Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Perusongelmana syöpätutkimuksessa on tunnistaa solutyyppi, joka kykenee ylläpitämään neoplastisen kasvun ja sen peräisin normaalin kudoksen soluista. Viimeaikaiset tutkimukset eri kasvaintyyppien on osoitettu, että fenotyypiltään tunnistettavissa ja erotettavat subfraktioita solujen hallussaan kasvaimen muodostava kyky. Esillä paperi, käyttäen kahta linjaa liittyvää ihmisen melanoomasolulinjaan ensisijainen melanoomalinja IGR39 ja sen metastasoitunut johdannainen linja IGR37, kaksi havainnot raportoidaan. Ensimmäinen on ensimmäinen fenotyyppinen todisteita alkuperän melanoomasyövälle kantasolujen (CSCS) mutatoituneista kudoksen kantasolujen; ja toinen on tunnistaa aggressiivisemman alapopulaatio CSCS melanooman jotka ovat CXCR6 +.

Methods /Havainnot

määritellään CXCR6 uudeksi biomarkkeri kudosspesifisiä kantasolujen epäsymmetrinen self -renewal. Näin ollen suhde melanooman muodostumisen ja ABCG2 ja CXCR6 ilmentyminen tutkittiin. Yhdenmukainen niiden ei-metastasoituneen luonne, lajittelematonta IGR39 solut muodostivat huomattavasti pienemmät kasvainten kuin lajittelematonta IGR37 soluja. Lisäksi, ABCG2 + solujen kasvaimia, jotka oli 2-kertainen massa kuin kasvainten tuottamia lajittelemattomien soluja tai ABCG2- soluja. CXCR6 + solut tuottivat aggressiivisempia kasvaimia. CXCR6 tunnistaa useampia erillisiä alapopulaatio viljeltyjen ihmisen melanoomasolujen kanssa aggressiivisempi MCSC fenotyyppiin kuin solut valitaan sen perusteella, että ABCG2 + fenotyyppiä yksin.

Johtopäätökset /merkitys

yhdistys aggressiivisemman kasvain ilmiasuun epäsymmetrinen itseuudistumisen fenotyyppi paljastaa aikaisemmin tunnistamattomia näkökohta kasvainsolun fysiologia. Nimittäin, säilyttäminen joidenkin kudosspesifisiä kantasolujen ominaisuuksia, kuten kyky epäsymmetrisesti itse uudistaa, vaikuttaa luonnollinen historia ihmisen kasvaimen kehitystä. Tieto tämän uuden piirteen kasvaimen kehittymistä ja etenemistä voi antaa uudet tavoitteet syövän ehkäisyyn ja hoitoon.

Citation: Taghizadeh R, Noh M, Huh YH, Ciusani E, Sigalotti L, Maio M, et al. (2010) CXCR6, uutena määritetyn biomarkkereiden kudosspesifisiä Stem Cell Epäsymmetrinen Self-Renewal, Tunnistaa aggressiivisempia Human Melanooma Cancer Stem Cells. PLoS ONE 5 (12): e15183. doi: 10,1371 /journal.pone.0015183

Editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Kanada

vastaanotettu: 05 elokuu 2010; Hyväksytty: 28 lokakuu 2010; Julkaistu: 22 joulukuu 2010

Copyright: © 2010 Taghizadeh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National institues terveysministeriön johtajan Pioneer Award # 5DP1OD000805 ja National Italian avustus COFIN 2008. rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä kemoterapian tehoa usein heikentynyt joko luontainen tai hankittu kasvain vastus, ilmiö kutsutaan monilääkeaineresistenssi (MDR) [1]. MDR voi johtua useita erillisiä järjestelmiä, muun muassa vähentämällä huumeiden kertymistä kasvainsoluissa [1]. Mekanismi, joka on useimmin laboratoriossa on lisääntynyt ulosvirtausta laaja luokka hydrofobisten sytotoksisten lääkkeiden välittyy yksi perheen energiariippuvainen kuljettajat (ABC perhe) [2]. Vaikka useat superperheen jäsenillä on omistettu erityisesti toiminnot, jossa kuljetetaan erityisten substraattien, on yhä selvempää, että monimutkainen fysiologinen verkoston ABC kuljettajat on keskeinen rooli isännän vieroitus ja suojelu kehoa ksenobioottien. Niistä ihmisen ABC superperheen, vain ABCB1, ABCC1 (MDR1) ja ABCG2 on tähän mennessä osoitettu välittävän MDR, joista jokaisella on erillinen päällekkäisiä ulosvirtauksen substraattispesifisyydet ja kudosten leviäminen [3]. Täyttävät rooli vieroitus, useat ABC kuljetusyritys on havaittu olevan yli-ilmentynyt syöpäsolulinjoissa viljelty selektiivisissä paineessa. Erityisesti ABCB5 yliekspressoituu melanooma, ja ABCG2 on ilmaistaan ​​subsellulaarisista CD133-positiivisia melanoomasoluja [4], [5].

Tässä raportissa selvitettiin uusi ehdokas melanoomasyövälle kantasolujen (MCSC) merkki, sytokiinin co-reseptorin CXCR6, suhteessa ominaisuuksien ABCG2 ilmentävien MCSCs. Tärkeä ratkaisematta kysymys alalla syövän kantasolujen (CSC) tutkimus on, onko suora linjaa suhde CSCS ja kudosten kantasolujen (TSSCs) löytyy normaaleissa kudoksissa, joista syövät syntyvät. On syytä tunnistaa merkkiaineiden erottaa tuumorigeenisia ulkopuolisten tuumorigeenisiä soluista [6]. CD133 ilmennetään useimpien Melanoomasolulinjojen [4], ja se ei tunnu pysty erottamaan tuumorigeenisiä ulkopuolisten -tumorigenic soluihin [6]. Lisäksi viime aikoina, Weissman ryhmä varmisti aggressiivisemman alaryhmän CD217 + ihmisen melanooman [8]. Ryhdyimme irtoa kokeellista valaista tätä asiaa tutkimalla aikaisemmin kuvatulla melanoomaan CSCS liittyy vakiintunut Melanoomasolulinjojen [4], [6] todisteita epäsymmetrinen itseuudistumisen, tietty ominaisuus TSSCs [7], [9]. Tämän arvioinnin käytimme uuden biomarkkereiden että osoitamme täällä liittyvän epäsymmetrinen itseuudistumisen, kemokiinireseptori CXCR6. Aiemmissa tutkimuksissa, CXCR6 tunnistettiin co-reseptori ihmisen immuunikatovirus infektion lymfosyyttien [10]. Alhainen CXCR6 ilmentymisen on myös todettu nimenomaan muisti /efektori Th1-solut ääreisverenkierrossa [11]. Viime aikoina, ilmentymistä CXCR6 liittyi ihmisen kasvaimista, mukaan lukien melanooma [12] – [14]. Tässä osoitamme, perustuu tutkimuksiin hiirellä solulinjojen geneettisesti tehdään epäsymmetrinen itseuudistumisen kuten TSSCs, että sekä kuvio ja taso CXCR6 ilmentyminen nimenomaan liittyy epäsymmetrinen itseuudistumisen jako.

Katsoimme yhteistyölle yhdistys CXCR6 ilmaisun ja ABCG2 ilmaisutapoja MCSC aktiivisuutta ja näyttöä laskeutuminen melanooman CSCS peräisin TSSCs. Itse asiassa, huomaamme, että suuri osa ABCG2-positiivisten melanoomasoluja, joilla tiedetään CSC ominaisuudet, myös ilmaista CXCR6. Lisäksi, kuten ABCG2 ekspressoivia melanoomasoluja, CXCR6-ilmentävät solut ovat pieni murto-osa soluista primaareihin, metastaattisen melanooman solulinjat ja ihmisen melanooma biopsianäytteistä.

In vivo

CXCR6 + melanoomasolujen tuottanut kasvaimen vähemmän aikaa kuin ABCG2 + soluja ja enemmän kiinnostavaa, negatiivinen alapopulaatio ei antanut kasvain. Tämä fenotyyppisiä co-yhdistys CXCR6, biomarkkeri epäsymmetrinen itseuudistumisen ei-syöpäsoluissa, CSC aktiivisuus kasvain- solujen on havaittu olevan suoria linjaa suhde TSSCs ja CSCS ollessa kyseessä melanosyyttisoluista ja melanooma, vastaavasti .

olemme lopuksi tunnettu alaryhmästä ABCG2 + /ABCG2- ja CXCR6 + /CXCR6- melanooman n ilmentämiseen melanoomaan liittyviä antigeenejä (MAA) ottaen huomioon mahdollisen immunoterapeuttisen lähestymistapaa vastaan ​​aggressiivisempi osapopulaatioiden ilmentävät ABCG2 ja /tai CXCR6.

tulokset

tunnistaminen CXCR6 biomarkkerina varten epäsymmetrisen itseuudistumisen jako

Aikaisemmin olemme raportoineet tutkimuksia geenimuunnossolulinjoissa viljelty solu malli, joka tarjoaa kokeellisesti ohjattu epäsymmetrinen itseuudistumisen osastojen samankaltaisia ​​kuin TSSCs [15], [16], [17]. Solut sisältävät Zn-säännelty villityypin p53-cDNA-geenin. Zn-väliaineessa, nämä solut jakautuvat symmetrisellä solun kinetiikan, tuottaa kaksi pyöräily solua kustakin jako. Näiden rajapintojen malli symmetrinen tekstiilisuojalauseke rajapinnat, joihin kaksi kantasoluja tuotetaan. Vuonna ZnCl

2-viljelyväliaineeseen, seurauksena normaalin p53 ilmentymisen indusoivat epäsymmetrinen itseuudistumisen alueet, joille ovat ominaisia ​​rajapintojen, jotka tuottavat yhden pyöräily sisko ja yksi sisko että pidätysten on G1 /S. Näiden rajapintojen malli epäsymmetrinen tekstiilisuojalauseke rajapintojen, jotka tuottavat yhden kantasolujen ja toinen solu, joka joko erottaa tai toimii kantaisä varten eriyttää solulinjaan.

geeni mikro-array analyysit (NCBI-GEO tietokanta, http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=dlmlzmuowumsqxy acc=GSE25334),

Cxcr6

tunnistettiin geeni, jonka ilmentyminen oli havaittavissa symmetrisesti itseuudistuvien kongeeniset p53-null ohjaus soluja kasvatettiin ZnCl

2-täydennetty väliaine. Kuitenkin, se indusoitiin p53-indusoituva läpikäyvien solujen epäsymmetrinen itseuudistumisen samoissa viljelyolosuhteissa. Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysit paljastivat, että symmetrisesti itseuudistuvien soluissa ilmaisivat

Cxcr6

mRNA havaittavissa määrin; mutta sen ilmentyminen kasvoi 8,6 ± 4,4 kertaisesti (n = 6 analyysit; p = 0,002) soluissa indusoitu siirtyä epäsymmetrinen itseuudistumisen.

Ensimmäinen mikro-array analyysit osoittivat myös, että epäsymmetrinen itseuudistumisen oli pakollista suurenemisen

Cxcr6

ilmaisu; ja siten osoitti, että lisääntynyt ekspressio ei johtunut p53 ilmaisua yksin.

Cxcr6

ilmentyminen oli myös detektoitavissa kongeeniset p53-indusoituva soluja geneettisesti, joissa on pakotettu ilmentyminen tyypin II inosiinimonofosfaattidehydrogenaasin geenin (IMPDH II), jopa silloin, kun p53: n ilmentyminen indusoitiin. Expression of IMPDH II, nopeutta rajoittavaa entsyymiä solujen guaniini ribonukleoti- biosynteesiä, estää p53 aiheuttama epäsymmetrinen itseuudistumisen jättäen p53-riippuvaista geenisäätelyn ehjä [16], [18], [19]. Tätä perustetta,

Cxcr6

määriteltiin tietty ”epäsymmetrinen itseuudistumisen liittyvä (ASRA)” geeni.

tutkimiseksi ASRA biomarkkereiden ominaisuuksien CXCR6 proteiinia, tutkimme sen rakenteessa ilmaisun selvitettiin epäsuoralla

in situ

immunofluoresenssilla (ISIF) havaitseminen kahdessa liittyvien yksisoluiset itseuudistumisen kuvio määrityksissä. Ensimmäisessä, sisar pari määritys (SP; [19]), solut levytettiin riittävän alhainen tiheys, jotta rajauksen sisaren solujen suhteellisen lähemmäs jälkeen jako. Toisessa, solut analysoidaan sen jälkeen, kun jako on läsnä sytokalasiini D (CD; [20]). CD estää sytokineesi, mutta ei estä ydinaseiden jako. Binucleated solut täten tuotti tarjota varmempi vertailun sisaren ytimeksi.

Aiemmissa sovelluksissa SP (aiemmalta nimeltään ”tytär pari;” [19] ja CD määrityksiä bromideoksiuridiinia (BrdU) sisällyttäminen käytettiin merkkiaine pyöräily S-vaiheen soluja. Toistaiseksi tutkimuksissa käytimme solusyklin vaihe-spesifistä proteiinia sykliini A: indikaattorina pyöräily soluja. sykliini A on hyvin kuvattu markkeri pyöräily solujen joka lisää asteittain tason lopusta G1 vaiheeseen G2 vaihe solusyklin [21]. epifluoresenssitoimintatilassa micrographs kuvassa. 1 näytä miten välilliset ISIF voidaan käyttää SP ja CD määrityksiä erottaa epäsymmetrisesti itseuudistuvien soluja (ASYM) päässä symmetrisesti uusimiseksi (SYM). olosuhteissa edistävien symmetrinen itseuudistumisen, sisko solujen parien ja CD-pidätti binucleated soluilla tiheä symmetrinen sykliini A: tunnistus. Sen sijaan, olosuhteissa, jotka edistävät epäsymmetrinen itseuudistumisen, epäsymmetrinen kuvio sykliini A: ilme on huomattavasti useammin.

Näkyy ovat esimerkkejä epifluoresenssilla ja vaihekontrasti micrographs rinnakkaisista SP ja CD-analyysit, kuten tekstissä on kuvattu. SYM, symmetrinen itseuudistumisen (kongeeniset p53-null suunniteltu solulinjoja kasvatetaan ZnCl

2-täydennetty väliaine). ASYM, epäsymmetrinen itseuudistumisen (Zn-riippuvaisten, p53-indusoituva muokattuja soluja kasvatettiin ZnCl

2-täydennetty väliaine). DNA, DAPI tuman DNA fluoresenssi. CyArta, epäsuora ISIF spesifisten vasta-aineiden sykliini A. CXCR6, epäsuora ISIF erityisiä vasta-aineita CXCR6. Huomaa, että ASYM tilassa, CXCR6 on säädellään ylöspäin pyöräily solussa, joka malleja epäsymmetrisesti itseuudistuvien TSSCs. Phase, vaihekontrasti mikrovalokuva. Asteikko bar = 50 mikronia.

Kuten kuviossa. 1, CXCR6 proteiinia ei havaita sekä sytoplasmassa ja tumassa geneettisesti muokattujen solujen käyttää tunnistamaan CXCR6 kuin ASRA biomarkkerina. Taso ydin- ilmaisu on korkeampi soluissa olosuhteissa epäsymmetrinen itseuudistumisen, sopusoinnussa mRNA ekspressiotietojen, joka kuvattiin aikaisemmin. Sekä SP ja CD analyysit, olosuhteissa symmetrinen itseuudistumisen, CXCR6 proteiini havaitaan molemmissa ytimissä sisko soluja. Sen sijaan, olosuhteissa, jotka edistävät epäsymmetrinen itseuudistumisen, solut on korkeampi taajuus epäsymmetrinen ilmaisun malli, joka on myös suoraan korreloi epäsymmetrinen kuvio sykliini A. määrällisiä CD analyysit, olosuhteissa, symmetrinen itseuudistumisen, vain 6 % of binucleated soluista osoitti koordinoida epäsymmetrinen ilmaus sykliini A ja CXCR6; kun taas 27% osoitti tämän tietty kuvio olosuhteissa epäsymmetrisen itseuudistumisen (p = 0,001). Nämä havainnot tunnistaa CXCR6 ensimmäisenä kuvatun sääteli biomarkkereiden solujen käynnissä epäsymmetrinen itseuudistumisen kuten TSSCs.

ABCG2 ja melanooma muodostumista

Tuoreessa ryhmämme julkaisi että ABCG2 on ilmaistaan ​​alapopulaatio ihmis-melanooma-solut (solulinja WM115), joka ilmaisee korkeaa CD133 [4]. Olemme laajennettu tämä analyysi ABCG2 kaksi ylimääräistä melanoomasolulinjoja peräisin samasta melanoomapotilaan: primäärisen melanooman solulinja IGR39 ja siihen liittyvän metastaattisen linjan IGR37.

Ensinnäkin, kuten on esitetty taulukossa 1, analysoitiin kolme polymorfismit C /A (421 C A), C /T (S248T) ja C /T (F208S) lajittelemattoman väestön ja ABCG2 + ja ABCG2- lajitellaan -alapopulaatioiksi paljastaen heterotsygoottinen tila ABCG2 kaikkien kolmen polymorfismit. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​alkuperä solulinjojen samasta potilaasta. Olemme keskittyneet näistä polymorfismien koska SNP 421C A on yleisin eri etnisten ryhmien [22] ja on liittynyt vähentynyt ilmentyminen ABCG2 proteiini [23]. Lisäksi F208S ja S248P polymorfismien liittyi viallisia kuljettamiseen aktiivisesti metotreksaatin ja hematoporfyriini [24]; ja erityisesti F208S muunnosproteiineihin (sekä glykosyloitu ja kypsymättömiä muotoja) tunnustetaan väärin laskostuneet proteiinit mukaan otaksuttu ”tarkastuspisteiden” järjestelmät ja helposti tehdään ubiquination ja proteiinien hajoamisen proteasomien [25].

vastaavasti ~11% ja -40% soluista aktiivisesti kasvattamalla IGR37 ja IGR39 oli havaittavissa lauseke ABCG2 (Fig. 2). IGR37 ja IGR39 solut lajiteltiin ABCG2 + ja ABCG2- alapopulaatioille ja istutetaan NOD-SCID-hiirissä (n = 3 kussakin alaryhmässä arvioitu). Lajittelemattoman soluja injektoitiin myös NOD-SCID-hiirissä (n = 3), vertailun vuoksi. Kahden kuukauden kuluttua hiiret kaikista kohortit uhrattiin. Kasvainmassat leikattiin, kuvaamisen, punnittiin ja hajotettiin eristää yksisolususpensioita tarkempaa analysointia varten. Kuten on esitetty taulukossa 2 ja kuviossa. 3, transplantaation ABCG2 + IGR37 soluissa johti kasvaimissa 2 kertaa suurempi massa keskimäärin verrattuna kasvaimia, jotka syntyivät ABCG2- soluista (p 0,01). Mielenkiintoista on, että injektio lajittelemattoman IGR37 solujen johtaa myös pienempiä kasvaimia kuin ABCG2 + solut, jotka olivat tilastollisesti samanlaiset koot tuumoreihin ABCG2- solut (Fig. 3, taulukko 2). Lajittelemattoman IGR39 solut johti pienempiin kasvainmassojen, verrattuna lajittelemattoman IGR37 soluihin (0,13 g vs. 1,4 grammaa, vastaavasti; p 0,01) 2 kuukautta injektion jälkeen solujen (taulukko 1). ABCG2- järjestetty IGR39 solut eivät osoittaneet mitään makroskooppisia massojen tässä aikapisteessä (taulukko 2), kun taas ABCG2 + IGR39 solujen kasvaimia, joissa on 3,6-kertainen massa verrattuna lajittelemattoman IGR39 soluja (taulukko 2; p 0,01).

Ensisijainen melanooma IGR39 solujen ja metastaattinen melanooma IGR37 soluja inkuboitiin ilmoitetuilla fluoresoiva FITC-konjugoiduilla vasta-aineilla ja analysoitiin virtaussytometrialla, kuten on kuvattu

Materiaalit ja menetelmät

. Y-akselit, sivusirontavirtaussytometriaa; X-akselit, suhteellinen fluoresenssin voimakkuus. Vasen paneeli, analyysit isotyyppis- (IgG) kontrolli vasta-aineet; keskimmäinen paneelit, analyysit anti-ABCG2 FITC-konjugoiduilla vasta-aineilla. Sen jälkeen FACS eristäminen perustuu osoitettuun portti (sininen ääriviivat), ABCG2 + lajiteltu solut analysoitiin uudelleen vahvistaa rikastus (oikea paneeli). Numerot, prosenttia koko arvioitiin solujen.

5 x 10

5 lajittelematonta, ABCG2 + tai ABCG2- lajiteltu solua injektoitiin ihon alle viiden viikon ikäiset NOD-SCID-hiirten (3 hiirtä kutakin kokeellinen kunnossa). Jälkeen 60 päivää, kasvaimen massa leikattiin punnittiin ja valokuvattiin.

Yksisolususpensiot saatu kaikki tuumoriksenografteja ja analysoidaan yhden tai kahden kanavan avulla virtaussytometrialla havaita ABCG2- ilmentäviä soluja. Yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen WM115 ihmisen melanoomasoluja ja melanooma biopsiat [4], ABCG2 ekspressio oli havaittavissa kaikissa -tuumoriksenografti soluvalmisteita (tietoja ei esitetty).

CXCR6 ja melanooma muodostumista

IGR37 ja IGR39 solupopulaatioiden näytteillä 10,6% ja 9,6% taajuudet ilmaisun CXCR6, vastaavasti (kuvio. 4). CXCR6 + ja CXCR6- alaryhmien IGR37 ja IGR39 solut lajitellaan ja ruiskutettiin NOD-SCID-hiirissä (n = 3 hiirtä per kohortin), kuten oli tehty lajiteltujen solujen perusteella ABCG2 ilmaisun. Yllättäen, kuten on esitetty kuviossa. 5 ja taulukko 2, kun vain 21 päivän injektion CXCR6 + IGR37 solujen merkittävää kasvaimia esiintyi jotka olivat keskimäärin 1,8 kertaa suurempi massa kuin kasvaimia, jotka johtuvat lajittelemattoman IGR37 soluista (p 0,01). Lisäksi, ei ole kasvaimia havaita CXCR6- injektoitiin soluja (taulukko 2 ja kuvio 6) sen jälkeen, jopa 2 kuukautta. Lisäksi CXCR6- solut eivät osoittaneet mitään massan, vaikka 4 kuukautta. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin IGR39 soluja. CXCR6 + solut kasvaimia 2,5-kertainen massa verrattuna lajittelemattomien soluihin; eikä massa havaittu, että CXCR6- soluja (taulukko 2). Kuten ABCG2, CXCR6 + solut olivat myös havaita in tuumoriksenografteja virtaussytometrialla (tietoja ei esitetty).

Yhden markkerin CXCR6 analyysit. Primäärisen melanooman IGR39 solujen ja metastaattinen melanooma IGR37 soluja inkuboitiin ilmoitetuilla fluoresoiva APC-konjugoiduilla vasta-aineilla ja analysoitiin virtaussytometrialla, kuten on kuvattu

Materiaalit ja menetelmät

. Y-akselit, sivusirontavirtaussytometriaa; X-akselit, suhteellinen fluoresenssin voimakkuus. Vasen paneeli, analyysit isotyyppis- (IgG) kontrolli vasta-aineet; keskimmäinen paneelit, analyysit anti-CXCR6 APC-konjugoiduilla vasta-aineilla. Sen jälkeen FACS eristäminen perustuu osoitettuun portti (sininen ääriviivat), CXCR6 + lajiteltu solut analysoitiin uudelleen vahvistaa rikastus (oikea paneeli).

5 x 10

5 CXCR6 + lajiteltu solua injektoitiin ihon alle viidessä -week ikäiset NOD-SCID-hiirten (3 hiirtä jokaista kokeellista kunnossa). Jälkeen 21 päivää, kasvaimen massa leikattiin punnittiin ja valokuvattiin.

5 x 10

5 CXCR6- järjestetty solua injektoitiin ihon alle viiden viikon ikäisten NOD-SCID-hiiriä (3 hiirtä varten kukin kokeellinen kunnossa). CXCR6- solut eivät tuottaneet kasvaimia.

Lopuksi analysoidaan prosenttiosuus CXCR6 + /ABCG2 + double-positiivisia soluja molemmissa solulinjoissa. Kuten on esitetty kuviossa. 7, 6,7% ja 3,1% IGR37 ja IGR39 soluja, vastaavasti, olivat double-positiivisia ABCG2 ja CXCR6. Kun pistetään ABCG2 + /CXCR6 + kaksinkertainen positiivisia IGR39 solujen NOD-SCID-hiirissä, kasvaimia syntyi joka oli keskimäärin 4-kertainen massa verrattuna kasvaimia kehittyi lajittelematonta soluista (p 0,01, taulukko 2). Kuten IGR39 solut lajiteltiin CXCR6 ilmaisun yksin, kasvainten IGR39 ABCG2 + /CXCR6 + solujen vaaditaan vain 21 päivää tuumorin havaitsemiseksi (taulukko 2).

Dual markkeri analyysit CXCR6 ja ABCG2. Primäärisen melanooman IGR39 solujen ja metastaattinen melanooma IGR37 soluja inkuboitiin ilmoitetuilla fluoresoiva APC-konjugoiduilla vasta-aineilla ja analysoitiin virtaussytometrialla, kuten on kuvattu

Materiaalit ja menetelmät

. Vasen paneeli, bivariate fluoresenssin intensiteetti analysoidaan vastaavien Apc- ja FITC-konjugoitua isotyypin (IgG) kontrolli vasta-aineet; keskimmäinen paneeli, bivariate fluoresenssin intensiteetti analysoidaan vastaavien Apc- ja FITC-konjugoidun CXCR6-erityisiä ja ABCG2-spesifisten vasta-aineiden. Numerot, prosenttia koko arvioitiin solujen.

Melanooma fenotyypin tuumoriksenograftien

moniparametrisissä immunohistokemiallinen analyysi ABCG2 + IGR37 solujen ksenografteja (taulukko 3 ja kuvio 8) paljasti, että kasvain peräisin nämä solut näkyvät homogeenista ilmaus erilaistumisen antigeenejä HBM45, HMW-MAA, ja endoteliini-B-reseptori, ja heterogeeninen ilmaus Melan-A-antigeenin. Ei erityisiä värjäystä varten ET-1-peptidi voidaan dokumentoida. Kaikki soluun etenemiseen antigeenejä arvioitiin olivat homogeenisesti ilmaistiin. Soluväliaineen makromolekyyli tenaskiini havaittiin kasvaimen siirteen laaja interstitiaalinen verkon sulkeutumi- solun pesiä erikokoisten. Niistä sikiöantigeenien analysoitiin erikseen, ei havaittavia määriä NY-ESO Löydettiin heikko ilmaus MAGE antigeenejä havaittiin. Samanlaisia ​​tuloksia on saatu ABCG2 + IGR39 soluja (tietoja ei esitetty).

tuumorisolupopulaatioon homogeenisesti ilmaisee Melan-A (A) ja HMW-MAA (B) erilaistumista antigeenejä. Sama jakelu luonnehtii syövän etenemisen antigeenien HER-3 (C) ja solunulkoisen makromolekyylin Tenaskiini (D). Jälkimmäinen tyypillisesti rajataan kasvain alueilla erikokoisten. (160-kertainen suurennus).

Euroopan CXCR6 + /ABCG2 + fenotyyppi ihmisen melanooman koepaloja

Vaikka arvioitiin Melanoomasolulinjojen olivat peräisin ihmisen tuumorikudoksista, äskettäin kuvattu CXCR6 + /ABCG2 + solun fenotyyppi on ehkä rajoitettu viljeltyihin kasvainsoluihin. Siksi tutkimme 4 viljelemättömästä ihmis-melanooma-positiivinen imusolmuke biopsianäytteistä läsnäolo solujen CXCR6 + /ABCG2 + fenotyyppi. Kaikki neljä biopsia näytteissä sisälsi pienen solujen alapopulaation ABCG2 + (12,2%, 8,4%, 2,65%, ja gt; 0,1%). Yksi näistä kolmesta sisälsi myös pieni väestö CXCR6 + (0,25%) ja pieni väestö kaksinkertainen positiivinen ABCG2 + /CXCR6 + (0,3%). Kuva. Kuvio 9 esittää tulokset virtaussytometria analyysi CXCR6 + /ABCG2 + positiivisia näytteitä.

Virtaussytometrianalyysi ihmisen melanooman biopsianäyte varten CXCR6 + /ABCG2 + alafraktion. Metastaattinen melanooma Ohutsuolikoepala käsiteltiin kuvatulla

Materiaalit ja menetelmät

ja välittömästi analysoitiin virtaussytometrialla. Vasen paneeli, bivariate fluoresenssin intensiteetti analysoidaan vastaavien Apc- ja FITC-konjugoitua isotyypin (IgG) kontrolli vasta-aineita. Oikea paneeli, bivariate fluoresenssin intensiteetti analysoidaan vastaavien Apc- ja FITC-konjugoituja CXCR6-erityisiä ja ABCG2-spesifisten vasta-aineiden. Numerot, prosenttia koko arvioitiin solujen.

CXCR6 toiminta ja CXCL16 tasoilla Melanoomasolulinjojen

Tuoreessa sitominen CXCR6 jonka halkaistut liukoista fragmenttia sen membraanisidotut ligandi CXCL16 ( ”sCXCL16”) on osoitettu tehostavan leviämisen sinoomasolulinjoja [11]. Olemme tutkineet vaikutukset vapaan sCXCL16 ligandin kasvuun IGR37 ja IGR39 soluja.

tasot CXCL16 keskipitkällä jonka lajittelemattoman solujen molemmissa solulinjoissa ja vastaavat CXCR6 + solut määritettiin käyttämällä ELISA: lla (Fig. 10 ). Taso CXCL16 havaittiin on erittäin alhainen (0,06 OD-yksikköä ± 0,03, n = 8). Mitään merkittävää eroa ei havaittu lajittelemattoman solun ja CXCR6 + lajitellut solut jälkeen 3 päivää viljelyn (Fig. 8).

50000 solua /kuoppa maljattiin 24 monikuoppalevyjä. Kun solut saavuttivat ~90% konfluenssin (~3-4 päivää), alusta otettiin talteen ja sentrifugoitiin lyhyesti. 50 ul: n erä väliainetta käytettiin CXCL16 havaitsemiseen käyttämällä Quantikine Human CXCL16 Immunoassay (R 0,01), joka oli keskimäärin 1,4-kertaisesti solujen määrä vasteena sCXCL16 lisäksi.

Kaksikymmentä tuhatta solua siirrostettiin yön yli yksittäisiin syvennyksiin 12 multi kuoppaiset levyt täydellisessä väliaineessa kasvun edellytys. Rekombinantti sCXCL16 (100 ng /ml) lisättiin seuraavana päivänä ja korvattiin 48 tunnin välein. 4. ja 7. päivän viljelyn jälkeen solut trypsinoitiin, ja elinkelpoisten solujen määrä määritettiin. Pylväsdiagrammi on keskiarvo ± S.D. kolmen itsenäisen kokeen kukin suoritettiin kolmena kappaleena. *, P 0,01

vs

. käsittelemättömät solut (mustat palkit); **, P 0,001

vs

. käsittelemättömät solut (mustat palkit).

Melanooma liittyvä antigeeni (MAA) ilmaisun ja ABCG2 versus CXCR6 ilmaisu

Ilmaisu profiilia MAA kuuluvien Cancer kivesantigeenien (CTA) perhe ( MAGE-A1, A2, -A3, -A6, GAGE ​​1-2, GAGE ​​1-6, SSX-2, SSX 1-5, ja NY-ESO-1) ja HMW-MAA suoritettiin RT-PCR . Kuten on esitetty taulukossa 4, joka on samanlainen havaitseminen kaavoja ABCG2 + ja ABCG2- -alapopulaatioiksi havaittiin molemmissa solulinjoissa. Lisäksi, käsittely DNA hypomethylating aine 5-atsa-2′-deoksisytidiinin, kykeni indusoimaan

de novo

ilmentyminen MAGE-A3, MAGE A4, GAGE ​​1-2, GAGE ​​1-6 ja SSX 1-5 molemmissa ABCG2

+ ja ABCG2

– IGR37 melanoomasoluja (taulukko 5).

Mitä CXCR6 + ja CXCR6- solualapopulaatioiden vuonna IGR37 ja IGR39 solupopulaatiot sekä kaksois-positiivisten ABCG2 + /CXCR6 + IGR37 soluja, päällekkäisyydet oli CTA perheen ja HMW-MAA (taulukko 6). Lisäksi kun CXCR6 + IGR37 -tuumoriksenografti, kaikki MAA proteiinit päällekkäin lukuun ottamatta CXCR6 + IGR37 solujen tyrosinaasi, Mart-1, ja gp100 (taulukko 6).

Keskustelu

Perusongelmana syöpätutkimuksessa on tunnistaa solutyyppi, joka kykenee ylläpitämään neoplastisen kasvun. On näyttöä siitä, että suurin osa syöpäsolut ovat klooneja, ja että syöpäsolut ovat jälkeläiset yhden solun (tarkistetaan [6]). On kuitenkin epäselvää, mitkä solut omaavat kasvaimeen aloittamista solujen toimintaa, säilyttäen kasvaimen kasvua. Ajatus syövän kantasolujen teoria on, että tiettyjen solujen (

so.

Syövän kantasoluja, CSCS) vaadittua regeneratiivinen ominaisuuksia, jotka johtavat kasvaimen muodostumisen [6]. Toinen tärkeä seikka, tähän asti epäselvä, on peräisin oletetun CSCS [6]. Tärkeä tapa osoittaa, että tietty alapopulaatio voi ylläpitää kasvaimen kasvu on käyttää ksenograftimalleja ihmisen soluja tai syngcenisiä malleja hiiren soluja. Kuitenkin merkittävä kritiikkiä, erityisesti ksenograftimallia on, että se on keinotekoinen malli, joka muun muassa siten, että heterologinen ympäristötekijät ei pidetä [6]. Toisaalta, toinen tärkeä seikka on tunnistaa markkereita, jotka pystyvät määrittämään syövän /aloittamisen kantasolujen alaryhmästä.

Tässä paperi, olemme tunnistaneet uuden biomarkkereiden joka liittyy epäsymmetrinen itse- uusiminen, kemokiini co-reseptorin CXCR6. Lisäksi roolia CXCR6 immuunivasteessa [10], [12], viime aikoina CXCR6 ilmentymistä on raportoitu joissakin ihmisen kasvaimissa, mukaan lukien melanooma [12]. Verrataan kahta vanhempien ihmisten melanoomasolulinjat, IGR39 (ensisijainen) ja IGR37 (metastaattinen), jälkimmäinen oli aggressiivinen -tuumoriksenografti muodostumista verrattuna primäärisen melanooman IGR39 soluja. Tämä ero Tuumorigeenisuustutkimuksissa heijastui CXCR6-lajiteltu osapopulaatioiden. Itse asiassa, CXCR6 + solut johti suurempi tuumorimassaa signficantly lyhyemmän ajanjakson, verrattuna lajittelemattoman soluihin. Lisäksi CXCR6- solut eivät aiheuta merkittävää, havaittavissa syöpäkasvain. Koska CXCR6 ilmentyminen havaittiin olevan yhteydessä epäsymmetrisen itseuudistumista, joka on tyypillinen TSSCs, MCSCs näyttävät olevan johdannainen kudosspesifisiä melanosyyttiä kantasoluja. Vaikka oletetaan, että epäsymmetrinen itseuudistumisen by TSSCs on ablatoitu niistä voi tulla kasvain lähtöaineiden [9], [15], kuten muuntunut solut voivat silti säilyttää merkkiaineita, jotka liittyvät aikaisemman kyky epäsymmetrinen itseuudistumisen, jälkeenkin TSSCs toiminto muuttaa mutaatioita.

Useat ABC kuljettajat on havaittu olevan yli-ilmentynyt syöpäsolulinjoissa viljellään selektiivisissä paineen [6]. Erityisesti, mitä tulee melanooman, ABCB5 yliekspressoituu melanooman ja ABCG2 ilmaistaan ​​osa-osa CD133-positiivisia melanooma solupopulaatio [4], [5]. Tässä osoitamme ensimmäistä kertaa, suhde ABCG2 ja epäsymmetrinen itseuudistumisen. Itse asiassa, ABCG2 + solut antoi suuremman kasvain massa kuin ABCG2- solujen immuunipuutteisilla hiirillä. Kuitenkin CXCR6-ilmentävät solut olivat aggressiivisempia kasvaimen muodostumisen kuin ABCG2 ilmentäviä soluja, mikä viittaa siihen, että alapopulaatio CXCR6 + /ABCG2 + solut voivat olla voimakkain MCSCs.

Toisaalta, on mielenkiintoinen kysymys on, miksi ei ole ABCG2 + eikä CXCR6 + soluja havaittiin tuumoriksenograftien. He saattavat olla liian harvinainen tai he eivät ehkä saa taakseen ympäristönäkökohdat ilmentämiseen immuunivajaisiin hiirillä. Itse asiassa, jos viljeltiin kasvaimia, jotka ovat peräisin ABCG2 + tai CXCR6 + soluja niiden ilmentymistä palautetaan viljelmässä yhden tai kahden kohtien [4] (tuloksia ei ole esitetty). Tässä yhteydessä on tärkeää korostaa, että analyysi ihmisen melanooman koepaloja vahvisti, että läsnä on ABCG2 + /CXCR6 + alafraktion ihmisen kudoksissa. Tämä havainto on merkittävä sulje pois mahdollisuutta, että ABCG2 + /CXCR6 + solufenotyypin olemassa vain soluviljelmässä. Näin ollen, sen vaikuttaa todennäköisemmältä, että proteiinien ekspression estetään jokin tuntematon mekanismi immuunivajausta hiirissä, tai muiden lajien yleensä.

kohdentaminen MCSCs voi esittää uuden ja tehokkaamman kliininen lähestymistapa ihmisen melanooman hoitoon. Kuitenkin niiden antigeenin profiilin voi haitata kliininen tulos immunoterapeuttisen strategioita näillä potilailla. Tässä yhteydessä olemme tutkineet määrin MCSCs profiilin tietyn kasvaimeen liittyviä antigeenejä (TAA) nykyisin käytössä terapeuttisina kohteina kliinisessä ympäristössä. Oikeastaan ​​puute sopivan terapeuttisen tavoitteita MCSCs saattaa todellisuudessa aiheuttaa pitkällä aikavälillä hoito ei tehoa, ylläpiti seuraus TAA-negatiivisten melanooma solukloonien. Tässä yhteydessä syntyminen TAA-negatiiviset solut voisivat välttyä immuuni valvonta on raportoitu melanooman potilailla, joille tehdään immunologisen hoidon [26]. Cancer kivesantigeenien (CTA: t) kattaa suurperheet metylaation-säänneltyjen ja vastaa tiukasti ita, ensimmäinen tunnistettu ihmisen ihosyövän [27], ovat lupaavimpia terapeuttisia kohteita hetkellä käyttämien melanoomapotilaissa. [15].