PLoS ONE: tuumorisoluissa Positiivinen ja negatiivinen yhteisen Cancer Stem Cell merkkiaineet pystyvät käynnistäminen tuumorikasvun ja tuottaa Molemmat jälkeläisten
tiivistelmä
Syöpä kantasolu (CSC) malli kuvaa, että kasvaimet hierarkkisesti järjestäytynyt ja ylläpitää CSCS makaa kärkeen. CSCS on ”tunnettu” eri kasvainten kasvaimen muodostavan määritys, jossa kasvainsolut erottaa tietyn solupinnan markkeri (tunnetaan CSC merkki) on erikseen istutetaan immuunivajaisiin hiirillä. Tällaisissa määrityksissä, kasvainsolujen positiivinen, mutta ei negatiivinen CSC merkki (täten määritelty CSC
+ ja CSC
– soluja, vastaavasti) on kyky kasvaimen muodostavien ja tuottavat molemmat jälkeläisten. Kuitenkin tässä osoitamme, että CSC
+ ja CSC
– soluilla samanlainen lisääntymistä natiivi valtioissa. Käyttämällä solu jäljittämistä menetelmä, osoitamme, että CSC
– soluilla samanlaisia kasvaimen kehittymisen ja leviämisen CSC
+ soluihin, kun he olivat yhdessä istutetaan immuunivajaisiin hiiriin. Sarjasiirrostuksilla yksisoluiset peräisin alalinja rakentaminen, me osoitti lisäksi, että CSC
+ ja CSC
– soluja CSC markkeri ilmentävien kasvainten voisi poikkeuksetta tuottavat sekä jälkeläisistä, ja niiden ominaisuudet säilyvät eri sukupolvien riippumatta alkuperää (CSC
+ – johdettu tai CSC
– johdettu). Nämä havainnot osoittavat, että kasvaimia synnyttäviä soluja ei voida erottaa yhteisen CSC markkereita yksin ja ehdotamme, että varoitukset on otettava käytettäessä näitä merkkiaineita itsenäisesti tunnistamaan syövän kantasoluja johtuen fenotyyppisen plastisuus syöpäsoluja.
Citation: Huang SD, Yuan Y, Tang H, Liu XH, Fu CG, Cheng HZ, et ai. (2013) tuumorisoluissa Positiiviset ja negatiiviset yhteisen Cancer Stem Cell merkkiaineet pystyvät käynnistäminen tuumorikasvun ja tuottaa Molemmat jälkeläisten. PLoS ONE 8 (1): e54579. doi: 10,1371 /journal.pone.0054579
Editor: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Yhdysvallat
vastaanotettu: 03 marraskuu 2011; Hyväksytty: 13 joulukuu 2012; Julkaistu: 21. 2013
Copyright: © 2013 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (avustukset 30471718, 30801094 ja 30872552) ja Shanghai Municipal Natural Science Foundation (avustus 10140902300). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Peruskysymys alalla kasvaintutkimuksille on joka solut voivat aloittaa kasvaimia. Kaksi mallia on esitetty selittämään aloittamiseen kasvainten [1], [2]. Klonaalisen evoluutiomalli (tunnetaan myös stokastinen malli) merkitsee sitä, että kasvaimet käsittävät soluja, yhtä Tuumorigeenisuustutkimuksissa ja että mikä tahansa funktionaalinen heterogeenisuus selittyy satunnainen tai stokastisia vaikuttaa (sisäinen tai ulkoinen), joka voi muuttaa käyttäytymistä yksittäisten solujen kasvain. Sitä vastoin syöpä kantasolujen (CSC) malli (tunnetaan myös hierarkian malli) mukaan, kuten normaaleissa kudoksissa, jotka ovat solujen hierarkioita ylläpitää kantasoluja, kasvaimet voidaan selittää hierarkkisen organisaatioiden, jossa CSCS makaa kärkeen pidä kapasiteetti kasvain aloittamista, itseuudistumiseen, ja sukupolvi fenotyypiltään erilaisia soluja vähän tai ei lainkaan proliferatiivista kapasiteettia. Kannattaa CSC malli ehdottaa, että CSCS voi selittää kasvainten käyttäytymistä, kuten etäpesäkkeiden [3], [4] ja kestävyys kemoterapiaa tai sädehoitoa [5] – [9]. Siksi CSC-täsmähoitoihin voi olla tulevaisuuden suunta kasvaimen hoito [10] – [13].
kautta kasvain muodostavia määritys, jossa fenotyypiltään erilaiset solut erikseen istutetaan immuunivajausta hiiriin, CSC oli ensimmäinen ”tunnistettu ”ihmisen akuuttia myelooista leukemiaa (AML), sillä vain CD34
+ CD38
– solujen havaittiin on kyky kasvaimen aloittamista itseuudistumiseen, ja tuottavat solut muiden subsets tällaisissa kunnossa [14]. Sittemmin ksenotransplantaatioon kokeellinen malli on laajalti käytetty CSC tutkimuksissa. Käyttämällä erilaisia solun pinnan markkereita, suuri määrä kirjallisuutta on julkaistu viittaa olemassaolon CSCS erilaisia kasvaimia, kuten krooninen myelooinen leukemia (CML) [15], [16], akuutti promyelosyyttinen leukemia (APL) [17], [18], rintasyöpä [19], glioblastoma [20] – [23], paksusuolen syöpä [24] – [26] ja melanooma [27] – [30].
kuitenkin on selvittämättä kiistaa siitä, onko kasvain muodostavan kapasiteetin ihmisen kasvainsoluissa on oikein huomioon aiemmissa tutkimuksissa [31], [32]. Koska tehokkuus ksenotransplantaatio useimmissa tapauksissa on huomattavasti pienempi kuin syngeenisille elinsiirrot, Kelly et ai. ehdotti, että kasvain muodostava kyky ihmisen syöpäsoluissa voi vakavasti vaarantunut hiiren miljöö vuoksi lajikohtaisia eroja affiniteetilla (tai tunnustamista) syto- ja kasvutekijän reseptorit sukulaisamideillaan ligandien [33]. Lisäksi Quintana et ai. työllisti enemmän korkeasti immuunipuutteisilla Hiirikanta (NOD /SCID interleukiini-2-reseptorin gamma-ketjun null [ll2rg – /-]) ksenotransplantaatioon määritystä ja havaittiin, että tämä voisi merkittävästi lisätä havaittavissa taajuus solujen Tuumorigeenisuustutkimuksissa ihmisen melanooma, mikä viittaa siihen, että kasvain muodostava kyky ihmisen kasvainsolujen voitaisiin suuresti heikentyä immuuni vaikutusvaltaansa ulkomaan miljöössä [34]. Nämä johtivat meidät onko proliferatiivista ja tuumorigeenisen kapasiteetin ihmisen kasvainsolujen, erityisesti kuin ”ei-CSCS” olisi aliarvioitu aikaisemmissa tutkimuksissa.
Tässä tutkimuksessa, arvioimme leviämisen ja apoptoosin oletetun CSCS (CSC
+ solut) ja ei-CSCS (CSC
– solut) primaaristen kasvainten sekä kasvainsolulinjoissa virtaussytometrialla. Toisin kuin aiemmissa raporteissa tavanomaisista ksenotransplantaatio määritykset (istuttamisen CSC
+ ja CSC
– soluja erikseen), jossa CSC
– soluja osoitettiin olevan vähän tai ei lainkaan proliferatiivista kapasiteettia [1], [35] , [36], me ei havaittu huomattavia eroja lisääntymistä ja apoptoosin välillä osajoukkoja natiivissa tilassa. Olemme edelleen työskentelee solun jäljitys tekniikkaa seurata leviämisen, tuumorigeenisyyteen CSC
+ ja CSC
– soluja. Päätimme tutkia solujen useista kasvainsolulinjoilla sijaan ensisijainen kasvaimia, jotka saattavat sisältää geneettisesti erilaisia soluja [27], [37]. Todettiin, että CSC
– soluja näytteillä samanlainen proliferatiivinen ja tuumorigeenisia kapasiteetit kuin CSC
+ soluja, kun kaksi subsets rinnakkain. Lisäksi molemmat alaryhmiä voisi aiheuttaa CSC
+ sekä CSC
– jälkeläisistä, vaikka ominaisuudet CSC
+ (tai CSC
-) soluja pidettiin eri sukupolvien riippumatta alkuperää (CSC
+ – johdettu tai CSC
– johdettu). Tuloksemme viittaavat siihen, että CSC merkkejä pitäisi käyttää harkiten erottamaan syövän kantasoluja muista kasvainsolut johtuu niiden fenotyyppisen plastisuus.
Tulokset
ilmentäminen CSC merkkiaineiden vaihtelee huomattavasti ihmisen ensisijainen kasvaimia ja kasvainsolulinjoja
Aikaisemmat tutkimukset viittaavat siihen leukemogeeninen /tuumorigeenisiä soluja rajoitettu harvinaisten populaation ilmentävien kasvainsolujen tiettyjen CSC markkereita [35], [36]. Käyttämällä trypsiini-vapaa dissosiaation protokolla (ylläpitää epitoopin eheys), havaitsimme prosenttiosuus CSC merkki positiivisten solujen (esim CD34
+ CD38
– for AML, APL, ja KML, CD44
+ CD24
– rintasyövän, CD133
+ varten glioblastoma ja paksusuolen syöpä, ja CD271
+ melanooman) ihmisen primaarikasvainten sekä kasvainsolulinjoissa virtaussytometrisellä analyysi. Olemme havainneet, että huomattava määrä primaaristen kasvainten tai tuumorisolulinjoissa ei ilmaista nämä CSC markkereita (kuvio 1A), joka on yhdenmukainen joidenkin muiden raporttien [38], [39]. Lisäksi teimme kvantitatiivinen RT-PCR ja totesi, että solut (molemmat CSC
+ ja CSC
-) CSC merkki ilmentäviä kasvaimia, mutta ei soluja CSC markkeri kuin ilmentävien kasvainten, ilmaista CSC merkki mRNA (kuviot 1B-F ja kuvio S1), mikä viittaa siihen, että CSC markkeri ilmentävien että ei-ilmentävien kasvainten saattavat olla peräisin erilaisista syöpäsoluja. Perus-kasvaimia ja kasvainsolulinjoja ilmentämään tällaisia CSC markkereita, prosenttiosuus CSC markkerin positiivisten solujen vaihdella suuresti, jotka vaihtelevat 0,4% käytettäessä AML niinkin korkea kuin 82,7% on paksusuolen syöpä (kuvio 1A).
(A) prosenttiosuus CSC markkeri positiivisten solujen ihmisen primaaristen kasvainten (n = 10 kullekin) ja kasvainsolulinjoissa. Yhden solun suspensiot valmistettiin, jota seurasi virtaussytometria-analyysin. Dots prosenttiosuutta CD34
+ CD38
– solujen AML, APL, ja KML, CD44
+ CD24
– solujen rintasyövän, CD133
+ solujen glioblastooma ja paksusuolen syöpä ja CD271
+ solujen melanooman näytteissä. (B-F) CSC merkki mRNA ilmentymistaso soluista (CSC
+ ja CSC
– soluja CSC merkki ilmentäviä tuumorisolulinjoja, ja soluja ei-ilmaisun tuumorisolulinjat) analysoitiin qRT-PCR ja normalisoidaan
GAPDH
. Taso CD34 mRNA KG-1 CSC
+ soluja, CD44 mRNA MCF-7 CSC
+ soluja, CD133 mRNA SHG-44 ja Caco-2 CSC
+ soluja, CD271 mRNA A375 CSC
+ soluja, on mielivaltaisesti nimetty 1,0 leukemia, rintasyöpä, glioblastooma, paksusuolen syöpä, melanooma näytteet, vastaavasti. Valokuvat osoittavat RT-PCR-tuotteita ja histogrammit esittävät CSC markkeri mRNA-ilmentymisen määrä solujen leukemia (B), rintasyöpä (C), glioblastooma (D), paksusuolen syöpä (E), ja melanooma (F) solulinjat. Huomaa, että soluja CSC merkki ei-ilmentäviä tuumorisolulinjoja (U37, U81, Colo320, LoVo, LS174T) eivät ilmaise CSC merkki mRNA.
CSC
– kasvainsolujen osoittavat samankaltaisia proliferaatiota CSC
+ kasvainsolujen natiivissa tilassa
tutkimiseksi leviämisen oletetun CSCS (CSC
+ solut) ja ei-CSCS (CSC
– soluja) natiivissa tilassa, mittasimme prosenttiosuus lisääntyvät ja apoptoottisten solujen kahden osajoukkoja CSC markkeri ilmentävien primaaristen kasvainten (esimerkiksi AML, APL, CML, rintasyöpä, glioblastooma, paksusuolen syöpä, ja melanooma) virtaussytometrialla. Kuten kuvioissa 2A ja 2B, prosenttiosuus Ki-67-positiivisia soluja, ja prosenttiosuus anneksiini V
+ 7-AAD
– solut eivät eroa merkittävästi näiden kahden osajoukkoja. Samanlaisia tuloksia saatiin
in vitro
(kuviot 2C ja 2D) ja
in vivo
(kuviot 2E ja 2F) tutkimukset CSC merkki ilmentävät ihmisen tuumorisolulinjoissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että proliferatiivista kapasiteettia CSC
– soluja on samanlainen kuin CSC
+ solujen natiivissa tilassa.
(A, B) CSC merkki ilmentävät Perusnäytteeseen valittiin käymään läpi Ki-67 ilmentymisen ja apoptoosin analyysi. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM; n = 10 kullekin leukemia, n = 8 glioblastoma ja paksusuolen syövän, n = 9 rintasyövän ja melanooman. (A) Ki-67 ilmentyminen CSC
+ ja CSC
– soluja ihmisen ensisijainen kasvaimia. Yhden solun suspensiot ihmisen primaaristen kasvainten värjättiin spesifisten vasta-aineiden CSC: n markkereita ja Ki-67-FITC: llä, mitä seurasi virtaussytometria-analyysin. (B) apoptoosimäärityksessä CSC
+ ja CSC
– soluja ihmisen ensisijainen kasvaimia. Yhden solun suspensiot ihmisen primaaristen kasvainten värjättiin spesifisten vasta-aineiden CSC: n markkereita ja anneksiini V-FITC /7-ADD, jota seurasi virtaussytometria-analyysin. (C-D) Ki-67 ilmentyminen (C) ja apoptoosin (D) määritys CSC
+ ja CSC
– soluja ihmisen kasvaimen solulinjojen viljeltiin seerumia sisältävässä väliaineessa. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta. (E-F) Ki-67 ilmentyminen (E) ja apoptoosin (F) määritystä CSC
+ ja CSC
– solujen ksenograftien peräisin ihmisen kasvaimen solulinjojen. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta. (G) DsRed-leimattua CSC
+ ja EGFP-leimatun CSC
– soluja, joka on peräisin samasta kasvainsolulinjat sekoitettiin niiden alkuperäisen suhteet ja viljellään yhdessä seerumia sisältävässä väliaineessa 20 kohtia. Dots osoittavat suhde CSC
+ – johdettu CSC
– johdettu (DsRed: EGFP) solut eri kohtia. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM 3 erilliselle kokeelle.
Voit seurata leviämisen CSC
+ ja CSC
– soluja, me käytettiin edelleen solun jäljitys tekniikkaa suunniteltu simuloimaan
in situ
ympäristössä, jossa sekä alaryhmissä rinnakkain. DsRed-leimattua CSC
+ ja EGFP-leimatun CSC
– soluja, joka on peräisin samasta kasvainsolulinjat sekoitettiin niiden alkuperäisen suhteet ja viljellään yhdessä seerumia sisältävässä väliaineessa 20 kohtia (katso Kokeelliset menettelyt tiedot ). Virtaussytometria analyysi osoitti, että suhde CSC
+ – johdettu CSC
– johdettu (DsRed: EGFP) solut pohjimmiltaan muuttunut koko prosessin (kuvio 2G). Nämä tiedot viittaavat siihen, että sekä CSC
+ ja CSC
– soluja voitaisiin levittää laajasti.
CSC
– kasvainsolujen näyttää samankaltaisia kasvaimen muodostavia ominaisuudessa CSC
+ kasvainsoluja samanakaiseen -transplantation
kun otetaan huomioon edellä esitetyt päätelmät, tutkimme kasvain muodostava kapasiteetti CSC
+ ja CSC
– solujen yhteistyö elinsiirron sekä perinteiset ksenotransplantaatio (istuttamisen CSC
+ ja CSC
– soluja erikseen). DsRed-leimattua CSC
+ ja EGFP-leimatun CSC
– soluja peräisin samasta kasvainsolulinjat sekoitettiin alkuperäisessä suhteessa. Eri määrä CSC
+, CSC
– tai mixed solut ruiskutetaan munuaisten kapseli sublethally säteilytettyä NOD-SCID-hiirissä, vastaavasti. Havaittiin, että molemmat CSC
+ ja CSC
– soluja voitaisiin aloittaa kasvainten muodostumista, kun istutetaan erikseen, vaikka tarkastusten kasvaimen muodostumisen CSC
– soluja oli merkittävästi pienempi kuin CSC:
+ solujen (taulukko S1). Kun CSC
+ ja CSC
– solut yhdessä siirrettyjen -ksenografteja koostuu sekä CSC
+ – johdettu (DsRed) ja CSC
– johdettu (EGFP) soluja, kuten on esitetty Kuviot 3A ja 3B. Tärkeää on, virtaussytometria analyysi osoitti, että suhteet CSC
+ – johdettu CSC
– johdettu (DsRed: EGFP) solujen ksenografteissa eivät merkittävästi poikkea suhteita CSC
+ CSC
– (DsRed: EGFP) solujen seoksia, jotka oli injektoitu (kuviot 3C ja 3D, taulukko 1). Toteutimme ksenotransplantaatio alas kolmanteen kulkua. Virtaussytometria analyysi osoitti, että suhteet CSC
+ – johdettu CSC
– johdettu (DsRed: EGFP) solujen ksenografteissa pohjimmiltaan muuttunut kesken eri kohdissa (taulukko 1). Nämä tiedot viittaavat siihen, että vaikka CSC
+ solut voivat olla tuumorigeenisemmiksi kun tutkittu erikseen, pre-eristetty CSC
– soluja voidaan ylläpitää yhteistyössä transplatation malli. Tutkimukset myös sitä, että kasvain muodostava kapasiteetti CSC
– soluja voitaisiin aliarvioida, jos ne tutkitaan erikseen vieraassa miljöössä.
(A ja B) DsRed-leimattu CSC
+ ja EGFP-leimattua CSC
– soluja, joka on peräisin samasta tuumorisolulinjat sekoitettiin niiden alkuperäisen suhteen ja co-istutetaan sublethally säteilytettyjä NOD-SCID-hiirissä. Valokuvat ovat fluoresoivia kuvia (A) ja hematoksyliinillä ja eosiinilla (B) serial osien ksenograftien peräisin KG-1, MCF-7, SHG44, Caco-2- ja A375. Asteikko bar = 100 pm. (C) virtausytometrisiä ääriviivapiirrokset osoittavat prosenttiosuuden DsRed ja EGFP solujen ksenografteissa. (D) histogrammit esittävät suhde CSC
+ CSC
– (DsRed: EGFP) solujen injektiota ja suhde CSC
+ – johdettu CSC
– johdettu (DsRed: EGFP ) solut ksenografteissa. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM 3 erilliselle kokeelle.
plastisuus CSC merkki perustuu hierarkia CSC merkki ilmentävien kasvainten
Yllättäen huomasimme, että huomattava määrä CSC
+ soluja läsnä CSC
– johdettu populaatiot sekä
in vitro
ja
in vivo
ja prosenttiosuus CSC
+ solujen CSC
+ – ja CSC
– johdettu populaatiot olivat vertailukelpoisia jälkeen viljeltiin (tai ksenotransplantaatio) usean kohtia (taulukko S2), mikä viittaa siihen, että CSC
– solujen CSC markkeri ilmentävät kasvaimet voivat aiheuttaa CSC
+ solujen . Sen varmistamiseksi, että CSC
+ solujen CSC
– johdettu väestöstä oli todellakin jälkeläisistä CSC
– soluja eikä seurausta solun kontaminaation aikana käyttöön solulaji [40], mittasimme (CSC merkki ilmentäviä kasvainsolulinjoja käyttämällä virtaussytometria) prosenttiosuus CSC merkki positiivisten solujen yhden CSC
+ – johdettu tai CSC
– johdettu alilinjat. Kuten kuviossa 4 ja kuviossa S2, sekä CSC
+ ja CSC
– solut kykenevät muodostamaan yhden solun johdettu alalinjoja ja synnyttää kaksi osajoukkoja. Aluksi prosenttiosuus CSC merkki positiivisten solujen yhden CSC
– johdettu alilinjat oli huomattavasti pienempi kuin yhden CSC
+ – johdettu alilinjat. Kuitenkin, pitkän ajanjakson kulttuurin (noin 20 kohtia, katso kokeelliset menetelmät lisätietoja), prosenttiosuus CSC markkeri positiivisten solujen kunkin alalinja oli tilastollisesti samanlainen kuin alkuperäisen kasvaimen solulinjojen. Lisäksi olemme havainneet, että klooni muodostavat tehokkuutta CSC
– soluja vaihteli 36,1% vuonna Caco-2-70,3% THP-1 (kuvio S3). Huomattavaa on, että prosenttiosuus kloonin muodostavat CSC
– soluja on huomattavasti korkeampi kuin saastumisen CSC
+ soluja (väärät negatiiviset solut, yleensä pienempi kuin 0,1%) CSC
– väestön lajiteltu FACS. Nämä tulokset osoittavat, että CSC
– solut voivat aiheuttaa CSC
+ solujen CSC merkki ilmentävät ihmisen kasvaimista.
(A-E) CSC
+ ja CSC
– soluja alkuperäisestä tuumorisolulinjat valittiin tuottamaan yksisoluiset peräisin alalinjoja (SCDSLs). Prosenttiosuus CSC markkeri positiivisten solujen alkuperäisestä kasvaimesta solulinjoja tai SCDSLs (passage 1 ja kanavan 20), KG-1 (A), MCF-7 (B), SHG44 (C), HT-29 (D), ja A375 (E) analysoitiin virtaussytometrialla. Rasiakuvaajien osoittavat prosenttiosuuden CSC merkki positiivisten solujen SCDSLs, jossa viikset edustavat minimi- ja maksimiarvot, Keski viivojen mediaani, ja laatikot edustavat 25. ja 75. prosenttipiste. Histogrammit osoittavat prosenttiosuuden CSC merkki positiivisten solujen alkuperäisessä kasvainsolulinjoissa ja SCDSLs. Tiedot SCDSLs edustavat keskiarvoa ± SEM 100 näytettä; Data alkuperäinen kasvainsolulinjojen edustavat keskiarvoa ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta; **
P
0,01 riippumattomien
t
-testissä.
kantaneet yksisoluiset peräisin alalinja rakentaminen alas kolmannen sukupolven (kuvio 5A ). Riippumatta sukupolvien tai alkuperä (CSC
+ – johdettu tai CSC
– johdettu), jokainen alilinja sisälsi huomattavan määrän CSC
+ solujen (kuviot 5B ja 5C, kuviot S4A ja S4b) , ja prosenttiosuus CSC merkki positiivisten solujen yhden CSC
+ – johdettu (tai CSC
– johdettu) alilinjat oli verrannollinen kaikissa sukupolvien (kuviot 5D ja 5E, kuviot S4C ja S4d). Erityisesti molemmat alaryhmiä voisi poikkeuksetta tuottaa CSC
+ ja CSC
– jälkeläisten kaikissa sukupolvien eikä alilinjat koostui yksinomaan CSC
+ tai CSC
– soluja. Lisäksi olemme tutkineet leviämisen ja kasvaimen kehittymisen CSC
+ (tai CSC
-) soluja eri sukupolvien (kuvio 6A). Kuten kuvioissa 6B, 6C ja kuvio S5, prosenttiosuus Ki-67-positiivisia soluja, prosenttiosuus anneksiini V
+ 7-AAD
– soluja, ja taajuus tuumorigeenisen soluista oli tilastollisesti samanlainen kaikissa sukupolvien vaikka alkuperästä. Nämä tulokset osoittavat, että CSC
– solut kykenevät tuottamaan CSC
+ solujen ja viittaavat siihen, että on olemassa huomattava plastisuus näistä yhteisistä CSC merkkiaineita näissä kasvaimissa.
(A) kaavio näyttää rakentaminen sarja- yksisoluiset peräisin alalinjoja (SCDSLs). CSC
+ ja CSC
– soluja alkuperäisestä tuumorisolulinjat valittiin tuottamaan SCDSLs ja mielivaltaisesti luokiteltu sukupolvi 1 SCDSLs (mukaan lukien G
1
+ ja G
1
-). CSC
+ ja CSC
– soluja G
1 SCDSLs valittiin tuottamaan G
2 SCDSLs (mukaan lukien G
1
+ G
2
+, G
1
-G
2
+, G
1
+ G
2
– ja G
1
-G
2
-). Me toistuva toimenpide, kunnes G
3 SCDSLs saatiin. (B-E) prosenttiosuus CSC markkeri positiivisten solujen SCDSLs KG-1, MCF-7, SHG44, Caco-2, ja A375 analysoitiin virtaussytometrialla, kun solu määrä oli noin 1 x 10
6. Rasiakuvaajien osoittavat prosenttiosuuden CSC merkki positiivisten solujen yhden CSC
+ – johdettu (B) ja CSC
– johdettu (C) alilinjat eri sukupolvien, jossa viikset edustavat minimi- ja maksimiarvot, Keski viivojen mediaani, ja laatikot edustavat 25. ja 75. prosenttipiste. Histogrammit osoittavat prosenttiosuuden CSC merkki positiivisten solujen yhden CSC
+ – johdettu (D) ja CSC
– johdettu (E) alilinjat eri sukupolvien. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM 100 näytettä, kukin yhdestä riippumaton sarja SCDSL rakentamiseen.
(A) kaavio näyttää solun luokittelu perustuu sukupolven ja CSC merkki ilme. Solut alkuperäisestä kasvaimesta solulinjat mielivaltaisesti luokiteltu sukupolvi 1 (G
1) solujen ja lajitellaan CSC merkki positiivinen (G
1
+) ja negatiivinen (G
1
– ) solut. G
1
+ ja G
1
– Sitten solut kasvatetaan (1 x 10
2 noin 1 x 10
8) tuottaa G
2 ( mukaan lukien G
1
+ G
2
+, G
1
+ G
2
-, G
1
-G
2
+ ja G
1
-G
2
-) soluja. Me toistuva toimenpide, kunnes G
3-solut hankittiin. (B ja C) CSC
+ ja CSC
– soluja eri sukupolvien käytettiin proliferatiivisia ja tuumorigeenisiä määrityksissä. Histogrammit osoittavat prosenttiosuuden Ki-67-positiivisia soluja, prosenttiosuus anneksiini V
+ 7-AAD
– soluja, ja taajuus tuumorigeenisen solujen CSC
+ soluja (B) ja CSC
– soluja (C) eri sukupolvien KG-1, MCF7, SHG44, Caco-2 ja A375. Taajuus kasvaimia aiheuttavasta solujen laskettiin ääriarvoina Laimennus Analyysiohjelmisto. Muut tiedot ilmaistaan keskiarvona ± SEM 3 erilliselle kokeelle.
Keskustelu
Kysymys joista kasvainsolujen edistävät kasvaimen etenemistä on perustavanlaatuinen vaikutuksia terapiassa. Perustuu pääasiassa havaintoihin, että vain kasvainsolut ilmentävät tiettyjä solunpintamarkkereiden voisi käynnistää kasvaimen kasvua, kun istutetaan immuunivajausta hiiriin, puolestapuhujia CSC malli ehdottaa, että kasvaimet hierarkkisesti järjestäytynyt ja siten kasvaimen hoito tulee suunnata poistamaan kasvaimia soluja (ts CSCS) [2], [41], [42]. Kuitenkin tässä osoitamme, että aiemmin määritelty CSC merkkiaineita (esim CD34
+ CD38
– for AML, APL, ja KML, CD44
+ CD24
– rintasyövän, CD133
+ for glioblastooma ja paksusuolen syöpä, CD271
+ melanooman) eivät välttämättä suodattaa tuumorigeenisiä soluja näissä kasvaimissa, koska molemmat CSC
+ ja CSC
– soluja voidaan aloittaa kasvaimen kasvua ja aiheuttaa sekä jälkeläisten ( eli CSC
+ ja CSC
– soluja). Tuloksemme herättää mielenkiintoisia kysymyksiä koskien plastisuus kasvaimen hierarkian.
CSC malli arvelee, että aloittaminen kasvaimen muodostumisen ohjaa CSCS kun taas ei-CSCS, jotka muodostavat suurimman osan solujen kasvain, ei ole tai rajoitettu kapasiteetti aloittamaan kasvaimen muodostumisen [1], [35], [36]. Toisaalta, CSCS raportoitiin olevan lepotilassa kuin ei-CSCS [41], [43]. Jos perustavanlaatuisia eroja proliferaatiopotentiaali olemassa välillä CSCS ja ei-CSCS, tällaiset erot olisi helppo havaita immunohistokemiallisella tai virtaussytometrianalyysin solujen lisääntymisen. Kuitenkin tässä osoitimme, että leviäminen ja apoptoosin oletetun CSCS (CSC
+ solut) ja ei-CSCS (CSC
– soluja) olivat huomattavan samanlaisia ensisijainen kasvaimia ja kasvaimen solulinjojen, mikä viittaa siihen, että lisääntymiskyvyn CSC
– soluja on ehkä aliarvioitu aikaisemmissa tutkimuksissa, joissa CSC
+ ja CSC
– soluja erikseen istutetaan eläimiä. Siksi olemme perustaneet solu jäljittämistä menetelmän tarkoituksena on simuloida
in situ
ympäristössä, jossa CSC
+ ja CSC
– soluja rinnakkain. Toisin kuin aiemmissa raporteissa, että CSC
– soluja ei ollut tai vajavaisen lisääntymistä ja siten ei aloittanut kasvaimen kasvua [35], [36], osoitimme, että CSC
– soluja näytteillä samanlainen leviämiseen tai kestävyyden CSC
+ soluihin, kun molemmat osajoukot olivat viljeltiin yh-
in vitro
tai co-istutetaan eläinten niiden alkuperäisen suhde. Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että sen lisäksi, että CSC
+ soluja, CSC
– soluja myös pystyvät lisääntymistä ja kasvaimen kehittymisen.
CSC mallin mukaan mainittu kasvain kuin solun hierarkia, jossa vain CSCS makaa kärkeen on kyky itseuudistumisen ja solujen tuottavan loput. Saatavilla oleva näyttö tukee CSC malli enimmäkseen peräisin kasvain muodostavista tutkimuksia. Kuten aiemmin mainittiin, kasvaimen muodostavien määritystä ei ehkä ole riittävä osoittamaan hierarkkisen organisaation, koska kasvaimen muodostavien kapasiteetti kasvainsolujen voi dramaattisesti vaikuttaa ulkoisen ja sisäisen tekijät [33], [34], erityisesti kun eri osajoukkoja kasvainsolut tutkitaan erikseen vieraassa miljöössä. Toisaalta, vaikka tutkimukset osoittivat, että CSC
– (CD133
-) solut glioblastooma [38] ja paksusuolen syöpä [39] voisi käynnistää kasvaimen kasvua, onko olemassa CSC merkki perustuu hierarkian nämä kasvaimia ei tutkittu laajasti. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet kohtalo solujen, jotka ovat peräisin oletetun CSCS (CSC
+ solut) ja ei-CSCS (CSC
– soluja) solun jäljitys olosuhteissa, joissa kaksi subsets rinnakkain. Löysimme molemmat CSC
+ ja CSC
– soluja voitiin havaita jälkeläisistä, jotka on CSC
+ (tai CSC
-) solut sekä
in vitro
ja
vuonna vivo
. Sarjasiirrostuksilla yksisoluiset peräisin alalinja rakenne soluja tuumorisolulinjoja, me osoitti lisäksi, että CSC
– sekä CSC
+ soluja CSC markkeri ilmentävien kasvainten voisi poikkeuksetta aiheuttaa sekä jälkeläiset, ja proliferatiivinen tai tuumorigeenistä kapasiteettia CSC
+ (tai CSC
-) soluja ylläpidettiin eri sukupolvien, riippumatta alkuperästä (CSC
+ – johdettu tai CSC
– johdettu). Nämä tiedot tarjoavat vahvoja todisteita siitä, että ei ole olemassa yhteistä CSC merkki perustuu hierarkia näissä kasvaimissa.
solunpintamarkkereiden on käytetty laajalti erottamaan CSCS ulkopuolisten CSCS ja suurin osa aiempien tutkimusten ehdotti, että CSCS rajoittuivat harvinainen populaatio kasvainsolujen [35], [36]. Kuitenkin meidän tiedot osoittavat, että ilmentyminen solun pinnalla on monimutkaisempi kuin aiemmin tunnistettu. Johdonmukaisia eräiden muiden raporttien [38], [39], osoitimme virtaussytometrisellä analyysin että prosenttiosuus CSC merkki positiivisten solujen vaihtelivat suuresti (vaihtelee 0,4% käytettäessä AML peräti 82,7% on paksusuolensyöpä) CSC merkki ilmentäviä kasvaimia ja että huomattava määrä primaarikasvainten tai tuumorisolulinjoissa ei ilmaista nämä CSC markkereita. Kautta kvantitatiivinen RT-PCR, me kertoo vielä, että solut (molemmat CSC
+ ja CSC
-) CSC merkki ilmentäviä kasvaimia, mutta ei soluja CSC markkeri kuin ilmentäviä kasvaimia ilmaisivat CSC merkki mRNA, mikä viittaa siihen, että CSC markkeri ilmentävät ja ei-ilmentävien kasvainten saattavat olla peräisin erilaisista syöpäsoluja. Erityisesti, toisin kuin sekä CSC malli ja klonaalisen kehittyminen malli, jossa fenotyyppinen heterogeenisyys johtuu epigeneettisiä ja geneettisiä muutoksia, vastaavasti, me osoitamme, että ilmaisu CSC merkkiaineiden solujen CSC markkeri ilmentävien kasvainsolulinjojen voi olla dynaamista. Tällainen ilmiö on todennut myös muulle kaikkien ihmisen primaareja kasvaimia [44] – [46] ja kasvainsolulinjoissa [45], [46]. Onko tällainen ilmiö on olemassa muilla primaarikasvainten optio lisätutkimuksia.
Tämä tiedot osoittavat, että sekä CSC
+ ja CSC
– soluja on kyky tumorigeneesin ja että ilmaus CSC markkereita on palautuva . Kuitenkin, emme sulje pois toiminnallista heterogeenisyys välillä subsets CSC
+ soluja oli korkeampi kasvainten muodostumiseen kuin CSC
– soluja, kun ne istutettiin erikseen hiiriin. Aiemmin CSC
+ solut raportoitu olevan suurempi immuunitoleranssiin (esim CD271
+ ihmisen melanoomasolujen [29]) ja korkeampi erityksen kasvutekijöiden (esim CD133
+ ihmisen glioblastoomasolut [47] ) kuin CSC
– soluja. Näin ollen suurempi tuumorigeenisyyteen CSC
+ solujen siirto ihmisiin voi johtua joko niiden parempaa sopeutumista ulkomaisen miljöön ja /tai niiden kyky erittää kasvutekijöitä, jotka ovat kriittisiä solujen eloonjäämistä ja proliferaatiota. Onko CSC
+ ja CSC
– soluja voidaan osoittaa ilmeistä eroja kasvaimen aloittamista etäpesäkkeitä, ja kestävyys kemoterapian tai sädehoidon ihmisen miljöö vielä tutkittava tarkemmin. Parempi ymmärrys taustalla olevien mekanismien toiminnalliset heterogeenisyys voisi tarjota tärkeitä vihjeitä kehittämistä ja arviointia uusia syöpähoitoihin.
Johtopäätökset
Tässä tutkimuksessa esitetään rajoittamisesta käyttämällä yhteisiä CSC markkereita tunnistaa solupopulaation (eli CSCS), jotka ovat
yksinomaan
, joka kykenee lisääntymään ja aloitetaan kasvaimen kasvua tuumorisolulinjoja tutkittiin. Tuloksemme ovat tukevat klonaalisen evoluutiomalli jossa suurin osa kasvainsoluista kykenevät lisääntymistä ja kasvaimen kehittymisen ja funktionaalinen heterogeenisyys kasvainsolujen johtuu satunnainen tai stokastisia vaikutteita (sisäinen tai ulkoisten). Tämä päätelmä perustuu havaintoihin, että samanaikaiset otaksuttu CSCS (CSC
+ solut) ja ei-CSCS (CSC
– soluja) näytteillä samanlainen kapasiteetin lisääntymistä ja kasvaimen kehittymisen ja että molemmat alaryhmiä voisi aiheuttaa CSC
+ ja CSC
– jälkeläisten. Tuloksemme viittaavat siihen rajoituksia käyttää näitä markkereita itsenäisesti erottamaan syövän kantasoluja ei-tuumorigeenisiä soluja johtuen fenotyyppisen plastisuus syöpäsoluja.
Materiaalit ja menetelmät
Ethics selvitys
<