Krooninen sairaus

tiivistelmä

Oksidatiivinen stressi-moduloidun signalointireittien ovat sekaantuneet syövän synnyn ja hoidon kesto. Linssin epiteelin kasvutekijän p75 (LEDGF /p75) on transkription koaktivaattori, joka edistää vastustuskykyä stressin aiheuttama solu- kuolema. Tämä proteiini on liitetty tulehdus- ja autoimmuunisairauksien olosuhteissa, HIV-AIDS ja syöpä. Vaikka LEDGF /p75 on nousemassa stressi selviytymisen onkoproteiinia on niukasti tietoa sen ilmentymistä ihmisen kasvaimissa. Tässä tutkimuksessa suoritettiin arvioimiseksi ilmaisunsa kattavan paneelissa ihmisen syövissä. Transkriptioekspressiokuvio tutkittiin Oncomine syövän geeni microarray tietokanta ja on TissueScan Cancer Survey Panel kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (Q-PCR) array. Proteiinin ilmentyminen arvioitiin immunohistokemiallisesti (IHC) syövän kudossiruina (TMA), joka sisältää 1735 kudoksia, jotka edustavat yhden tai jäljitellä porausnäytteistä 1220 yksittäistapauksia (985 kasvain ja 235 normaaleissa kudoksissa). Kaikkiaan 21 suuren syöpätyyppeihin analysoitiin. Analyysi LEDGF /p75 transkriptio ilmentymisen Oncomine aineistot esiin huomattavia säätelyä (kasvain vs. normaali) 15: ssä 17 kasvaintyypeille. TissueScan Cancer Q-PCR array paljasti selvästi kohonneet LEDGF /p75 transkriptio eturauhasessa, paksusuolen, kilpirauhasen, ja rintasyöpiä. IHC analyysi TMA paljasti merkittävän kohonneeseen LEDGF /p75-proteiinin eturauhasen, paksusuolen, kilpirauhasen, maksan ja kohdun kasvaimet, suhteessa vastaaviin normaaleissa kudoksissa. Kohonnut transkripti tai proteiinin ilmentymistä LEDGF /p75 oli nähtävissä useissa kasvaintyypeissä. Nämä tulokset edelleen vahvistaa LEDGF /p75 kuin syöpään liittyvien proteiinien, ja antaa perustelut meneillään olevia tutkimuksia, joiden tavoitteena on ymmärtämiseen kliinistä merkitystä sen ilmentymistä tietyissä ihmisen syövissä.

Citation: Basu A, Rojas H, Banerjee H, Cabrera IB, Perez KY, De León M, et al. (2012) Expression of Stressi Response onkoproteiinia LEDGF /p75 in Human Cancer: Tutkimus 21 kasvaintyypeille. PLoS ONE 7 (1): e30132. doi: 10,1371 /journal.pone.0030132

Toimittaja: John R. Battista, Louisiana State University ja A M College, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 09 joulukuu 2011; Julkaistu: 19 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Basu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Institutes of Health (NIH) National Center Minority terveys- ja terveys- erot [NIH-NCMHD 5P20MD001632 (MDL, CAC)]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

yhä enemmän todisteita tukee keskeinen hypoteesia, että laajennetun tilan solun oksidatiivisen stressin (Ascos) on merkittävä tekijä syövän synnyn [1], [2]. Mahdollinen laukaisee Ascos kuuluvat elintapoihin ja ympäristöön liittyvät tekijät, kuten ruokavalion, infektiot, tupakointi, alkoholin ja epäpuhtauksien [3]. Ascos aiheuttaa vahinkoa DNA: ta, proteiinia ja lipidejä, sekä aktivaation stressin transkriptiotekijöiden, mikä aktivointi stressiä, antioksidantti, tulehdusta, ja pro-selviytymisreittejä, jotka edistävät pahanlaatuisiksi, solusyklin sääntelyn, vastustuskyvyn solukuolemaa ja hoito, invaasio, angiogeneesi, ja etäpesäkkeiden [1], [2].

LEDGF /p75 on stressivaste proteiini, joka edistää solujen eloonjäämistä läsnäollessa ympäristön stressitekijöiden että aiheuttaa Ascos, kuten kemoterapia, säteily , lämpö, ​​ja seerumistarvaatio [4] – [7]. LEDGF /p75 tunnetaan myös transkription koaktivaattori p75 [8], PC4 ja SFRS1 vuorovaikutuksessa proteiinin (PSIP1) [9], ja tiheä hieno pilkullinen autoantigeeni 70 kD (DFS70) [10]. Se on liitetty tulehdukseen, autoimmuniteetin, HIV-1: n replikaation, ja syöpä [10] – [17]. Stressi selviytyminen ominaisuudet LEDGF /p75 näyttävät liittyvän sen kykyyn sitoa tiettyjä transkriptiotekijöitä ja helpottaa transaktivaatiota stressi, tulehduksellinen, antioksidantti, ja syöpään liittyvien geenien [18] – [23]. LEDGF /p75 (530 aminohappoa), ja sen vähemmän tunnettuihin vaihtoehtoisia silmukointivariantti, LEDGF /p52 (333 aminohappoa), on johdettu LEDGF /PSIP1 geenin [8], [9], [24]. LEDGF /p52 vastaa N-terminaalista aminohappoa 1-325 ja LEDGF /p75, ja se sisältää lisäksi intronin johdettu 8 aminohapon häntä [25]. Ryhmämme raportoitu aiemmin, että LEDGF /p75 ylössäädellään syöpäsoluissa verrattuna normaaleihin soluihin, ja että LEDGF /p52 ilmentyy suhteellisen alhaisena syöpäsoluissa, indusoi apoptoosin ektooppisesti ilmaistuna, ja antagonisoi pro-selviytymisen toimintojen LEDGF /p75 [7], [16], [25].

Useat riviä todisteet tukevat viime aikoina LEDGF /p75 kuin onkoproteiinia ihmisen syövässä. Esimerkiksi LEDGF /p75 on tavoite kromosomitranslokaation leukemioissa, jolloin LEDGF /NUP98 fuusioproteiineja tiiviimmän toimintaa [23], [26] – [29]. Sen mRNA ilmentyminen havaittiin voimistuvan sisään räjäytykset kemoterapiaa kestäviä akuutti myelogee- nisessä sairastavalla potilaalla, ja sen kohdunulkoinen yliekspressio suojattu leukemiasolujen huumeiden aiheuttamaa solukuolemaa [30]. LEDGF /p75 hihnoja Menin sekoitettu linjaa leukemia (MLL) transkriptiotekijä monimutkaista kromatiinin aktivoida leukemogenesis [23]. Ryhmämme raportoitu aiemmin, että LEDGF /p75 on autoantigeenistä eturauhassyövässä (PCA), koholla proteiinin ilmentyminen eturauhasessa tuumorikudoksissa [16]. Havaitsimme myös, että sen kohdunulkoinen yliekspressio edistää solujen eloonjäämistä vastaan ​​stressin aiheuttama kuolema HepG2 maksakasvain soluihin [7], ja heikennettyjä dosetakseli aiheuttama lysosomaalisen solukuoleman PCa soluissa [31]. Daugaard et ai. [17] raportoitu kohonnut LEDGF /p75 transkriptio ilmentymisen ihmisen rinta- ja virtsarakon syövät, ja että sen kohdunulkoinen yliekspressio rintasyövässä soluissa suojattu lääkkeen aiheuttama lysosomaalisen solukuoleman ja lisäsi Tuumorigeenisuustutkimuksissa syöpäsolujen hiiren malleissa. Viime aikoina kohonnut gonadotropiinien oli osoitettu lisäävän LEDGF /p75-riippuvaisen aktivaation VEGF-C ilmentymisen, lisäten imusuonten ja angiogeneesin munasarjojen kasvaimia [32].

Vaikka transkriptio ilmentymisen LEDGF /p75: n raportoitiin voimistuvan leukemia, rintasyöpä, ja virtsarakon syövät [17], [30], immunohistokemiallinen (IHC) ilmentymisen analyysi proteiinin ihmisen kasvainkudoksissa on suoritettu vain PCa [16]. Syntymässä rooli LEDGF /p75 rasittavana selviytymisen onkoproteiinia johti meidät tekemään kattavan analyysin sen mRNA ja proteiini ilmentymistä 21 suuren ihmisen kasvaintyypit käyttäen syöpää geeni microarray tietokantoihin, TissueScan Cancer Q-PCR array, ja IHC analyysi kudos mikrosirut (TMA). Tämä tutkimus antaa näyttöä, että LEDGF /p75 ilmentymistä selektiivi- sesti ihmisen syövissä.

Materiaalit ja menetelmät

Bioinformatics Analyysi Oncomine Cancer Gene Microarray Database

vertailua LEDGF mRNA ilmaisun välillä kasvain ja normaaleissa kudoksissa, valitsimme aineistoja päässä Oncomine tietokannasta (Compendia biotieteiden, Ann Arbor, MI, USA; www.oncomine.org). Nämä aineistot, jotka sisältävät geenin mikrosiruja syöpien ja vastaavien taudista vapaan normaali ja /tai viereisistä normaaleista kudoksista, edellyttäen kertamuutosta tiedot geenien ilmentyminen (kasvain vs normaali), jossa p-arvot lasketaan t-testejä. On syytä mainita, että aineistot tutkitaan eivät spesifisiä LEDGF /p75, mutta jos geenien ilmentyminen tietoja LEDGF /PSIP1-geeni, joka aiheuttaa sekä p75 ja p52 silmukointivariantit. Kaikkiaan 81 aineistoja tutkittiin LEDGF /PSIP1 transkriptio lauseke seuraavat syövät: virtsarakon (2 aineistot), rinta (9 aineistot), kohdunkaula (2 aineistot), paksusuolen ja peräsuolen (3 aineistot), ruokatorven (3 aineistot), munuainen (6 aineistot), pään ja kaulan (8 aineistot), maksaan (2 aineistot), keuhkojen (9 aineistot), lymfooma (3 aineistot), munasarjojen (6 aineistot), haima (6 aineistot), eturauhasen (13 aineistot), sylkirauhasten (1 aineisto), iho (5 aineistot), vatsa (2 aineistot) ja kohtu (1 aineisto). Ei microarray tietoja oli käytettävissä LEDGF /PSIP1 transkriptin ilmentymistä syöpää sappirakko, ohutsuoli, ja kilpirauhasen.

Human ”TissueScan Cancer Survey Panel” Q-PCR Array

Käytimme ihmisen ”TissueScan Cancer Survey Panel 96-I” Q-PCR array (CSRT-101, Origene Technologies Inc., Rockville, MD, USA) in-house analyysi LEDGF /p75 mRNA: n ekspression 96 kudoksissa kattaa 8 merkittävä ihmisen syövissä ( rinta-, paksusuoli-, munuais-, maksa-, keuhko-, munasarja-, eturauhas-, ja kilpirauhasen). Tämä joukko koostui ensimmäisen juosteen komplementaarinen DNA (cDNA) 9 yksittäistapauksia kunkin syöpätyypin ja 3 tapausta vastaavassa normaalissa viereisiin kudoksiin. Valmistajan rajallisesti potilaalle kliinis tiedot (ikä, sukupuoli, kasvaimen vaiheessa pTNM vaihe), ilman potilaan tunnistamista.

Q-PCR suoritettiin 96-kuoppaisen PCR array levyt (Origene) käyttäen MyiQ lämpösyklilaite (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) käyttäen alukkeita, jotka ovat spesifisiä LEDGF /p75 silmukointivariantti (eteenpäin 5′-TGCTTTTCCAGACATGGTTGT-3 ’ja reverse 5′-CCCACAAACAGTGAAAAGACAG-3′), ja iQ SYBR Green Supermix (Bio- Rad). Lyhyesti, 30 ui PCR-seosta, joka sisälsi 15 ui 2 x master mix, 13 ui kahteen kertaan tislattua vettä, ja 1 ui kutakin eteen- ja reverse-alukkeita (10 pmol /ul), lisättiin kuhunkin 96 kuoppaan ja PCR array levyt. PCR-monistus suoritettiin 95 ° C: ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C: ssa 1 minuutti. mRNA: n ekspressio normalisoitiin käyttäen ilmentymisen housekeeping-geenin ihmisen beeta-aktiini, jonka alukkeita (eteenpäin 5’-CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG-3 ’ja reverse 5′-AGGTCCAGACGCAGGAT GGCATG-3’) on järjestetty TissueScan Cancer Q-PCR array kit pitoisuus 10 pmol /ul. Datan analyysi, ΔΔCt menetelmää käytettiin. Kertamuutoksia laskettiin ero geenien ilmentymisen välillä kasvainten ja vastaavassa normaalissa viereisen valvontaa.

RNA-interferenssi-välitteisen knockdovvn LEDGF /p75

PC-3 syöpäsolujen hankittiin American Type Culture Collection ja viljeltiin toimittaja suositteli kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2 37 ° C: ssa. Ohimenevä knockdovvn LEDGF /p75 PC-3-soluja suoritettiin käyttäen Amaxa Nucleofection menetelmällä (Amaxa, Lonza), kuten aiemmin on kuvattu [21]. LEDGF /p75 siRNA (siLEDGF /p75) ja salattu siRNA duplex (siSD, negatiivinen kontrolli) syntetisoitiin Integrated DNA Technologies (IDT). SiLEDGF /p75-sekvenssin vastasi nukleotidejä 1340-1360 (5′-AGACAGCAUGAGGAAGCGAdTdT-3 ’) suhteen ensimmäisen nukleotidi aloituskodonista LEDGF /p75: n avoimen lukukehyksen [21]. Tämä sekvenssi vastaa aluetta, C-terminaalista LEDGF /p75 ole jaettu LEDGF /p52. Sekvenssin siSD oli 5’GCGCGCUUUGUAGGAUUCGdTdT-3 ’[21].

Vasta-aineet ja immunoblottaus

Seuraavia vasta-aineita käytettiin: hiiren monoklonaalisia anti-β-aktiini (Sigma-Aldrich), ja anti-LEDGF (1:1000, BD Biosciences); kanin polyklonaalisten vasta-aineiden anti-LEDGF /p75 (1:1000, Novus Biologicals); anti-LEDGF /p75 (1:1000, Bethyl); ja (HRP) -merkattua toissijainen IgG (Zymed). Käytimme myös LEDGF /p75-spesifisten kanin polyklonaalista vasta-ainetta, joka on kehitetty W.M. Keck autoimmuunisairaus Center of Scripps Research Institute (La Jolla, CA, USA). Tämä kani-vasta-aine, alun perin nimetty anti-DFS /LEDGFp75 # 5087-vasta-aine (jäljempänä Scripps-Ab5087), nostettiin vastaan ​​rekombinantti, katkaistun DFS70 proteiini tuotetaan osittainen cDNA-klooni, pDFS6.1, joka koodasi C-terminaalista alueella LEDGF /p75 [10]. Tunnistaa vasta-aine, joka on spesifinen ainoastaan ​​LEDGF /p75 silmukointivariantti selvitimme reaktiivisuus kaikkien edellä mainittujen kaupallisia ja ei-kaupallisia LEDGF vasta immunoblottauksella käyttämällä solulysaatteja PC-3-solujen kanssa siSD ja siLEDGF /p75.

Immunoblottaus suoritettiin olennaisesti kuten aikaisemmin on kuvattu [21]. Lyhyesti, kokonais-proteiineja PC3-solujen kanssa siSD ja siLEDGF /p75 erotettiin SDS-PAGE (NuPAGE 4-12%, Invitrogen), jota seurasi siirto polyvinyylifluoridista (PVDF), (Millipore). Membraanit blokattiin 5% kuivamaitoa liuosta TBS-T-puskuria (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,1% Tween 20) 1 h ja testattiin primaarisilla vasta-aineilla. Usean pesun jälkeen TBS-T, kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundäärisiä vasta-aineita 30 minuuttia ja sitten pestiin jälleen TBS-T: llä. Proteiini vyöhykkeet havaittiin tehostetulla kemiluminesenssin (Amersham).

immunohistokemiallinen analyysi Cancer kudossiruina

Ihmisen syöpä kudossiruina (TMA), kaupallisesti saatavissa National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA , USA), IMGENEX Corp. (San Diego, CA, USA) ja US Biomax Inc. (Rockville, MD, USA), käytettiin IHC-analyysi LEDGF /p75. Useita erilaisia ​​TMA käytettiin määrän lisäämiseksi kasvainkudoksen tyypit ja näytteen koko (taulukko 1). Lyhyesti, ostimme NDRI kattava yleiseurooppalainen syöpä TMA sisältävä kahtena ydintä 642 ainutlaatuinen tapauksissa (522 tuumorikudoksista 20 pääkasvaintyypit ja 120 taudista vapaan normaali ja /tai normaali vierekkäisen yksilöt) on 5 diasarja (TS-1, TS -2, TS-3, TS-4 ja TMA5). Jokainen yleiseurooppalaisen syövän TMA IMH-326, IMH-327 ja IMH-328 (IMGENEX Corp), sisälsi 59 yksilöitä eri kasvaintyypeille, kun taas TMA IMH-336, IMH-337 ja IMH-338 (IMGENEX Corp.) sisälsi vastaava 59 vastaaviin normaaleihin viereisten kudosten.

Käytimme myös TMA IMH-303 (IMGENEX Corp.), joka sisältää 40 PCa kudoksia ja 9 vastaaviin normaaleihin viereisten kudosten. Kahdeksan ylimääräistä TMA US Biomax käytettiin, joista jokainen sisältää useita kudosnäytteitä yhden kasvaimen tyyppi (rinta-, paksusuoli-, munuais-, keuhko-, maksa-, haima-, eturauhas-, kilpirauhasen) sekä vastaavat taudista vapaan normaalia valvontaa ja /tai viereisistä normaaleista kudoksiin. Näissä valmistajien TMA saatu niukasti perustiedot kliinis tiedot (ikä, sukupuoli, kasvaimen vaiheessa joissakin tapauksissa), joka vastaa kudoksen ytimet ilman potilaan tunnistamista. Tietoa ei ollut saatavilla potilaiden rodun tai etnisen alkuperän, neo-adjuvantti hoito, kirurginen tekniikka, vuosi leikkauksen, instituutiot keränneen kudokset, määrä laitoksia, seurata rutiineja, ja kudoksen käsittely tekniikoita. Rajallinen Potilaan seuranta liittyvät tiedot TMA esti Kaplan-Meier selviytymisen analyysin.

TMA värjättiin käyttäen Biogeeniset i6000 automaattisen stainer (Biogenex Corporation, Fremont, CA, USA) kuten aiemmin on kuvattu [16] , [33]. Lyhyesti, parafiiniin kudosleikkeiden että TMA dioja poistettiin parafiini ja objektilasit upotettiin Citra-Plus-antigeenin haku ratkaisu (Biogenex Corp.). Antigeeni haku suoritettiin mikroaaltouunissa diat 2 min 100%: n teholla ja sen jälkeen 10 minuutin ajan 20% teholla. Objektilasit jäähdytettiin sitten antigeenin haku liuosta 20 minuutin ajan. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus pysäytettiin käsittelemällä 3% vetyperoksidia 10% metanolia, ja Power Block © Universal esto-reagenssia (Biogenex Corp.) käytettiin estämään ei-spesifistä proteiinia sitova.

TMA laseja inkuboitiin yön yli jossa Scripps-Ab5087 anti-LEDGF /p75-vasta [16], jota seurasi 3 pesua PBS: llä. Dioja inkuboitiin sitten Multi-link © biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen (Biogenex Corp.) 20 minuutin ajan, jota seurasi inkubointi streptavidiini-kytketty peroksidaasiin superherkkien Label © (Biogenex Corp.) 20 minuutin ajan. Immunovärjäys havaittiin peroksidaasi aktivointi 3-amino-9-ethycarbazole (AEC) kromogeenina (biocare Medical, Concord, CA, USA). TMA vastavärjättiin kevyesti hematoksyliinillä (Sigma, St. Louis, MO, USA) ja peitettiin Per- mountilla (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). Negatiivisia kontrolli ensisijainen vasta-aine oli jätetty pois ja korvasi kanin esi-immuuni seerumi. Kudosleikkeet tutkittiin Olympus BX50 mikroskoopilla, ja kuvat hankittiin käyttämällä digitaalista Spot RT3 ™ kamera (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, USA). Immunovärjättiin TMA pisteytettiin sokkona for LEDGF /p75 immunoreaktiivisuus jonka hallituksen sertifioitu patologi. 4-tason pisteytystä (0 = negatiivinen, 1 = heikko, 2 = kohtalainen, 3 = voimakas) käytettiin arvioimaan värjäyksen intensiteettiä. Kudokset pistein 0-1 katsottiin olevan lievää värjäytymistä, kun taas kudoksissa pistein 2-3 katsottiin olevan korkean intensiteetin värjäystä. Kudosnäytteitä, jotka osoittivat huonolaatuisia jätettiin analyyseistä. Nämä tutkimukset suoritettiin hyväksyntää Institutional Review Board.

Tilastollinen analyysi

Opiskelijan t-testiä käytetään arvioimaan merkitystä muutoksen mRNA ilmaisun välillä kasvain ja normaali viereinen ohjaus näytteet TissueScan Cancer Q-PCR array. Tilastollinen analyysi IHC tietojen ja niiden suhdetta potilaiden hoitotuloksia tehtiin käyttäen SAS-ohjelmiston pakettia (versio 9.2; SAS Institute). Helpottamiseksi tilastollisen analyysin, kudosnäytteitä jaettiin kahteen ryhmään perustuen niiden tulokset. ”Low” värjäytyminen määritettiin yhdistettiin värjäytymisen intensiteetti tulokset 0 ja 1, kun taas ”high” värjäys oli yhdistetty tulokset 2 ja 3. Erot ekspressiotasot LEDGF /p75-proteiinin välillä kasvainten ja normaaleissa kudoksissa analysoitiin käyttämällä Fisherin testiä.

kontrolloimiseksi vääriä positiivisia, mikä voi syntyä usean hypoteesien testaukseen tutkimuksissa vääriä löytö määrä (FDR) säädetty p-arvot laskettiin myös. FDR on määrällisesti virheen käytetään yleisesti monivertailuja. Se ohjaa odotettu osuus virheellisesti hylätään nollahypoteesi. Toisin sanoen, FDR ohjaa osa positiivisen löydöistä, jotka ovat vääriä. Associations välillä ekspressiotasot LEDGF /p75 ja kliinis parametrit määritettiin käyttämällä Fisherin testiä (ikä ja sukupuoli) sekä Kendallin tau korrelaatio analyysi (kasvainten vaihe). Todennäköisyys arvot

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Toistettavuus rinnakkaisten ytimien arvioitiin Cochran-Mantel-Haenszelin testiä, joka testataan homogeenisuus rinnakkaisnäytteiden välinen.

Tulokset

LEDGF /p75 transkriptio ylössäädellään ihmisen eri syöpätyyppeihin

in silico analyysi LEDGF /PSIP1 mRNA: n ekspression syövän kudoksissa suoritettiin käyttäen syövän geeni mikrosirulla aineistoja päässä Oncomine tietokantaan, verrattuna terveisiin kudoksiin ja normaaleissa kudoksissa (joko taudista vapaan normaali ja /tai viereisistä normaaleista). Jotka esitetään taulukossa 2, havaitsimme tilastollisesti merkitsevä (

P

0,05) voimistumista LEDGF /PSIP1 transkriptio joissakin käytettävissä microarray aineistoja alkaen rinta-, kohdunkaula, paksusuoli, ruokatorven, munuaisten, pään ja kaulan, maksan, keuhkon, lymfooma, munasarja-, haima-, eturauhas-, sylkirauhasen, ihon ja vatsan. Taittohuulet nousu oli suurempi kuin 2 rinta-, kohdunkaula, pään ja kaulan, munuaiset, iho, ja vatsa (taulukko 2). Kasvu oli vaatimaton (välillä 1 ja 2) ja peräsuolen, ruokatorven, maksa-, keuhko-, munasarja-, haima-, eturauhas-, ja sylkirauhasen syövät. Ei muutoksia LEDGF /PSIP1 transkriptin ilmentyminen havaittiin rakon (5 aineistot) ja kohdun (1 aineisto) syöpiä. Mikään edellä mainituista 17 syöpätyyppeihin osoitti merkittäviä downregulation LEDGF /PSIP1 transkriptio missään aineisto. Ei aineistot olivat käytettävissä vertaamalla kasvaimen vs normaali ilmentyminen LEDGF /PSIP1 nauhoituksen sappirakko, ohutsuoli, ja kilpirauhassyövän.

ilmentyminen LEDGF /p75 transkriptio tutkittiin lisäksi kokeellisesti kahdeksassa kiinteä kasvain tyypit (rinta-, paksusuoli-, munuais-, maksa-, keuhko-, munasarja-, eturauhas- ja kilpirauhasen) käyttäen TissueScan Cancer Q-PCR array, joka sisälsi syövän kudosnäytteitä 12 luovuttajalle tapauksissa (n = 9 kunkin syövän tyypin, n = 3, joka vastaa normaaleissa kudoksissa). Spesifisiä alukkeita LEDGF /p75 käytettiin näissä kokeissa. Kuten on esitetty kuviossa 1, joka on tilastollisesti merkitsevä (

P

0,05) voimistumista LEDGF /p75-transkripti havaittiin eturauhasessa (2,38-kertainen,

P

= 0,002), kilpirauhasen (1,85-kertainen

P

= 0,031), rinta (2,26-kertainen,

P

= 0,037) ja paksusuolen (2,04-kertainen,

P

= 0,047) syöpiä. Vaikka taso LEDGF /p75 transkripti nostettiin ( 1,02-kertainen) muissa syöpätyypeissä (lukuun ottamatta maksasyövän) kansi muutokset eivät olleet tilastollisesti merkitseviä. Maksakasvaimet oli lievästi downregulation (-1,24 kertaisesti) LEDGF /p75 transkriptio ilme, mutta lasku oli tilastollisesti merkityksetön.

Tiedot analysoitiin käyttämällä ΔΔCt menetelmällä arvojen normalisoitu p-aktiini tasot. Y-akseli edustaa induktio kannen LEDGF /p75 mRNA-tasolla kahdeksassa syöpätyypeissä (n = 9) verrattuna matching normaaliin viereisiin kudoksiin (n = 3) jono. Virhejanat näyttää erilaisia ​​keskivirheen. *

P

0,05.

P

arvot määritettiin Studentin t-testiä.

valinta LEDGF /p75-spesifinen vasta-aine IHC

Jotta voitaisiin tunnistaa vasta-aine, joka on spesifinen for LEDGF /p75 ja joita voitaisiin käyttää IHC arvioida ilmentymisen tasoa tämän proteiinin syöpä TMA, arvioimme immunoblottauksella spesifisyyden olevia anti-LEDGF vasta-aineita. Kolme kaupallisesti saatavilla anti-LEDGF vasta-aineita (Bethyl, BD ja Novus) ja ei-kaupallinen vasta-aine (Scripps-Ab5087) vastaan ​​LEDGF testattiin immunoblottauksella PC-3-solujen kanssa ja ilman ohimeneviä knockdown proteiinin (kuva 2). PC-3-solut transfektoitiin siSD toimi kontrollina. Immunoblottaus analyysi osoitti, että kaikki 3 kaupalliset vasta-aineet LEDGF reagoivat sekä p75 ja p52 variantteja. Kuitenkin Scripps-Ab5087 vasta-aine havaitaan ainoastaan ​​LEDGF /p75, ja näin ollen on valittu IHC tutkimuksia.

Solut transfektoitiin siLEDGF /p75 aiheuttaa ohimenevää knockdovvn LEDGF /p75. PC-3-solut transfektoitu pieni häiritsevä salattu RNA duplex (siSD) toimi vastaava valvonta. Immunoblottaus analyysi testattiin spesifinen reaktiivisuus kaikkien vasta-aineiden LEDGF /PSIP1. Kaikki blot parit (siSD ja siLEDGF /p75) kullekin vasta-aineelle olivat peräisin samasta blot.

LEDGF /p75 proteiini on yli-ilmentynyt ihmisen eri Cancer tyypit

suoritetaan IHC analyysi LEDGF /p75-proteiinin ilmentymisen kasvainkudoksissa käyttäen laajan paneelin TMA sisälsivät yhteensä 2330 kudoksen ytimet, mukaan lukien 1754 kasvaimet kudoksen ytimet yli 35 erilaista ihmisen syövän ja vastaavat 576 ei-kasvain (normaali ja ei-syöpä tulehduksellinen ) kudoksen ytimet (taulukko 1). Olemme ulkopuolelle tilastollisen analyysin niitä kasvaintyypeissä, joka oli alle 5 kasvainkudoksen ydintä ja /tai ei ole ollut vastaavaa ei-kasvainkudoksia. Ei-kasvain tulehduksellinen kudos ytimet poistettiin myös, koska kaikki kasvaintyypeissä oli vastaava tulehduskudoksissa. Jotkut kudoksen sydämiä ei voitu sijoitettiin heikon kudoksen laatua. Lopulta, 21 kasvaintyypin mukana meidän tilastollinen analyysi (taulukko 3). Nämä oli yhteensä 1735 kudosten edustavat yhden tai jäljitellä porausnäytteistä 1220 luovuttajalle tapauksissa, joissa 985 kasvain tapauksia ja 235 ei-kasvain tapauksissa.

tulokset IHC analyysin yhdistettyjen pistemäärät LEDGF /p75-proteiinin ilmentymistä (eli korkea = tulokset 2-3 vs low = tulokset 0-1) kasvainkudoksissa verrattuna normaaleihin kudoksiin on esitetty taulukossa 3. oli merkittävä yliekspressio LEDGF /p75-proteiinin eturauhasen, paksusuolen, kilpirauhasen, maksan ja kohdun kasvaimet (

P

0,05) (taulukko 3 ja kuva 3). Kohonneet ekspressiotasot rinta- kasvaimissa oli lähellä tilastollista merkittävyyttä (

P

= 0.087). Kun korjattu esiintymistä vääriä positiivisia, ainoastaan ​​eturauhasen, kilpirauhasen, ja maksa kasvaimia havaittu olevan merkittävää yli-ilmentymisen LEDGF /p75-proteiinin (FDR säätää

P

0,05).

kudossiruina värjättiin vasta-vastaan ​​LEDGF /p75, ja yksittäiset ytimet sokeasti pisteytetty seuraavalla asteikolla: 0 = ei värjäystä, 1 = heikko värjäystä, 2 = kohtalainen värjäytyminen, 3 = voimakas värjäytyminen. Sijoitettiin kudokset yhdistettiin kahteen ryhmään: matala värjäytymistä (pisteet 0 ja 1, tummat pylväät) ja korkea värjäys (pisteet 2 ja 3, valokeilat). Prosenttiosuus yksilöitä kahdessa värjäys luokat piirrettiin tuumorikudoksia verrattuna normaaliin (mukaan lukien taudista vapaan normaali ja normaali viereisten) kudoksiin. *

P

0,05; **

P

0,01.

P

arvot määritettiin Fisherin testiä.

prosenttiosuus kasvaimen kudoksista korkealla (pisteet 2-3) LEDGF /p75-proteiinin ilmentyminen oli 70,5% vuonna kilpirauhasen, 68% maksan, 38,3% eturauhasen, 30,2% kohdun, ja 25% paksusuolen syövistä, verrattuna 12,5%, 31,3%, 0%, 0%, ja 6,3%, vastaavasti, niiden vastaavat normaaleissa kudoksissa (taulukko 3) . Oli neljä syöpätyyppejä (rinta, kohdunkaula, munasarja, ja sylkirauhasen), jossa taajuus kasvainten näytetään korkean LEDGF /p75-proteiinin ilmentyminen oli noin 20% tai suurempi, ja vastaavat normaalit kudokset osoittivat vähän tai ei lainkaan proteiinin ekspression. Kun kuitenkin verrattiin erot LEDGF /p75 ilmaus (korkea vs. matala ilmaus) välillä kasvain ja normaaleissa kudoksissa,

P

arvot eivät pääse merkitystä. Mielenkiintoista, kun vertasimme eroja kasvaimen ja normaaleissa kudoksissa suhteen LEDGF /p75 ilmaus (pisteet 1-3) vs. ei lauseke (pisteet 0),

P

arvot rinta- ja kohdunkaulan syövät saavutti merkitystä (

P

0,05; tuloksia ei ole esitetty). Vertailu rinnakkaisten ytimien ei osoittanut mitään merkittävää eroa (

P

= 0,6226) välillä toistojen, mikä viittaa siihen, korkea toistettavuus välillä jäljitellä ydintä.

Kuvio 4A esittää edustavan kasvainkudoksen ydintä immunovärjättiin Scripps-Ab5087 anti-LEDGF /p75-vasta-ainetta. Edustaja IHC kuvat vastaavat eturauhas-, paksusuoli-, ja kilpirauhasen kasvainkudoksen ydintä alhainen (tulokset 0-1) ja korkea intensiteetti (pisteet 2-3) värjäystä. Kuten edellä mainittiin, nämä kolme kasvaintyypeissä näkyy merkittävää voimistumista sekä transkriptin (TissueScan Cancer Q-PCR array) ja proteiini (IHC). Kuviossa 4B esitetään edustavat IHC kuvat taudista vapaan normaalissa eturauhasessa ja paksusuolen kudokset (ei-syöpä luovuttajien), sekä eturauhasen ja paksusuolen kasvain yksilöitä heidän Hyväksytty viereisten kudosten. Kilpirauhasen syöpä TMA ei ole sovitettu viereisten kudosten tiettyjä kilpirauhasen kasvaimia. Havaitsimme, että ”normaali” kudosten vieressä eturauhasen ja paksusuolen kasvain kudosten oli kohtalainen LEDGF /p75 värjäystä, verrattuna suhteellisen matalan intensiteetin värjäys taudista vapaan normaaleja kudoksia. Toinen mielenkiintoinen havainto oli, että LEDGFp75 immunovärjäyksellä jaettiin sekä tumassa ja sytoplasmassa useimmissa kasvain tutkituissa kudoksissa.

. Edustavat kuvat immunohistokemiallisella värjäyksellä (lievää tulokset 0-1, korkea intensiteetti, tulokset 2-3) varten LEDGF /p75 eturauhasen, paksusuolen ja kilpirauhasen kasvaimet (Mittakaava-40 m; suurennos = 200 x). B. Edustavia kuvia LEDGF /p75 immuunivärjäystä kuin sairauden normaalissa eturauhasessa ja paksusuolen kudoksiin, ja kasvaimen kudokset ja niiden yhteensovitettujen viereisten kudosten (Mittakaava-40 m; suurennos = 400 x). TMA värjättiin käyttäen LEDGF /p75 kanin spesifisten vasta-aine Scripps-Ab5087, kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät. Identtiset kameran asetuksia käytettiin hankinta ja käsittely kuvien tiettyyn kudokseen tyyppi.

Käytettävissä kliinis ominaisuudet potilailla, joiden kasvain tyypit näyttämällä merkittävä LEDGF /p75 yli-ilmentymisen on yhteenveto taulukossa 4. numero kudosnäytteitä varten paksusuolen ja eturauhasen syöpiä eroaa sarjojen keskustella iän ja sukupuolen takia puuttuvien tietojen kaupallisesti saatavilla TMA. Tiedot ikä puuttui 4 ydintä eturauhasen syöpä TMA kun tietoja sukupuoleen puuttui 2 hylsyjen paksusuolensyöpä TMA. Korrelaatio nämä ominaisuudet ja LEDGF /p75-proteiinin ilmentymisen paljasti, että yli-ilmentyminen tämän proteiinin maksassa ja kilpirauhasessa kasvainten merkitsevästi todennäköisempi nuorilla (

P

0,05) (taulukko 4). Mediaani iät potilaiden edustettuina TMA oli 62 vuotta paksusuolen syövän, 53 vuotias maksasyövän, 66 vuotta eturauhassyövän, 48 vuotta kilpirauhassyöpä ja 70 vuotta kohtusyöpä. Mikään viidestä kasvaintyypeissä näytteillä merkittävä korrelaatio lisääntynyt LEDGF /p75 ilmaus, sukupuoleen tai lisääntynyt TNM kasvain vaiheessa. Rajoitetun Potilaan seuranta liittyvät tiedot TMA esti pitämästä korreloivat LEDGF /p75-ilmentymisen elossaololuku tuloksia.

cross-platform analyysi LEDGF /p75 ilmentymistä erilaisissa ihmisen kasvain tyypit on yhteenveto Taulukko 5. transkriptio ja proteiini ilmaisuja kunkin kasvaintyyppi verrataan poikki eri alustoilla käyttää: in silico, Q-PCR ja IHC.

keskustelu

Tämä tutkimus tehtiin osana jatkuvaa pyrkimyksiä ymmärtää biologista ja kliinistä merkitystä LEDGF /p75 ilmentymistä ihmisen syövässä. Tuloksemme osoitti merkittävää voimistumista molempien LEDGF /p75 transkriptio ja proteiini eturauhasen, paksusuolen ja kilpirauhasen kasvaimet, päätellä analyysi transkriptin ilmentymistä Oncomine syövän geeni microarray tietokanta (jos tietoja saatavilla) ja TissueScan Cancer Q-PCR array, ja analyysi proteiinin ilmentymisen IHC in TMA. Havaittu säätelyä LEDGF /p75 eturauhastuumoreissa on yhdenmukainen aiempien raporttien mukaan proteiini on tavoite autovasta-aineiden joillakin potilailla PCA määrä lisääntyy molemmissa PCa solulinjoissa ja kudoksissa, ja edistää chemoresistance PCA solulinjoissa kun ektooppisesti yliekspressoitu [16], [31].

Huomattava säätelyä LEDGF /PSIP1 transkriptio on havaittu myös joitakin Oncomine aineistoja varten rinta-, kohdunkaula, ruokatorvi, munuaisten, pään ja kaulan, maksa, keuhkot, lymfooma, munasarja-, haima-, sylkirauhasen, ihon ja vatsan. Kuitenkin vain 4 ulos 8 kasvaintyypeille (eturauhas-, paksusuoli-, rinta- ja kilpirauhasen) osoittivat merkittävää ylössäätely LEDGF /p75 transkriptio että TissueScan Cancer Q-PCR array. Vaikka muissa elimissä (munuainen, keuhko, ja munasarjojen) näytteille 1,02 kertainen LEDGF /p75 transkriptio korkeus tässä array, säätely ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Nämä erot Oncomine tietokanta ja TissueScan Cancer Q-PCR array voisi johtua pienen otoskoon jälkimmäisessä, menetelmiin /alusta muunnelmia, analyysi LEDGF /PSIP1 vs LEDGF /p75 ja käyttö liity kasvaimen aineistoja. [17].