssa vastakkaista merkkiä). Tämä kriteeri sallittu tunnistamisen selostukset kanssa yhtäpitävät modulaatio ja otti huomioon sisäisten biologisten erot erillisten solulinjojen, jotka saattavat heijastua amplitudi kertaiseksi muutoksia.

Gene ontologia, kanoninen koulutusjakson, ja toiminnallinen verkko analyysit tehtiin käyttäen sekä DAVID tietopankista [23] ja MetaCore ohjelmiston GeneGo Inc., levittämällä leikkauksen rikastamiseen P-arvot ( 0,05). Geenien ilmentyminen aineistoja on talletettu osaksi Gene Expression Omnibus (GEO) tietokanta, ID: GSE36364.

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=flktjkcsuyygcrm acc=GSE36364).

Statistical Methods and Data Analysis

Ellei toisin mainita, arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM. Vertailut kahden ryhmän välillä suoritettiin käyttäen paritonta kaksipuolista Studentin

t

testin normaalin jaetaan muuttujia. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS Statistics 17 ohjelmisto (Chicago, IL) ja GraphPad Prism 5 ohjelmisto (San Diego, CA). Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia. Kaikissa analyyseissä, erot katsottiin merkitsevä P 0,05 (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001

verrattuna

ohjaus) ja

ns

varten ole merkittäviä .

(A) sqrt-PCR (vasemmalla) ja western blot-analyysi (oikealla) CD157 in OV-90 /CD157 ja OV-90 /mock soluja. GAPDH ja β-aktiini käytettiin sisäisen valvonnan, vastaavasti. (B) morfologiset pesäkkeiden muodostaman OV-90 /mock ja OV-90 /CD157 soluja. Edustavia pesäkkeet visualisoitiin jälkeen kristalliviolettia värjäyksen näkyvät. Mitta-asteikko: 200 uM. (C) sqrt-PCR-analyysi E-kadheriinin ja N-kadheriinin in OV-90 /mock ja OV-90 /CD157-soluja. Densitometrian määrällisesti mRNA ekspression osoitti molekyylien suhteessa GAPDH. (D) vaikutus CD157 ilmentymisen vaikutus anoikis. Sen jälkeen 48, 72. 96 ja 192 h kiinnittymisestä riippumattoman kasvun jälkeen solut kiinnitettiin, värjättiin propidiumjodidilla ja analysoitiin FACSCanto. Anoikis in OV-90 /mock ja OV-90 /CD157-soluja määritettiin mittaamalla prosenttia sub-G1-soluja. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05; ** P 0,01, kaksisuuntainen t-testi. (E) ankkurointi-riippumaton kasvu OV-90 /CD157 ja mock-solut analysoitiin pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys. Kuvaaja keskimäärin muodostuneiden pesäkkeiden kolmesta itsenäisestä kokeesta ± SEM jälkeen 3 viikkoa inkuboinnin solujen pehmeässä agarissa. *** P 0,001, kaksisuuntainen t-testi. (F) vaikutus CD157 ilmentymisen soluvaelluksen naarmuuntumista haavan määritystä OV-90 /CD157 ja mock soluja. Soluja kasvatettiin yksittäiskerroksina, haavoittuneita, ja valokuvattu hetkellä 0 ja 24 tunnin kuluttua. Haavan reunat on merkitty mustalla katkoviivalla (asteikko bar: 200 uM). (G) kyky solujen sulkea haava laskettiin mittaamalla 20 satunnaisesti valittua etäisyydet pitkin haavan reunalla hetkellä 0 ja 24 tuntia. Tulokset edustavat prosentuaalinen vähennys keskimääräisen haavan leveyden ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05; kaksisuuntainen t-testi.

(A) sqrt-PCR (vasemmalla) ja western blot -analyysi (oikealla) osoittaa, OV-90-solut transdusoitiin retroviraalisesti kanssa shRNA, joka kohdistuu ihmisen CD157 mRNA, mikä tehokas knockdovvn CD157 ilmaisua. GAPDH ja β-aktiini käytettiin sisäisen valvonnan, vastaavasti. (B) morfologiset pesäkkeiden muodostaman OV-90 /scramble ja OV-90 /shCD157 soluja. Edustavia pesäkkeet visualisoitiin jälkeen kristalliviolettia värjäyksen näkyvät. Mitta-asteikko: 200 uM. (C) sqrt-PCR E-kadheriinin, N-kadheriinin ja Snail, Twist1 ja Slug transkriptiorepresso- in OV-90 /scramble ja OV-90 /shCD157 soluja. Densitometrian määrällisesti mRNA ekspression osoitti molekyylien suhteessa GAPDH. (D) Anoikis määrityksessä. Ajassa 48, 72, 96 ja 192 tunnin ajan ankkurista riippumattomaan kasvuun, solut kiinnitettiin, värjättiin propidiumjodidilla ja analysoitiin FACSCanto. Data-analyysi suoritettiin ModFit LT ™ solusyklin analyysi-ohjelmisto. Anoikis in OV-90 /sekoituskoodin ja OV-90 /shCD157 soluissa määritettiin mittaamalla prosenttia sub-G1-soluja. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05; ** P 0,01, kaksisuuntainen t-testi. (E) ankkurointi-riippumaton kasvu OV-90 /sekoituskoodin ja OV-90 /shCD157 solut analysoitiin pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys. Kaavio edustaa keskimäärin pesäkkeiden /kenttä muodostuu kolmesta itsenäisestä kokeesta ± SEM 3 viikon inkuboinnin solujen pehmeässä agarissa. * P 0,05, kaksisuuntainen t-testi. (F) vaikutus CD157 Knockdown on OV-90 soluvaelluksen scratch-haavan määrityksessä. Soluja kasvatettiin yksittäiskerroksina, haavoittuneita, ja valokuvattu hetkellä 0 ja 24 h (asteikko bar: 200 uM). Haavan reunat on merkitty mustalla katkoviivalla. (G) kyky OV-90 /scramble ja OV-90 /shCD157 solujen sulkea haava laskettiin mittaamalla 20 satunnaisesti valitun matkoja pitkin haavan reunalla hetkellä 0 ja 24 tuntia. Tulokset edustavat prosentuaalinen vähennys keskimääräisen haavan leveyden ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. ** P 0,01, kaksisuuntainen t-testi.

Tulokset

CD157 Expression Moduloi munasarjasyöpäsoluja Morfologia ja Cell-solujen vuorovaikutus

Valitsimme OVCAR- 3 munasarjasyöpäsoluja sopivimmaksi malli tutkittaessa aiheuttamia vaikutuksia CD157 ilmaisu, koska niillä on epiteelin fenotyyppi [24], ovat huonosti invasiivisia, tuskin motile muovin ja tuskin kiinnittymisestä riippumaton [25]. Tutkia biologisen merkityksen CD157 munasarjasyövän etenemiseen, me transfektoitiin stabiilisti täyspitkä CD157 in CD157-negatiivinen OVCAR-3-soluihin (kuvio 1A). Valomikroskoopilla kuvia paljasti, että mock solut kasvoivat niin tiukasti kytketty klustereita koostuu soluista tyypillisiä mukulakivikadut kaltaisia ​​epiteelin morfologia. Sen sijaan, OVCAR-3 /CD157 soluja näytteillä enemmän hajallaan jakelu ja pitkänomainen muoto, ominaispiirre fibroblastien kaltaisten solujen, ja muodostivat huonosti organisoitu liitoskohdat vierekkäisten solujen (kuvio 1 B, C).