Krooninen sairaus

tiivistelmä

Expression matriksimetalloproteinaasi 9 (MMP-9) on koholla erilaisia ​​tulehdus- ja onkologian merkinnät, mukaan lukien haavainen koliitti ja peräsuolen syövän. MMP-9 on alavirtavaikuttajainhibiittorit ja ylävirran välittäjänä reittejä mukana kasvun ja tulehdusta, ja on pitkään pidetty lupaavana terapeuttisena kohteena. Kuitenkin aikaisemmat yritykset kohdistaa metalloproteinaasien (MMP: t), kuten MMP-9, ovat hyödyntäneet laajakirjoinen tai puoliksi selektiivisiä. Vaikka jotkut näistä lääkkeistä osoittivat merkkejä tehoa potilailla, kaikki MMP kohdistetut estäjien on haitannut annosta rajoittava toksisuus tai riittävää kliinistä hyötyä, mikä johtuu todennäköisesti niiden spesifisyyden puutteen. Tässä osoitamme, että selektiivinen inhibitio MMP9 ei aiheuttanut liikuntaelinten oireyhtymä (ominaisuus myrkyllisyys pan-MMP-inhibiittorit) rottamallissa, mutta vähentää sairauden vakavuutta on dekstraaninatriumsulfaatti aiheuttaman hiirimallissa haavainen paksusuolitulehdus. Olemme myös havainneet, että MMP-9 esto väheni kasvaimen kasvua ja metastaasit esiintyvyys kirurgisessa potilaalle tehdä ksenograftimallia peräsuolen syöpä, ja että estäminen joko kasvain- tai peruskudoksettoman johdettuja MMP-9 riitti vähentämään ensisijaisen kasvaimen kasvua. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että selektiivinen MMP-9 inhibitio on lupaava terapeuttinen strategia tulehdus- ja onkologian kohdalla, joissa MMP-9 on ylössäädelty ja liittyy patologian, kuten haavainen paksusuolen tulehdus ja paksusuolen ja peräsuolen syövän. Lisäksi me raportoimme kehittää voimakas ja erittäin selektiivinen allosteeristen MMP-9 estäjä, humanisoitu monoklonaalinen vasta-aine GS-5745, jota voidaan käyttää arvioimaan terapeuttisten mahdollisuuksien MMP-9 inhibition potilailla.

Citation: Marshall DC , Lyman SK, McCauley S, Kovalenko M, Spangler R, Liu C, et ai. (2015) Selective allosteerinen esto MMP-9 on tehokas nonkliinisissä Colitis ulcerosa ja peräsuolen syövän. PLoS ONE 10 (5): e0127063. doi: 10,1371 /journal.pone.0127063

Academic Editor: Fabio Cominelli, CWRU /UH Digestive Health Institute, Yhdysvallat |

vastaanotettu: Joulukuu 23, 2014; Hyväksytty: 11 huhtikuu 2015; Julkaistu: May 11, 2015

Copyright: © 2015 Marshall et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Kaikki kirjailijat ja tunnustettu henkilöt ovat nykyisiä tai entisiä työntekijöitä Gilead Sciences. Gilead Sciences rahoitetaan kaikki tutkimukseen tässä tutkimuksessa ja oli ainoastaan ​​mukana tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista, ja valmistelu käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut: Kaikki kirjoittajat ovat nykyisiä tai entisiä työntekijöitä Gilead Sciences. Tämä Tutkimuksen rahoittivat Gilead Sciences. Gilead Sciences omistaa patentin ”Vasta-aineita matriisimetalloproteinaasi 9” (US8501916 B2) ja patenttihakemuksen ”Vasta-aineita matriisimetalloproteinaasi 9” (US20130281676 A1), ja arvioi parhaillaan humanisoitu monoklonaalinen vasta-aine GS-5745 vaiheen 1 kliinisissä kokeissa (ClinicalTrials gov tunnisteet NCT01831427, NCT02077465, ja NCT01803282). Mikään näistä kilpailevien etujen vaikuttavat tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa koskevat tietojen jakamista ja siihen liittyvää aineistoa toimitettu käsikirjoitus.

Johdanto

Matrix (MMP) -välitteisen proteolyysiä näyttelee avainasemassa modulaatio solun homeostaasin: MMP voi aloittaa, täydentää tai downregulate signa- mukana kasvua ja tulehdusta aktivoimalla sytokiinien ja vapauttavaa eristetyn kasvutekijöitä, ja muokata kudosrakenne hajottamalla rakenneosat soluväliaineen (ECM) [1 -6]. Niistä 23 MMP perheenjäseniä, MMP-9 (tunnetaan myös gelatinaasi B) esittää erityisen lupaavaa terapeuttisena kohteena ottaen huomioon todistusaineisto osoittavat sen osallistumisesta patologisia prosesseja, jotka edistävät krooninen tulehdus, kasvaimen kehittymisen, ja etäpesäkkeiden [5-7].

säädeltyyn MMP-9 ilmaisun ja aktiivisuus liittyy useita tulehdussairauksiin kuten haavainen paksusuolen tulehdus (UC) [1, 7-12]. UC on relapsoiva /remittoivan autoimmuunisairaus paksusuolen tulehdus [13-16], joka sisältää induktio MMP-9-proteiinin tasot ja proteolyyttisen aktiivisuuden alueilla aktiivinen taudin [10, 11, 17]. MMP-9 toimintaa UC on osallinen sekä sukupolvi ja jatkumisen tulehdustilan valtion se indusoi proinflammatoristen sytokiinien, kuten TNF-α ja IL1 α [18-20] ja se voi auttaa ylläpitämään pro-tulehduksellisten prosessien vapauttamalla TNF -α ja TGF-β, jonka tehostava IL-8, ja aktivoimalla IL1-β [4, 21-26]. MMP-9 voi myös edistää tulehduksellinen miljöö kautta proteolyysin tyvikalvon (BM) aineosat kollageeni IV ja laminiini [7]. Hävittäminen epiteelin BM, määrittävä piirre UC [13, 14, 16, 18], voi aiheuttaa epiteelisolujen apoptoosin [27], joka osaltaan menetys eheyden paksusuolen limakalvon Epiteeliesteen, entisestään pahentaa tulehdusta. Samoin häiriöitä endoteelin BM voi helpottaa lymfosyyttien ja neutrofiilien transmigraatio paikalle tulehdus [28-30].

Krooninen UC andMMP9 ilmentymisen UC ovat riskitekijöitä kehittämiseen kolorektaalisyöpää (CRC) [15 , 31-33], ja vaikka tarkkaa polku kroonisen tulehduksen ja dysplasiaa että kasvainta ei ole selvää, osallistumista MMP-9 prosesseissa, jotka mahdollistavat perustaminen ja leviämistä sekä näiden sairauksien [1, 6, 7, 34, 35] ehdottaa, että se voi olla tärkeä rooli etenemistä UC syöpään. MMP-9 ilmentyminen on koholla ja korreloi huonon ennusteen monenlaisia ​​kasvaimia, mukaan lukien CRC [5, 6, 35-47], ja se toistaa useita rooleja prosessissa kasvaimen: MMP-9 on tuotettu kasvainsolujen sekä strooman tulehdussolujen kuten kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) ja neutrofiilien, ja on keskeinen välittäjäaine kasvaimeen strooman ylikuulumisen, joka johtaa vastavuoroinen aktivointi pro-onkogeenisen signalointi näissä kahdessa osastoissa [48-52]. MMP-9 edistää etäpesäkkeiden helpottamalla kasvainsolun muuttoliikettä ja invaasiota kautta lohkaisu BM ja muut ECM osia [53], ja se on myös liitetty ensisijainen kasvaimen kasvua nojalla asemansa niin alavirran kohde [54-63] ja ylävirran säädin keskeisten onkogeenisten signalointireittien. Jälkimmäisessä kapasiteettia, MMP-9 saattaa mahdollistaa pro-onkogeenisen signaloinnin kautta sen kyky vapauttaa kasvutekijöitä, kuten EGF, FGF-2, ja VEGF: n [64-67], ja moduloimaan integriini ja reseptorityrosiinikinaasin funktio [54, 68, 69 ]. Viime kädessä nämä eri näkökohdat MMP-9 käytännöllisillä konsertti vaikuttaa signalointi säätelyhäiriötä ja matriisi proteolyysin, jotka edistävät kasvua ja leviämistä kasvaimia [53, 64, 70-73].

merkitystä MMP-9 vuonna patologia tiettyjen tulehdus- ja onkologian merkintöjen on osoitettu, joista käy ilmi, että

MMP-9 – /-

hiirten vähentynyt sairauden vaikeusasteen kokeellisissa malleissa paksusuolentulehduksen ja nivelreuma, ja näytetään myös vähensi kasvaimen kasvua ja /tai vähentää etäpesäkkeiden useat syöpä mallit [1, 66, 74-81]. Vaikka nämä ja muut julkaistut havainnot viittaavat siihen, että MMP-9 on vakuuttava terapeuttinen kohde, aikaisemmat yritykset kohdistaa MMP (myös MMP-9) käytetään yleiseurooppalaisen erityisiä tai puoliksi selektiivisiä, ja epäonnistuivat johtuen annosta rajoittavia sivuvaikutuksia, kuten tuki- ja liikuntaelinten oireyhtymän (MSS ) ja /tai yleensä puuttuu kliinistä hyötyä [1, 17, 39, 82-84]. Jälkeenpäin puute terapeuttinen näillä laajakirjoisempia MMP-inhibiittorit on ymmärrettävää, koska roolit että MMP: t voivat olla kriittisessä homeostatic prosesseissa [22, 85].

Täällä raportoimme kehittämistä erittäin selektiivinen ja voimakas allosteerinen vasta-estäjä MMP-9: osoitamme, että esto MMP-9 on tehokas hiirimalleissa UC ja peräsuolen syövän, ja että tämä hoito ei aiheuta MSS rottamallissa. Ehdotamme, että selektiivinen esto MMP-9-välitteisen patologisten signalointi ja matriisi proteolyysi on uusi terapeuttinen mahdollisuus tulehdustiloja kuten UC, ja syöpien, kuten CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Kudokset

Pakastemarjat (FF) ja formaliini kiinnitetyille ja parafiiniin upotetut (FFPE) ihmisen kudosta saatiin Cureline, Inc. (Burlingame, CA), Asterand (Detroit, MI), tai Folio Biosciences (Powell, OH) .

Rekombinantti MMP-9-proteiinien ja immunisointi

Ihmisen MMP-9-proteiinia tuotettiin kloonaamalla täyspitkä cDNA osaksi pSecTag2hygro (B) vektori (Life Technologies, Carlsbad, CA) ja ohimenevästi transfektoimalla se HEK293 -solut (ATCC, Manassas, VA). Esikäsitelty väliaine puhdistettiin Ni-Sepharose Fast Flow 16/20 XK-pylvääseen (GE Life Sciences, Pittsburgh, PA). Tämä proteiini ja Ribi adjuvanttia käytettiin immunisointiin BALB /c-hiiriä (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) kautta jalka pad. Hiiret, joiden seerumin vasta-ainetiittereitä vastaan ​​MMP-9 käytettiin tekemään hybridooma kirjastojen kautta fuusio B-solujen eristetty imusolmukkeista. Nämä kirjastot subkloonattiin yhden solun lajittelu tuottaa klonaalisia populaatioita, josta anti-ihmisen MMP-9-vasta AB0041 tunnistettiin. Rokotukset, hybridooma kirjaston luomisen, ja vasta-kloonaus tehtiin vasta-aineen Solutions (Sunnyvale, CA). Anti-hiiri MMP-9 monoklonaalinen vasta-aine AB0046 oli niinikään tuotettu poikkeuksin että MMP-9 hiirten (Jackson Laboratories) käytettiin ja että hiiren MMP-9 proteiinia koostuu pro ja katalyyttidomeeneissa vain (aa 1-445) käytettiin immunisointiin. Spesifisyyden analyysi, täyspitkä MMP proteiinit hankittiin R 10 mM natriumfosfaatti, 140 mM natriumkloridi). Vasta-aineen puhtaus arvioitiin ratkaista pienenee ja ei-vähentää näytteiden SDS-PAGE 4-12% Bis-Tris geeleillä ja värjäys Simple Blue Safe tahra (Invitrogen). Puhdistetut vasta-aineet osoitettiin sisältävän alle 5% aggregaatteja SEC-HPLC: llä käyttäen TSKgel G3000SWxl pylväs Tosoh (King of Prussia, PA). LAL testaus (Endosafe, Charles River Laboratories, Charleston, SC) käytettiin vahvistamaan vasta-ainevalmisteet, sisälsi vähemmän kuin 5 EU /mg endotoksiinia.

MMP-9 suoraan sitova entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA) B

Suora sitova antigeeni-alas ELISA-määritykset puhdistetulla yhdistelmä-MMP-9-proteiinien kehitettiin mittaamaan näennäinen sitoutumisaffiniteetin AB0046, AB0041, ja GS-5745. Kaikki pesut PBS + 0,05% Tween-20 (PBST). Täyspitkä MMP-9-proteiinien päällystettiin Maxisorp-levyt (NUNC, Rochester, NY), minkä jälkeen salvattiin PBS: llä + 5% (w /v) naudan seerumialbumiinia (BSA; EMD Millipore). Sitten levyt pestiin ja sarjalaimennoksia anti-MMP-9-vasta-aineita PBS: ssä lisättiin. Pesun jälkeen levyjä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Thermo Scientific, Fair Lawn, NJ) laimennettiin 1: 10000 PBS: ssä + 0,5% (w /v) BSA: ta sen jälkeen pestiin ja kehitettiin käyttäen 3,3 ’, 5,5’- tetrametyylibentsidiiniä (TMB; Sigma, St. Louis, MO) 1 minuutin ajan. Reaktio sammutettiin lisäämällä 1 M suolahappoa. Kvantifiointi suoritettiin SpectraMax M5 levylukijaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) absorption tilassa aallonpituudella 450 nm. Näennäinen Dissosiaatiovakioiden (K

D (ELISA)) määritettiin käyttäen Softmax Pro -ohjelmaa (Molecular Devices) piirtämällä absorbanssiarvot vs. vasta-aineen pitoisuus ja sovittamalla tiedot 4 parametrin logistista yhtälöä, jossa ”C ”parametri yhtälö määritellään näennäisen K

D.

epitooppikartoitus AB0041 ja AB0046

Kaikki mutantti MMP-9 konstruktioita käytetään epitooppikartoituksessa kertyi mutaatio hiiren ja ihmisen MMP-9 ekspressiovektoreita käyttämällä QuikChange II kohdennettu mutageneesi Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Yksittäiset kloonit varmistettiin DNA-sekvenssianalyysillä, ja mutantti-MMP-9-proteiineja tuotettiin tilapäisellä transfektiolla HEK293-soluissa. Väliaine kerättiin sen jälkeen, kun 24-48 tuntia ja päällysteenä His-Select Hi-Capacity Ni2

+ päällystetyn levyn (Sigma), yön yli 4 ° C: ssa. Seuraavana päivänä levyt pestiin PBST: llä ja blokattiin 5% BSA: ta PBS: ssä yhden tai kahden tunnin ajan ympäristön lämpötilassa, minkä jälkeen inkuboitiin joko 10 nM tai 1 nM vasta-ainetta laimennettuna PBST: hen. Levyt pestiin ja niitä inkuboitiin vuohen anti-hiiri IgG- HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA,) laimennettuna 1: 10000 0,5% BSA: ta PBS: ssä. Levyt pestiin, kehitettiin ja lue kuten edellä on kuvattu.

MMP-9 -aktiivisuusmäärityksiä

MMP-9-aktiivisuus arvioitiin käyttäen pysäytettiin fluorogeenisia substraatteja; pilkkominen tuottaa fluoresenssin, joka on verrannollinen entsyymin aktiivisuus [86]. Ihmisen ja hiiren määritykset käytetään QXL 520-γ-Abu-P-Cha-Abu-Smc-HA-Dab (5-FAM) -AL-NH2, jossa Smc = S-metyyli- L-kysteiini, Abu = 2-aminovoihappo ja Cha = β-sykloheksyylialaniini (AnaSpec Inc., Fremont, CA), ja rotan määritystä käytetään Mca-PLGL-Dpa AR-NH2; (R 4 parametrin käyrän sovitus käytettiin määrittämään IC

50.

TNF-α-fuusioproteiinin katkaisun määritys

rekombinantti ihmisen pro-TNF-α-fuusioproteiinin katkaisun määritys (R paljon mitään. 5237K) juomavedessä opintovapaalla päivinä 0 5. DSS ratkaisu oli korvattiin juuri valmistettu liuos päivänä 3. Yksi ryhmä hiiriä (n = 5) eivät saaneet DSS ja toimi ei taudin kontrolliryhmään. Tutkimuspäivänä 6, 14 eläintä ryhmää kohti annettiin intraperitoneaalisesti joko PBST ajoneuvon, isotyypin kontrollivasta-aine (30 mg /kg), AB0046 (30 mg /kg), tai etanersepti (10 mg /kg, Clayworth Healthcare, Castro Valley, CA) . Ajoneuvojen ja vasta annosteltiin päivinä 6, 9, ja 12, ja etanerseptin annosteltiin päivinä 6, 8, 10, ja 12. Kaikki eläimet punnittiin ja arvioitiin silmämääräisesti esiintyminen ripuli ja verinen uloste päivittäin. On tutkimuksen päättymisen (päivä 14), kaikki eläimet tehtiin video tähystys alemman paksusuolen pienellä eläin endoskoopin (Karl Storz Endoskope, Saksa). Eläimet nukutettiin isofluraanilla ja paksusuolentulehdus pisteytettiin visuaalisesti seuraavan asteikon [89]: 0 (normaali), 1 (verisuonten menetyksen), 2 (verisuonten menetyksen ja todisteita haurauden), 3 (haurauden ja eroosiot ), ja 4 (vakava haavauma). Kukin hiiri annettiin yksittäinen pisteet (kutsutaan tähystys pisteet), joka vastasi parhaiten vakavia vahinkoja havaitaan koko pituudelta paksusuolen. Tällä tutkimuksen päättymisen, eläimet lopetettiin altistuminen C0

2. Arvioidaan koliitti vakavuus histologisesti, board-sertifioitu eläinlääkärin GI patologi, sokaisi suhteen opintoryhmiin arvioituna H 25%: sta), 2 (26-50% vaikuttaa), 3 (51-75% vaikuttaa), ja 4 ( 76% vaikuttaa). Nämä tulokset laskettiin keskiarvo saamiseksi yhden keskimääräinen pistemäärä hiirtä kohti per parametri. Tämä tutkimus ja siihen liittyvä histopatologista analyysiä (mukaan lukien valinta edustavat kuvat) suoritti Biomodels, LLC.

HCT116 kirurginen potilaalle tehdä ksenograftimallia

Kaikki kolme HCT116 prekliinisissä tutkimuksissa tehtiin AntiCancer Inc. (San Diego, CA). Nainen NCR nu /nu-hiiriä saatiin Charles River (Wilmington, MA) ja kasvatettiin AntiCancer Inc. tuottaa tutkia eläimiä. Koe-eläimet olivat ylläpitämä on HEPA-suodatettu ympäristössä, jossa on 14 tunnin valo /10 tunnin pimeä jakso kokeilua varten. Häkit, ruoka ja vuodevaatteet autoklavoitiin; LabDiet hiiri Chow saatiin PMI Nutrition International Inc. (Brentwood, MO) ja annettiin ad libitum, kuten juomavettä. Hiiret satunnaistettiin painon mukaan 4 ryhmään (yksi kontrolliryhmä, 3 koeryhmään) 15 eläintä. Preimplantaatioal- kasvain varastot ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinja HCT116 ilmentävät GFP (Anti-Cancer Inc.) valmistettiin ihonalaisesti ruiskuttamalla HCT116-GFP solut pitoisuudella 5 x 10

6 solua /100 ul kylkeen nude hiirillä. Laajennuksen jälkeen, kasvainten kudokset kerättiin hiiriltä ja leikataan fragmentteja noin 1 mm

3. Kaksi tällaista kasvain fragmentit sitten kirurgisesti ortotooppisesti istutettu (SOI) vieressä paksusuolen jokaisen tutkimuksen eläimen, alle ketamiinia /asepromatsiini /Xylazine anestesia.

Kun istutetaan kirurgisesti kasvaimet saavuttivat keskimääräinen tilavuus on noin 70-100 mm

3, hiiret jaettiin hoitoryhmiin. Käsittely aloitettiin 16 päivää kasvaimen istutuksen jälkeen for Study 1 ja tutkimus 3, ja 17 päivän kuluttua implantaatiosta for Study 2. Kaikki hiiret käsiteltiin AB0041 /AB0046 cocktail sai kyllästysannoksena AB0046 50 mg /kg ensimmäisenä päivänä hoitoon. AB0041 ja AB0046 oli tämän jälkeen annosteltiin vatsaonteloon injektiona kahdesti viikossa 15 mg /kg, joko yksinään tai yhdessä (yhdistelmässä ryhmää, kukin vasta-aine oli läsnä 15 mg /kg). Verrokkihiiret vehikkeliä (PBS, 0,01% Tween-20). Primaarikasvaimen koot ja ruumiinpaino mitattiin (kaliiperimittauksin tai sähköisessä mittakaavassa, vastaavasti) kahdesti viikossa Tutkimus 2 ja tutkimus 3, ja kerran viikossa Study 1. Taka-pohjainen kokoarvioita saatiin mittaamalla kohtisuorassa pienempi mitta ( W) ja merkittävä ulottuvuus (L) tunnusteltava kasvain. Arvioitu kasvaimen tilavuus (mm

3) laskettiin kaavalla (W

2 x L) /2.

Hiiret lopetettiin 20 päivän kuluttua hoidon aloittamisesta (Tutkimus 3) 18 päivän kuluttua hoidon aloittamista (tutkimus 2), tai 28 päivän kuluttua hoidon aloittamisesta (tutkimus 1). Laukaisee eutanasiaa olivat: kasvaimen 2000 mm

3, 20% laihtuminen, havaittiin häiriöitä elintärkeä fysiologisen toiminnon, tai haavaumia tai kuolio, kasvaimen. Ensisijainen paksusuolen kasvain ja kaikki elimet metastasiaa kerättiin tutkimuksen lopussa, ja primaarikasvaimen punnittiin jälkeen leikkaaminen. Kasvaimet jakaa kahtia ja yksi puolikas kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin ratkaisu histologiaa varten. Toinen puoli, ja kaikki GFP-positiivisia etäpesäkkeitä muista elimistä laitettiin kudoksen kasetit ja olivat snap-jäädytettiin nestetypessä. FluorVivo kuvantamisjärjestelmä (INDEC Biosystems, Santa Clara, CA) käytettiin koko kehon kuvantamisen. Ruumiinavauksessa avoin kuvantaminen suoritettiin rintaontelon ja vatsan alueella tarkastusta metastaasin imusolmukkeisiin, keuhko- ja muilla aloilla. Läsnäolo nekroottisen kudoksen H Aragen komitea Animal Care ja käyttö (IACUC hyväksymisnumero SA-003-A); Animal Care ja käyttö komitean Cancer (IACUC hyväksymisnumero 14-090).

piirtäminen ja tilastollinen analyysi

Tiedot analysoitiin ja visualisoidaan Prism ohjelmistoa (GraphPad, v5.01). Kliinistä, histopatologiset ja immunohistokemia arvioiden merkitys asetuksen hoitoryhmien vs. vehikkeliryhmässä arvioitiin seuraavasti: D’Agostino Pearson omnibus normaaliuden testiä käytetään määrittämään, onko tietoja normaalisti jakautunut. Tiedot, jotka on normaalisti jakautunut arvioitiin yksisuuntainen ANOVA Dunnettin Multiple Comparison testin jälkeen. Non-normaalisti jakautunut tiedot arvioitiin joko Mann Whitneyn testi (pareittain analyysi) tai Kruskal-Wallisin testi kanssa Dunnin Multiple Comparison testin jälkeen. Fisherin tarkkaa testiä käytettiin analysoitaessa etäpesäkkeiden tietoja. P-arvo nimitykset ovat seuraavat: * 0,05, ** 0,01, *** 0,001, **** 0,0001.

Tulokset

Generation ja luonnehdinta anti-MMP-9-vasta-aineiden

MMP-9-kohdistettuja monoklonaalisia vasta-aineita tuotetaan immunisoimalla hiiriä ihmisen yhdistelmä-DNA tai hiiren MMP9 proteiineja, ja ehdokas vasta tunnistettiin

in vitro

seulonnan kohde sitoutumisen esto alustan proteolyysiä, ja valikoivuus vs. muut MMP perheenjäseniä. Valintaprosessi tuotti AB0041, joka inhiboi sekä ihmisen MMP-9 (hMMP9) ja rotan MMP-9 (rMMP9), mutta ei sitoudu hiiren MMP-9 (mMMP9); ja AB0046, joka päinvastoin estää mMMP9, mutta ei sitoutumista rMMP9 tai hMMP9 (taulukko 1). Molemmat vasta-aineet oli korkea affiniteetti ja erinomainen teho sillä AB0041 kohdistaminen hMMP9, K

D (app) = 0,133 ± 0,030 nM ja IC

50 = 0,172 ± 0,007 nM, ja AB0046 kohdistamista mMMP9, K

D (sovellus) = 0,218 ± 0,097 nM ja IC

50 = 0,029 ± 0,005 nM (taulukko 1). AB0041 ja AB0046 olivat erittäin selektiivinen, jossa on yli 500-kertainen selektiivisyys MMP-9 vs. muut MMP perheenjäsenet (myös erittäin homologisia MMP2) (taulukko 1 ja taulukko 2). Molemmat vasta-aineet käyttäytyi kuin ei-kilpailevat inhibiittorit, kuten IC

50-arvot syntyy vastaan ​​entsyymin aktiivisuus peptidisubstraatin, eivät oleellisesti vaikuta substraattikonsentraatioita vaihtelevat 1-20 uM (kuvio 1A). Lisäksi, sekä vasta-aineet inhiboivat MMP-9-välitteisen pilkkoutumisen fysiologisesti asiaankuuluvien substraattien gelatiinia ja peruskalvon kollageenin IV, jossa tehot samanlaisia ​​kuin syntyy peptidisubstraattia määrityksessä. IC

50 AB0041 oli 0,34 ± 0,061 nM gelatiinia pilkkominen (Kuva 1 B) ja 0,30 ± 0,025 nM kollageeni IV pilkkominen (kuvio 1 C), ja IC

50 AB0046 liivatetta pilkkominen oli 0,26 ± 0,018 nM (kuvio 1 B). Hiiri MMP9 ei sulattamaan ihmisen kollageeni IV, joten AB0046 ei ole arvioitu tässä määrityksessä.