Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja tarkoitus

NAD (P) H: kinoni oksidoreduktaasi 1 (NQO1) välittämä kinoni vähentäminen ja myöhemmin UDP-glukuronosyylitransferaasien (UGT) katalysoidun glukuronidoitumalla on hallitseva metaboliareitti tanshinone IIA (TSA), lupaava syöpälääkkeen. UGT ovat positiivisesti ilmaistu eri kasvain kudosten ja tärkeä rooli aineenvaihdunnan poistamista TSA. Tutkimuksen tavoitteena on tutkia roolia UGT1A määritettäessä kertymiseen solun ja tuloksena apoptoottista vaikutusta TSA.

Experimental Approach

Tutkimme TSA kertymiseen solun ja glukuronoitumalla HT29 (UGT1A positiivinen) ja HCT116 (UGT1A negatiivinen) ihmisen paksusuolen syövän solulinjat. Tutkimme myös TSA välittämää reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tuotanto, sytotoksisuus ja apoptoottinen vaikutus HT29 ja HCT116-solujen tutkimaan, UGT1A tasot liittyvät suoraan TSA syövän vaikutusta. UGT1A siRNA tai propofolia, joka on UGT1A9 kilpaileva estäjä, käytettiin estämään UGT1A ilmentymisen tai UGT1A9 aktiivisuutta.

Key Results

Useita UGT1A isoformit positiivisesti ilmaistuna HT29 mutta ei HCT116-soluissa. Cellular S9 jakeet valmistettu HT29 on voimakas glukuronisaatio aktiivisuus TSA, joka voidaan estää propofolianestesian UGT1A siRNA häiriöitä. TSA solunsisäinen kerääntyminen HT29 on paljon pienempi kuin se, HCT116-soluissa, mikä korreloi korkean ekspressiotasot UGT1A in HT29. Johdonmukaisesti, TSA indusoi vähemmän solunsisäisten ROS, sytotoksisuus ja apoptoottinen vaikutus HT29 kuin HCT116-soluissa. Esikäsittely HT29 kanssa UGT1A siRNA tai propofoli voi pienentää TSA glukuronidaatiota samanaikaisesti parantaa solunsisäisen kertymisen, sekä parantaa TSA syövän vaikutusta.

Päätelmät ja vaikutukset

UGT1A voivat vaarantaa TSA sytotoksisuus kautta vähentää sen solunsisäisen altistuksen ja kytkemällä NQO1 laukeavan redoksijaksossa metaboliseen poistamiseen. Tutkimuksemme voivat antaa valoa ymmärtämisessä solu- farmakokineettisiä ja molekyylitason mekanismi, jonka UGT määrittävät kemoterapian lääkkeiden vaikutuksia, jotka ovat UGT ”alustoille.

Citation: Liu M, Wang Q, Liu F, Cheng X, Wu X, Wang H, et al. (2013) UDP-glukuronosyylitransferaasin 1A kompromisseja Solunsisäinen kertyminen ja syövän vaikutusta of tanshinone IIA Human koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 8 (11): e79172. doi: 10,1371 /journal.pone.0079172

Editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 27, 2013; Hyväksytty: 20 syyskuu 2013; Julkaistu: 14 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus sai taloudellista tukea pohjaa tekijän National Erinomainen Väitöskirja of China (Grant 200979), Natural Science Foundation of China (Avustukset 91029746 ja 81273586), Natural Science Foundation of Jiangsun maakunnassa (Avustukset BK2011065 ja BK2012026), ja ohjelma New Century Excellent Talents in University (Grant NCET-09-0770). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

UDP-glukuronosyylitransferaasien (UGT) katalysoivat glukuronidaatiota monien lipofiilisten endogeenisten pinnoille kuten bilirubiinin ja steroidihormonien, ja vierasperäiset aineet kuten syöpää ja kliininen lääkkeet [1], [2], [3]. Useimmissa tapauksissa, UGT-välitteistä metaboliaa edistää aineenvaihduntaa poistamista ja vähentää biologista tehokkuudet substraattien, vaikka useita tapauksia bioaktivaatiosta on havaittu [4], [5]. UGT siis pidetään tärkeänä vieroitus järjestelmä. Geneettisten polymorfismien ja UGT aiheuttaa heikentynyt entsyymiaktiivisuus on liitetty syövän riski, kuten peräsuolen syöpä, rintasyöpä, keuhkosyöpä, proksimaalinen ruoansulatuskanavan syöpä, maksasyövän ja eturauhassyövän [6], [7]. Vaihtoehtoisesti, parannettu entsyymiaktiivisuuksien UGT voi olla tärkeä tekijä kemoterapeuttisen vastus monia lääkkeitä, jotka ovat UGT ”substraatteja, kuten irinotekaani, metotreksaatti, epirubisiini, ja tamoksifeeni [8], [9], [10], [11] , mikä on ratkaiseva rooli UGT anti-syövän hoidossa. UGT ovat positiivisesti ilmaistuna erilaisten kasvainten kudokset ja solut, vaikkakin suhteellisen alemman tason verrattuna vastaaviin normaaleihin kudoksiin [12], [13], [14], [15]. Vaikka UGT on väitetty olevan tärkeä syy kemoterapeuttisten vastus, tiedetään vain vähän suoraa vaikutusta UGT koskien kertymiseen solun kohde syöpäsoluissa ja kemoterapeuttisten tehoa huumeita.

tanshinone IIA (TSA) on diterpeenin phenanthrenequinone yhdiste eristettiin kuivattu juuri Salvia miltiorrhiza (Danshen kiinaksi), joka on laajalti käytetty kasviperäisten lääkeaineiden kanssa hyvin todistettu sydän- ja aivoverenkierron tehot [16], [17], [18]. Erityisesti kertyvät todisteet tukevat että TSA on lupaava syöpälääke [19], [20], [21], [22]. Aikaisemmin olemme selvennetty, että TSA eliminoituu pääasiassa kautta peräkkäinen NAD (P) H: kinoni oksidoreduktaasi 1 (NQO1) ja UGT katalysoidun aineenvaihdunta [23], [24]. NQO1 katalysoi kahden elektronin pelkistys TSA tuottaa erittäin epävakaa katekoli aineenvaihduntatuotteen, jotka voidaan nopeasti glukuronidoitua jos UGT ovat läsnä. Kuitenkin, kun UGT ovat poissa, erittäin reaktiivinen katekoli välituote voidaan tehdään redoksijaksossa Kinonianalyysien vähentäminen ja auto-oksidaation, prosessi, joka tuottaa suuria määriä reaktiivisia hapen lajeja (ROS). Tähän havaintoon perustuen olemme äskettäin vahvistettu, että NQO1 on tärkeä solunsisäinen tavoite TSA, joka saa aikaan apoptoottisen kuoleman ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin [25].

perusteella meidän viimeisten tietojen mukaan useita UGT1A isoformit osallistuvat TSA glukuronisaatio [24], tässä tutkimuksessa keskitytään valaisemaan rooli näiden UGT määritettäessä kertymiseen solun ja apoptoottista vaikutusta TSA ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Täällä osoitti, että TSA glukuronoitumalla UGT-positiivisten syöpäsolujen vähentynyt TSA kertymiseen solun, hajosi NOQ1 laukaisema redoksijaksossa, ja näin vähensivät TSA aiheuttamaa ROS muodostumisen ja sen syövän vaikutusta.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines ja Culture

Ihmisen paksusuolen syövän solulinjat HT29 ja HCT116 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, USA). Solut kasvoivat McCoyn 5a (Gibco, USA) väliaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone, USA), 100 U ml

-1 penisilliiniä ja 100 mg ml: ssa

-1 streptomysiiniä 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä 5% CO

2. Eri tarkoitukseen, soluja viljeltiin 24-72 tunnin ajan väliaineessa, ja sitten lisättiin lääkeaineet. Trypsiiniä (2,5%), käytettiin solujen keräämisen. Kaikki solut mycoplasma ilmainen.

Kemikaalit ja reagenssit

TSA hankittiin National Institute for Control of Pharmaceutical ja biologisten tuotteiden (Peking, Kiina), ja valmistettiin osaksi kiinteän dispersion kanssa PEG6000 kuin on kuvattu [26]. Propofoli, 4-metyyliumbelliferonin (4-MU), mykofenolihappo (MPA), N-asetyylikysteiini (NAC), dikumarolityyppisten (DIC), glukoosi-6-fosfaattia, glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi, β-nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatin (NADP) , uridiini-5′-difosfaattiglukuronihapolla (UDPGA), D-sokerihappo hapon 1,4-laktoni, β-D-glukuronidaasia (Escherichia coli), klooritsoksatsonin, 2 ’, 7’-dikloorifluoresiinidiasetaattia (DCFH-DA), ja 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT), saatiin kaikki Sigmalta (St. Louis, MO, USA). Anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit hankittiin Bipec Biopharma Corporation (USA). Reaaliaikainen PCR-alukkeet havaitsemiseksi selostukset UGT1A1-, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A9-, ja UGT1A10 ostettiin Invitrogen (CA, USA). Vasta-aineita UGT1A (Abcam, USA), UGT1A9- (Abcam, USA), ja GAPDH (Boster Biology, Kiina) käytettiin Western blot-analyysi. Korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) luokka asetonitriili saatiin Fisher Scientific (Toronto, Kanada). Kaikki muut kemikaalit olivat HPLC-laatua tai paras laatu, joka oli kaupallisesti saatavissa.

Ohimenevä transfektio UGT1A siRNA

Ohimenevä transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, USA) valmistajan ohjeita. Lyhyesti, Stealth RNAi siRNA (Invitrogen, USA) UGT1A hiljaisuuden tai negatiivinen kontrolli sekoitettiin Lipofectamine RNAiMAX Reagent Opti-MEM I (Gibco, USA), jonka finial pitoisuus oli 20 nM, ja siRNA seos lisättiin sopiva kulttuuri levy huoneenlämmössä. Eksponentiaalisesti kasvavat solut myöhemmin kylvettiin transfektioseos sisältävä levy. Soluja inkuboitiin inkubaattorissa (5% CO

2) 37 ° C: ssa 24-72 tunnin ajan.

kvantifiointi mRNA-tasojen

Yhteensä mRNA uutettiin soluista, ja cDNA syntetisoitiin PrimeScrip RT reagenssia (Takara Biotechnology, Dalian, Kiina). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin SYBR Esisekoite Ex Taq II (TaKaRa Biotechnology, Dalian, Kiina) seuraten valmistajan ohjeita. Sekvenssit alukkeiden käytettävien reaaliaikainen PCR on listattu tukevia tietoja 1 (taulukko S1). PCR-olosuhteet olivat 95 ° C 1 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 5 sekunnin ajan, 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan.

Western blot -analyysi

Solut kerättiin ja kokonais-proteiini uutettiin. Proteiinipitoisuus määritettiin sitten käyttäen BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Kiina). Yhtä suuret määrät proteiinia (50 ug) ladattiin ja erotettiin SDS-PAGE-elektroforeesilla. Proteiinit siirrettiin sitten PVDF-kalvolle (PALL, USA). Blotit blokattiin kuoritun maidon 5% on TBST-puskurissa, ja inkuboitiin 24 tuntia 4 ° C: ssa tietyn ensisijaisen vasta-aineita. Kalvo pestiin 3 kertaa TBST: llä ja inkuboitiin sitten HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (KeyGen, Nanjing, Kiina) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Signaali visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssin (ECL, Millipore). Proteiini ekspressiotasoja normalisoitiin kanssa GAPDH.

UGT Activity Assay

UGT aktiivisuus esittämä substraatin glukuronidaatiota aktiivisuus solujen S9 jakeet. Solut kerättiin talteen 2,5% trypsiiniä ja pestiin jääkylmällä PBS: llä, homogenoitiin PBS: ssä, ja sentrifugoitiin 9000 g: ssä 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa, jolloin saatiin solujen S9 jakeet. Proteiinipitoisuutta S9 fraktioiden määritettiin käyttäen BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Kiina). Aiempien raporttien [27], [28], ei-spesifinen UGT1A substraatti 4-MU määrittämiseen käytettiin yleistä toimintaa UGT1A, ja MPA, joka on glukuronidoitua ensisijaisesti UGT1A9- määrittämiseen käytettiin UGT1A9- toimintaa. Lyhyesti, 4-MU tai MPA (0,5 mM) inkuboitiin 200 ul: ssa reaktioseosta, joka sisälsi 0,1 mg (0,2 mg MPA) solun S9 jakeet, 2 mM UDPGA, 1 mM sokerihappo hapon 1,4-laktonia, 5 mM MgCl

2, ja 50 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,4) 37 ° C: ssa 15 min (30 min MPA). S9 fraktiot esikäsiteltiin alamethicin pitoisuutena 25 ug mg

-1 jäissä 20 min. Sen jälkeen kun esi-inkuboitu 5 minuuttia 37 ° C: ssa, reaktio käynnistettiin lisäämällä UDPGA. Reaktiot pysäytetään lisäämällä 400 ui jääkylmää asetonitriiliä ja näytteitä sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 20000 g. Supernatanttinäytteet (100 ui) analysoitiin Shimadzu (Kioto, Japani) LC-2010C HPLC-järjestelmä, jossa on kvaternaarinen pumppu, autosampler, sarake uuni, ja UV-detektoria. Erottaminen suoritettiin käyttämällä Lunar-C18-pylvästä (250 x 4,6 mm i.d., 5 um, Phenomenex Inc., Kiina) ja esikolonni (Phenomenex Inc., Kiina). 4-Mu, liikkuva faasi oli asetonitriili (A) ja vettä ja 25 mM K

2HPO

3 (B), virtausnopeudella 1 ml min

1; eluutio suoritettiin seuraavalla gradientilla: 15% A (0-2 min), lineaarinen gradientti 15%: sta 60% A (2-5 min), 60%: sta 40% A (5-8 min), ja 15% A 8-10 min, ja sitten vielä 5 min tasapainotus kolonnin lämpötilassa 40 ° C, ja UV-detektio 322 nm: ssä. MPA, liikkuva faasi oli asetonitriili (A) ja vettä, jossa on 0,1% (v /v) etikkahappoa (B) virtausnopeudella 1 ml min

1; eluutio suoritettiin seuraavalla gradientilla: 45% (0-2 min), lineaarinen gradientti 45%: sta 80% A (2-8 min), 80% A: ta vielä 1 min, ja 45% A 9-10min ja sitten vielä 4 min tasapainotus kolonnin lämpötilassa 40 ° C, ja UV-detektio 250 nm: ssä. Tarkka kvantitointiin vastaperustetun glukuronideiksi saavutettiin kalibroimalla aitoja standardeja (Sigma, USA).

Glukuronidaatio määritys TSA S9 Fraktiot

S9-fraktio (0,25 mg) inkuboitiin ilmoitettu pitoisuudet TSA reaktioseoksessa, joka koostuu 2 mM UDPGA, 1 mM sokerihappo hapon 1,4-laktonia, 5 mM MgCl

2, ja NADPH-regeneroituva järjestelmä, joka sisältää 0,2 mM NADP 1,9 mM glukoosi-6-fosfaatin, 1,2 U ml

-1 glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi, ja 50 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,4) lopulliseen tilavuuteen 200 ui. S9-fraktio esikäsiteltiin alamethicin pitoisuutena 25 ug mg

-1 jäissä 20 min vähentää viivettä UGT toimintaa. Entsyymin kinetiikkaa määrityksessä, kun esi-inkuboitu 5 minuuttia 37 ° C: ssa, reaktio käynnistettiin lisäämällä UDPGA ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 60 min. Propofolin inhibition tutkimuksessa, propofoli (0-400 uM) oli inkuboitu yhdessä TSA (20 uM) 37 ° C: ssa 20 min. Kaikki reaktiot lopetettiin jääkylmää asetonitriiliä, mitä seurasi sentrifugointi 20,000 x g 10 min, jolloin saatiin supernatantit, ja analysoitiin sitten HPLC-systeemi sama kuin edellä on kuvattu menetelmä, joka perustuu edellisessä raportissa [24].

TSA kertymiseen solun ja Glukuronidaatio elävissä soluissa

Eksponentiaalisesti kasvavat solut 70% konfluenssiin altistettiin 20 uM TSA 0,5, 2, 6, 24 ja 48 tuntia. Solut ja viljelyväliaine kerättiin erikseen ilmoitettuina ajankohtina. Solut pestiin kolme kertaa jääkylmällä PBS: llä. Ultrapuhdasta vettä (300 ui) lisättiin kuhunkin soluun näytettä ja jäädytys /sulatus kolme kertaa rikkoa soluja. Joko solu- tai elatusaineessa näytteestä (100 ui), lisättiin jää-kylmällä asetonitriilillä (300 ui) ja sekoitettiin voimakas pyörre 5 min, mitä seurasi sentrifugointi 20,000 x g 10 min supernatantin saamiseksi, analysoitiin sitten HPLC-menetelmällä perustuvat edellisessä raportissa [24]. Lääkeainepitoisuudet normalisoitiin määrittämällä proteiinikonsentraatio solun näytteitä käyttäen BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Kiina).

ROS Pitoisuus

Indikoitu pitoisuus TSA oli ylläpitäjä solujen 70% yhtymäkohta 1 tunti. Sitten soluja käsiteltiin DCFH-DA: ssa 30 minuuttia ja pestiin jääkylmällä PBS: llä kolme kertaa. Cellular ROS voi keskustella kuin fluoresoiva DCFH-DA sen loisteputki johdannainen DCF. ROS muodostuminen analysoitiin mittaamalla fluoresenssi-intensiteetti DCF 535 nm (488 nm: n virityksellä) Synergy-H1 fluorimetriä (Bio-Tek Instruments).

Sytotoksisuusmääritys

Solut ympättiin 7000 solua per kuoppa 96-kuoppaiselle levylle ja inkuboitiin yön yli. Solut altistettiin sen jälkeen osoitettuihin konsentraatioihin TSA. 48 tunnin kuluttua (ja HCT116) tai 72 tuntia (HT29), MTT: tä (5 mg ml

-1) lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja levyä inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä 4 tuntia. MTT-liuos poistettiin ja 150 ui DMSO: ta, lisättiin kuoppaa kohti. Absorbanssi 570 nm: ssä mitattiin mikrolevylukijalla.

Apoptosis Assay

Solut ympättiin 2 x 10

5 /kuoppa 6-kuoppaiselle levylle ja saavutti 60% konfluenssin jälkeen 72 tuntia kulttuuriin. Sitten solut altistettiin ilmoitetun pitoisuuden TSA 48 tuntia (HCT116) tai 72 tuntia (HT29) ja kerättiin 0,25% trypsiini ilman EDTAa ja pestiin jääkylmällä PBS: llä. Anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (Bipec Biopharma Corporation, USA) käytettiin värjäämään solut mukaan valmistajan ohjeita. Näytteet analysoitiin käyttäen virtaussytometriä (BD FACSCalibur, USA).

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitetään keskiarvoina ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Tilastolliset erot kahden ryhmän arvioitiin käyttämällä Studentin t-testiä; useita vertailuja, yksisuuntaisella varianssianalyysillä, jota seuraa Dunnetin testiä sovellettiin. Ero pidettiin merkitsevä * P 0,05, ** P 0,01, tai *** P 0,001.

Tulokset

Useita UGT1A isoformit Positiivisesti ilmoitettuna HT29 muttei HCT116 solut

ensin arvioitiin ekspressiotasot UGT1A isoformit, jotka olivat mukana TSA glukuronidaatiota reaaliaikaista PCR sekä HT29 ja HCT116 solulinjoissa. Kuvio 1A esittää geenin ilmentymisen mallia UGT1A isoformien HT29. Sitä vastoin ei ilmentymistä UGT1A geenien havaittiin HCT116-soluissa (tietoja ei ole esitetty). Jotta voitaisiin edelleen tutkia roolia UGT erityisiä siRNA käytettiin vaientamaan UGT1A geenejä HT29. Kolme paria siRNA: iden kohdistuu UGT1A sekvenssi suunniteltiin, ja paras pari, jolla on korkein hiljentäminen vaikutuksia yhdessä ei-spesifisen siRNA Negatiivisena kontrollina tutkittiin. Sen jälkeen siRNA transfektioissa, mRNA-tasot arvioitiin HT29. MRNA-tasot UGT1A1-, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A9-, ja UGT1A10 vähenivät 85,8%, 31,4%, 87,5%, 66,5%, ja 68,2%, vastaavasti, kun taas negatiivinen kontrolli siRNA oli vain vähän vaikutusta (kuvio 1A). Western blot -määritys tuettu korkean ekspressiotason UGT1A vuonna HT29, kun taas mitään havaittavaa UGT1A proteiini havaittiin HCT116-soluissa (kuvio 1 B). Proteiini ilmentyminen koko UGT1A ja erityisten UGT1A9 oli jyrkästi vähentynyt UGT1A siRNA HT29 (kuvio 1 B ja 1 C). Tulokset UGT toiminnan testi osoitti, että HT29 omaavat suuren kapasiteetin kohti glukuronidaatiota 4-MU, yleinen UGT1A alustalle, ja MPA suhteellisen erityinen UGT1A9 koetin. 4-MU ja MPA glukuronisaatio toimintaa vähennettiin kanssa UGT1A siRNA transfektio 85,6% ja 57%, vastaavasti (kuvio 1 B ja 1 C). Yhdenmukainen mRNA ja proteiini tasoilla tarkastus, ei UGT1A erityisiä entsymaattista aktiivisuutta havaittiin HCT116-soluissa (kuvio 1 B).

Soluja esikäsiteltiin UGT1A siRNA, ei-spesifistä siRNA (negatiivinen kontrolli) tai vehikkelillä 48 tuntia. (A) mRNA tasot UGT1A isomuotojen in HT29. UGT1A1 mRNA taso Solujen ajoneuvo otettiin 1; (B) proteiini tasoilla ja entsyymin toimintaa UGT1A; (C) proteiini tasoilla ja entsyymin toimintaa UGT1A9. Yhteensä UGT1A aktiivisuus määritettiin nopeuden ilmaisemiseksi 4-Mu glukuronidaatiota ja UGT1A9- spesifinen aktiivisuus määritettiin nopeuden ilmaisemiseksi MPA glukuronidaatiota. Entsyymiaktiivisuus ilmaistaan ​​nmol per min per mg proteiinia. UGT1A toimintaa 0,1 nmol min

-1 mg

-1 pidettiin nondetectable (ND). Tulokset esitetään keskiarvona ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

esto UGT1A Expression tai UGT1A9 Activity Vähentää TSA Glukuronidaatio in HT29 Cell S9 Fraktiot

Saada käsitys TSA glukuronidaatiota paksusuolen syöpäsoluissa, suoritimme entsyymin kineettinen määritys käyttäen S9 jakeet valmistettu HT29 kanssa tai ilman UGT1A siRNA hoitoa. Yhdenmukainen edellisessä tutkimuksessa [24], M1 ja M2, pari regioisomeerien TSA katekoli glukuronideina, havaittiin alkaen HT29 muttei HCT116 solu S9 jakeet. TSA glukuronidaatiota näytetään tyypillinen Michaelis-Menten-kinetiikkaa (kuvio 2A ja 2B). Kinetic parametrit, kuten näennäinen K

m, maksimi nopeus (V

max), luontainen puhdistuma (CL

int, V

max /K

m) M1 ja M2, ja summa CL

int (M1 + M2) on koottu taulukkoon 1. vaiennettu UGT1A isoformien UGT1A siRNA lyijyä on noin 10-kertainen pieneneminen V

maksimiarvot tuottavilla M1 ja M2, kun taas oli vähän vaikutusta K

m arvoja. Näin ollen CL

int M1 ja M2 ja summa CL

int (M1 + M2) on UGT1A hiljaisuuden ryhmässä olivat noin 10 kertaa pienempi kuin negatiivisen kontrolliryhmän.

entsyymikinetiikka muodostumiselle TSA glukuronidiin (M1 ja M2) tutkittiin (A) solu S9 jakeet valmistettu HT29 esikäsitelty negatiivinen kontrolli siRNA, ja (B) solujen S9 jakeet valmistettu HT29 esikäsitelty UGT1A siRNA. (C) inhiboivaa vaikutusta propofolin (0-400 uM) TSA glukuronoitumalla HT29 solussa S9 jakeet. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

estävää vaikutusta propofolin TSA glukuronoitumalla HT29 solufraktioiden tutkittiin myös. Koska UGT1A9 tietyn alustan [8], propofoli osoitti noin 25% esto sekä M1 ja M2 100 uM, ja noin 40%: n esto 400 uM (kuvio 2C).

UGT1A mittaava TSA Kertyminen Colon Cancer solut

voit testata, onko UGT1A voi vaikuttaa TSA sijoitettuun elävissä soluissa, teimme cellular farmakokineettinen tutkimus. Dynaaminen solunsisäinen kerääntyminen TSA ja sen metaboliittien (M1 ja M2) määritettiin. Kiinnostaa, solunsisäinen taso TSA jatkuvasti kasvanut aikana 48 tunnin kuluessa TSA hoidon HCT116-soluissa. Kuitenkin TSA pitoisuus HT29 oli korkeimmillaan 6 tuntia ja laski sitten rajusti (kuvio 3A). Alue käyrän alla 0-48 tuntia (AUC

0-48 h) ja suurin pitoisuus (C

max) TSA HCT116 olivat paljon suurempia kuin vuonna HT29 (taulukko 2). Esikäsittely HT29 propofolia aiheutti huomattavan lisäten solujen kertymistä TSA. Vastaavasti, UGT1A siRNA transfektio lisäsi myös TSA kertymistä HT29 (kuvio 3A, taulukko 2). Sekä M1 ja M2 oli havaittavissa HT29 0,5 tunnin kuluttua TSA hoidon, mikä viittaa nopea solunsisäisen tuotannon glukuronideiksi. Solunsisäisen tasot M1 ja M2 oli korkeimmillaan 6 tuntia, ja sitten laski (kuvio 3B ja 3C), kun taas taso TSA glukuronideina viljelyalustassa kertynyt jatkuvasti aikana havaitseminen (kuvio 3D ja 3E). Muodostumista M2, mutta ei M1, laskettiin joko propofoli tai UGT1A siRNA transfektion HT29 (kuvio 3B ja 3C, taulukko 2). Sekä propofoli ja UGT1A siRNA merkittävästi vähentynyt muodostuminen TSA glukuronideina M1 ja M2 elatusaineessa (kuva 3D ja 3E, taulukko 2).

HT29-soluja esikäsiteltiin UGT1A siRNA tai ajoneuvon 48 tuntia, tai esikäsitelty propofolia (100 uM) 1 tunti. Sitten solut altistettiin TSA (20 uM), 0,5, 2, 6, 24, ja 48 tuntia ja näytteitä sekä viljelyalustan ja solut kerättiin ja valmistettiin HPLC-analyysiä varten. TSA ja sen glukuronideiksi (M1 ja M2) havaittiin perustuvaa menetelmää meidän edellisessä raportissa [24]. (A) solunsisäinen TSA HT29 tai HCT116-solut; (B) solunsisäinen M1 HT29; (C) solunsisäinen M2 HT29; (D) M1 HT29 soluviljelyalustassa; (E) M2 HT29 soluviljelyalustassa. Data näytetään keskimääräisenä ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

UGT1A Vähentää TSA-indusoidun ROS Formation

Olemme aiemmin osoittaneet, että TSA läpikäy NQO1 aineenvaihdunta tuottaa on erittäin epävakaa katekoli väli, joka voitaisiin joko konjugoituna UGT tai palasivat itsestään takaisin vanhemman TSA muodostaen turha redoksijaksossa liian suuria määriä ROS tuotanto [23]. Lisäksi olemme havainneet, että TSA tuotti merkittävän tason ROS NSCLC-soluja, NQO1 positiivinen ja UGT negatiivinen solulinjassa [25]. Meillä on siis perusteltu, että läsnäolo UGT1A, TSA-laukaisi redoksijaksossa voidaan kytkeä metabolista poistamista ja vähentää siten tuotantoa ROS. Tutkia tämän hypoteesin, DCF värjäys Määritys suoritettiin seuraamaan TSA-indusoidun ROS muodostumista. TSA indusoi annoksesta riippuvaa muodostumista ROS HCT116-soluissa (kuviot 4A). Nämä muutokset ROS muodostumista ei havaittu HT29 (kuvio 4B). Kun propofoli käytettiin estämään UGT1A9 aktiivisuutta HT29, TSA aiheuttama ROS tason merkitsevästi kasvoi noin 3,6-kertainen 40 uM TSA, ja tämä kasvu kääntyi NAC (kuva 4B). Sen sijaan, propofoli ei muuttanut TSA aiheuttamaa ROS tasolla HCT116-soluissa, mutta yhdistelmä NAC edelleen laskenut TSA aiheuttamaa ROS tason (kuviot 4A). Lisäksi, UGT1A siRNA transfektio myös tehostaa merkittävästi ROS tasoilla 2,0-kertainen 40 uM HT29 (kuvio 4C).

Soluja esikäsiteltiin UGT1A siRNA tai ei-spesifisiä siRNA (negatiivinen kontrolli) 48 tunnin ajan tai esikäsitelty propofolia (100 uM) /NAC (5 mmol) 1 tunnin ajan. Sitten solut altistettiin TSA (5, 20, 40 uM) 1 tunti ja sen jälkeen käsiteltiin DCFH-DA. Fluoresenssi-intensiteetti mitattiin fluorometrillä. (A) HCT116-solut; (B) ja (C) HT29. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD vähintään neljän itsenäisen kokeen (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, TSA hoito vs. verrokki-solut;

# P 0,05,

# # P 0,01,

### P 0,001, propofoli /NAC esikäsittely vs TSA vain, tai UGT1A siRNA esikäsittely vs negatiivinen kontrolli siRNA esikäsittely).

UGT1A Aiheuttaa resistanssi Colon Cancer solut TSA-indusoitua sytotoksisuutta

Ylimääräinen ROS voi aiheuttaa häiriöitä solunsisäisen redox homeostaasin, ja peruuttamaton oksidatiivisen muutokset lipidi-, proteiini- tai DNA: ta, sen jälkeen edistää solujen apoptoottisen kuoleman kautta sekä kuoleman reseptori ja mitokondrioiden-välitteisen reittejä [29 ]. Olemme äskettäin vahvistettu, että TSA-indusoitu sytotoksisuus on ROS riippuvainen [25]. Koska läsnä UGT1A in HT29 vaarantunut tuotanto ROS, ehdotamme, että ilmentyminen UGT1A geenien lisäisi vastus syöpäsolujen TSA-indusoidun sytotoksisuuden. Tätä varten, MTT-määritys suoritettiin sekä HT29 ja HCT116-soluissa. Tulokset osoittivat, että TSA tuotettu dramaattinen sytotoksisuuden HCT116 soluissa, jotka ilmentävät ei UGT1A kanssa IC

50-arvoon 4,5 ± 0,4 uM (kuvio 5A). Sen sijaan, HT29, jotka ekspressoivat runsaasti UGT1A entsyymejä, todettiin erittäin vastustuskykyinen TSA sytotoksisuutta IC

50-arvo 54,3 ± 4,7 uM (kuvio 5B). Esikäsittely propofoliin estävän UGT1A9 aktiivisuutta huomattavasti TSA sytotoksisuuden HT29 kanssa IC

50-arvoon 29,9 ± 4,5 uM (kuvio 5B), joka purettiin yhdistelmä NAC (IC

50 80 uM) . Vuonna HCT116-soluissa, propofolin tehostettu TSA sytotoksisuus ei havaittu, mutta NAC yhdistelmä aiheutti suuren TSA vastus (kuvio 5A). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että vaikutus propofolin HT29 on peräisin esto UGT1A9 ja edistää näin turha redoksijaksossa TSA. Johdonmukaisesti, UGT1A siRNA transfektiot myös parannettu sytotoksista vaikutusta TSA HT29 ja vähensi IC

50 arvon 25,9 ± 5,6 uM (kuvio 5C).

Soluja esikäsiteltiin UGT1A siRNA tai ei- erityiset siRNA (negatiivinen kontrolli) 24 tunnin ajan, tai esikäsitelty propofolia (100 uM) /NAC (5 mmol) 1 tunnin ajan. Sitten solut altistettiin kaltevuus pitoisuuksia TSA (2,5-80 uM HT29, 0,5-40 uM HCT116) ja ilmoitettuina ajankohtina, ja MTT-analyysi suoritettiin. (A) HCT116-solut; (B) ja (C) HT29. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD vähintään neljän itsenäisen kokeen (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001).

UGT1A kompromisseja TSA-indusoitu apoptoosi Colon syöpäsolut

edelleen tutkia roolia koko UGT1A ja UGT1A9 TSA välittämän syövän vastainen vaikutus, solujen apoptoottista kuolemaa tutkittiin jonka anneksiini V-FITC /PI värjäystä määrityksessä. Kun HT29-soluja altistettiin ilmoitetun pitoisuuden TSA 72 tuntia, oli vähän havaittavissa apoptoottisia soluja (kuvio 6B). Kuitenkin apoptoottista kuolemaa havaittiin HCT116-soluissa sen jälkeen, kun 48 tunnin TSA altistumisen annoksesta riippuvalla tavalla. Apoptoottista solukuolemaa oli 20,7 ± 1,7%, 30,8 ± 2,4%, ja 48,7 ± 3,0%: lla TSA pitoisuuksilla 5, 20 ja 40 uM, vastaavasti (kuva 6A). Propofoli (100 uM) merkittävästi palautti herkkyyttä HT29 TSA aiheuttamaa apoptoottista kuolemaa, mistä pohjapinta apoptoottista tasoilla apoptoottisen suhde 27,8 ± 4,5%, 45,0 ± 3,5%, ja 53,5 ± 14,7%: iin 5, 20, ja 40 uM TSA, vastaavasti (kuvio 6B). Propofol-parannettu apoptoosia ei havaittu HCT116-soluissa (kuvio 6A). Vastaavasti, UGT1A siRNA transfektio lisääntyi TSA-indusoitua apoptoosia in HT29, kuvaavat 16,2 ± 1,4%, 40,3 ± 4,3%, ja 48,5 ± 3,2% apoptoottisia soluja TSA pitoisuuksilla 5, 20 ja 40 uM, vastaavasti (kuvio 6C ).

Soluja esikäsiteltiin UGT1A siRNA tai ei-spesifisiä siRNA (negatiivinen kontrolli) 72 tunnin ajan, tai esikäsitelty propofolia (100 uM) 1 tunti. Sitten solut altistettiin TSA (5, 20, 40 uM) ja osoitetun ajan ja kerättiin. Solut värjättiin anneksiini V-FITC /PI ja tutkittava virtaussytometrialla. (A) HCT116-solut; (B) ja (C) HT29. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, TSA hoito vs. verrokki-solut;

# P 0,05,

# # P 0,01,

### P 0,001, propofoli esikäsittely vs TSA vain, tai UGT1A siRNA esikäsittely vs negatiivinen kontrolli siRNA esikäsittely).

keskustelu

Monet anti -cancer aineet ovat substraatteja UGT, ja tästä syystä, toiminnallinen merkitys UGT aiheuttamisessa kemoterapeuttisten vastus on tullut tärkeä huolenaihe. Huolimatta aiempien pyrkimyksiin korjata tätä tärkeää asiaa, hyvin vähän tiedetään suora vaikutus UGT ilmaistuna tuumorikudoksissa /solujen määrittämisessä kertymiseen solun ja tuloksena syövänvastainen vaikutus sellaisista aineista, jotka ovat UGT ”substraatteja. Me osoitamme tässä tutkimuksessa, että ekspressiotaso UGT1A, ja erityisesti UGT1A9-, on tärkeä tekijä määritettäessä solunsisäisen kertymisen ja apoptoottinen vaikutus TSA ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa.

edellisessä tutkimuksessa havaittiin, että UGT1A isoformeja, mukaan lukien UGT1A1-, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A10 ja erityisesti UGT1A9, ovat hallitseva osallistuvia entsyymejä glukuronisaatiota TSA sen jälkeen vähennys NQO1. Vaikka UGT2B7 voidaan mukana tuotannon M1 ja kokonaisvaatimukseen glukuronidaatiota TSA, CL

int (M1 + M2) arvo UGT1A9 oli paljon suurempi kuin UGT2B7 [24]. Ja HT29, pohjapinta ilmaus UGT2B7 on paljon pienempi kuin UGT1A9- (kuvio S1). Tähän havaintoon perustuen, vaiennettaisi UGT1A mukaan UGT1A siRNA ja inhibointi UGT1A9 mukaan propofolia tutkittiin TSA aineenvaihdunnasta ja myrkyllisyydestä tässä tutkimuksessa.

HT29 oltava riittävät UGT entsyymiaktiivisuuden glukuronidaatti TSA sekä S9 fraktiot ja elävien solujen (kuvio 1, 2, 3).