Krooninen sairaus

tiivistelmä

Noin 30-40%: lla potilaista, joilla varhaisessa vaiheessa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) esittelee kanssa uusiutuva sairaus kahden vuoden kuluessa resektio. Täällä suoritimme laajan galektiini ilmentymisen profiloinnin retrospektiivinen tutkimus Pakastetuilla ja parafiiniin tuumorikudoksia 87 vaiheen I /II pienisoluista keuhkosyöpää. Tuloksemme osoittavat, että galektiini mRNA ilmaisun NSCLC rajoittuu galektiini-1, -3, -4, -7, -8, ja -9. Seuraavaksi vaiheessa, univariable Coxin regressioanalyysi tunnistettu galektiini-1, galektiini-9FL ja galektiini-9Δ5 mahdollisimman ennustetekijöitä markkereita. Kaplan-Meier eloonjäämisennusteet paljasti, että yleinen eloonjääminen oli huomattavasti lyhyempi potilailla, jotka ilmentävät galektiini-1 yläpuolella mediaani tasolla, eli 23,0 (2,9-43,1) vs. 59,9 (47,7-72,1) kuukautta (p = 0,020) sekä potilailla että nimenomainen galektiini-9Δ5 tai galektiini-9FL mediaanin alapuolella, vast. 59,9 (41,9-75,9) vs. 32,8 (8,7-56,9) kuukautta (p = 0,014) tai 23,2 (-0,4-46,8) vs. 58,9 (42,9-74,9) kuukautta (p = 0,042). Kaikki kolme galectins olivat myös ennustetekijöitä tautien vapaa elinaika. Monimuuttujalähettimet Coxin regressioanalyysi osoitti, että käyttöjärjestelmä, merkittävin ennustetekijöiden malli sisältyy vaihe, ikä, gal-1 ja gal-9Δ5 kun malli DFS mukana vaiheessa ikä ja gal-9Δ5. Lopuksi nykyinen tutkimus vahvistaa ennustetekijöiden arvon galektiini-1 ja tunnistaa galektiini-9Δ5 uusina potentiaalia ennustetekijöitä merkkiaineita alkuvaiheen NSCLC. Nämä havainnot voivat auttaa tunnistamaan varhaisessa vaiheessa pienisoluista keuhkosyöpää, joka voisi hyötyä eniten adjuvanttihoitoa.

Citation: Schulkens IA, Heusschen R, van den Boogaart V, van Suylen RJ, Dingemans A-MC, Griffioen AW, et al. (2014) galektiini Expression Profilointi Osoittaa galektiini-1 ja galektiini-9Δ5 kuten ennustettaessa Vaihe I /II ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 9 (9): e107988. doi: 10,1371 /journal.pone.0107988

Editor: Pierre Busson, Gustave Roussy, Ranska

vastaanotettu 7 huhtikuuta, 2014; Hyväksytty: 21 elokuu 2014; Julkaistu: 26 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Schulkens et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia Alankomaiden Cancer Society (www.kwfkankerbestrijding.nl:UM2008-4101, VU2009-4358) ja AWG ja VLT. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), kliinis lavastus mukaan TNM luokittelu on edelleen tärkein erotin luokitella potilaalla on selvä tulos. Valitettavasti potilaista diagnosoitu varhaisessa vaiheessa taudin lähes 30%: sta 40%: esittää kasvaimen uusiutumisen kahden vuoden kuluttua kirurginen resektio [1]. Koska on osoitettu, että adjuvanttihoitoa voi parantaa eloonjäämistä potilailla, joilla resektoidun vaiheen II-III a NSCLC, tunnistaminen alkuvaiheessa potilailla, joilla on huono selviytyminen on kliinisesti merkittävää [1].

Galectins ovat proteiini perhe, jonka jäsenet on määritelty, kun läsnä on konservoituneen hiilihydraatin tunnustamista verkkotunnuksen [2]. Toistaiseksi viisitoista galectins on tunnistettu, yksitoista joka ilmaistaan ​​myös eri ihmisen soluissa ja kudoksissa [3], [4]. He käyttävät monia erilaisia ​​toimintoja, joissa sääntely ja hienosäätöä immuunijärjestelmän on parhaiten tutkittu. Näin ollen vapautuminen galektiini ilmentyminen liittyy usein riittämätön immuunivasteen, joka edistää eri sairauksista, kuten syöpä [5], [6]. Lisäksi, galectins on havaittu välittävän kasvainsolujen etäpesäkkeiden [7] – [9] ja aiheuttamiseksi ja ylläpitämiseksi tuumorin angiogeneesiä [10] – [15], joka edelleen lisää syövän etenemisessä. Kaikki tämä on johtanut tunnustamista galectins kuten diagnostisia ja prognostisia markkereita eri syöpätyyppejä, mukaan lukien keuhkosyöpä. Esimerkiksi lisääntynyt galektiini-3 ilmentyminen on kuvattu indikaattorina huonon ennusteen pienisoluista keuhkosyöpää [16], [17]. Samanlaisia ​​havaintoja on raportoitu varten galektiini-1 ilme [16] – [18]. Lisäksi galektiini-1 ilmentyminen on kohonnut keuhkosyöpä kudoksessa verrattuna normaalin keuhkokudoksen [19]. Viime aikoina, kohonneet galektiini-1 ilmentymisen havaittiin edistää keuhkosyöpä etenemistä ja chemoresistance [20], kun taas lisääntynyt galektiini-4: n ekspression osoitettiin ennustaa imusolmuke etäpesäke adenokarsinooma keuhkoissa [21]. Kaikki nämä havainnot kuvaavat ennustetekijöiden potentiaalia galectins keuhkosyövässä. Kuitenkin myös galektiini ilmaisua voidaan käyttää myös erottamaan alkuvaiheessa NSCLC potilaalla on hyvä tai huono ennuste ei ole vakiintunut. Siksi Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, onko mittaus galektiini mRNA ilmaisun voisi toimia kliinisen lopputuloksen ennustajana potilailla, joilla on vaiheen I /II NSCLC käyttämällä monimuuttuja mallia.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen

tutkimus hyväksyi paikallinen sisäisen tarkastelun aluksella (Maastricht Pathology Tissue Collection, https://www.pathologymumc.nl/research/external-projects/maastricht-pathology-tissue-collection- mptc) ja noudattaa suosituksia ohjaava lääkärit biolääketieteellisen tutkimuksen ihmiseen kohdistuvan säädetyn Helsingin julistus. Mukaisesti säätelevät etiikka, käyttö anonymisoidaan kudosta kudospankki ei edellytä erityistä kirjallista suostumusta.

Potilaat

Nykyinen tutkimus sisältyi kasvain näytteitä potilaista vaiheen I /II NSCLC jotka tehtiin anatominen parantava resektio klo akateemisen sairaalan Maastrichtin vuosien 1994 ja 2004 [22]. Hylkäämisperusteet olivat 1) Edellinen muu maligniteetti, 2) Kehittäminen liity pahanlaatuisen aikana seurantaa vähintään 4 vuotta, tai 3) Neo-adjuvanttihoito.

Näytteiden ominaisuudet

resekoitu aine varastoitiin -80 ° C: ssa osana Maastrichtin patologian Tissue Collection. Vain kudoksia potilailta vaiheen I /II tauti ja kasvaimen alueen 50% (keskiarvo 65,9%, 95% CI: 59,9-71,9), arvioitujen hematoksyliini /eosiinilla värjätyt leikkeet kokenut patologi (R-JVs), katsottiin oikeutettuja lisätutkimuksiin.

Tutkimuksen suunnittelu

takautuvasti analysoitiin kasvainkudoksen portaan I /II NSCLC potilaat, joille tehtiin parantava resektio leikkauksen välillä 1994 ja 2004 akateemisen sairaalan Maastricht. Kaikkiaan 87 potilasta oli mukana. Potilaat saivat ole aiempaa hoitoa ja ei ollut ollut tai kehittää jotka eivät liity syöpäsairauksia 4 vuoden ajan leikkauksen jälkeen. Seuranta-aika oli vähintään 5 vuotta, jonka aikana potilaat tutkittiin rutiininomaisesti 3 kuukauden välein 2 ensimmäisen vuoden aikana ja sen jälkeen 6 kuukauden välein. Kliiniset päätetapahtumat olivat kokonaiselinaika (OS) ja sairauksien elinaika (DFS). Kokonaiselossaoloaika oli aika kuukautta leikkauspäivänä päivään saakka kuolema mistä tahansa syystä. Taudista vapaa eloonjääminen oli aika kuukautta leikkauspäivänä päivään saakka kasvaimen uusiutumisen joko Paikallista tai kaukana. Ehdokas muuttujia, joita pidettiin sisällytettäväksi malleja olivat mRNA ekspressiotasot kutakin galektiini (in 2∧-deltaCt), ikä (vuosina), vaihe (I tai II), sukupuoli, histologia (suomuinen tai muu), tupakoinnista ( entinen tai muu). Potilaiden määrä sisällyttää määritettiin saatavuus kasvain näytteitä. Tässä otoskoko, noin 50 tapahtumia, jotka mahdollistivat sisällyttämistä 5 muuttujia monimuuttuja analyysiä välttämiseksi yli istuva.

Soluviljelmät

Seuraavat solulinjat käytettiin: A549 ihmisen alveolaarinen karsinooma (ATCC CCL-185), H460 ihmisen suuri cell carcinoma (ATCC HTB-177), H1650 ihmisen bronkoalveolaarinen karsinooma (ATCC CRL-5883), H1975 ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (ATCC CRL-5908), H3255 ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (ATCC CRL-2882, lopetettu). Kaikkia solulinjoja viljeltiin RPMI (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia, penisilliiniä (50 U /ml) ja streptomysiiniä (50 ug /ml). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2: ssa kostutetussa inkubaattorissa.

RNA: n eristys ja cDNA-synteesi

Kokonais-RNA eristettiin 10 x 10 pm paksu jäädytetyt kudosleikkeet tai viljellyistä soluista käyttämällä RNeasy-kittiä (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Jos kasvain kudos, ylimääräinen jakso otettiin ennen ja jälkeen sarja 10 H /E-värjäys ja arviointi prosenttiosuus kasvaimen alueella. Perimän DNA saastuminen poistettiin palstalla DNaasikäsittelyä. Pitoisuus ja puhtaus RNA analysoitiin käyttäen NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies). Sen jälkeen cDNA-synteesi suoritettiin iScript cDNA Synthesis Kit (Biorad) käyttäen 0,5-1,0 mikrogrammaa kokonais-RNA: ta.

Reaaliaikainen qPCR

qPCR oli tehtävä sellaisen iQ5 Multicolour Real-Time PCR Detection System (BioRad) tai CFX96 (BioRad) käyttäen iQ SYBR Green PCR master mix (BioRad) käyttäen 400 nmol /l ja sopivia alukkeita, jotka on kuvattu aiemmin [23]. Erotella eri galektiini-9 silmukoitumisvariantit seuraavia alukkeita: gal-9FL eteenpäin GCAGACAAAAACCTCCCG, gal-9FL käänteinen CCCAGAGCACAGGTTGATG, gal-9Δ5 eteenpäin ATCAGCTTCCAGCCTCCC, gal-9Δ5 käänteinen CCCAGAGCACAGGTTGATG, gal-9Δ5 /6 eteenpäin CTACATCAGCTTCCAGACCCA, gal- 9Δ5 /6 käänteinen CCCAGAGCACAGGTTGATG. qPCR Näiden silmukointivarianteista suoritettiin käyttäen Sensimix (Quantace) Tm = 61 ° C. Kaikki alukkeet syntetisoitiin Eurogentec.

Western blot

Western blot suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti. Lyhyesti, 5-10 10 um crysections suspendoitiin 60 ul: Laemlli näytepuskuria (Biorad), jota oli täydennetty 01:20 β-merkaptoetanoli. Näytteitä keitettiin 5 minuutin ajan ja välittömästi erotetaan geelielektroforeesilla 15% polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin PVDF-membraaneille (Millipore). Membraanit blokattiin Oddyssey estopuskurilla (LI-COR Biosciences) 1 tunnin ajan ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa joko kanin anti-galektiini-1-vasta-aine (Peprotech) tai vuohen anti-galektiini-9-vasta-ainetta (R R & D systems), vasta-aineet, jotka spesifisyys määritettiin ennen [23]. Värjäys tehtiin näkyviksi käyttämällä StreptABComplex /HRP Kit (Dako). Leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä (Merck), kuivattu, ja asennettu Depex (BDH Prolabo). Sokkoutettu pisteytys galektiini-1 ja galektiini-9 suoritettiin kolme eri osastoihin kasvain, eli kasvainsoluja, kasvaimen strooman ja kasvaimen endoteelisoluissa. Sillä pisteytystä galektiini-1 ja galektiini-9 taajuutta värjäytyminen määritettiin käyttäen seuraavaa asteikkoa: 0 = ei ole tai tuskin lainkaan soluja positiivinen, 1 = pieni osa soluista positiivisia, 2 = noin puolet solujen positiivinen, 3 = enemmän niin puolet soluista positiivinen, 4 = kaikki tai suurin osa soluista positiivisia. Kaikki värjäykset tekee vähintään kaksi riippumatonta henkilöä.

Tilastollinen

Bivariable Pearsonin korrelaatiokertoimet laskettiin tutkia suhteita galektiini mRNA ekspressiotasot (2

-ΔCt), kliininen parametrit, ja /tai immunohistokemiallisella värjäyksellä tulokset. Tunnistaa tärkeimmät ennustavat potilaiden tulos kaksivaiheista lähestymistapaa käytettiin. Ensinnäkin, univariable assosiaatioita OS tai DFS kanssa kliiniset oireet tai kunkin galektiini tutkittiin käyttäen Coxin regressioanalyysiä. Seuraavaksi monimuuttuja Coxin regressioanalyysi kanssa eteenpäin valinta suoritettiin merkittävimmistä galektiini ennustajia tunnistettu univariable analyysissä eli gal-1 (kategorinen), gal-9FL (kategorinen), gal-9Δ5 (kategorinen), yhdessä iän (jatkuva ) ja vaihe (kategorinen), joko OS tai DFS kuin lopputulos. Analyysin mukana Kaplan-Meier selviytymisen arvioi kanssa Log rank testi suoritettiin määrittämään mediaani tai DFS. Mediaani mRNA ekspressiotasoja käytettiin raja-arvo jakaa potilaille osaksi korkean ilmaisu ryhmä (edellä mediaani) ja alhaisen ilmentymisen ryhmässä (alle mediaani). Luottamusväli mediaanielinajassa laskettiin Bonnet et al. [24]. Kaikki tilastolliset laskelmat suoritettiin vuonna SPSS20.0.0.

Tulokset

ilmentyminen galektiini mRNA alkuvaiheen NSCLC ja keuhkosyövän solulinjat

Me tehdään laaja galektiini geenien ilmentymisen analyysi retrospektiivinen tutkimus resektoidun tuumorikudoksista peräisin 87 potilaalla diagnosoitu varhaisessa vaiheessa (vaihe I /II) NSCLC. Mediaani-ikä potilailla oli 65,5 vuotta (vaihteluväli 37,4-85,5) ja seuranta oli vähintään 5 vuotta, jonka aikana 47 potilasta (54,0%) esitti uusiutuva sairaus ja 50 potilasta kuoli (57,5%). Keskimääräinen eloonjäämisaika (OS), joka määritellään välinen aika leikkauspäivänä saakka kuolinpäivä, oli 48,7 kuukautta (95% CI +33,1-+64,2kuukausi). Taudista vapaa eloonjääminen (DFS), joka määritellään välinen aika leikkauspäivänä asti päivän Paikallista tai etäpesäkkeenä, oli 33,3 kuukautta (95% CI 34,8-+49,6kuukausi). Yleinen demografiset ja standardi ennustetekijöitä muuttujia potilaan ryhmä on lueteltu taulukossa 1.

Saat näkemystä ennustetekijöiden arvon galektiini ilmaisun vaiheessa I /II NSCLC ensin ratkaista, mikä galectins ilmaistaan NSCLC kasvainkudoksessa. qPCR analyysi aiemmin validoitu alukkeilla suunnattu vastaan ​​kaikkia tunnettuja ihmisen galectins [23] kävi ilmi, että kuusi galectins eli galektiini-1, -3, -4, -7, -8, ja -9, mRNA: n ilmentymisen voitiin havaita (kuvio 1A ). Koska laaja liitos on raportoitu galektiini-9 [23], [25], [26], myös määrittää mRNA: n ilmentymisen yleisin galektiini-9 silmukoitumisvarianttia, eli galektiini-9 täyspitkän (FL), galectin- 9, jossa on deleetio eksonista 5 (Δ5), ja galektiini-9, jossa on deleetio eksonien 5 ja 6 (Δ5 /6). Kaikki kolme vaihtoehtoa olivat havaittavissa gal-9Δ5 hallitsevina variantti (kuvio 1A, upotus). Proteiinin ilmentyminen eri galektiini perheenjäsenten varmistettiin seulomalla immunohistokemiallisella värjäykset saatavilla ihmisen proteiinin atlas [27] (kuvio 1 B). Proteiinin ekspressiota eri galektiini-9 liitoksen isoformien edelleen vahvistettiin Western blot -analyysillä (kuvio 1C). Lisäksi ilmaisun profilointi eri keuhkosyövän solulinjat vahvisti, että ilmentyminen rajoittui galektiini-1, -3, -4, -7, -8, ja -9 (kuva S1). Tämä vahvistavat joiden tutkimus Lahm et al. joka analysoi ilmentyminen useiden galectins laajasti paneelin syöpäsolulinjojen [28]. Kaikki nämä havainnot osoittavat, että galektiini-1, galektiini-3 ja galektiini-8 ovat runsaimmin ilmaistaan ​​galectins kun taas ekspressio galektiini-4, galektiini-7, ja galektiini-9 on suhteellisen alhainen, sekä kasvaimen kudoksissa ja eri keuhkosyövän solulinjat.

Insertti osoittaa ilmentymisen kolmen galektiini-9 silmukointivarianttia. (B) Kuvia immunohistokemiallinen värjäytyminen galectins kanssa havaittava mRNA: n ekspression NSCLC [27]. (C) Western blot-analyysi galektiini-9 isoformi ilmentymistä NSCLC kasvainkudoksen 5 eri potilailla. Kolme bändit odotettavissa moolimassat galektiini-9FL, galektiini-9Δ5 ja galektiini-9Δ5 /6 havaittiin vaihtelevilla intensiteettiä.

väliset galektiini mRNA ilmaisun ja kliinisten parametrien alkuvaiheen NSCLC

analyysi suhdetta eri galektiini mRNA ekspressiotasot havaittiin merkittävä positiivinen korrelaatio yhteensä galektiini-9 ja erityinen galektiini-9 silmukoitumisvarianttia eli gal-9FL (r = 0,48), gal-9Δ5 (r = 0,85 ), ja gal-9Δ5 /6 (r = 0,52). Näiden silmukoitumisvariantit oli merkittävä korrelaatio gal-9FL ja gal-9Δ5 (r = 0,44) sekä välillä gal-9Δ5 ja gal-9Δ5 /6 (r = 0,53). Merkittäviä korrelaatioita havaittiin myös välillä galektiini-3 ja gal-9FL (r = 0,34) ja välillä gal-4 ja gal-9Δ5 /6 (r = 0,31). Ei merkittäviä korrelaatioita välillä havaittiin mRNA-ekspressiotasot muiden galectins. Suhteesta galektiini mRNA ilmaisun ja kliinisten parametrien, eli ikä, vaihe, sukupuoli, histologian, ja tupakointi, havaitsimme heikosti merkittävä korrelaatio sukupuolen ja gal-9Δ5 (r = 0,24) sekä iän ja vastaavasti gal-1 (r = 0,26), gal-9 (r = -0,25) ja gal-9Δ5 (r = -0,30). Mitään merkittävää korrelaatiota galektiini mRNA ilmaisun ja loput parametrit eli histologia, vaihe, ja tupakointi, löydettiin.

Association between galektiini mRNA ilmaisun ja ennusteeseen alkuvaiheen NSCLC

Seuraavaksi univariable Coxin regressio analyysit suoritettiin valita markkereita vahvin yhdessä OS (taulukko 2) ja DFS (taulukko 3). Tämä tunnistettu vaiheessa gal-1, gal-9FL ja gal-9Δ5 mahdollisimman ennustavat tekijät sekä käyttöjärjestelmän ja DFS alkuvaiheen pienisoluista keuhkosyöpää. Myöhemmin Kaplan-Meier analyysejä käytettiin arvioimaan mediaani ja DFS potilailla, jotka ilmaisivat tiettyä galektiini alapuolella tai yläpuolella mediaani mRNA ilmaisun tasolla. Potilaat, jotka ilmensivät galektiini-1 edellä mediaani tasoilla oli merkittävä lyhyempi OS ja DFS (kuvio 2A ja taulukko 4). Univariable Cox mallissa myös yksilöidään kaksi silmukoitumisvarianttia galektiini-9 eli gal-9FL ja gal-9Δ5, jotka mahdollisesti liittyvät sekä käyttöjärjestelmän ja DFS. Itse asiassa potilailla, joilla on joko gal-9FL tai gal-9Δ5 ekspressiotasot mediaanin alapuolella oli merkittävää lyhyempi OS sekä lyhyempi DFS (kuvio 2B + C ja taulukko 4). Mikään muu galectins oli merkitsevästi yhteydessä OS tai DFS.

Lopuksi monimuuttuja Coxin regressioanalyysi suoritettiin eteenpäin valinta merkittävimmistä tekijöistä, jotka mainitaan univariable analyysit eli vaiheessa, ikä, galektiini-1 galctin-9FL ja galektiini-9Δ5. Nämä analyysit osoittivat, että OS merkittävin ennustetekijöiden malli sisältyy vaihe, ikä, gal-1 ja gal-9Δ5 kun malli DFS mukana vaiheessa ikä ja gal-9Δ5 (taulukko 5).

lokalisointi ja jakelu galektiini-1 ja galektiini-9-proteiinin ilmentymistä alkuvaiheen NSCLC kudos

saat enemmän näkemystä lokalisointi ja jakelu galektiini-1 ja galektiini-9 proteiinin suoritimme immunohistokemiallinen värjäykset edustavaan osajoukko kasvaimia (n = 45). Galektiini-1 laajasti ilmaistu useimmissa tuumorikudoksissa. Ilmaisu kasvainsoluissa vaihteli kasvainten sekä kasvaimiin, joidenkin kudokset, joissa ei ole positiivisia kasvainsoluja, kun taas muissa kudoksissa kasvainsolut olivat vahvasti positiivisia. Useimmissa kudoksissa osoitti positiivista värjäytymistä stroomassa sekä kasvaimen endoteelisoluissa (kuvio 3A). Galektiini-9 värjäytyminen oli vähemmän merkittävä verrattuna galektiini-1. Itse asiassa, positiivisia kasvainsoluja vain harvoin, vaikka joissakin kudoksissa ilmestyi näkyviin gradientti kasvaa galektiini-9 tasot kasvainsoluissa lähempänä strooman kudokseen (kuvio 3B). Sekä strooman ja kasvaimen endoteelisolujen värjättiin positiivinen useammin (kuvio 3B).

Värjäys havaittiin kasvaimen soluosastoon (T), strooman osaston (S) ja kasvaimen endoteelisoluissa (nuolet). Insertti vasemmalla näkyy isotyyppikontrollia värjäystä. Asteikko bar = 50 mikrometriä. Baarissa kaavioita kvantifiointi IHC pistemäärät galektiini-1 ja galektiini-9 eri kasvaimen osastoissa.

Seuraavat Pearsonin korrelaatio analyysi värjäytymisen tulokset osoittivat, että oli merkittävä käänteinen korrelaatio pisteet galektiini-1 ja galektiini-9 kasvainsoluissa (corr. kerroin. -0,36) vaikka oli olemassa positiivinen korrelaatio galektiini-1 ja galektiini-9 proteiinin pisteet kasvaimen endoteelisolujen (corr. kerroin. 0,44). Kuitenkaan ei galektiini-1 tai galektiini-9 proteiinivärjäys tulokset liittyivät OS tai DFS. Lisäksi ei ollut mitään korrelaatiota IHC tulokset ja mRNA-tasoja.

Keskustelu

Arvioimme ennustetekijöiden merkitys galektiini mRNA: n ilmentymisen potilailla, joilla on vaiheen I /II ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. Univariable Coxin Regressioanalyysistä käytettiin valita joukko kaikkein prognoosi- kliinisten parametrien ja galectins. Ne on pääosin käytetty monimuuttuja-analyysi voisi luoda mallin, joka voisi ennustaa OS tai DFS potilailla, joilla on vaiheen I /II NSCLC. Tärkein löydös on, että ennustamiseksi OS merkittävin ennustetekijöiden malli sisältyy vaihe, ikä, gal-1 ja gal-9Δ5 kun malli DFS mukana vaiheessa ikä ja gal-9Δ5.

Galectins on aiemmin liittynyt keuhkosyövän etenemisen [16], [17], [29]. Havaintomme, että potilaat, jotka ilmentävät galektiini-1 yläpuolella mediaani tasolla on merkittävä lyhyempi yleinen hyväksyy näissä tutkimuksissa [16], [17] sekä tutkimuksia muiden syöpien [30]. Prognostisia arvo galektiini-1 vahvistettiin monimuuttuja analyysiin. Galektiini-3, joka on myös liitetty huono tautiin tulos keuhkosyöpäpotilaita [16], [17], ei ollut tilastollisesti merkitsevä meidän potilasryhmässä. Tämä vahvistavat kaksi uudempaa tutkimuksissa [31], [32]. Toisaalta, se on ehdotettu, että sijainti solun galektiini-3, eli ydin- vs. sytoplasman ehkä prognoosi- arvon toistumisen [33]. Olemme vain mitattuna galektiini-3 mRNA ekspressiotasot ja ei määritellyt solun lokalisaatio galektiini-3-proteiinin ilmentymistä meidän potilasryhmässä. Siten emme voi sulkea pois, että näitä parametreja voivat olla ennusteen arvioinnissa vaiheessa I /II pienisoluista keuhkosyöpää.

A novel havainto nykyisen tutkimus oli tunnistaa tietyn gal-9 silmukointivariantti eli galektiini-9Δ5 ennustetyövälineenä markkeri NSCLC. Käyttämällä monimuuttuja Coxin regressioanalyysiä nyt havaittu, että alhainen galektiini-9Δ5 ilmentyminen oli yhteydessä huonoon OS ja DFS alkuvaiheen pienisoluista keuhkosyöpää. Nämä havainnot ovat linjassa muiden raporttien, jossa galektiini-9-ilmentyminen korreloi käänteisesti syövän etenemiseen ja potilaan eloonjäämisen useita eri syöpätyyppejä, kuten ihosyöpä, maksasyövän ja rintasyövän [34] – [36]. Viime aikoina, Jiang et al. tunnistettu galektiini-9 ilmaisun itsenäisenä ennustetekijä retrospektiivinen tutkimus 305 potilasta, joilla mahalaukun syövän. Jälleen pieni galektiini-9-ilmentyminen liittyy huono selviytyminen [37].

galektiini-9Δ5 on yksi kolmesta useimmin tunnistettu galektiini-9 vaihtoehtoja. Nämä silmukoitumisvariantit koodaavat proteiinia, isomuotoja, jotka vaihtelevat pituuden linkkerin alueen kahden CRD domeenit, jotka vaikuttavat multimeeri muodostumista ja valenssi [38], [39]. Edellisen tiedot viittaavat siihen, että eri galektiini-9-isoformien on erilaiset rooli tuumorisolujen, esim. ne eri tavoin vaikuttavat solujen tarttumisen ECM ja endoteeliin [40]. Yleensä muuttunut galektiini-9 ilmentyminen on liitetty epänormaalin soluadheesiota, kasvua ja muuttoliike [39]. Toiset ovat kuvanneet, että galektiini-9 voi vaikuttaa solujen selviytymistä sekä homo- ja heterotyyppisten soluaggregaation [9], [34], [40] – [43]. Menetys galektiini-9 ilmaisun voisi vaarantaa kudoksen eheys mahdollistaa syöpäsolujen intravasate liikkeelle ja etäispesäkkeitä. Itse asiassa rintasyövän matalan galektiini-9 ilmaisun oli tarkemman ennusteen etäpesäkkeiden verrattuna imusolmuke asema [42]. Samanlaisia ​​havaintoja tehtiin melanooman ja kohdunkaulan levyepiteelikarsinooma [34], [44]. Nämä vaikutukset riippuvat useita parametreja, mukaan lukien erityiset galektiini-9 variantti, solutyypistä ja adheesio matriisin komponentti, jota solut sitovat [45]. Onko ja kuinka kaikki nämä parametrit vaikuttavat keuhkosyöpä etenemiseen vaatii lisätutkimuksia. Mahdollisesti, galektiini-9 voi toimia kemoattraktantti keuhkosyövän soluja, joka on samanlainen kuin on kuvattu eosinofiilit [46], [47], tai endoteelisoluihin [26]. Yhdessä havainto, että stroomasoluihin galektiini-9Δ5 ilmentyminen pysyy koholla keuhkokasvaimia tässä chemoattracting toiminta osoittaa, että galektiini-9Δ5 voisi toimia ohjauksen vihje etäpesäkekasvainten solujen siirtyä kohti paikalle intravasation eli verisuonistoon. Tämä voi edistää kasvaimen etäpesäke etenkin jos menetys galektiini-9 tuumorisoluissa johtaa menetykseen kudoksen eheyden [45]. Lopuksi, on raportoitu, että eläinmalleissa ja syöpäpotilaiden, kasvainsolut voidaan vapauttaa galektiini-9, joka sisältää eksosomeiksi, joka voi indusoida T-solujen apoptoosin [48], [49]. Olipa kasvain endoteelisolujen myös erittää galektiini-9 sisältävien eksosomeiksi on vielä tutkittava, mutta tällainen mekanismi voisi edistää kasvaimen etenemistä tarjoamalla keino paeta immuunipuolustukselle.

immunohistokemiallinen arviointi galektiini-1 ja galectin- 9 proteiinin ilmentyminen osoittivat eroja lokalisointi ja jakauma kasvainkudoksen. Nämä havainnot ovat linjassa aiempien havaintojen eri kasvaimissa, joissa molemmat galektiini-1 ja galektiini-9 proteiineja voitiin havaita eri osastoissa kasvain, kuten kasvainsolujen, kasvaimen strooman ja kasvaimen endoteelisolujen [17], [23], [ ,,,0],30], [42], [44]. Kuitenkin proteiinin ilmentyminen ei ollut ennusteen arvioinnissa meidän potilasryhmässä. Todennäköisesti tämä liittyy siihen, että immunohistokemiallisella värjäyksellä edustaa enemmän laadullisen arvioinnin sijaan kvantitatiivisen analyysin. Siten todellinen proteiinin ekspressiotasoja ei voida tarkasti kvantitoida IHC värjäystä. Lisäksi ei galektiini-9-vasta-aineita on saatavilla, jotka tunnistavat tiettyjä silmukointimuunnokset. Tämä viittaa siihen, että kyseessä on alkuvaiheessa NSCLC potilaat, määritetään galektiini mRNA-tasoja on enemmän vastinetta ennustetta arvioita verrattuna immunohistokemiallisella värjäyksellä.

Tärkein rajoittava Tämän tutkimuksen on suhteellisen pieni otoskoko 87 suhteessa suuri määrä parametreja, jotka analysoitiin. Otoskoko sallittu sisällyttämistä vain 5 covariates siinä regressiomalli minimoimiseksi yli istuva. Lisäksi olemme mukana vain alkuvaiheen pienisoluista keuhkosyöpää. Siten lisätutkimuksia käyttäen suurempia potilasryhmiä ja myös myöhemmissä vaiheissa NSCLC, eli vaiheen III /IV, voi tarjota enemmän näkemystä ennustetekijöiden arvon galektiini mRNA: n ilmentymisen profilointiin.

Yhteenvetona laajat galektiini ilme profilointi vahvisti prognostisia arvo galektiini-1 ja tunnistettu gal-9Δ5 mahdollisena uusi ennustetekijöitä merkkiaineita alkuvaiheen NSCLC. Tunnistaminen tällaisten merkkiaineiden on tärkeää tunnistaa potilaat, jotka hyötyvät adjuvanttihoitoa. Lisäksi havaintomme ovat esimerkkejä merkitystä profilointi yksittäisten silmukoitumisvarianttia galektiini-9. Vielä on selvitettävä, silmukointivariantti-erityinen profilointi on samanlainen hyödyntää myös muissa syöpätyyppejä, mukaan lukien ne, joissa yleinen galektiini-9 ilmaisu on ennusteen merkki.

tukeminen Information

Kuva S1.

galektiini mRNA ilmaisun profiilin eri NSCLC linjat. Insertti osoittaa ilmaus kolmen galektiini-9 silmukoitumisvarianttia.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0107988.s001

(TIF) B

Kiitokset

Kirjoittajat olisi kiittää tohtori F. Galindo Garre tilastollisiin neuvoja ja E. Aanhane tekniseen tukeen.