Krooninen sairaus

tiivistelmä

Jatkuva virukset kurissa erityisiä lymfosyyttien. Klonaalisen T-solureseptorin (TCR) ohjelmisto vastaan ​​Epstein-Barrin virus (EBV), perustamisen jälkeen seuraava ensisijainen infektio, osoittaa vankka stabiilisuus ajan. Kuitenkin taustatekijät vaikuttavat tähän pitkäaikaissäilyvyys ovat edelleen huonosti ominaista. Hyödyntämällä olevan

in vivo

hoitopaikassa, missä lymfosyyttien homeostaasin oli ohimenevästi levoton, tutkimme EBV antigeenispesifisten CD8 T-solujen ennen ja jälkeen ei-myeloablatiivista Lympho heikentäviä kemoterapia melanoomapotilailla. Huolimatta kehittyneempiä T-solujen erilaistumista, potilaiden T-solut osoittivat klonaalinen koostumus verrattavissa terveillä henkilöillä, jakaminen mieluummin

TRBV20

ja

TRBV29

geenisegmenttiin käyttö ja useat yhteistyössä hallitseva julkinen TCR clonotypes. Lisäksi meidän data paljasti, että läsnä oli suhteellisen vähän hallitseva EBV antigeenispesifisen T-solun clonotypes, jotka enimmäkseen jatkui seuraavat ohimeneviä lymfoproliferatiivisten ehtyminen (TLD) ja lymfosyyttien talteenotto, todennäköisesti liittyy puuttuminen EBV uudelleenaktivointi ja

de novo

T-solujen esikäsittely näillä potilailla. Mielenkiintoista, jatkuva clonotypes usein koekspressoi muisti /homing liittyvien geenien (

CD27

,

IL7R

,

EOMES, CD62L /MYY

ja

CCR5

) tukee käsitystä siitä, että ne ovat erityisen tärkeitä pitkäkestoinen CD8 T-soluvasteita. Kuitenkin, klonaalisen koostumus EBV-spesifisten CD8-T-solujen on säilynyt ajan kanssa, kun läsnä on samalla määräävän clonotypes jälkeen ei-myeloablatiivista kemoterapiaa. Havaitut clonotype sitkeys osoittaa korkea luotettavuutta CD8 T-solujen homeostaasin ja käyttövalmiiksi.

Citation: Iancu EM, Gannon PO, Laurent J, Gupta B, Romero P, Michielin O, et al. (2013) Persistence EBV Antigeenispesifisen CD8 T-solujen Clonotypes aikana homeostaattisina Immuunireaktivaatio syöpäpotilailla. PLoS ONE 8 (10): e78686. doi: 10,1371 /journal.pone.0078686

Editor: Derya Unutmaz, New York University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 01 elokuu 2013; Hyväksytty: 15 syyskuu 2013; Julkaistu: 25 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Iancu ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus sponsoroi ja tukee Sveitsin National Center of Competence in Research (NCCR) Molecular Oncology ja Sveitsin National Science Foundation myöntää 32003B0-118123 ja 310030-129670. P. O. Gannon on myös vastaanottaja apurahan Kanadan Institutes of Health Research (CIHR-IRSC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ensisijainen Epstein-Barrin virus (EBV) infektio liittyy massiivinen virusreplikaation. Huolimatta sukupolven vankka T-solujen spesifisen immuunivasteen, EBV aikaan latentin infektion B-soluissa [1]. Kuitenkin terve EBV-tartunnan saaneista ihmisistä jäävät oireettomia koko elämänsä takia viruksen eristämistä by antigeenispesifisen muistin CD8 T-lymfosyyttejä [1-3]. Koska yhä enemmän huomiota on omistettu optimoimalla terapeuttiseen rokotusstrategioita syöpää vastaan, immuuni valvonta kroonisen EBV-infektio edustaa mielenkiintoinen malli järjestelmä tutkia mekanismeja sukupolvi ja huolto elinikäisen suojaavia immuunivasteita.

antigeenillä valmisteltuun CD8 T-solujen allas on hyvin heterogeeninen ja koostuu T solualapopulaatioiden at eriasteista solujen erilaistumisen perustuu niiden fenotyyppiin, toiminta ja anatominen sijainti, jolloin ero ”efek-” ja ”muisti” T -solujen haastavaa [4- 6]. Yleensä muisti-T-solujen tapaan näyttää pysyvyyttä ja itseuudistumisen kykyjä, korkea proliferaatiopotentiaali, ja kyky nopeasti ja tehokkaasti tuottaa efektorisolujen vastauksena antigeeni uudelleen kohtaaminen [7-9]. Sen sijaan, T-soluja on kyky siirtyä tulehduskohtaan, tappaa antigeenin laakeri kohdesoluihin ja erittävät erilaisia ​​sytokiinejä (esim IFNy, TNFa) [10].

Onko muisti soluvasteita ylläpidetään pitkiä aikoja tai ajoittain ”uudistettu” kuuluu edelleen keskustelua. Se on erityisen vaikea kysymys vastata ihmisillä koska se vaatii perusteellista analyysiä suojaavan immuunivasteen yli pitkiä aikoja. Tässä suhteessa, T-solureseptorin (TCR) on erinomainen merkkiaine, joka mahdollistaa antigeeni-vasteita, joita on noudatettava pitkin T-solujen erilaistumista ja ajan mittaan [11]. Perusteellinen analyysi sekä viruksen ja kasvaimen antigeeni-spesifisten CD8-T-soluvasteita ovat osoittaneet, että antigeenispesifisten T-solujen ohjelmisto koostuu yleensä erittäin usein (joka määritellään myös määräävä) sekä harvemmin (määritelty ei-määräävä) T-solujen clonotypes [12,13]. Kautta prosessia kutsutaan TCR clonotype valinta, tietyt clonotypes saattaa tulla hallitseva pitkin T-solujen erilaistumista [14-16] tai koko ajan infektion kuluessa [17]. Pysyvyys ihmisen virus-T-solun, clonotypes usean vuoden ajan on osoitettu ihmisillä eri virusinfektioiden: influenssaan [18], herpes simplex virus [19,20], EBV [21], sytomegalovirus (CMV) [14] ja ihmisen immuunikatovirus (HIV) [22]. Äskettäin Klarenbeek ja työtovereiden [23] käsiteltiin kysymystä siitä, onko klonaalisen ohjelmistoon, joka on perustettu aikana alkuvaiheessa infektioiden CMV ja EBV säilyy pitkien ajanjaksojen ajan. He havaitsivat, että immuunivasteet olivat erittäin vakaa, ja kun se on vahvistettu ei kehity aikana 5 vuoden seuranta [23]. Vaikka herpesvirus-spesifisten T-soluvasteiden paljasti ennennäkemättömän vakauden TCR clonotype ohjelmistoon ajan seuraavien ensisijainen infektio, vähemmän tiedetään koskien niiden pysyvyys aikana olosuhteet immunologisen stressin oireettomia kantajia.

Tässä tutkimuksessa olemme tutki luotettavuutta EBV antigeenispesifisten vasteet käytettäessä

in vivo

ympäristössä, jossa tasapaino virus ja immuunivastetta voidaan väliaikaisesti vaarantua seuraavia ohimeneviä lymfoproliferatiivisten ehtyminen (TLD). Erityisesti arvioimme EBV antigeenispesifisen CD8 T-solujen clonotype koostumus ja pysyvyys melanoomapotilaissa jotka saivat ei-myeloablatiivista kemoterapiaa, minkä jälkeen otto- solujen siirto (ACT) autologisia perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC) [24,25 ]. Voitaisiin arvioida määrällisesti virus-spesifisten T-soluvasteiden, suora

ex vivo

clonotypic analyysit yhdistetään geeniekspressioprofilointi yksittäisten antigeenispesifisten T-soluja suoritettiin [13]. Anti-viruksen T-soluvasteita potilailla olivat eriytetty verrattuna terveisiin yksilöihin, joka käsittää sekä muistin ja efektori-CD8-T-soluja. Hallitseva TCR beeta-ketjun clonotypes, mukaan lukien useita julkisia TCR-sekvenssit, havaittiin säilyvän ajan terveillä henkilöillä ja seuraava TLD ja ACT potilaiden keskuudessa. Sitten tutkittiin T-solujen clonotypes vaihdellessa taajuuksilla seuraavat aluetunnus ja immuunijärjestelmän palautuminen, ja totesi, että clonotypes kanssa useammin suorittaa polyfunktionaalista muisti /homing geeniekspressioprofiili (

CD27

,

IL7R

,

EOMES, CD62L /MYY

ja

CCR5

). Kaikkiaan meidän tietojen mukaan EBV-spesifisten T soluvalikoima jatkuu paitsi vakaissa olosuhteissa, mutta myös aikana ohimenevää immunologisia häiriöitä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

kliiniset tutkimukset suunniteltiin ja toteutettiin mukaan asiaa sääntelystandardien ja hyväksytty (i) eettisiä provisio Lausannen yliopiston, (ii) LICR pöytäkirjan arviointikomiteassa, ja (iii) Sveitsin kansallisten sääntelyviranomaisten (Swissmedic ). Ne on rekisteröity NCI kliinisissä tutkimuksissa numerolla NCT00324623 ja EU20607 (www.clinicaltrials.gov). Kaikki verinäytteet potilailta kerättiin kirjallisesta suostumus. Ääreisveren näytteitä neljästä EBV-positiivisten terveiden luovuttajien Bcl3, BCL4, BCL7 ja BCL8, iältään 25 ja 45 vuoden kerättiin kaksi kertaa-pistettä, vuosina 2002 ja 2006, ja kaikki rahoittajat antoivat tietoon suostumus.

melanoomapotilaat ja hoito

verinäytteet viidestä EBV-positiivisten melanooma potilaiden, iältään välillä 39-75 vuotta, kirjoilla vaiheen I kliininen tutkimus Syöpätautien Lausannen yliopistollisen sairaalan (Sveitsi) , otettiin eri ajankohtina ennen ja jälkeen hoidon. Sen jälkeen kokoelma PBMC mukaan leukafereesejä (Leuka), potilaat saivat ei-myeloablatiivista kemoterapiaa, johon kuului Busulfaanin 2 mg /kg (potilaat LAU 618 ja LAU 672) tai syklofosfamidi (CTX) 30 mg /kg (LAU 1144 ja ensimmäinen kierros Lau 1013) tai 60 mg /kg (LAU 936 ja toisen kierroksen LAU 1013) kaksi päivää ja fludarabiinilla 30 mg /m

2 3 päivää [24,25]. Kolme päivää viimeisen injektion jälkeen fludarabiinin, autologisia PBMC: t infusoidaan, ja peptidi rokottaminen Melan-A analoginen peptidi emulgoitu epätäydelliseen Freundin adjuvanttia annettiin ihon alle, kuten aikaisemmin on kuvattu [24]. Potilaan LAU 1144 sai myös liukoisen LAG-3-proteiinin adjuvanttia.

Vasta-ainetasot EBV melanoomapotilaissa

Plasma otettiin kaikilta potilailta useissa ajankohtina ennen ja jälkeen Lympho tuhoavien hoitoa ja analysoitiin muutoksia vasta-ainetasot tiedetään liittyvän kanssa valtion EBV uudelleenaktivointi. Tarkemmin, olemme verranneet plasman vasta-ainetasot kolmea EBV ekspressoidut proteiinit: EBNA-IgG: tä (Epstein-Barr-tuma-antigeeni), EA-IgG: tä (Early Antigen), VCA-IgG ja IgM (Viral Capsid Antigen). EBV vasta-aineet määritettiin käyttäen Athena Multi-Lyte EBV testausjärjestelmän (Zeus tieteellinen, Sommerville, NJ, USA) on Luminex 200 lukijan valmistajan mukaan ohjeita. Tulokset ilmaistiin mielivaltaisina yksikköinä.

Cell valmistelu ja virtaussytometria

PBMC: t saatiin tiheys sentrifugoimalla käyttäen Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi). CD8-T-lymfosyytit positiivisesti rikastettu kylmäsäilytetyt PBMC: käyttäen anti-CD8-päällystetyt magneettiset mikrohelmet (Miltenyi Biotech, Bergish Gladbach, Saksa). PE-leimattua HLA-A * 0201 /peptidi-multimeerit valmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [26], joilla on HLA-A2 rajattu epitooppi GLCTLVAML (nimitystä A2 /GLC) on johdettu EBV lyyttisen proteiinin BMFL1. Solut värjätään ensin PE-leimatun multimeerit 1 tunti huoneenlämmössä (RT) PBS: ssä, 0,2% BSA, 50 uM EDTA, ja sen jälkeen sopivilla vasta-aineilla (20 min 4 ° C: ssa). Solut joko suoraan analysoitiin (LSR-II virtaussytometrillä, BD Biosciences, San Diego, CA) tai lajitellaan määritellään väestön käyttäen FACSVantage SE kone (BD Biosciences). Seuraavat monoklonaalinen Ab ostettiin BD Biosciences tai BD Mingen; anti-CD28-FITC, anti-CD8-allofykosyaniini /Cy7, anti-CCR7: rotta-IgG-mAb, vuohen anti-rotta-IgG-allofykosyaniini, ja CD3-AmCyan-A. Anti-CD45RA-PE-Texas Red mAb ostettiin Beckman Coulter (Marseille, Ranska).

Generation T-solukloonien ja kulttuuri

HLA-A2 /multimeeri

+ CD8

+ T-solujen alaryhmiä määriteltiin efektori-muisti (EM) CCR7-

-CD45RA

-CD28

+ (EM28

pos), CCR7-

-CD45RA

-CD28

– (EM28

neg) ja efek- CCR7

-CD45RA

+ CD28

– (EMRA), ja lajiteltiin virtaussytometrialla suoraan

ex vivo

(kuva S1) . Lajitellut solut kloonattiin rajoittavalla laimennuksella ja laajennetaan RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 8% ihmisen seerumin (HS), 150 U /ml ihmisen rekombinantti-IL-2 (rhIL-2, lahja GlaxoSmithKline), 1 mikrogramma /ml fytohemagglutiniinia (PHA ; Sodiag, Losone, Sveitsi) ja 1×10

6 /ml säteilytettyä allogeenista PBMC (3’000 rad) syöttösoluja. A2 /multimeeri

+ T-solujen kloonit laajennettiin väliajoin (joka 15 päivä) direstimulaatioon 24-kuoppalevyillä PHA, säteilytettyjen tukisolut ja hrIL-2.

suora ex vivo solujen lajittelu, cDNA vahvistusta ja yksisoluisia geeni PCR-

Yhden tai viiden solueriä lajiteltiin suoraan

ex vivo

T solualaryhmiä kohteisiin ja cDNA valmistelu ja globaali cDNA monistaminen suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [27,28]. Gene allekirjoitus yksittäisen T-solun tunnistettiin geeni-spesifisten PCR, kuten on kuvattu [28], ja PCR-tuotteet visualisoitiin elektroforeesin jälkeen 2,5% agaroosigeelillä. Käytimme seuraavia alukkeita:

GAPDH

: 5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 ’; rev-5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3 ’,

beeta-2-mikroglobuliini

: 5′-CCAGCAGAGAATGGAAA GTC-3′; rev-5′-GATGCTGCTTACATGTCTCG-3 ’,

CCR7

: 5′-CCAGGCCTTATCTCC AAGACC-3′; rev-5′-GCATGTCATCCCCACTCTG-3 ’,

CD27

: 5′-ACGTGACAGAGTGCC TTTTCG-3′; rev-5′-TTTGCCCGTCTTGTAGCATG-3 ’,

IL7R

(IL-7RA /CD127): 5′-ATC TTGGCCTGTGTGTTATGG-3′; rev-5′-ATTCTTCTAGTTGCTGAGGAAACG-3 ’;

EOMES

(eomesodermin): 5′-AGCAGGCTGTGAACATTGG-3 ’; rev-5’-TTGACTCCTGGG CCTAGTATC-3 ’,

CCR5

: 5-TCAGCAGGAAGCAACGAAGG-3′; rev-5′-TCTTTGACTTG GCCCAGAGG-3 ’,

KLRD1

(CD94): 5′-GTGGGAGAATGGCTCTG CAC-3′; rev-5′-TGAGCTGTTGCTTACAGATATAACGA-3 ’,

IFNy

(IFN): 5′-GCCAAC CTAAGCAAGATCCCA-3′; rev-5′-GGAAGCACCAGGCATGAAATC-3 ’,

PRF1

(perforiinin): 5′-TTCACTGCCACGGATGCCTAT-3′; rev-5′-GCGGAATTTTAGGTGGCCA-3 ’,

GZMB

(grantsyymi B): 5′-GCAGGAAGATCGAAAGTGCGA-3′; rev-5′-GCATGCCAT TGTTTCGTCCAT-3 ’,

SELL

(CD62L): 5′-CCGTCTGTGAATTGGACCAT-3′; rev-5′-AAC AGCAAAACCCCCAAACT-3 ’.

TCR spectratyping, sekvensointi ja TCR clonotyping

TCR spectratyping [14] käytettiin tunnistamaan kaikki TCR clonotypes, jotka luokitellaan Immunogene- (IMGT) ehdotetun nimikkeistön mukaan Lefranc ja työtovereiden (http : //imgt.org/) [29]. Nopeasti tunnistamaan TRBV osan käyttö, cDNA: EBV antigeenispesifisten CD8 T-soluja saatettuna ensin yksittäisiä PCR käyttäen joukko aiemmin validoitu fluoresenssileimattua eteenpäin alukkeiden spesifisiä 22 TCR

BV

subfamilies ja yksi merkitsemätön reverse-aluke, joka on spesifinen vakioalue beta-ketjun TCR [30]. Tämä TRBV-CDR3 spectratyping analyysi edustaa prescreening askel, joka mahdollistaa säästää aikaa ja reagenssit (tietoja ei ole esitetty). Kun positiivinen TRBV subfamilies havaittiin, yksittäiset cDNA-näytteet tuotetaan joko

ex vivo

lajitellun yksittäisen solun näytteitä (n = 477) ja 5-solun näytettä (edustaen vastaa 300-450 EBV-spesifisten CD8-T-solujen kohti terve luovuttajan tai melanoomapotilaalla) tai

in vitro

syntyy T-solukloonien (terveiden luovuttajien, n = 530 klooneja, melanooma potilaiden, n = 779 kloonia) altistettiin TRBV erityisiä PCR. Erottaminen ja havaitseminen monistetaan PCR fragmentteja, jotka sisälsivät koko CDR3 segmentin tehtiin läsnäollessa loisteputki kokomerkkiaineiden ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (AppliedBiosystems /Life Technologies Corporation, Zug, Sveitsi) ja tiedot analysoitiin GeneScan 3.7.1 ( AppliedBiosystems). Viimeisessä vaiheessa, PCR-tuotteet kiinnostavia olivat suoraan puhdistettiin ja sekvensoitiin reverse-aluketta (Fasteris SA, Geneve, Sveitsi). Suurin osa PCR-tuotteet sekvensoitiin kuitenkin useita määräävän TCR clonotypes (n = 8 HDS; n = 10 potilasta), ainutlaatuinen vastaavia alukkeita

CDR3

geenin segmentti suunniteltiin ja käytettiin clonotyping PCR kuten aikaisemmin kuvatulla tavalla [15]. Kaikki

ex vivo

yksisoluisia, 5-solu, ja

in vitro

syntyy T-solu-cDNA: n näytteitä terveiltä luovuttajilta ja melanoomaa potilasta käsitellään samalla tiukkaa lähestymistapaa.

Tilastolliset analyysit

Kuten koko tekstissä, Kruskal-Wallisin ei-parametrista, yksisuuntainen ANOVA ja Spearmanin korrelaatiota suoritettiin Prism 5.0 (La Jolla, Kalifornia, USA) ja

P

0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Co-ilmaisu ympyräkaaviot verrattiin keskenään käyttämällä 10’000 permutaatiot lasketaan Ohjelmiston SPICE 5,2 (NIH, Bethesda, USA).

Tulokset

Tehostettu efektorisolutyyppi erilaistumista EBV antigeenispesifisten CD8 T-solujen seuraavat ohimeneviä lymfoproliferatiivisten ehtyminen ja immuunijärjestelmän palautuminen

Viimeaikaiset immunoterapia kokeet ovat osoittaneet, että lymfoproliferatiivisten ehtyminen aiheuttama ei-myeloablatiivista kemoterapiaa suosi myöhempi laajentaminen adoptiivisesti siirrettyjen T-solujen homeostaattisina mekanismien ([31]; kuvio 1A). Tarkentaa tätä strategiaa, olimme aikaisemmin analysoi vaikutusta kolme erilaista kuin myeloablatiivisen ilmastointi kemoterapiahoitojen on lymfoproliferatiivisten ehtyminen ja käyttövalmiiksi melanoomapotilailla [24,25]. Kolme solunsalpaajahoitojen indusoi merkittävää ohimenevää ehtyminen lymfosyyttien, jota seurasi tehokkaan talteenoton yhteensä lymfosyyttien [24,25] ja CD8 T-solujen (kuvio 1 B, vasen paneeli) laskee normaalitasolle neljän viikon kuluttua adoptiovanhemmat solujen siirron (post-ACT).

. Kaavioesitys kuin myeloablating Lympho heikentävien käsittely ja sen jälkeen ACT PBMCdden melanooman potilaille. Verinäytteet analysoitiin kaikille potilaille leukafereesituotteeseen aikapisteessä (Leuka) ennen TLD kemoterapiaa ja post-ACT (aika-pisteen T1), joka vastasi päivä 32 (potilas LAU 1144), päivä 45 (LAU 1013), tai päivä 60 (LAU 618, LAU 936, ja LAU 672). B. Vasen paneeli; kokonaismäärät CD8 T-solujen viideltä melanooma potilaiden Leuka ja post-ACT. Oikea paneeli; fenotyyppiä CD8 T-solujen osoittavat osuudet varhaisen eriytetty (EM28

pos; CCR7-

negCD45RA

negCD28

pos) ja myöhään eriytetty (joka koostuu EM28

neg; CCR7-

negCD45RA

negCD28

neg ja EMRA; CCR7

negCD45RA

posCD28

neg) subsets neljästä terveestä luovuttajasta (HDS) ja viideltä melanoomaa potilaiden Leuka ja post-ACT. C. Vasen paneeli; kokonaismäärät EBV-CD8 T-solujen ääreisveren viideltä melanoomaa potilaiden Leuka ja post-ACT ajankohtina. Oikea paneeli; fenotyyppi EBV-CD8 T-solujen osoittavat osuudet varhaisen eriytetty (EM28

pos; CCR7-

negCD45RA

negCD28

pos) ja myöhään eriytetty (joka koostuu EM28

neg; CCR7

negCD45RA

negCD28

neg ja EMRA; CCR7

negCD45RA

posCD28

neg) subsets neljästä terveistä luovuttajista ja viideltä melanoomaa potilaiden Leuka ja post-ACT. D. EBV-spesifistä vasta-ainetta tasot mitattiin plasmasta näytteistä viidestä melanoomapotilailta eri ajankohtina ennen ja jälkeen Lympho tuhoavien hoitoa. Päivä 0 x-akseli kuvaa päivänä ACT. Tulokset edustettuina mielivaltaiseen yksiköiden suhteellinen indeksi mittakaavassa. Plasmassa evoluutio on esitetty erikseen jokaisen anti-EBV-vasta-(anti-VCA-IgM ja IgG, anti-EBNA IgG ja anti-EA IgG), ja harmaa palkki edustaa raja-negatiivisiin ja positiivisiin tilan kunkin merkin.

sitten analysoimme CD8 T-soluja, jotka ovat spesifisiä EBV lyyttisen proteiinin BMFL1 viideltä potilaalta, joilla on vaiheen IV melanooma ennen ja jälkeen TLD (kuvio S1) ja neljä terveiltä luovuttajilta. Kokonaisosuus EBV antigeenispesifisten T-solujen ennen ja jälkeen hoidon pysyi ennallaan (kuvio 1 C, vasen paneeli;

P

= 0,625, Kruskal-Wallis). Verrattuna terveisiin yksilöihin, BMFL1-spesifisten CD8-T-solujen melanoomapotilailta osoittivat kehittyneempää efektorisolujen erilaistumista lisääntynyt prosenttiosuudet EM28

neg (määritelty CCR7

negCD45RA

negCD28

neg) ja EMRA ( määritellään CCR7-

negCD45RA

posCD28

neg) osajoukot jo ennen hoitoa (ts aikaan leukafereesejä) (kuvio 1 C, oikea paneeli). Nämä osajoukot kasvoi edelleen ja tuli hallitseva post-ACT. Terveillä luovuttajilla, niin pitkälle efektorisolutyyppi erilaistumista ei yleensä havaita EBV-CD8 T-solujen, joka muistuttaa paremmin CMV-spesifisten T-soluvasteiden [14,32]. Heikomman määrin kehittyneet efektorisolutyyppi erilaistumiseen havaittiin myös koko CD8 T-solujen allas (kuvio 1 B, oikea paneeli), mikä viittaa siihen, että edeltävä historia syövän etenemisen ja sai hoitoja, kuten kemoterapiaa ja immunoterapia, ovat saattaneet vaikuttaa CD8 T soluosastoon.

Transient lymfoproliferatiivisten ehtyminen ei johda EBV uudelleen aktivoituminen

tutkia kykyä EBV antigeenispesifisten CD8-T-soluvasteen ohjata viruksen toiminnan aikana tilanteissa vähentynyt immuunijärjestelmän valvonnan, määrittelimme onko ei-myeloablatiivista kemoterapiaa ehkä johtanut EBV uudelleen aktivoituminen. Plasma vasta-ainetasot viruksen kapsidin antigeenille (VCA) IgG ja IgM, Epstein-Barr tuma-antigeenin (EBNA) IgG, ja varhainen antigeeni (EA) IgG mitattiin ennen ja jälkeen TLD ja ACT-hoitoja (kuvio 1 D) [33]. EBV-spesifisten vasta-aineiden pysyi stabiilina useita kuukausia hoidon jälkeen kaikilla potilailla. Tämä on sopusoinnussa piilevä EBV-infektio ilman viruksen uudelleenaktivoituminen, vaikka jälkimmäinen ei voida täysin sulkea pois. EBV n kopiomäärän miljoonasosaa PBMC olivat alle tason havaitseminen reaaliaikaisella PCR-reaktion verinäytteistä ennen ja jälkeen TLD (tuloksia ei ole esitetty).

Ex vivo EBV antigeenispesifisen CD8 T-solujen ohjelmistoon seuraavat ohimeneviä lymfoproliferatiivisten ehtyminen paljastaa clonotype pysyvyys huolimatta taajuuden vaihteluista

aiemmin kehittänyt strategian globaalin cDNA vahvistus 5-solutasolla sopiva suoran

ex vivo

arviointi yksittäisen TCR BV-CDR3beta (TRBV) geenisegmenttiin käyttö [14,34]. Lyhyesti, cDNA: EBV-epitooppispesifisiä CD8 T-solut on alun perin tuotettu ja jota käytetään näytön toistuvia TRBV perheille. Tämän jälkeen ylivoima kunkin TRBV perheen määritettiin testaamalla jokainen 5-solujen näyte, joka sisältää altaan positiivisen TRBV perheisiin sekä edustaa vastaa 300 450 virusta CD8 T-solujen per yksilö. Monistettu TRBV-CDR3-JB-geenin segmentit lopulta sekvensoitiin tai PCR-clonotyped tunnistamaan ainutlaatuinen TCR allekirjoitus kunkin T-solujen clonotype, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tätä lähestymistapaa käyttäen me aluksi verrattuna TCR clonotype ohjelmistoon suoraan

ex vivo

lajiteltu 5-solu EBV-spesifisten T-solujen kanssa, yhden T-solujen tuottama

in vitro

rajoittavan laimennuksen kulttuureissa . Vastaavissa suhteissa yksittäisten TCR clonotype allekirjoitukset löydettiin käytettäessä

ex vivo

lajiteltu 5-solun ja

in vitro

T-solujen kloonaus lähestymistapoja (kuvio S2A) yhteisymmärryksessä aiempien tutkimusten kanssa, [14 , 15,28]. Lisäksi itsenäisesti suorittaa

ex vivo

lajittelu kokeita virusta antigeenispesifisten T-solujen, osoittivat samanlaisia ​​suhteellinen taajuuksilla määräävän T-solujen clonotypes (kuvio S2B). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että meidän suora

ex vivo

lähestymistapa mahdollistaa korkean resoluution molekulaarisen karakterisoinnin clonotype ohjelmistoon

in vivo

määritellyissä antigeenispesifisen osapopulaatioiden.

vieressä määritetään pysyvyys EBV BMFL1-spesifisten T-solujen clonotypes terveillä henkilöillä ajan. Suurin osa clonotypes oli läsnä sekä varhaisen ja myöhäisen ajankohtina (kuvio 2A). Lisäksi korrelaatio havaittiin tilastollisesti merkittävä assosiaatio taajuuksien clonotypes havaittu yli 4 vuoden (kuvio 2B; Rho = 0,739,

P

0,001, Spearmanin korrelaatio). Voisimme tarkkailla syntynyt uusia clonotypes ajan, mutta nämä havaittuja clonotypes olivat matalia taajuuksia (

5%) (kuvio 2B). Yhdessä nämä tulokset ovat samansuuntaisia ​​kuin aiemmin raportoitu ryhmämme [14] ja muut [23], ja osoittavat, että kerran perustettu terveillä aikuisilla, klonaalisen koostumus aikana krooninen herpes viruksia infektio pidetään stabiilina vähintään useita vuosia.

A ja C TRBV clonotype koostumus EBV-CD8 T-solujen PBMC kahdelta terveiltä luovuttajilta (A) varhaisen (2002) ja myöhäinen (2006) ajankohtina, ja PBMC neljästä melanoomapotilailta ( C) Leuka ajankohdassa ja post-ACT. Jokainen clonotype edustaa sen erityinen TRBV perhe ja sen koodinumero (clono). Clonotype taajuudet on laskettu, kun läsnä on kunkin clonotypic sekvenssin joukossa yksittäisiä 5-solun näytettä (terveiltä luovuttajilta, n = 142; melanoomapotilailla, n = 344) järjestetty suoraan

ex

vivo

. Huomattavaa on, että vain taajuudet joko uuden ”kasvaa” tai ”vähentynyt” clonotypes on kuvattu. B ja D. korrelaatio yksittäisten clonotype taajuuksia saadaan

ex

vivo

lajiteltu 5-solujen näytteistä (B) välillä verinäytteitä aikaisin (2002) ja myöhäinen (2006) aika-pistettä kaksi tervettä luovuttajien ja (D) välillä Leuka ja post-ACT viideltä melanoomapotilailta (Spearmanin korrelaatio). Sisäkkeet esittävät korrelaation TCR clonotypes taajuuksilla alle 10% terveiden luovuttajien ja 20% potilaista.

arvioitu, EBV antigeenispesifisen TCR ohjelmistoon viidellä melanoomapotilailla määrittämiseksi palautumiskyky määräävän T-solujen clonotypes seuraavat TLD ja ACT (kuvio 2C). Samoin kuin terveiden luovuttajien, yleinen TCR ohjelmistoon jatkui seuraavat aluetunnus ja ACT kanssa suuri enemmistö clonotypes on havaittavissa ennen ja jälkeen hoidon (kuvio 2C). Lukuun ottamatta potilaan LAU 936, The clonotypes että joko kadonnut tai esiintyi olivat matalan taajuuden (alle 5%), joka voi liittyä herkkyys tekniikka enemmän kuin varsinainen ulkonäköä tai katoaminen tietyn clonotype. Kuitenkin löysimme selvempi vaihtelut taajuudet havaittavan clonotypes potilailla verrattuna terveiden luovuttajien, mikä näkyi erityisesti varten clonotypes taajuuksilla 20% (kuvio 2D). Yhdessä tuloksemme osoittavat, että klonaalinen koostumus EBV-CD8 T-solujen maailmanlaajuisesti ylläpidettiin melanooman potilailla, joille aluetunnus ja seuraa immuuni saattamisen vaihteluista huolimatta taajuudet erityisiä potilaille sekä clonotypes havaittavissa alemmilla taajuuksilla.

EBV antigeenispesifisiä clonotypes laakeri julkisen TRBV sekvenssit usein jaettu terveiden luovuttajien ja melanoomapotilaita

Suurin samankaltaisuus EBV epitooppispesifisiä CD8 T-solujen välillä tervettä aikuista ja potilaat oli etuoikeutettu

in vivo

valinta hallitseva clonotypes kanssa TRBV ketjujen kuuluvien

TRBV14

,

TRBV20

ja

TRBV29

perheet (kuva 2). Havaitsimme myös ainakin neljätoista julkinen TRBV sekvenssit, kaksi CDR3 motiivia RDxTGNGY ja VGxGGTNEKL, jotka olivat yliedustettuja ja jaettu sisällä terveille henkilöille ja melanoomapotilaita (kuvio 3A). Julkisen clonotypes on määritelty, kun läsnä on sama identtinen TRBV-CDR3-BJ sekvenssi löytyy ainakin kaksi sukulaisyksilöistä. Aiempien raporttien [35], useita Julkisen TRBV clonotypes tunnistettu tässä tutkimuksessa koodasi kaksi tai kolme eri nukleotidisekvenssin variaatioita. Kun vertasimme taajuudet julkisen TRBV clonotypes säilyisi koko EBV-CD8 T-soluvasteita, kolmasosa heistä edustaa hallitseva clonotypes (taajuuksilla 5%) (kuvio 3B). 35 on 48% EBV antigeenispesifisen clonotypes havaittiin alhaisilla taajuuksilla (välillä 1 ja 5%), kun taas noin neljännes havaittiin vain kerran terveiden luovuttajien tai potilaiden. Yhdessä meidän tiedot osoittivat todisteita korkea samankaltaisuus EBV BMFL1-spesifisten CD8-T-solujen välillä melanooma potilaiden ja terveiden yksilöiden, kuten on kuvattu (i) jakaminen usein julkisen TRBV sekvenssit ja (ii) pysyvyys näiden julkisten TRBV clonotypes ajan ja seuraava aluetunnus.

. Kooste 14 julkisen aminohapon TCR beta-domain sekvenssit havaittu joukossa kolme terveiden ihmisten ja viisi melanoomapotilaasta. Kukin TCR beeta-ketjun clonotype kuvataan TRBV segmentin, CDR3-beeta-sekvenssin, TRBJ segmentti, määrä nukleotidisekvenssi variantteja tunnistettiin kustakin aminohapposekvenssi, sekä osuuden terveiden luovuttajien ja potilaiden, josta kukin sekvenssi tunnistettiin. B. jakelu julkisen sekvenssien koko EBV-CD8 T-solujen terveillä luovuttajilla ja potilailla mukaan niiden suhteellinen taajuus; hallitseva clonotypes (taajuuden 5%) ovat edustettuina musta, alhainen hallitseva (1-5%) harmaana ja ainutlaatuisia jaksoja valkoinen.

Tehostettu geeniekspressiota polyfunctionality yksittäiset EBV antigeenispesifisten CD8 T-solujen jälkeen ohimenevän lymfoproliferatiivisten ehtyminen ja immuunijärjestelmän palautuminen

tutkimiseksi edelleen vaikutuksen TLD ja ACT, me tunnettu kehitys EBV-epitooppispesifisiä CD8-T-soluvasteen potilaan LAU 1013, joille tehtiin kahden peräkkäisen syklin aluetunnuksen ja immuunijärjestelmän palautuminen (kuvio 4A), ilman merkkejä EBV uudelleenaktivoinnin (kuvio 1 D). Taajuus EBV-varhaiskuntoutus-eriytetty ”muisti-like” EM28

pos ja myöhään eriytetty EM28

neg /EMRA CD8 T-solut olivat samankaltaiset kahden leukafereesin ajankohtina (Leuka I ja Leuka II) ( kuvio 4B). Mukaisesti tiedot on esitetty kuviossa 1, havaitsimme parannettu efektorisolu erilaistumista EBV-spesifisten T-solujen ennen (at Leuka I) ja seuraavat lymfoproliferatiivisten ehtyminen (Leuka II), verrattuna virus-spesifisiä T-soluja terveiltä luovuttajilta .

. Aikataulu hoito potilaan LAU 1013, jotka saivat kaksi kierrosta TLD (kuvattu harmaat laatikot). Harmaat nuolet osoittavat leukafereesejä (Leuka I ja Leuka II) ja infuusioon PBMC vastaavasti. Verinäytteet otettiin päivänä 45 (post-Leuka I) ja päivänä 15/22 (post-Leuka II) jälkeen reinfusion. B. Fenotyyppikuvaus EBV BMFL1 CD8-T-solujen (vasen paneeli) ja CD8-T-solujen (oikea paneeli) osoittaa osuudet varhaisen eriytetty (EM28

pos; CCR7-

negCD45RA

negCD28

pos) ja myöhään eriytetty (joka koostuu EM28

neg; CCR7-

negCD45RA

negCD28

neg ja EMRA; CCR7

negCD45RA

posCD28

neg) osajoukkojen PBMC otettu potilaan LAU 1013 at Leuka I (n = 2) ja Leuka II (n = 3) aikapisteissä. Virhepalkit (keskiarvo +/- SD) edustavat riippumatonta kokeellisia rinnakkaista. C. Suoraan

ex

vivo

kumulatiivinen ilmaus muisti /itseohjautuva liittyvien geenien (

CD62L /SELL

,

CCR5

,

IL7R

,

CD27

ja

EOMES

) ja efektori liittyvien geenien (

PRF1

,

KLRD1 /CD94

,

IFNy

ja

GZMB

). Yhden EBV-CD8 T-solut lajiteltiin aikaisen eriytetty EM28

pos ja myöhään eriytetty EMRA at Leuka I (n = 266) ja Leuka II (n = 162) ajankohtina ja käsitellään globaalin cDNA vahvistusta kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät.

P

-arvot suoritettiin yksisuuntaisella ANOVA testi; ns, ei ole merkittävä.

tukeminen Information

Kuva S1.