Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Runsaasti todisteiden hiirellä malleja osoittaa, että CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ säätelijä-T-solut (Treg) ylläpitää perifeerisen toleranssin omia antigeenejä ja myös estää kasvaimen vastaisen immuunivasteen. Tähän mennessä on vain vähän tietoa siitä, CD4

+ T-solu hoitovasteita peräsuolen syöpä (CRC). Ryhdyimme mitata T-soluvasteita kasvaimeen liittyvä antigeeni ja tutkii Treg iskeytymistä niitä kasvaimen vastaisen immuunivasteen CRC potilailla.

Menetelmät ja tärkeimmät havainnot

Treg tunnistettiin ja luonnehtia CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ virtaussytometriaa käyttämällä. Useammin Treg osoitettiin sekä ääreisverenkierron ja suoliliepeen imusolmukkeiden potilaita, joilla on peräsuolen syöpä (CRC) verrattuna joko terveisiin kontrolleihin tai potilailla, joilla on tulehduksellinen suolistosairaus (IBD). Ehtyminen Treg perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) CRC potilaista paljastanut CD4

+ T-soluvasteita, havaittuna IFNy julkaisu, kasvaimeen liittyvä antigeeni 5T4, kun taas mitään vaikutusta ei havaittu terveiden samanikäisiin kontrolliryhmään .

Johtopäätökset /merkitys

Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että Treg kykenee inhiboimaan kasvaimeen liittyvä antigeeni-spesifisiä immuunivasteita on rikastunut potilailla, joilla on CRC. Nämä tulokset tukevat perustelut manipuloimalla Treg parantaa syövän immunoterapiassa.

Citation: Clarke SL, Betts GJ, Plant, Wright KL, El-Shanawany TM, Harrop R, et al. (2006) CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Regulatory T Cells Suppress Anti-kasvain immuuni hoitovasteita peräsuolen syövän. PLoS ONE 1 (1): E129. doi: 10,1371 /journal.pone.0000129

Academic Editor: Christopher Arendt, Sanofi-Aventis, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 syyskuu 2006; Hyväksytty: 14 marraskuu 2006; Julkaistu: 27 joulukuu 2006

Copyright: © 2006 Clarke et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat rahoituksella Tenovus Cancer Charity, Cardiff, ja pieni avustus palkinnon Cardiffin ja Vale NHS Trust. KLW rahoitti Wellcome Trust kohdeapuraha ja Association of International Cancer Research. AMG on MRC vanhempi tutkija.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on neljänneksi yleisin diagnosoitu pahanlaatuinen sairaus, jonka arvioitu 1 miljoonaa uutta tapausta ja yli 500 000 kuolemantapausta vuodessa maailmanlaajuisesti [1]. Nykyinen potilaiden hoidosta CRC pyörii poisto primaarikasvaimen ja paikallisten imusolmukkeiden ja valikoiva käyttö 5-fluorourasiilin (5FU; ehkäisee tymidylaattisynteesin) kemoterapian [2]. Viimeaikaiset edistysaskeleet preoperative kuvantamisen, kirurginen tekniikka ja käyttö neo-adjuvanttihoitoa ovat parantuneet tulokset, mutta peräsuolen syöpä on toiseksi yleisin kuolinsyy syöpään länsimaissa 40-50% potilaista, joille tehdään mahdollisesti parantava toimenpide, joille uusiutumisen tai kuoleman etäpesäkkeitä.

kliinis-patologinen lavastus taudin vahvasti korreloi ennusteeseen. Mielenkiintoista on, että parantunut kliininen tulos liittyy myös läsnä kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL), erityisesti, jos lymfosyytit hyökkäävät rauhasten elementit kasvain [3], [4]. Tämä viittaa siihen, että anti-kasvain immuunivasteita törmää kasvua primaarikasvaimen, ja niillä voi olla tärkeä rooli säätelyssä etäpesäkkeitä. Epäsuora todisteita merkitystä immuunivasteen syöpäpotilailla on epidemiologisen yhdistys joidenkin populaatioiden välillä kasvainten lisääntymisen ja immunosuppression jälkeisen elinsiirron [5].

Paljon kiinnostusta on hiljattain syntynyt roolissa luonnossa esiintyviä väestöstä CD4

+ CD25

+ säätelijä-T-solut (Treg), tunnettu siitä, että ilmentyminen haarukkamaisen pään transkriptiotekijän FOXP3, ja kohonneita pinnan merkkiaineiden CD45RO, CTLA-4, ja GITR [6 ], [7], [8]. Treg on osoitettu ohjaamaan itse antigeenispesifisiä vasteita periferiassa, ja täten voi olla rooli säätelyssä kasvaimen vastaisen immuunivasteen. Useat ryhmät myös meidän omat, ovat osoittaneet, että ehtyminen Treg edistää sukupolven anti-kasvain immuunivasteen ja kasvaimen hyljinnän hiiren malleissa (tarkistetaan [9]). On näyttöä siitä, että nämä suojaavia vasteita kohdistaa sekä kasvaimen antigeenejä sekä yhteisiä kasvainantigeenejä [10], [11].

Äskettäin useat tutkimukset ovat havainneet useammin CD4

+ CD25

+ T-solujen perifeerisessä veressä potilaiden eri syöpätyyppejä, vaikka suurin osa näistä tutkimuksista ei vahvistanut, että nämä olivat Treg värjäämällä varten FOXP3 (tarkistetaan [9]). Läsnäolo FOXP3

+ Treg sisällä TIL munasarjasyöpä on kuitenkin todettu, että itsenäinen riskitekijä huonompi ennuste. Lisäksi sen jälkeen, kun puhdistus kasvaimen askites, nämä Treg osoitettiin tukahduttaa Her2-spesifisten T-soluvasteiden

in vitro

[12].

Ihmisen onkopsykologista sikiön antigeenin, 5T4, on 72 kDa: n leusiinirikkaita membraaniglykoproteiinin joka ilmentyy korkeilla tasoilla istukan ja myös monenlaisia ​​ihmisen karsinoomien kuten peräsuolen, maha-, munuais- ja munasarjojen mutta harvoin normaaleissa kudoksissa [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Tässä tutkimuksessa testasimme hypoteesia, että Treg kehittää CRC potilailla, joilla estetään 5T4-spesifisiä immuunivasteita. Näytteitä potilaista, joilla CRC tai IBD, ja terveisiin kontrolleihin tutkittiin käsittelemään kolmea kysymystä: on taajuus Treg (CD25

hiCD4

+ FOXP3

+ T-solut) lisääntyi verestä tai imusolmukkeista sairastavista potilaista CRC; voi anti-kasvain T-solu vasteita 5T4 tunnistettava CRC potilaille; ja älä Treg törmää nämä anti-kasvain immuunivasteen?

Methods

Sample ryhmät

CRC potilaita tunnistettiin monialainen tiimipalaverit ensimmäisen esittämistä adenokarsinooma ja ei raportoitu etäispesäkkeitä on poikkipinta kuvantaminen (TNM-luokitus I-III; Duke vaiheessa A-C). IBD potilaiden (haavainen paksusuolen tulehdus tai Crohnin tauti) osallistuu klinikan tai tehdään elektiivinen kirurginen resektio rekrytoitiin tutkimukseen. Paikallinen eettinen komitea hyväksyntä myönnettiin tutkimuksen mukaan Bro Taf Local Research eettisen komitean.

Antigeenit

Puhdistettua proteiinia (PPD) (Statens Serum Institut, Tanska), hemagglutiniini (HA) oli ystävällinen lahja tri John Skehel (Nimr, Mill Hill), 5T4 tuotettiin kuten aiemmin on kuvattu [19] (Oxford Biomedica). Kaikki antigeenejä käytettiin lopulliseen konsentraatioon 1 ug /ml.

puhdistus lymfosyyttien

30-50 ml verta otettiin potilailta tai valvonnan ja heparinisoidaan (10 U /ml). PBMC uutettiin Lympho- (Axis-Shield, Oslo, Norja). Solut pestiin kahdesti RPMI ennen jatkokäyttöä. Imusolmukkeet leikeltiin tuoreista näytteistä 30 minuutin kuluessa leikkauksen, pestään RPMI, muussattu steriilin solusiivilän ja kerättiin sentrifugoimalla.

virtaussytometrianalyysin lymfosyyttien verestä ja imusolmukkeiden

näytteet värjättiin fluoresoivasti leimattuja vasta CD4 (klooni RPA-T4), CD25 (klooni M-A251), CD45RO (klooni UCHL1) ja CTLA4 (klooni BNI3) (BD Pharmingen), CD4 (klooni S3.5) (Caltag ) ja CD25 (klooni 4E3) (Miltenyi Biotec). Kaikki värjäys suoritettiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), 2,5% FCS: ää, 5 mM EDTA, ja solunsisäinen värjäys suoritettiin käyttäen Cytofix, Cytoperm kit (BD Pharmingen). FOXP3 värjäys suoritettiin käyttäen FITC-anti-humaani-FOXP3 -värjäyspakkausta (klooni PCH101) (71-5776 eBioscience). Lymfosyytit eroteltiin eteenpäin ja sivusironta profiileja. Kaikki virtaussytometrillä suoritettiin BD FACSCalibur ja analysoitiin käyttäen Summit v3.1 analyysi ohjelma (rakentaa 839 DakoCytomation, Fort Collins, Colorado).

CD4

+ CD25

hi add-back kokeiluja

Puhdistetut PBMC rikastettiin CD4

+ soluja ja sitten erotettiin CD4

+ CD25

hi ja CD4

+ CD25

– jakeet käyttäen magneettisia helmiä (Miltenyi CD4

+ CD25

+ sääntely eristyspakkausta). Virtaussytometria kustakin fraktiosta osoitti, että tiukkuus CD25

+ solun valinnan mukaan Miltenyi CD4

+ CD25

+ sääntely- eristyspakkausta ja Miltenyi anti-CD25 helmiä oli vertailukelpoinen. Proliferaatiomäärityksessä perustettiin käyttäen 2×10

4 CD4

+ CD25

– soluja, aktivoitu 0,5 ug /ml levyyn sidotun anti-CD3 (klooni OKT3) (eBioscience) ja 1 ug /ml liukoista anti -CD28 (klooni 28.2) (BD Pharmingen) vasta-aineita, RPMI 1640, johon oli lisätty 10% lämmöllä käsitelty FCS, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 2 mM L-glutamiinia ja 1 mM natriumpyruvaattia. CD4

+ CD25

– solut aktivoitiin yksin tai, kun läsnä on CD4

+ CD25

hi solut, vaihtelevissa suhteissa 01:01, 1:0.1, 1:0.01 ja 1:0.001 CD4

+ CD25

-:CD4

+ CD25

hi soluja. Kasvu mitattiin vuorokautena 3 lisäämällä 0,037 MBq /kuoppa (1 pCi) ja [

metyyli

-3H] -tymidiinin (Amersham Biosciences) lopullisen 18 tunnin viljelyn. Solut kerättiin päälle painettu suodatinmatolle suodattimet (Wallac, Turku, Suomi toimittaja Perkin Elmer) käyttäen TomTek solukerääjän. Kun suodattimet olivat kuivia, MeltiLex sulate-on tuikeaine arkkia (Wallac) lisättiin ja suodattimien luettiin käyttäen Trilux 1450 Microbeta nestetuike- ja luminesenssilaskuria (Wallac).

IFN-γ-ELISPOT-määrityksissä

Vasta-aineet on saatu Mabtech (Natka, Ruotsi) ja ELISPOT kehitettiin käyttämällä alkalisen fosfataasin substraattia kit Bio-Rad (Hercules, Kalifornia). Vaikutus Treg heikentymisen antigeenispesifisen IFN-γ tuotantoa arvioitiin rinnakkain määrityksissä. CD25

hi-solut köyhdytetty käyttäen magneettierotukset Macien CD25 mikrohelmien (Miltenyi Biotec, Saksa). Lyhyesti, 1,5 x 10

7 PBMC-inkuboitiin 15 ui anti-CD25 päällystetyillä helmillä reaktion kokonaistilavuus oli 150 ui puskuria (1 x PBS, 0,5% BSA, 5 mM EDTA), 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan . Ylimääräinen helmet pestiin pois ja PBMC ajettiin alas MS sarakkeeseen. Kolonni pestiin 3 x 1 ml: lla pesua puskurissa. Teho väheneminen varmistettiin virtaussytometrillä. Määritykset tehtiin käyttäen joko 3,5 × 10

5 köyhdyttämätöntä tai CD25

hi-köyhdytettyä soluja RPMI 1640 täydennetty 5% lämpökäsitelty FCS, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 2 mM L -glutamine ja 1 mM natriumpyruvaattia kuoppaa kohti polymeerin tukema 96-suodatus levy (MAIP-S-4510) (Millipore, Moslheim, Ranska) on reaktion kokonaistilavuus 100 ul /kuoppa. Vasta-ainepitoisuuksien käytetään ja pesuvaiheet mukaisesti valmistajan ohjeiden, kaikki vasta-aine inkubaatiot olivat 50 ul /kuoppa. Menetelmä on kuvattu aiemmin [20]. PPD, HA ja 5T4 testattiin kahtena kappaleena kuoppiin, jotka on lisätty lopulliseen konsentraatioon 1 ug /ml, ja sitä verrataan kontrolliarvoihin kuopat ilman proteiinia. Levyä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 18 tuntia. Aktivoidut T-solut laskettiin on yhden solun tasolla laskemalla täplät kuoppaa kohti käyttämällä automaattista ELISPOT-lukija (Cadama). Hoitoon vastanneet joilla on todettu vähintään 5 pilkkuja muodostavien solujen (SFC) per 10

6 PBMC, vähentämisen jälkeen taustalla, ja kasvua vähintään 50% yli taustan.

Tilastollinen analyysi

virtausytometrisiä analysoitiin käyttämällä paritonta opiskelijan

t

-testi (GraphPad Prism versio 2.0 (GraphPad software). osuus syöpäpotilaiden ja terveiden verrokkien asennus vastaus 5T4 verrattiin käyttämällä suljettu lomake vertailemiseksi eroja ja laskemalla luottamusvälit [21].

tulokset

määrittely ihmisen Treg väestöstä

Käyttämällä tiukkaa gating parametrit raportoi äskettäin [8], Treg olivat tunnistettiin CD4-positiivisten solujen kanssa kirkkaampi CD25 värjäys kuin CD4-negatiivinen populaatio (kuva 1a). taajuus Treg laskettiin prosenttiosuutena CD4

+ CD25

hei solujen CD4

+ väestö, ja oli välillä +0,09-+1,44% CD4

+ soluja PBMC terveiden samanikäisillä valvontaa. noudatetun raportteja, valtaosa CD4

+ CD25

hi-soluja CTLA4-positiivisten ja ilmaisi CD45RO ( 97%) [6], [7], [8]. CD25

hi väestö analysoitiin edelleen ilmaus FOXP3. Kuten kuviossa 1b, yli 95% CD4

+ CD25

hi-solut ilmaisivat FOXP3, verrattuna noin 30% CD4

+ CD25

int soluja. Tämä värjäysmallia oli sama sekä terveiden verrokkien ja CRC potilaita. FOXP3 ilmentyminen oli vähäinen CD4

+ CD25

– soluja (kuva 1b).

(A) CD4

+ CD25

-, CD4

+ CD25

int ja CD4

+ CD25

hi solut tunnistettiin, kuten on esitetty. CD4

+ CD25

hi solut ovat niitä, joissa CD25 ekspressio oli korkeampi kuin CD4

– väestöstä. (B) FOXP3 ilmaisu kussakin väestöstä arvioitiin solunsisäistä värjäystä. (C) Vasta eristettyjä CD4

+ CD25

– T-soluja (2 x 10

4 solua /kuoppa) viljeltiin yksinään (CD25 /matala) tai CD4

+ CD25

hi T-soluja eri suhteissa, ja stimuloitiin levyyn sidotun anti-CD3- ja liukoisen anti-CD28. Proliferaatiota arvioitiin (

3H) -tymidiinin. Tulokset edustavat keskiarvoa kolmen kuopan kanssa keskihajonta, edustavasta määritystä.

Vahvista sääntelyn fenotyypin tämän populaation CD4

+ CD25

hi soluja, niiden kyky tukahduttaa aktivointi CD4

+ CD25

– solut arvioitiin käyttäen yhdessä viljelemisen

in vitro

proliferaatiomäärityksessä. CD4

+ CD25

– ja CD4

+ CD25

hi-solut erotettiin PBMC, menetelmissä kuvatulla tavalla. Lisääminen CD4

+ CD25

hi solujen polyklonaalisia stimuloidaan CD4

+ T-solut selvästi tukahdutti leviämisen CD4

+ CD25

– T-soluja ja ilmoituksen mukaan ohessa tämä tukahduttaminen oli annoksesta riippuvaista [8], [22], [23] (kuva 1c).

CRC potilailla on lisääntynyt määrä Treg ääreisverenkierrossa

Treg olivat fenotyypiltään määritelty kuten edellä . Kuvassa 2a on esitetty taajuudet Treg että PBMC CRC potilaiden (n = 12, ikä 58-80 vuotta) verrattuna samanikäisiin terveillä verrokeilla (n = 11, ikä 48-93 vuotta) ja potilaat, joilla on tulehduksellinen suolistosairaus (n = 22, ikä 19-80 vuotta). Kaikissa ryhmissä, taajuus Treg oli alle 2% CD4

+ T-soluja. Kuitenkin keskimääräinen taajuus CRC potilaalla (1,13%) lisääntyi merkitsevästi verrattuna kontrolliryhmiin (IBD potilasta 0,56%, terveillä verrokeilla 0,46%). Ei ollut merkittävää eroa taajuus Treg myös terveiden ja IBD potilaita.

(A) Vasta eristettyjä PBMC: 12 CRC potilaista, 11 tervettä samanikäisiin valvontaa ja 22 IBD potilasta värjättiin vasta-aineilla CD4 ja CD25. Käyttämällä gating hahmoteltua strategiaa kuvassa 1, Treg laskettiin. (B) Mesenteric imusolmuke näytteitä (LN) kerättiin kirurgisista näytteistä 8 CRC ja 7 IBD potilaiden ja värjätään ja aidatulla kuten edellä. Tiedot osoittavat prosenttiosuus CD4

+ soluja, jotka olivat CD25

hi kussakin näytteessä. Kukin symboli edustaa yhtä potilasta. P-arvot laskettiin käyttäen parittoman opiskelijan

t

-testissä.

CRC potilailla on lisääntynyt määrä Treg vuonna suoliliepeen imusolmukkeiden

saaminen ohjaus imusolmukkeet potilailla, joilla ei ole vatsaontelon sairaus ei ollut mahdollista. IBD potilaat tarjoavat paksusuolen sairauden kontrolliryhmän CRC potilaille, jälkimmäinen myös usein osoittavat alueita tulehdus ympärillä kasvain. Lisäksi tulokset PBMC: istä ei osoittanut merkittävää muutosta taajuudet Treg potilailla, joilla on IBD verrattuna terveisiin verrokkeihin. Näin ollen meidän katsoi kohtuulliseksi käyttää suoliliepeen imusolmukkeiden saatu IBD leikkauspotilaiden kuin kontrolliryhmässä, jossa tutkimaan Treg toisen imukudokseen.

tuore imusolmukkeet saatiin kirurgisesti resektoitua näytteet ja valmistellaan hahmoteltu menetelmissä. Taajuudet Treg suoliliepeen imusolmukkeet saatu CRC potilailla (n = 8), ja IBD potilailla (n = 7) verrattiin (kuvio 2b). CRC potilaat taas osoitti merkittävää kasvua taajuus Treg, mikä kasvu on jo kuvattu ääreisverenkierron. Imusolmuke johdettu CD25

hi Treg oli sama fenotyyppi kuin löytyy verestä (tuloksia ei ole esitetty). Ei havaittu eroja kokonaisosuus CD4

+ tai CD8

+ T-soluja (tuloksia ei esitetä).

Potilaat, joilla on ei-metastasoituneen CRC osoittavat voimakasta CD4

+ T-soluvasteita muistaa antigeenejä

PBMC puhdistettiin CRC potilaista (n = 14) ennen leikkausta ja CD4

+ T-soluvaste kontrolliryhmään muistaa antigeenien PPD ja HA mitattuna IFN-γ release. Näitä tuloksia verrattiin terveisiin samanikäisiin kontrolleihin (n = 11) (kuva 3). CD4- ja CD8-Depleetiokokeita vahvisti, että nämä olivat CD4

+ T-soluvasteita (tietoja ei esitetty). Ei ollut näyttöä siitä, että potilaat saivat immunosuppressiohoitoa; kaikki aiheet vastannut vähintään yhden antigeenin. Soluproliferaatiota arvioitiin myös rinnakkain kokeissa mittana T-solujen aktivaation, ja jälleen mitään todisteita immunosuppressiota havaittiin ennen leikkausta (tuloksia ei ole esitetty).

Koko PBMC 11 iän verrokeilla ja 14 CRC potilaat arvioitiin vastauksia antigeenejä PPD ja HA mitattuna IFN-γ ELISPOT. Puhdistettu PBMC lisättiin 3,5 x 10

5 solua /kuoppa, ja inkuboitiin 18 tunnin ajan, kun läsnä oli joko 1 ug /ml PPD, 1 ug /ml HA tai ilman antigeeniä. Kuopat kaksinkertaisina. Alle 5 täplän muodostavat solut /10

6 PBMC pidettiin negatiivinen.

Treg olla huomattava vaikutus kasvaimen vastaisen immuunivasteen veressä potilaiden CRC

joukko määrityksiä suoritettiin CRC potilaista (n = 14) ja iän verrokit (n = 11) ja määrittää, onko poistaminen CD25

hi solujen muuttaa immuunivastetta muistaa antigeenejä ja kasvaimeen liittyvän antigeenin 5T4. Me optimoitu eristys- järjestelmä on suunniteltu nimenomaan heikentävistä vain CD25

hi solujen näytteitä hahmotellulla menetelmissä (kuvio 4a). Vasta-eristetty PBMC: itä käytettiin

ex vivo

IFN-γ-ELISPOT-määrityksissä kuten edellä määrittää vasteita muistaa antigeenien ja vasta kasvaimen antigeeni-5T4, ennen ja jälkeen ehtyminen Treg. Kokonaisuutena ehtyminen Treg paljastui joitakin vastauksia muistaa antigeenejä CRC potilaiden ja verrokkien (kuva 4b). Kuitenkin siinä tapauksessa, että kasvaimeen liittyvä antigeeni 5T4, oli silmiinpistävä ero valvontaa ja CRC potilailla. 5T4-erityisiä

ex vivo

vaste havaittiin 1/11 terveen valvonnan ja ehtyminen Treg tehostetun tämän vastauksen. Vaikka ehtyminen Treg täydennetty 5T4-erityisiä vaste 1/14 CRC potilaiden, ehtyminen tämän väestön johti

paljastumista

5T4 vasteen 5/14 potilaista testattiin (95%: n luottamusväli sillä pariksi eroja on -0,83–0,22 paljastaa merkittäviä eroja 5T4 vastausten välillä CRC potilaiden ja terveiden verrokkien). Nämä tiedot viittaavat siihen, että Treg on tukahduttaa anti-5T4-immuunivasteita, erityisesti potilailla, joilla on paksusuolen ja peräsuolen syövän. Nämä kuusi potilasta, jotka osoittivat tehostetut 5T4 vasteet olivat samankaltaiset Treg taajuuksilla ääreisverenkierron (vaihteluväli 0,82-2,35% keskiarvosta 1,14%) taajuuksille mitataan koko CRC väestöstä (keskiarvo 1,13%). Vaikka IFN-γ-vapautuminen, mitata suoraan

ex vivo

, käytössä anti-5T4 vasteita havaitaan, emme löytäneet voimakasta proliferatiivisia vasteita 5T4 joko CRC potilailla tai valvontaa. Kuitenkin useita kierroksia uudelleen stimulaation ja lisäksi IL-2, olemme kasvaneet ulos HLA-DR-rajoitetun 5T4-spesifisen linjat (tuloksia ei ole esitetty).

(A) PBMC: t puhdistettiin ja kaksi valmistetut näytteet: koko PBMC ja PBMC köyhdytettyä CD25

hi soluja. (B) Koko PBMC ja CD25

hi-köyhdytettyä PBMC: 11 iän verrokeilla (avoimet pylväät) ja 14 CRC potilasta (kiinteät pylväät) perustettiin rinnakkain IFN-y ELISPOT-määrityksessä (3.5 x 10

5 solua /kuoppa) PPD (top kaavio), HA (keskimmäinen kuvio) tai 5T4 (alempi kaavio). Määrä vasteen näkyy kullekin antigeenille. Kussakin tapauksessa, prosentuaalinen vasemmalla on taajuus reagoivien että lisääntynyt jälkeen Treg ehtyminen (lisäys), prosenttiosuus keskellä on taajuus ei-vastetta, joka oli vastetta ehtymisen (New Response) ja oikealla taajuus vaste jotka laskivat tai ei muutoksia vastetta Treg ehtymisen (vähennys /NC). 95%: n luottamusväli pariksi eroja mittasuhteet välillä potilaiden ja verrokkien on -0,83–0,22 paljastaa merkittävän eron 5T4 vastauksia. (C) 6 CRC sairastavien potilaiden vasteet 5T4 esitetään yksityiskohtaisemmin. Palkit edustavat pilkkuja muodostavien solujen /10

6 PBMC vähentämisen jälkeen tausta paikkoja, koko PBMC (vaaleanharmaa) ja CD25

hi-köyhdytettyä PBMC (tummanharmaa). Vastaukset havaittiin vain CD25-

hi-köyhdytettyä PBMC potilaista 1-5, kun taas vaste havaittiin sekä PBMC väestöä potilaasta 6. Kaikessa määrityksissä, kaivot perustettiin kahtena.

keskustelu

Vertasimme taajuus huolellisesti määriteltyjen CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ säätelijä-T-solut (Treg) CRC potilailla, joilla on terve ikään verrokeilla ja IBD potilaita. CRC potilailla on useammin Treg ja on todisteita, että nämä Treg kohde kasvaimen vastaisen immuunivasteen.

arvioi parannettu määrä Treg CRC potilailla korreloi yleistä immunosuppressiota. Yhdistelmä IFN-γ ELISPOT määrityksiä ja proliferaatiomäärityksillä seurata vastauksia muistaa antigeenien PPD ja HA, osoittivat yhtä vankka vasteita CRC potilaiden ja terveiden kontrollien, mikä osoittaa, että immuunivasteita kuin kasvaimen antigeenejä ovat moitteettomia CRC potilailla.

kuvio immunoreaktiivisuus oli silmiinpistävän toisistaan ​​CRC potilaiden ja terveiden kontrollien kun immuunivasteita kasvaimeen liittyvää onkopsykologista sikiön antigeenin, 5T4, verrattiin. 5T4-vasteita havaittiin suhteessa tervettä verrokkia, mutta nämä vasteet olivat pääosin muuttamattomana Treg ehtyminen. Sen sijaan, 5T4-spesifinen vaste havaittiin yli kolmasosa CRC potilaiden vasta poistamisen jälkeen Treg, mikä viittaa siihen, että Treg CRC potilailla tukahduttaa kasvaimen immuunivasteen. Tämä ryhmä CRC potilailla, jotka osoittivat anti-5T4 vasteet jälkeen Treg ehtyminen näytti olevan samanlainen Treg taajuuksia verrattuna koko CRC ryhmä, vaikka suurempiakin tutkimuksia tarvitaan vahvistaa tämän. Koska 5T4-vasteet eivät paljastaneet joita Treg ehtyminen terveillä verrokeilla, nämä tiedot osoittavat myös, että Treg solut pystyvät ehkäisemään 5T4-vasteita kehittyy vastauksena kasvain. Tarkka mekanismi, jolla tämä tapahtuu vaiheessa on epäselvää, mutta se on mahdollista, että sytokiini miljöö tuumorin sisällä edistää sukupolven Treg tunnustaa kasvaimeen liittyviä antigeenejä. Viimeaikaiset raportit osoittavat rooli TGFli laajentamiseen Treg [24], [25]. Jyrsijällä kasvain malli on osoitettu, että vain dendriittisolut (DC: t) alkaen kasvain, mutta ei tuumorin-eläimissä edistää proliferaatiota Treg. Mielenkiintoista DC: iden kasvaimeen eläimissä voidaan laajentaa Treg, mutta vain, jos esi-inkuboida kasvainsolujen supernatanteista. Nämä vaikutukset voitiin estää

in vitro

käyttäen anti-TGF-vasta-aineiden [26]. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että Treg vaativat sekä kasvaimen antigeenispesifisen stimulaation ja sytokiinit, kuten TGFp, jotta lisääntyä ja tukahduttaa kasvaimen vastaisen immuunivasteen.

5T4 on houkutteleva ehdokas tuumorirokotteet, koska se on ilmaistuna monissa epiteelikasvaimissa. Tämä tutkimus kuitenkin osoittaa, että Treg tunnistaa antigeeni ja mahdollisesti osansa tukahduttamaan kasvaimen vastaisen vasteita, oletettavasti vahingoksi yksittäisen. Kaksi muuta tutkimukset ovat osoittaneet, että Treg tunnistaa kasvaimen antigeenejä (LAGE-1 ja ARTC-1) potilailla, joilla melanooma [27], [28]. On tärkeää varmistaa, että rokote strategioiden kasvaimeen liittyviä antigeenejä ei lisätä sääntelyn varren immuunijärjestelmän estäen siten mahdollisten anti-kasvain immuniteetin. Yksi lähestymistapa voi olla heikentävistä Treg ennen rokotusta, kuten äskettäin osoitettu munuaissyövän [29]. Se on suurta kiinnostusta siis määrittää tulevissa tutkimuksissa onko tällainen strategia johtaa mitattavissa kliinisessä vasteita CRC potilailla.

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää professori Robert Newcombe, Department of Epidemiology, tilastot ja Public Health, Cardiff University tilastollisia neuvoja.