Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolut (CSCS) on osoitettu välittävän tuumorigeenisyyteen, kemoterapia-vastus, radio-vastus ja etäpesäkkeitä, jotka viittaavat siihen, ne pitää terapeuttisia kohteita. Koska niiden eriytetty tytärsolut eivät enää ole tuumorigeenisiä, indusoimaan erilaistumista CSCS voi olla yksi strategioita, joita voidaan hävittää CSCS. Tässä osoitamme, että ATOH1 voi indusoida erilaistumista mahasyövän kantasolujen (GCSCs). Reaaliaikainen PCR: llä ja western blot-analyysi osoitti, että ATOH1 indusoitiin erilaistumisen aikana GCSCs. Lisäksi lentivirus aiheuttama yliekspressio ATOH1 in GCSCs ja mahasyövän solulinjoissa merkittävästi indusoi erilaistumista, vähentää proliferaatiota ja pallo muodostumisen, ja alennetaan

in vivo

kasvainten muodostumista subkutaaninen injektio ja maksan etäpesäkkeiden ksenograftimalleissa. Nämä tulokset viittaavat siihen ATOH1 harkita kehittämiseen eriyttäminen terapian mahasyövän.

Citation: Han ME, Baek SJ, Kim SY, Kang CD, Oh SO (2015) ATOH1 voi säädellä tuumorigeenisyyteen mahasyövän solut indusoimalla erilaistumista Cancer Stem Cells. PLoS ONE 10 (5): e0126085. doi: 10,1371 /journal.pone.0126085

Academic Editor: Gianpaolo Papaccio, Napolin toinen yliopisto, ITALIA

vastaanotettu: 03 syyskuu 2014; Hyväksytty: 30 maaliskuu 2015; Julkaistu: 7. 2015

Copyright: © 2015 Han et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi paitsi RNA sekvenointitulosten joka talletettiin yleisölle arkistoon (GEO-hakunumero: GSE46597).

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Bio ja Medical Technology Development Program (2012M3A9C6050213) ja Basic Science Research Foundation (2012R1A1A3010521) National Research Foundation (NRF) rahoittama Korean hallitus (MEST) ja apurahan National R Menetelmät

Mahasyöpää kantasolujen viljelmiä

Mahasyöpää kudokset haettiin saatuaan kirjallinen lupa potilailta, jotka tehtiin kirurginen resektio at Pusan ​​National University Hospital (PNUH) ja Pusan ​​National University Yangsan Hospital (PNUYH ). Tutkimuksen protokolla hyväksyi Pusan ​​National University Hospital-Institutional Review Board (PNUH-IRB) ja Pusan ​​National University Yangsan Hospital-Institutional Review Board (PNUYH-IRB). Mahasyöpä kantasolut viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [6], ja indusoitiin erilaistumaan lisäämällä 5% FCS media sijaan kasvutekijöitä.

Culture mahalaukun syövän solulinjojen

mahasyövän solut (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638, NCI-N87) viljeltiin RPMI1640 täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 100

ug

/ml penisilliini /streptomysiinillä, 37 ° C: ssa 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa. Nämä solulinjat saatiin Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea).

Culture of 293FT solulinjan

293FT-solut ylläpidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 0,1 mM MEM ei-välttämättömiä aminohappoja (NEAA), 1 mM MEM-natriumpyruvaattia (molemmat Sigmalta, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 6 mM L-glutamiinia (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), ja 1% Pen-Strep: ssa 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa.

RNA sekvensoinnilla ja tietojen analysointi

Kirjasto valmistettiin käyttämällä IlluminaTruSeq RNA Sample Prep Kit ja sekvensoitiin käyttämällä Illumina Genome Analyzer IIx (San Diego, CA, USA) tuottamaan 76 emäsparin pariksi lopussa lukee. Sequenced lukee oli tasattu ihmisen viite genomin 19 käyttäen Tophat 2 [PubMed id 19289445]. mRNA-ekspressio mitattiin RPKM (Lukee Per kiloemästä miljoonasosaa kartoitettu lukee) alkaen yksilöllisesti kartoitetaan lukee käyttäen hg19 RefSeq malli ja HTSeq paketti (https://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/). Bed tiedostot tuotettiin käyttämällä Tophat 2. Kaikki RNA sekvenointitulosten talletettiin yleisölle arkistoon (GEO-hakunumero: GSE46597).

Reaaliaikainen PCR

RNA: n ja reaaliaikaisen PCR tehtiin käyttäen Power SYBR Green PCR Master Mix, ja ABI Prism 7500-sekvenssin ilmaisinta (molemmat Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), kuten aiemmin on kuvattu [28]. Alukesekvenssit käyttää (eteenpäin ja taaksepäin, tässä järjestyksessä) olivat seuraavat: Differentiation markkerit; CA1, 5′- TCA GAG CAG CTG GCA CAA TTC CG -3 ’ja 5′- CCT TCA GAG GTT GGG TTG GGC G -3′; SSTR2, 5’- CCA GGA ACC CCA AAC GTC CG -3 ’ja 5′- CAG TGT GAC ATC TTT GCT TTT CCG C -3′; CHga, 5’- GCA AAC CGC AGA CCA GAG GAC C -3 ’ja 5′- TGT CTC AGC CCC GCC GTA GT -3′; PGC2, 5’- TGG CCT ACC CTG CTC TGT CCG -3 ’ja 5′- ACT CCA GGA CCA GGT TGC TGA GG -3′; MUC5AC, 5’- TCA CAC GGT CCT GCC CAC AGA G -3 ’ja 5’ACC CCT GCA TCT CAG AGC CCC -3′; ATP4B, 5’- GAA AGC CCA GCC CCA CTA CAG C -3 ’ja 5′- TGC TCC GCC ATG ACC TTG CAC -3′; Stemness markkerit; CD44, 5’- GCC TGG GGA CTC TGC CTC GT -3 ’ja 5′- AGC CTT GCA GAG GTC AGC GG -3′; LGR5, 5’- GAG CTG CCT TCC AAC CTC AG -3 ’ja 5′- CCC GCA AGA CGT AAC TCC TC -3′; BMI1, 5’- TGG TTG CCC ATT GAC AGC GG -3 ’ja 5′- AAA AAT CCC GGA AAG AGC AGC CG -3’; ja c-Myc, 5’ACA CCC GAG CAA GGA CGC GA -3 ’ja 5′- CGC GGG AGG CTG CTG GTT TTC -3′; ATOH1, 5’- CCC CTT CCA GCA AAC AGG TG -3 ’ja 5′- ACG GGA TAA CAT TGC GCA GC -3′; GAPDH 5’- GAG TCC ACT GGC GTC TTC AC -3 ’ja 5′- ATG ACG AAC ATG GGG GCA TC -3’. GAPDH käytettiin standardoida cDNA tulotasoilla.

Western blot-analyysi

Western blot -analyysi suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [24], käyttäen seuraavia vasta-aineita: ATOH1 (LSBio, Seattle, WA, USA ); CD44, LGR5, ATP4B, CA1, PGC, MUC5AC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA); c-Myc, kaspaasi-3 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA); lohkaista kaspaasi-3, kaspaasi-9, halkaistut kaspaasi-9 (Cell Signaling Technology, MA, USA); p21, β-aktiini-vasta-aine (Abcam, Cambridge, MA, USA) ja HRP-konjugoidulla sekundäärisellä vasta-aineella (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA).

Lentivirusvektorikonstruktit rakentaa ja tuottaa aktiivisen viruksen

Jos haluat luoda ilme klooni, sekvenssi varmistettiin virus ORF Clones (ATOH1, IOH34744, Life Technologies, Grand Island, NY) Gateway merkintä vektorit siirrettiin pLenti7.3-DEST vektorin (pLenti7.3/V5-DEST Gateway Vector Kit, Life technologies, Grand Island, NY, USA) käyttämällä LR rekombinaatiolla reaktion (LR-klonaasia II entsyymin yhdistelmä, Life technologies, Grand Island, NY, USA). Muuntamista varten, One Shot Stbl3 Kompetentteja E. coli (Life Technologies) käytettiin. Sen jälkeen, kun transfektoitu samanaikaisesti ilmaisun kloonin ja ViraPower Packaging Mix (Life Technologies) läpi 293FT Cell Line (Life Technologies), jolloin saatiin lentivirus, lentivirus- supernatantit kerättiin. Nämä lentiviruksen varastot käytettiin transdusoimaan GCSCs ja mahalaukun syövän solulinjat.

Virus keräämistä ja lisääminen suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Life Technologies). Ohjaus virus tuotettiin samanaikaisesti ilman sisällyttämistä ATOH1.

rakentaminen RASSF4-reportteri solulinjojen ja lusiferaasianalyysissä

Gluc-ON promoottori Reporter kloonit, pEZX-PG02 (HPRM11834-PG02 , GeneCopoeia, Rockville, MD, USA) oli käytetty RASSF4-lusiferaasireportteri solulinjoja (NCI-N87 ja SNU216 solut) ja puromysiinin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) käytettiin valinnassa. Lentivirus käytettiin edellä kuvattua aiheuttaa ATOH1. Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin käyttäen erittää-Pair Gaussia Luciferase Assay Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD, USA) valmistajan ohjeiden 72 h transduktion jälkeen.

Vieraslajisiirteen määrityksessä

Solut laimennettiin sopiva Pistosannoksen (1×10

6 solua), sekoitetaan BD matrigeelin (BD Biosciences, CA, USA) 1: 1-suhteessa, ja injektoidaan subkutaanisesti selkäpuolelle kunkin kylki on sekamuotoinen immuunipuutos (SCID) hiiriä (n = 5 /ryhmä). Minimoimaan kokeellinen vaihtelevuuden takia yksilöllisiä eroja saajahiiret, solupopulaatiolähteitä oli verrattava injisoitiin vastakkaisilla kyljissä saman eläimiä. Kasvaimet kerättiin sen jälkeen, kun 4 viikkoa ja tuumorit punnittiin. Maksan etäpesäkkeiden malli, SCID-hiiret nukutetaan intraperitoneaalisella injektiolla ketamiinia /ksylatsiinia yhdistelmä. Sitten hiiret viilletty noin 10 mm vasemmalla subcostal, perna vahvistettiin alla vatsakalvon, vatsakalvon avattiin noin 8mm ja perna oli altistunut yli vatsakalvon. Solut (5×10

4 solua /100

ui

) on hitaasti injektoitiin pernan hiirten kautta 27-gaugen neula (n = 5 /ryhmä), ja sitten perna palautettiin vatsaontelon , vatsakalvon ja haava ommeltiin. 4 viikkoa istuttamisen jälkeen soluja, hiiret tapettiin [37]. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals antamien National Institute of Health. Pusan ​​National University toimielinten Animal Care ja Käytä komitea (PNU-IACUC) hyväksyi kaikki koetoimenpiteet eläimiin liittyviin.

Soluproliferaatiomääritys

Viisi päivää transduktion lentivirus 10

pl

esisekoitettu vesiliukoista tetratsoliumsuolaa-1 (WST-1, Roche, Indianapolis, IN, USA) lisättiin kuoppiin. Nämä solut inkuboitiin sitten kahden tunnin ajan, ja solujen elinkykyisyys määritettiin mittaamalla absorbanssi 450 nm: ssä käyttäen ELISA-lukijaa (TECAN, Mannedorf, Sveitsi).

Sphere muodostumista määrityksessä

Spheres oli hajotetaan yksittäisiä soluja ja maljattiin 96-kuoppalevyille 0,2 ml: n tilavuudella median. Kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisella levyllä sisälsi vähemmän kuin 10 solua. Soluja viljeltiin sitten ja seurattiin 5-7 päivää. Spheres suurempia kuin 25 pm laskettiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia ja tehokkuutta pallo muodostumista verrattiin.

Tietojen analysointi

paramerinen Mann-Whitneyn U-testiä tai Studentin t-testiä (parittomia vertailut) käytettiin määrittämään merkitykset välisten erojen keskiarvoista kaksi ryhmää, ja yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA), jota seurasi Tukey monivertai- käytettiin määrittämään merkitykset välisten erojen keskiarvoista kolme tai useampia ryhmiä . * Osoittaa P-arvo 0,05, jota pidettiin merkitystä kriteeri. Aineisto analysoitiin SPSS-ohjelmiston, versio 12,0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Tulokset esitetään keskiarvoina ± SDS.

Tulokset

induktio ATOH1 erilaistumisen aikana GCSCs

erilaistuminen GCSCs seerumin on aiemmin osoitettu, [6]. Tunnistaa liittyvät tekijät erilaistumiseen, vertasimme mRNA: n ilmentymisen profiilit kantasolujen ja solujen eriytetty solussa valtioissa RNA sekvensoinnilla. Monet tuumorisuppressorigeeneille indusoitiin erilaistumisen aikana (tuloksia ei ole esitetty). Mielenkiintoista on, ATOH1, transkriptiotekijä kriittinen erilaistumista suolen epiteelisolujen, indusoitui myös. Vahvistamaan tämän induktion ATOH1 erilaistumisen aikana, tutkimme muutokset ilmentymistason ATOH1 reaaliaikaisella PCR: llä ja western blot -analyysillä. Huomasimme, kuten GCSCs lähestyi päätelaite erilaistumisen vaiheissa, ilmentymisen ATOH1 kasvoi (kuvio 1).

erilaistuminen GCSCs indusoitiin lisäämällä FBS: ää. mRNA: n ilmentymisen tasot määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä (A). Tulokset on esitetty keskiarvoina ± SDS kolmen riippumattoman kokeen. Proteiinin ekspressiotasot määritettiin Western blot -analyysillä (B).

yli-ilmentäminen ATOH1 indusoi erilaistumista GCSCs

määrittämiseksi roolit ATOH1 aikana GCSC erilaistumisen, me yli-ilmentynyt sitä GCSCs käyttäen lentiviruksen. Voit tarkistaa erilaistuminen tilojen, tutkimme ekspressiotasoja eri merkkiaineita erilaistumista tai stemness. Huomattavaa on, että yli-ilmentyminen ATOH1 on GCSCs lisääntynyt ekspressiotaso eri erilaistumisen markkereita, mutta laski ekspressiotasot eri stemness markkereita (kuvio 2).

Erilaisia ​​merkkiaineita erilaistumiseen (A) tai stemness (B) oli tutkitaan sen jälkeen yli-ilmentävät ATOH1 in GCSCs reaaliaikaisella PCR (A, B) ja western blot-analyysi (C). Tulokset on esitetty keskiarvoina ± SDS kolmen riippumattoman kokeen. *

P

0.01.

Seuraavaksi, tutkimme ATOH1 voisi säädellä lisääntymistä tai pallo muodostumista. Mielenkiintoista on, että yli-ilmentyminen ATOH1 vähensi proliferaatiot eri mahasyövän solulinjojen ja pallo muodostumista GCSCs (kuvio 3).

Mittakaava = 100

um

. Tulokset on esitetty keskiarvoina ± SDS kolmen itsenäisen kokeen *

P

0.01.

ATOH1 yliekspressio alennetaan

in vivo

kasvainten muodostumiseen

Voit selvittää ATOH1 voi säädellä

in vivo

kasvainten muodostumiseen mahalaukun syövän solujen, käytimme maksan etäpesäke mallin tuottama ruiskuttamalla mahasyövän solujen pernan (solut sittemmin siirtyneet maksa). Huomattavaa on, että yli-ilmentyminen ATOH1 vähensi merkittävästi kasvainten muodostumista maksassa GCSCs ja NCI-N87 mahasyövän-soluissa (kuvio 4). Lisäksi silloin, kun teimme ihonalainen ksenografteja, havaittiin samanlaiset tulokset (kuvio 4).

4 viikon jälkeen, kasvainmassat saatiin ja niiden painot mitataan (C).

ATOH1 lisääntynyt RASSF4 promoottorin aktiivisuutta

vahvista onko eriyttäminen GCSCs by ATOH1 välittyy sen transkriptioaktiviteettia selvitimme promoottorin aktiivisuuden ATOH1 kohdegeenin (RASSF4) käyttäen Lusiferaasimäärityksiä [29]. Jälkeen RASSF4 promoottorin, joka oli yhdessä lucifease geenin, stabiilisti tuotu mahasyövän solulinjoissa (NCI-N87 ja SNU216 solut), tutkimme vaikutuksia ATOH1 aktiivisuudesta lusiferaasin. Transduktion ATOH1 lisäsi merkittävästi lusiferaasiaktiivisuus RASSF4 promoottorin. (Kuva 5).

RASSF4 promoottori yhdistettynä lusiferaasin geeni tuotiin NCI-N87 ja SNU216 soluja. Transduktion ATOH1 lisäsi merkittävästi lusiferaasiaktiivisuus. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta *

P

0.01.

osallistuminen apoptoosin ja solukierron reittejä vaikutuksia ATOH1

Aiemmat raportit ovat kertoneet apoptoosia ja solukierron reittejä osallistuvat vaikutuksia ATOH1 kasvaimiin verkkokalvolla [30] ja paksusuolen [25]. Joten, me tutki liittyvä proteiinit osallistuvat myös vaikutuksia ATOH1 jakautumiseen (kuvio 3A) ja pallo muodostumiseen (kuvio 3B) esillä olevassa tutkimuksessa. Muutos lisääntymistä ja alalla muodostuminen voi johtua hitaampi solusykliä, lisääntynyt apoptoottisen korko, tai molemmat.

Löysimme transduktion ATOH1 lisääntynyt taso pilkkoa-kaspaasi-3 ja-kaspaasi-9 in GCSCs ja mahasyövän solulinjoissa (kuvio 6), mikä viittaa siihen, että luontainen apoptoosireittiä voi olla mukana. Lisäksi olemme myös löytäneet säätely ylöspäin p21 upon ATOH1 yliekspressio (Kuva 6).

Yhteensä ja pilkotun muotoja kaspaasi 3 ja 9 tutkittiin kaksi päivää sen jälkeen, kun transduktion ATOH1 NCI-N87-solut, SNU216 solut ja GCSCs. Lohkaisu kaspaasi 3 ja 9, ylössäätöä p21 havaittiin ATOH1-yli-ilmennetään soluissa.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa, osoitamme, että ATOH1, joka on HLH transkriptiotekijä , voi aiheuttaa erilaistumista GCSCs, ja tämä johtaa menetykseen kasvainten muodostumiseen. ATOH1 yli-ilmentyminen on aikaisemmin osoitettu indusoivan erilaistumista suoliston kantasolujen erittävien solujen [24], ja ATOH1-nolla -hiirissä, erittävien solujen ei muodostunut suolistossa [26]. Tämä vaikutus ATOH1 erilaistumiseen on havaittu myös peräsuolen syövän soluja, joissa se toimi tuumorisuppressorina. Lisäksi noin 70% paksusuolen ja peräsuolen syöpiä, sen ilme on raportoitu pienentyä geneettiset ja epigeneettiset mekanismit [25,31]. Kolorektaalisyövässä solut, ATOH1 yliekspressio vähensi lisääntymistä ja kasvua pehmeässä agarissa ja ksenografteissa [31], ja poistaminen ATOH1 tehostetun tuumorigeenisyyden hiirissä [25]. Nämä tulokset yhdessä viittaavat siihen, että ATOH1 voidaan käyttää eriyttäminen hoito gastrointestinaalisten syöpien.

Toisin sen vaikutusta erilaistumiseen, ATOH1 voi myös edistää leviämisen progenitorisolujen ja kasvainten muodostumiselle. Aikana pikkuaivojen kehittäminen hiirillä, ATOH1 havaittiin aloittaa erilaistumisprosessia pikkuaivojen rakeen neuroniesiasteiden varhaisessa vaiheessa (P0). Kuitenkin myöhemmin (P5), se edisti leviämisen esiasteiden [32,33,34]. ATOH1 poisto P0, esti voimakkaasti erilaistuminen, mutta sen poistaminen myöhemmässä vaiheessa seurauksena irtautuminen solukierron ja erilaistuminen [35]. Nämä erilaiset roolit ATOH1 eri vaiheissa voidaan selittää eri targetomes [35]. ATOH1 edistänyt medulloblastoma muodostumista yhdessä Shh hedgehog signalointireitille [36,37]. Lisäksi sen ilmentyminen havaittiin olevan merkittävästi koholla mucinous adenokarsinooma, sinettisormus syöpä, ja suoliston neuroendokriininen kasvaimia [38]. Siksi pystyä hyödyntämään ATOH1 erilaistumisen hoito, sen suora tavoitteet, jotka indusoivat erilaistumista on tunnistettava.

Vaikka ilmaisulliset statukset ATOH1 on raportoitu normaalin mahan limakalvoa ja mahasyövän, sen roolit ovat huonosti tunnettu. ATOH1 ilmentyy normaaleissa ihmisen mahalaukun epiteelisolujen alhainen [39,40], mutta sen ilmentymistä ei havaittu normaalissa mahalaukun epiteelisolujen hiiren mahan [26]. Lisäksi hiiren ja ihmisen metaplastiset mahalaukun limakalvon osoitti ATOH1 ilmentymistä [41], mutta sen ilmentymistä ei havaittu mahasyövän solulinjoissa, mukaan lukien MKN74, MKN45, KATOIII, ja HSC58 [40]. Joissakin mahasyöpäpotilaista, se on yli-ilmentynyt [39]. Sen patofysiologisia roolit eivät ole koskaan tutkittu mahasyövän. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että induktio ATOH1 ilmentymistä voidaan vähentää proliferaatiota, invaasio ja kasvainten muodostumiseen mahalaukun syövän soluja. Olemme myös löytäneet mahdollista osallistumista p21 ja apoptoosireittiä ATOH1 vaikutuksista.

havainnot viittaavat siihen mahdollisuuteen, että ATOH1 geeni tulisi pitää mahdollisina hoidon kohteena mahasyövän. Pienet molekyylit, jotka indusoivat sen ilmentymistä tai geeniterapian avulla viruksen tai kantasoluja voidaan kehittää. Erityisesti, ATOH1 havaittiin indusoivan erilaistumista mahalaukun syövän kantasoluja, ja siten, hoito kohdistaminen ATOH1 voisi poistaa syövän kantasoluja.