Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä on yksi kauhistuttava syöpiä pessimistinen ennuste. Huolimatta monista hoitoja, ei ole parantamisen eloonjäämisaste. Tässä tutkimuksessa arvioimme syöpälääkkeen vaikutuksia kaempferol, tunnettu flavonoidi, jossa on funktionaalisia bio-aktiivisuutta eri pahanlaatuisia kasvaimia. Kaempferol oli syövän vaikutuksia MiaPaca-2, Panc-1, ja SNU-213 ihmisen haimasyövän soluja. Annoksesta riippuvalla tavalla, kaempferol vähentynyt elinkelpoisuus näiden haimasyöpäsoluissa lisäämällä apoptoosin. Erityisesti kaempferol tehokkaasti esti muuttavien aktiivisuutta ihmisen haimasyövän soluja varsin alhaisilla annoksilla ilman myrkyllisyyttä. Syövän vastaisen vaikutuksen kaempferol välitti EGFR liittyvän Src, ERK1 /2, ja AKT polkuja. Nämä tulokset yhdessä viittaavat siihen, että kaempferol, eli phytochemical ainesosa raportoitu olevan anti-elinkelpoisuus ja antioksidantti ominaisuuksia, voi toimia turvallisuuden kulkeutumista estävällä reagenssilla ihmisen haimasyövän soluja, jotka tarjoavat perusteet lisätutkimuksia kaempferol kuin vahva ehdokas sillä mahdollinen kliininen tutkimus pahanlaatuisen haimasyövis-.

Citation: Lee J, Kim JH (2016) kaempferol Estää haimasyöpä Cell Growth ja Migration kautta Blockade EGFR-sivujen Pathway

In vitro

. PLoS ONE 11 (5): e0155264. doi: 10,1371 /journal.pone.0155264

Editor: Aldo Scarpa, University of Verona, Italia

vastaanotettu: 03 helmikuu 2016; Hyväksytty: 26 huhtikuu 2016; Julkaistu: 13. toukokuuta, 2016

Copyright: © 2016 Lee, Kim. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama opetusministeriön (2009-0094059).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on tappava tauti. 5 vuoden eloonjäämisaste potilaiden haimasyöpä on alle 1% [1]. Yksi tärkeimmistä ominaisuuksista haimasyövän on varhainen leviämistä ja etenemistä paikallisia kasvaimia. Nämä ominaisuudet aiheuttavat vakavia komplikaatioita potilailla, joilla on haimasyöpä. Siksi useimmat potilaat ovat ennenaikaisen kuoleman [2]. Metastaattista taipumus tuumorisolujen on merkittävä este hoidossa haimasyöpä. Kuitenkin tutkijat eivät ole valaista miten pahanlaatuisia haimasyöpäsoluissa siirtyä ensisijainen kasvainpaikkaa kaukaiseen elin [3]. Kun lisäksi on nykyisin saatavissa syöpälääkkeet ja sädehoitoa on merkityksetön vaikutus useimmilla potilailla, joilla haimasyöpä. Siksi laajoja tutkimuksia on suoritettu tutkimaan molekyylitason mekanismeja vastuussa näistä ominaisuuksista ja kehittää uusia strategioita parantaa hoitotuloksia potilaiden haimasyöpä.

Flavonoidit ovat polyphenolic yhdisteitä, jotka runsaasti löytyy eri kasvien [4 ]. Ne tarjoavat useita terveyshyötyjä johtuen niiden antioksidantti ja anti-tulehdus toimintaa. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että flavonoidit estävät eri vaiheissa syöpä, kuten leviämisen ja angiogeneesiin [5]. Erityisesti kaempferol, tunnettu flavonoidi, on merkittävä biologinen vaikutus erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia. Kaempferol on runsaasti löytyy teetä, omenat, mansikat, pavut, ja sitrushedelmien [6]. Kaempferol säätelee eri ominaisuuksia syöpäsolujen, kuten apoptoosin [7-9], solusyklin [10,11], ja tulehdus [12,13]. Lisäksi kaempferol myös estää migraation ja invaasion aktiivisuus medulloblastoma ja rintasyövän soluja [14,15]. Mutta sen ”anti-muuttavien vaikutus haiman syöpäsoluja ei tunneta.

kasvutekijän reseptorin (EGFR) on reseptori tyrosiinikinaasin, joka on erityisen aktivoituu vuorovaikutuksessa välillä EGFR ja kasvutekijöitä EGF-perheen. Useat mekanismit johtavat epänormaali aktivoituminen EGFR havaittu eri syövissä,

i

.

e

., EGFR yli-ilmentyminen, mutaatio, ja ligandi-reseptori riippumaton stimulaation. EGFR on edustava reseptori taustalla eri kasvain fenotyyppejä, kuten leviämisen, anti-apoptoottiset etu, muuttoliike, ja hyökkäyksen pahanlaatuiset kasvaimet mukaan lukien haimasyöpä [16-19]. Voimistunut EGFR löytyy myös haimasyövän kasvaimia, jotka korreloivat synkkä ennuste [20].

Tässä tutkimuksessa selvitimme luonne kaempferol n syöpälääkkeen vaikutus ihmisen haimasyövän solulinjoissa kautta saarron EGFR-liittyvä solunsisäinen signalointi. Tuloksemme osoittavat, että kaempferol voi olla turvallinen estäjä vastaan ​​pahanlaatuinen haimasyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

MiaPaca-2, Panc-1, ja SNU -213 ihmisen haimasyövän solulinjoissa saatiin Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea). Soluja kasvatettiin joko DMEM (MiaPaca-2 ja Panc-1) tai RPMI-1640 (SNU-213), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA), 1 x 10

5 yksikköä /l penisilliiniä, and100 mg /l streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 37 ° C: ssa. Soluviljelmää inkuboitiin kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2, kuten aikaisemmin on kuvattu [21]

. Ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA, USA). HUVEC kasvatettiin EGM-2 Bulletkit väliaineessa (Lonza Biologics, Hopkinton, MA) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO2. Kaikki kokeet suoritettiin käyttäen HUVEC 3-6 kohtia. EGFR-estäjä (Gefitinibi) ja yleiseurooppalaisen kaspaasiestäjä (Z-VAD-FMK): nämä inhibiittorit ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Vasta-aineet ja fosfo-EGFR (Tyr1068), EGFR, fosfo-Src (Tyr416), Src, fosfo-AKT (Ser473), AKT, fosfori-ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK) 1/2 (Thr202 /Tyr204), ERK , proliferoivan solun tuma-antigeeni (PCNA) ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) saatiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Kampferol, kampferol-3-O-glukosidi, ja kampferol-4′-O-glukosidi (kuvio 1) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

mittaus solujen elinkelpoisuuden

solujen elinkyky määritettiin käyttämällä WST-1-liuos: 2- (4-jodifenyyli) -3- (4-nitrofenyyli) -5- (2,4-disulfofenyyli) -2H-tetratsolium-liuosta ( Boehringer Mannheim, Mannheim, Saksa). Tässä määrityksessä MiaPaca-2, Panc-1, ja SNU-213-soluja (5 x 10

3 /kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevyille (Nunc, Roskilde, Tanska). Soluja pidettiin elatusaineessa 24 tuntia. Tänä aikana, niitä käsiteltiin eri annoksilla kaempferol. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä 72 tuntia. Kymmenen mikrolitraa WST-1-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Sen jälkeen, kun 10-min inkuboinnin jälkeen huoneenlämpötilassa, absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

Migration määrityksessä

solumigraation määrityksiä suoritettiin käyttäen Transwell läpäisevä tukee (Corning Costar, Lowell, MA), jonka huokoskoko oli 8,0 um. Polykarbonaatti suodattimet esipäällystetty fibronektiinin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) käyttäen alustaa, joka sisälsi 10 mg /l fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta; pre-pinnoite prosessi suoritettiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Alempi kammio täytettiin 500 ui RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% seerumia. Sen jälkeen altistamalla solut 15 h nälkään seerumivapaassa RPMI-1640-alustassa, me keskeytetty solut (5 x 10

4 solua /kuoppa) 100 ui seerumia ja ladataan jokaiseen ylempään kammioon. Sen jälkeen, nämä solut edellä mainitussa väliaineessa 6 tunnin ajan 37 ° C: ssa, poistimme solut yläpinnan suodattimen pumpulipuikolla. Sitten me kiinnitetään ja värjätään suodattimien avulla 1% kristalliviolettiliuoksella. Eluoitu väriaine mitattiin 560 nm: ssä ELISA-lukijalla (Bio-Rad).

Invasion määrityksessä

Invasion analyysit suoritettiin käyttäen kasvutekijä vähentää matrigeeliin (BD Biosciences, San Diego, CA , USA) päällystettiin 24-TranswellTM levyt mukaan toimittajan protokollan. Solut levitetään ylemmän kammion, joka sisältää RPMI ilman seerumia 20 tunnin ajan, ja solut, jotka olivat vaeltaneet takapuolelle suodattimen 24 tunnin jälkeen solut värjättiin. Eluoitu väriaine mitattiin 560 nm: ssä ELISA-lukijalla.

kaempferol kohdistinvalinta

Valittaessa tavoitteet kaempferol, käytimme perinteisen kiinalaisen lääketieteen järjestelmien farmakologian tietokanta ja analyysi alustan (TCMSP) kuten aiemmin on kuvattu [22].

Western blot-analyysi

arvioimiseksi phosphoylation prosessin eri molekyylejä, Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu [23]. Tässä menetelmässä, käsittelimme viljeltiin MiaPaca-2 ja Panc-1-solujen kaempferol varten osoitetun kiinteän määrän kertoja. Sen jälkeen, pesimme nämä solut ennalta jäähdytetty fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS). Kokonaisten solujen lysaatit, solut hajotettiin M-PER lyysipuskuria (Thermo Scientific, Bonn, Saksa), joka sisälsi proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit. Kokonaismäärä proteiinin määritettiin BCA määrällisesti menetelmällä (Bio-Rad). Solulysaatit erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, UK). Nämä membraanit blokattiin käyttämällä 5% naudan seerumin albumiinia ja 2% Tween Tris puskuroidussa suolaliuoksessa. Olemme laimennettu vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä fosfo-EGFR (Tyr1068), EGFR, fosfo-Src (Tyr416), Src, fosfo-AKT (Ser473), AKT, fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), ERK, ja GAPDH on blokkauspuskuriin 1: 1000-suhde. Sen jälkeen, me inkuboitiin näiden vasta-aineiden yön yli 4 ° C: ssa. Visualisoida bändejä röntgen- filmi, käytimme piparjuuriperoksidaasikonjugoiduilla aasin anti-kani tai aasin anti-hiiri-vasta-ainetta (Santa Cruz, CA, USA) yhdessä Western blot detektointireagenssia (Intron, Seoul, Korea). Bändit mitattiin densitometrisesti analyysi, joka suoritettiin käyttäen ImageJ analyysin ohjelmisto.

Tilastolliset analyysit

Tulokset esitettiin keskiarvo ± keskihajonta (SD). Opiskelijan

t

-testi käytettiin määrittämään tasojen merkitys, jota käytettiin sitten verrattaessa kahden itsenäisen näytteen. Ryhmiä vertailtiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA). Tällöin Tukeyn

post-hoc

testiä sovellettiin merkittäviä tärkeimmät vaikutukset (SPSS 12.0K for Windows, SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Tulokset

kaempferol estää ihmisen haiman solujen elinkelpoisuus läpi apoptoosireittiä

kaempferol noin 10gM indusoi merkittäviä anti-elinkelpoisuus vaikutus haiman syöpäsoluissa läpi apoptoosin [9]. Selvittämiseksi syövän vaikutusta kaempferol ja sen johdannaiset, MiaPaca-2, Panc-1, ja SNU-213 haimasyövän soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien kaempferol, kaempferol-3-O-glukosidi, ja kaempferol-4′ O-glukosidi (0, 10, 25, ja 50 uM). Kontrolliin verrattuna soluihin, joita oli käsitelty PBS: llä, 50 uM kaempferol inhiboivat spesifisesti solujen elinkelpoisuuden noin 40% MiaPaca-2-soluja, 15% Panc-1-soluissa, ja 10% SNU-213-soluja. Sen sijaan, kaempferol-3-O-glukosidi ja kaempferol-4′-O-glukosidi ei ole estävää vaikutusta MiaPaca-2, Panc-1, ja SNU-213-soluja samoissa olosuhteissa (S1 kuvio).

Jotta voitaisiin edelleen tutkia tietyn syövän vaikutus kaempferol, MiaPaca-2, Panc-1, ja SNU-213-soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien kaempferol (0, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 10, 100, ja 200 uM). Altistuminen kaempferol ei aiheuttanut merkittävää muutosta solujen elinkelpoisuuden jos se oli läsnä suhteellisen pieninä annoksina: enintään 0,5 uM MiaPaca-2, korkeintaan 1 uM Panc-1, ja jopa 10 uM SNU-213 soluja. Kuitenkin korkeampi annoksia kaempferol oli merkittävä estävä vaikutus solujen elinkykyyn. Kontrolliin verrattuna soluihin, joita oli käsitelty PBS: llä, 200 uM kaempferol esti solujen elinkelpoisuuden noin 70%: MiaPaca-2-soluja, 45% in Panc-1-soluissa, ja 50% SNU-213-soluissa (kuvio 2A, 2B ja 2C).

(AC) MiaPaca-2, Panc-1, ja SNU-213 ihmisen haimasyövän soluja inkuboitiin vaihtelevilla annoksilla kaempferol 72 tuntia. Elinkelpoisuus mitattiin WST-1 määritys (Data edustaa prosenttiosuutta ± SD ja edustavat kolme erillisiä kokeita, *

p

0,05, **

p

0,01, * **

p

0,001). (D) MiaPaca-2-soluja inkuboitiin joko puuttuessa tai läsnä ollessa kaempferol (0, 0,1, ja 10 uM) ja /tai z-VAD (1 uM) 72 tuntia. Solulysaatit altistettiin immunoblot-analyysillä käyttäen vasta-aineita yhteensä kaspaasi-3, pilkotaan-kaspaasi-3, ja GAPDH. (E) Panc-1-soluja inkuboitiin eri annoksia kaempferol (0, 10, ja 100 uM) 72 tuntia. Solulysaatit alistettiin immunoblot-analyysillä käyttäen vasta-aineita PCNA yhteensä kaspaasi-3, pilkotaan-kaspaasi-3, ja GAPDH.

selville anti-elinkelpoisuus vaikutus kaempferol, me tutki tarkemmin kaspaasi -3-välitteisen apoptoosin MiaPaca-2 haimasyöpäsoluissa jotka olivat kaikkein herkimpiä kaempferol hoitoon. Olemme alun perin varmennettu, että 10 uM kaempferol vähensi solujen elinkelpoisuuden, joka suppressoi merkittävästi esikäsittely pan-kaspaasi-inhibiittori, Z-VAD (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi, kaempferol indusoi pilkkominen kaspaasi-3, joka oli ehkäistä tehokkaasti, kun MiaPaca-2-soluja esikäsitelty z-VAD (kuvio 2D). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin 100 uM kaempferol käsiteltiin Panc-1 ja SNU-213-soluissa (kuvio 2E ja tietoja ei ole esitetty). Runsaus PCNA väheni myös apoptoosin aikana, kuten aiemmin on raportoitu [24].

Nämä tulokset osoittivat, että kaempferol voi tehokkaasti estää kasvun haimasyöpäsoluissa jos se annetaan sopiva annos; se aiheuttaa

in vitro

apoptoosin haiman syöpäsoluja.

kaempferol estää migraation ihmisen haimasyövän soluja pieninäkin annoksina

varmistamiseksi edelleen syövän vaikutusta kaempferol olemme tutkineet estävää vaikutusta kaempferol siirtolaisuudesta MiaPaca-2, Panc-1, ja SNU-213 soluja. Kontrolliin verrattuna solut käsiteltiin PBS: llä, seerumin aiheuttaman migraation MiaPaca-2-soluissa oli vähentynyt jopa noin 30% sen jälkeen kun niitä käsiteltiin 1 uM kaempferol (kuvio 3A). Oltuaan käsiteltiin 1 uM kaempferol samoissa olosuhteissa, migraatio Panc-1 ja SNU-213-solut estivät jopa noin 20% ja 30%, tässä järjestyksessä (kuvio 3B ja 3C). Hoito jopa 1 uM kaempferol-3-O-glukosidi ja kaempferol-4′-O-glukosidi ei vaikuttanut migraatio MiaPaca-2, Panc-1, ja SNU-213-solut (S2 Kuva). Seuraavaksi tutkimme pohjapinta myrkyllisyyttä kaempferol käyttäen HUVEC edustavan normaalit solut. Kaempferol hoito (0, 0,005, 0,01, 0,2, 0,5, ja 1 uM) ei vaikuttanut muuttoliike ja HUVEC: ien elinvoimaisuus (kuvio 3D ja tuloksia ei esitetty). Lisäksi arvioimme invasiivisen toiminnan jälkeen annoksesta riippuvainen hoidon kaempferol in MiaPaca-2, Panc-1, ja SNU-213-soluja. Kontrolliin verrattuna solut käsiteltiin PBS: llä, seerumin aiheuttaman hyökkäyksen MiaPaca-2, Panc-1, ja SNU-213-solujen estyi 40%, 30% ja 40%, vastaavasti, sen jälkeen kun niitä käsiteltiin 1 uM kaempferol (kuvio 3E, 3F ja 3G). Kuviossa 3H esitetään edustavat kuvat anti-invaasion vaikutus tuottaman 1 uM kaempferol hoitoa. Kaempferol inhiboivat spesifisesti seerumin muuttoliikkeelle ja invaasion ihmisen haimasyövän soluja suhteellisen pieni annos ilman toksisuutta.

(AD) MiaPaca-2, Panc-1, SNU-213-soluissa, ja HUVEC inkuboitiin vaihtelevilla annoksilla kaempferol 6 tuntia. Siirtyminen toiminta arvioitiin käyttäen siirtokuoppaan-migraatiokokeessa (Data edustaa prosenttiosuutta ± SD ja edustavat kolme erillisiä kokeita, ns tarkoittaa ei-merkitsevä, *

p

0,05, **

p

0,01, ***

p

0,001). (E-G) MiaPaca-2, Panc-1, ja SNU-213-soluja inkuboitiin vaihtelevilla annoksilla kaempferol 20 tuntia. Invasiivisen toiminta arvioitiin käyttäen TranswellTM-invaasiomääritys määritys (data prosenttiosuutta ± SD ja edustavat kolme erillisiä kokeita, *

p

0,05, **

p

0,01, ***

p

0,001). (H) edustaja kuva laajuisten hyvin invaasiomääritys (asteikko bar = 50 pm).

kaempferol on anti-syöpä vaikutuksia kautta EGFR-liittyvä signalointireitin ihmisen haimasyövän soluja

Various tavoitteet voitaisiin edellyttänyt mukaan kemikaalien kasviperäisten lääkkeiden käyttämällä julkista TCMSP tietokantaan [22]. Valitsimme 24 haimasyöpä solu tavoitteet kaempferol käyttäen TCMSP tietokantaa; ne sisältyvät kuuden reseptoreihin, mukaan lukien epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), 16-kinaasit, ja kaksi luokkiin-proteiineja (kuvio 4A ja 4B).

Kaksikymmentäneljä mahdollisia kohteita käyttäen TCMSP tietokannassa jaettu reseptorin (A) ja kinaasit /luokkiin-proteiinia (B) kuin niiden toiminnot.

Olemme aiemmin osoittaneet, että EGFR-liittyvä signalointi reitti on elintärkeä muuttavien aktiivisuuden haimasyöpäsoluissa [25]. Lisäksi mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) signalointipolkujen kriittisesti myös siirtolaisuuden ja hyökkäys eri syöpäsoluissa kuten haimasyöpä [25-27]. Erityisesti kaempferol indusoi apoptoosia kaksi leukemiasolulinjoja kautta PI3K /AKT-reitin [28]. Siksi ymmärtää vaeltavien esto signalointi polkuja kaempferol hoidon ihmisen haimasyövän soluja, tutkimme phosphoylation taso EGFR, Src, AKT, ja ERK1 /2 jälkeen altistamalla haimasyövän soluja aikariippuvainen kaempferol hoitoja. Hoito kaempferol, joka annettiin ulkoisesti haimasyövän soluja, vähensi phosphoylation tasot EGFR, Src, AKT, ja ERK1 /2 on ajasta riippuva tavalla MiaPaca-2 ja Panc-1-soluissa (kuvio 5A). Lisäksi, EGFR: n signalointireitin käyttäen farmakologisia estäjä, gefinitib tukahdutetaan Src, AKT, ja ERK1 /2 phosphoylation annoksesta riippuvalla tavalla Panc-1-soluissa (kuvio 5B). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös MiaPaca-2-soluissa (tietoja ei ole esitetty). Olemme edelleen todentaa osallistumista EGFR-polun muuttaminen signaalitransduktion kaempferol hoitoa. Annosriippuvaisesti käsiteltiin kaempferol (0, 0,2, 0,5, ja 1 uM) inhiboi merkittävästi migraatio MiaPaca-2, Panc-1, ja SNU-213 soluja, jotka oli ehkäistä tehokkaasti esikäsittelemällä osa-kuolettavan annoksen gefitinibin (0,01 uM) in MiaPaca-2, Panc-1, ja SNU-213-soluissa, vastaavasti (kuvio 5C, 5D ja 5E). Nämä tulokset osoittivat, että kaempferol estää spesifisesti seerumin aiheuttaman läpi kulkeutumista salpauksen EGFR liittyvien signalointireitin.

(A) MiaPaca-2 ja Panc-1-soluja inkuboitiin kaempferol (1 uM) vaihtelevia ajanjaksoja ja solulysaateista tehtiin Western blot -analyysi käyttäen spesifisiä vasta-aineita fosfo-EGFR (Tyr1068), EGFR, fosfo-Src (Tyr416), Src, fosfo-AKT (Ser473), yhteensä AKT, fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), yhteensä ERK, ja GAPDH. Suhteellinen pikselin intensiteettiä p-EGFR, p-Src, p-AKT, ja p-ERK1 /2 mitattiin p-EGFR /EGFR, p-Src /Src, p-AKT /AKT ja p-ERK1 /2 /ERK2 käyttäen Image J ohjelmisto. (B) Panc-1-soluja inkuboitiin eri annoksilla gefitinibin 60 min, ja solulysaatit altistettiin Western blot-analyysillä käyttäen spesifisiä vasta-aineita fosfo-EGFR (Tyr1068), EGFR, fosfo-Src (Tyr416), Src, fosfo-AKT (Ser473), yhteensä AKT, fosfori-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), yhteensä ERK, ja GAPDH. Suhteellinen pikselin intensiteettiä p-EGFR, p-Src, p-AKT, ja p-ERK1 /2 mitattiin p-EGFR /EGFR, p-Src /Src, p-AKT /AKT ja p-ERK1 /2 /ERK2 käyttäen Image J ohjelmisto. (C-D) MiaPaca-2, Panc-1, ja SNU-213-soluja inkuboitiin puuttuessa tai läsnä ollessa gefitinibin (0,01 uM) 1 tunti, ja käsiteltiin edelleen vaihtelevia annoksia kaempferol 6 tuntia. Siirtyminen toiminta arvioitiin käyttäen TranswellTM-migraatiokokeessa (

p

-arvo Studentin

t

testi ja edustavat kolme erillisiä kokeita, Tähdet osoittavat merkittävää eroa verrattuna gefitinibin poissaolon ja läsnäolon *

p

0,05, **

p

0,01).

Yhdessä nämä tulokset osoittavat selvästi, että kaempferol estää tehokkaasti vaeltavien aktiivisuutta estämällä EGFR liittyvän Src, AKT, ja ERK1 /2 signalointireitille ihmisen haimasyövän soluja (kuvio 6).

keskustelu

tässä tutkimuksessa määritimme, että muuttava toiminta ihmisen haiman syöpäsoluja inhiboitui merkittävästi jopa suhteellisen pienillä annoksilla kaempferol hoitoa. Olemme myös sertifioitu että kaempferol tehokkaasti estää haimasyövän solujen kasvua läpi apoptoosin

in vitro

annoksesta riippuvaisella tavalla. Lisäksi valitsimme 24 tavoitteisiin kaempferol käyttäen TCMSP tietokantaa, ja todennut, että syöpälääkkeen vaikutuksia kaempferol hoidon haimasyöpäsoluissa johtuivat saarto EGFR liittyvän Src, AKT, ERK1 /2 signalointireitille.

Vaikka tutkijat ovat kehittäneet state-of-the-art diagnostisia työkaluja ja kattava kohdennettu hoitoja estävän haimasyöpä, yleinen eloonjäämisaste potilaiden ei ole vielä parantunut [27,28]. Yksi kriittinen ominaisuuksia haimasyövän on aggressiivista vaeltavien aktiivisuus, joka on vastuussa kehittämiseen unrespectable, paikallisesti edennyt tai metastaattinen haimasyöpä [29]. Tässä raportissa kaempferol ollut merkittäviä anti-vaeltavia vaikutus haimasyöpä.

Syövän vastainen vaikutus kaempferol haiman syöpäsolujen kasvu voi johtua sen anti-hapettumista ja sytotoksista aktiivisuutta [30,31]. Lisäksi, kaempferol inhiboi seuraavien entsyymien liittyvät solun kasvuun ja signalointireitin: cAMP-fosfodiesteraasin, tyrosiinikinaasin, DNA topoisomeraasi II, topoisomeraasi I: n, ja myosiinin kevytketju-kinaasin [32-34]. Kaempferol hoito estää myös rasvahappojen synteesi (FAS) ja solujen kasvua, ja indusoi apoptoosia sekä eturauhas- ja rintasyövän soluja. Tämä osoittaa, että apoptoosin induktio eri syöpäsoluissa voidaan inhibitioon liittyviä FAS [35,36]. Yhteisymmärryksessä aiempien tutkimusten kanssa, havaitsimme, että kaempferol esti solun kasvua aiheuttamalla apoptoosin syöpäsoluissa kautta laski PCNA ja halkaistut kaspaasi-3 koulutusjakson Tämä esto syöpäsolujen saavutettiin antamalla kaempferol eri annoksina. Mutta estävä vaikutus on vähentynyt, kun haimasyövän soluja altistettiin esikäsittelyyn z-VAD-FMK. Zhang et ai. raportoitu dramaattinen vaikutus

Neidonhiuspuut

poimia kaempferol elinkyvystä esto pienillä pitoisuuksilla [9]. Tutkimuksessamme kaempferol osoitti kohtalaista elinkelpoisuuden inhibitio liiallinen annoksina kaempferol in MiaPaca-2 ja Panc-1-soluissa. Erot tutkimusten voi heijastaa solulinjan edellytykset [37] tai eri lähteen kaempferol.

kemiallinen rakenne flavonoidi on korreloinut sen biologinen aktiivisuus [38-40]. Das et ai. osoitti, että bio-aktiivisuus vaikuttaa rakenteeseen flavonoidi jalostetussa palmuöljyä. Flavonoidi molekyylit hydroksyyliryhmällä A- ja B renkaat ja C3 asema oli taipumus voimakkaita bio-toimintaa [41]. Yhteisymmärryksessä, tehokkain kaempferol on voimakas polyhydroksyyliyhdistettä ryhmien A, B, ja C-renkaat verrattuna kaempferol-3-O-glukosidi ja kaempferol-4′-O-glukosidi.

kaempferol voi tukkia kehittäminen metastaattinen estämällä matriksimetalloproteinaasi-3-vaikutuksen erittäin invasiivinen rintasyövän solulinjan MDA-MB-231 [15]. Kaempferol hoito esti myös muuttoa MDA-MB-231-solujen saarron läpi c-MET ja AKT signalointireitteihin [14]. On kuitenkin olemassa mitään aikaisempaa raportteja vaikutuksista kaempferol hoidon siirtolaisuudesta haiman syöpäsoluja. Erityisesti kaempferol on kyky estää tehokkaasti muuttavia aktiivisuutta ihmisen haimasyövän soluja ilman myrkyllisyyttä, jopa suhteellisen pienillä annoksilla. Lisäksi suuria annoksia kaempferol (10 ja 100 uM) lisää merkittävästi esti migraation haiman syöpäsoluja. Kuitenkin suurin annokset vaikuttaa merkittävästi myös HUVEC muuttoliikettä.

Koska huomattavaa kehitystä bioinformatiikan-liittyvillä aloilla syövät, voisimme valita 24 haimasyöpä solu tavoitteet kaempferol [42]. Erityisesti se, että EGFR ja hepatosyyttien kasvutekijän reseptorin (HGFR-) olivat tavoitteita haiman syövistä kaempferol oli innostavaa. On kiinnostavaa, että välillä ei ollut korrelaatiota haimasyöpä ja kampferol johdannaiset, kaempferol-3-O-glukosidi, ja kaempferol-4′-O-glukosidi on TCMSP tietokantaan. Se voisi olla mahdollinen syy tehottomiksi toiminnan kaempferol-3-O-glukosidi ja kaempferol-4′-O-glukosidi haiman syöpäsolun kuitenkin tarvitaan lisätutkimuksia ymmärtää sakon mekanismi noin eroa kaempferol ja sen johdannaiset .

EGFR ja HGFR- edustavat reseptorityrosiinikinaaseilla jotka ovat kriittisiä syitä aggressiivisesti pahanlaatuisten haimasyövistä [17,43,44]. Täällä todentaa, että hoito kaempferol tehokkaasti vähentää phosphoylation EGFR, Src, AKT, ja ERK1 /2 kautta. Gefinitib esti myös phosphoylation EGFR, Src, AKT, ja ERK1 /2 polku, ja lisäksi esikäsittely gefinitib vähentynyt vaikutus kaempferol siirtolaisuudesta haiman syöpäsoluja. Niinpä validoitu tiedot TCMSP tietokannasta että EGFR voisi olla kohde kaempferol haiman syöpiä. Lisäksi korrelaatio HGFR- ja kaempferol ei voida jättää huomiotta. Tarkka tutkimus mekanismin olisi tehtävä ymmärtää syöpälääkkeen vaikutuksia kaempferol vuonna HGFR ilmaisi haimasyöpä.

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että kaempferol voisi toimia voimakas estäjä haimasyöpäsoluissa muuttavien fenotyyppi , toimiva saarron läpi EGFR liittyvän Src, AKT, ja ERK1 /2 signalointireitille. Siksi kaempferol on suojaava ja helposti saatavilla olevia anti-haimasyövän reagenssi, joka voi estää aggressiivisen kasvun ja kiihkeä muuttavien aktiivisuus haimasyövis-.

tukeminen Information

S1 Kuva. Herkkyydet kaempferol ja sen johdannaisia ​​ihmisen pancratic syöpäsoluja elinkelpoisuutta.

MiaPaca-2, Panc-1, ja SNU-213 ihmisen haimasyövän soluja inkuboitiin vaihtelevien annosten kaempferol ja sen johdannaiset kaempferol-3-O-glukosidi ja kaempferol-4′-O-glukosidi 72 tuntia. Elinkelpoisuus mitattiin WST-1 määritys (data prosenttiosuutta ± SD ja edustavat kolme erillisiä kokeita, *

p

0,05, **

p

0,01).

doi: 10,1371 /journal.pone.0155264.s001

(EPS)

S2 Kuva. Vaikutus eri annosten kaempferol deriviates siirtolaisuudesta ihmisen haimasyövän soluja.

(AC) MiaPaca-2, Panc-1, ja SNU-213-soluja inkuboitiin vaihtelevilla annoksilla kaempferol-3-O-glukosidi ja kaempferol -4′-O-glukosidi 6 tuntia. Siirtyminen toiminta arvioitiin käyttäen TranswellTM-migraatiokokeessa (data prosenttiosuutta ± SD ja edustavat kolme erillisiä kokeita, *

p

0,05).

Doi: 10,1371 /journal.pone. 0155264.s002

(EPS) B

Kiitokset

Tämä työ (Grants nro C0301723) tukivat Business Academic-teollisuuden Cooperative n rahoittamien Korea pienten ja keskisuurten Business Administration vuonna 2015.