Krooninen sairaus

tiivistelmä

oksisterolit ovat hapettumista tuotteita kolesterolin. Kolestaani-3β, 5α, 6β-trioli (lyhennetty trioli) on yksi runsaimmin ja aktiivinen oksisterolit. Tässä me raportoimme, että trioli osoittaa syövän vastaista aktiivisuutta vastaan ​​ihmisen eturauhasen syöpäsoluja. Solujen käsittely trioli annosriippuvaisesti tukahdutetaan leviämisen LNCaP CDXR-3, DU-145, ja PC-3 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen ja vähentää pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa. Suun kautta triolia 20 mg /kg päivässä kolmen viikon hidasti merkittävästi PC-3-nude-hiirissä. Virtaussytometrianalyysin paljasti, että trioli kohtelu 10-40 uM aiheutti G1 solusyklin pysähtymiseen, kun TUNEL määritys osoitti, että trioli hoito 20-40 uM aiheuttaman apoptoosin kaikissa kolmessa solulinjoissa. Micro-Western Taulukot ja perinteinen Western blotting menetelmiä osoitti, että trioli hoito johti pienentyneeseen ilmaisun Akt1, fosfo-Akt Ser473, fosfo-Akt Thr308, PDK1, c-Myc, ja Skp2 proteiinin tasot sekä kertymistä solusyklin estäjä p27

Kip. Trioli käsittely johti myös alentunut Akt1 proteiinin ilmentymistä PC-3 ksenografteissa. N yli-ilmentyminen Skp2 PC-3-solujen osittain pelastettiin kasvun aiheuttama esto trioli. Trioli hoito tukahdutti muuttoliike ja hyökkäys DU-145, PC-3, ja CDXR-3-soluissa. Ilmentymistasojen liittyvien proteiinien epiteelin-mesenkymaalitransitioon sekä fokaalisen adheesion kinaasin vaikuttivat trioli käsittely näissä soluissa. Trioli hoito aiheutti voimistunutta ilmentymistä E-kadheriinin proteiinin tasot, mutta laski ilmentymisen N-kadheriinin, vimentiinin, Slug, FAK, fosfo-FAK Ser722, ja fosfo-FAK Tyr861-proteiinin tasoja. Konfokaali laser mikroskoopilla paljasti uudelleenjako β-aktiini ja α-tubuliinin kehällä on CDXR-3 ja DU-145-soluja. Meidän havainnot viittaavat siihen, että trioli voi edustaa lupaavaa terapeuttista ainetta pitkälle metastaattinen eturauhassyöpä.

Citation: Lin C-Y, Huo C, Kuo L-K, Hiipakka RA, Jones RB, Lin H-P, et ai. (2013) kolestaani-3β, 5α, 6β-trioli hillitsee, Migration, ja Invasion of Human eturauhassyöpäsolujen. PLoS ONE 8 (6): e65734. doi: 10,1371 /journal.pone.0065734

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 28 joulukuu 2012; Hyväksytty: 27 huhtikuu 2013; Julkaistu: 13 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat CS-101-PP-14 (National Health Research Institutes), NSC 99-2320-B-400-015-MY3 ja NSC 101-2325-B-400-014 (National Science Council) Taiwanissa CPC; DOH101-TD-C-111-004 (Department of Health) Taiwanissa JYC ja CPC. SYL tukee DOH101-TD-C-111-004. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on toiseksi yleisin diagnosoitu syöpä miehillä ja viidenneksi yleisin syöpä yleistä maailmassa. Vuonna 2008 yli 899000 uutta tapausta diagnosoitiin (GLOBOCAN 2008-versio 1.2). Länsimaissa eturauhasen syöpä on yleisin ei-ihon karsinooma miehiä. Mukaan tilastojen Surveillance Epidemiology ja Lopputulokset (SEER) National Cancer Institute, yli 240000 miestä diagnosoitu ja yli 28000 miestä kuoli eturauhassyövän vuonna 2012 Yhdysvalloissa. Vaikka leikkaus on usein onnistunut elimeen rajoittunut eturauhassyöpä, androgeeniablaatio hoito on ensisijainen hoito metastaattisen eturauhassyövän. Valitettavasti useimmat saavat eturauhassyöpäpotilaat androgeeniablaatio hoito lopulta kehittyy toistuvia, kastraatio vastustuskykyisten kasvainten 1-3 vuotta hoidon. Keskimääräinen eloonjäämisaika 1-2 vuotta syövän uusiutumisen [1], [2]. Ei tehokasta tavanomaista hoitoa olemassa potilaita, jotka relapsi kanssa edenneen eturauhassyövän. Kemoterapia usein hoitoon metastaattisen hormonirefraktorisiksi eturauhassyöpä 2,3. Kuitenkin chemotherapies osoittavat yleensä vain vähän vaikutusta pitkittää selviytymistä. Siksi uusien hoitojen kehittyneen eturauhasen syöpiä tarvitaan.

oksisterolit ovat hapettumista tuotteita kolesterolin. Oksisterolit on olennaiset roolit säätelyssä kolesterolin homeostaasin, verihiutaleiden aggregaatiota, apoptoosin, ja proteiini prenylaatio [4]. Kuitenkin oksisterolit liittyvät ateroskleroosin kehittymiseen, neurologinen sairaus, ja syövät, [4]. Tietyt oksisterolit on raportoitu olevan syöpää ehkäisevistä vaikutuksista, mahdollisesti modulaation kautta kolesterolin ulosvirtausta, Akt, tai maksan X-reseptorit (LXR) [5], [6]. Esimerkiksi käsittelemällä 22 (R) -hydroxycholesterol, 24 (S) -hydroxycholesterol, 7α-hydroksikolesteroli-, 7β-hydroksikolesteroli-, 25-hydroksikolesteroli-, ja 5α, 6α-epoksikolesterolin tukahdutti leviämisen ihmisen eturauhasen, rinnan, paksusuolen, keuhkon, ja leukemia syöpäsolujen [7] – [14]. Nämä oksisterolit aiheutti joko G1 solusyklin pysähtymisen [7] – [11], tai apoptoosin syöpäsoluissa [12] – [14]. Näin ollen, oksisterolit jossa sytotoksinen aktiivisuus saattaa olla mahdollinen terapeuttinen aine edenneen eturauhassyövän syöpiä.

kolestaani-3β, 5α, 6β-trioli (lyhennetty trioli) on yksi runsaimmin oksisterolit. Trioli on peräisin kolesterolin hapettumisen kautta muodostumista 5α, 6α-epoksikolesterolin ja 5β, 6β-epoksikolesterolin [15], [16] välituotteina. Aiemmin 5α, 6α-epoksikolesterolin on raportoitu olevan syövän vastaista aktiivisuutta [13]. Tässä tutkimuksessa selvitimme kykyä trioli tukahduttaa leviämisen kehittyneen ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa sekä

in vitro

ja

in vivo

. Käytimme Micro-Western Arrays, äskettäin kehitetty vasta-aine-pohjainen, suurikapasiteettisten Western blotting-määritys [17] – [20], tutkia viestintäproteiinit vaikuttaa trioli pitkälle eturauhassyövän solut. Meidän havainnot viittaavat siihen, että trioli voi edustaa lupaavaa terapeuttista ainetta pitkälle metastaattisen eturauhassyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

kolestaani-3β, 5α, 6β-trioli ostettiin Sigma (St. Louis, MO, USA). Matrigel hankittiin BD Bioscience (San Jose, CA, USA).

Cell Culture

Eturauhassyöpäsolulinjat PC-3, DU-145, ja LNCaP alilinjat olivat lahja laboratoriossa professori Shutsung Liao (University of Chicago, IL, USA). Nämä solulinjat on kuvattu aikaisemmin [7], [8], [10], [21] – [27]. LNCaP CDXR-3-solut siirrostettiin ja ylläpidetään kuten aiemmin on kuvattu [7], [8], [10], [11], [21] – [23], [27]. DU-145 ja PC-3-soluja ylläpidettiin DMEM (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Atlas Biologicals, Fort Collins, CO, USA), penisilliinillä (100 U /ml ), ja streptomysiinillä (100 ug /ml) (täydellinen alusta), kuten aiemmin on kuvattu [28]. PZ-HPV-7-solut hankittiin Bioresource Collection ja Research Center (BCRC, Hsinchu City, Taiwan) ja viljeltiin keratinosyyttispesifisestä seerumivapaassa väliaineessa (Gibco /Invitrogen) 5 ng /ml ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää ja 50 ug /ml naudan aivolisäkeuutetta.

proliferaatiomääritystä

solut ympättiin tiheydellä 3 x 10

3 solua /kuoppa 100 ul: ssa täydellistä alustaa 96-kuoppaisilla levyillä. Proliferaatiomääritykset suoritettiin huollossa olosuhteissa (DMEM 10% FBS PC-3 ja DU-145; DMEM, jossa 10% CS-FBS LNCaP CDXR-3). Suhteellinen solujen määrä analysoitiin mittaamalla DNA-pitoisuus solulysaateista fluoresoivalla värillä Hoechst 33258 (Sigma, St. Louis, MO, USA) kuten aiemmin on kuvattu [8], [10], [11], [21], [ ,,,0],23], [24], [27], [28]. Kaikki lukemat normalisoitiin keskimääräiseen ohjaus- ehto (ei trioli käsittely) kussakin kokeessa. Koe toistettiin kolme kertaa. Kymmenen kaivoja käytettiin kunkin kunnossa. Keskiarvo ja keskihajonta edustaa keskiarvon ja keskihajonnan vastaavasti kaikki tulokset 30 kaivoja kolme koetta.

solunelinkykyisyysmääritys

Solut ympättiin tiheydellä 3 x 10

3 solua per kuoppa 96-kuoppaisen levyn (BD Bioscience). 24 tunnin kuluttua solut käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla triolia 48 tuntia tai 96 tuntia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT (3,4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2-5-difenyylitetratsoliumbromidi) määritys [29]. Formatsaanituotteen määrän määritettiin mittaamalla absorbanssi 560 nm: ssä käyttäen Tecan Genios ™ (TECAN ryhmä Ltd, Männedorf, Sveitsi) [29]. Kaikki tulokset normalisoitiin keskiarvo kontrolli ehto (ei trioli käsittelyä) kussakin kokeessa. Koe toistettiin kolme kertaa. Aina kymmenen kaivoja käytettiin kunkin kunnossa. Keskiarvo ja keskihajonta edustaa tulokset kaikista 30 kaivoja kolme koetta.

Virtaussytometrinen analyysi

Solut ympättiin tiheydellä 5 x 10

5 solua 10- cm ruokia 10 ml: aan väliainetta ja niitä viljeltiin 24 tuntia ennen lisäämistä triolia. 48 tunnin kuluttua viljelyn, kun läsnä on eri pitoisuuksia trioli, solut poistettiin trypsiinillä ja kiinnitetään 70% etanolilla fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) yli yön -20 ° C: ssa. Kiinnitetyt solut pestiin PBS: llä, käsiteltiin 0,1 mg /ml RNaasi A: PBS: ssä 30 minuutin ajan, ja suspendoitiin sitten PBS: ään, joka sisälsi 50 ug /ml propidiumjodidia. Solusyklin profiilit ja jakaumat määritettiin virtaussytometria-analyysi soluista käyttäen BD FACScan-virtaussytometrillä (BD Biosciences). Solusyklin jakautumisen analysoitiin käyttämällä ModFit LT ohjelmistoa (Verity Software House, Topsham, ME, USA) kuvatulla [10], [23], [24], [26], [27].

Soft agar Colony muodostumisen määritys

PC-3 ja LNCaP CDXR-3-soluja (8 x 10

3) suspendoitiin 0,3% matalan sulamispisteen agaroosilla (Lonza, Allendale, NJ, USA), joka sisälsi DMEM, jossa 10% FBS tai 10% hiilellä erotettua FBS: ää (CS-FBS), vastaavasti, ja sitten kerrokseksi 3 ml jähmettyi 0,5% alhaisen sulamispisteen agaroosia, joka sisälsi DMEM, jossa oli 10% FBS: ää (PC-3) tai 10% CS-FBS ( CDXR-3) 6 cm ruokia. Solujen annettiin kasvaa 37 ° C: ssa 5% CO2 14 päivää (PC-3) tai 17 päivää (CDXR-3). Levyt värjättiin 0,005% kristalliviolettia 30% etanolia 6 tuntia havaita solujen pesäkkeitä.

TUNEL Pitoisuus

Soluja viljeltiin peitinlasien 24 kuoppiin ja käsiteltiin 0, 20, ja 40 uM trioli 48 tai 96 tuntia. Solut huuhdeltiin kahdesti PBS: llä ja altistettiin TUNEL-määritystä käyttämällä ApoAlert DNA Fragmentation Assay Kit (luettelonro. 630108 Clontech, Mountain View, CA, USA) mukaisesti valmistajan ohjeen. TUNEL-värjätyt solut havaittiin Olympus -konfokaalimikroskoopilla 200 x (FV300, Olympus, Tokio, Japani).

Ethics lausunto

Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suositusten oppaasta Care ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health (Taiwan). Protokolla hyväksyttiin National Health Research Institutes Institutional Animal Care ja Käytä komitea (NHRI-IACUC-101046-A). Hiiriä pidettiin valvotuissa ympäristöolosuhteissa (22 ° C, 12 tuntia vaihtoehtoinen valo-pimeä-sykliä, 50% kosteus, ruokaa ja vettä ad libitum). Anestesian (Isofluraani 1%) annettiin vähentää kipua hiirillä aikana ymppäyksen eturauhasen syöpäsoluja. Eläinten hoito suoritettiin standardin mukaisesti eettisten ohjeiden (National Institutes of Healthin ”Guide hoidosta ja käytöstä koe-eläimet” ja kliininen koe-eläinlääketieteen (K. Hrapkiewicz, L. Medina, ja DD Holmes, 1998, Iowa State University Press). koe suunniteltu minimoimaan määrä nude-hiirten käyttää.

tuumoriksenografteja kateenkorvattomissa hiirissä

Kokeesta, hiiret hyväksynyt National Health Research Institutes Institutional Animal Care ja käyttö lausunnon ( NHRI-IACUC-101046-A). Male Balb /c nu /nu-hiirten (NCI Frederick, MD), 6-8 viikkoa ikäisiä, injektoitiin ihon alle molempiin kylkiin 5 x 10

5 PC-3-solut suspendoitiin 0,5 ml: ssa Matrigel (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA). seuranta kasvaimen kasvua aloitettiin viikkoa tuumorin istuttamisen jälkeen. hiiret erotettiin ja kontrolliryhmiin. 5 hiiriä, joissa on 10 kasvaimia koostuu kontrolliryhmässä ja 5 hiiret kuljettavat 8 kasvaimia koostui hoitoryhmässä. Kolme viikkoa ymppäyksen jälkeen PC-3-soluja, hiiret hoitoryhmässä käsiteltiin oraalisesti 5 päivää /viikko 20 mg /kg-trioli. Trioli annettiin ajoneuvoon, joka sisälsi 1% Tween 20: tä, 25%: iin dimetyylisulfoksidia PBS: ssä. Hiiret kontrolliryhmässä oli letkulla ajoneuvon vain. Trioli käsittely aloitettiin 21 päivää inokulaation jälkeen solujen ja jatkettiin 21 päivää. Kasvaimet mitattiin viikoittain käyttäen jarrusatulat ja tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa tilavuus = pituus x leveys x korkeus x 0,52 [7], [21] – [23].

Luciferase-reportteri Pitoisuus

PC-3-solut ympättiin 2 x 10

5 solua /kuoppa 12-kuoppaisella levyllä DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää. 24 tuntia sen jälkeen, kun pinnoitus, PC-3-solut transfektoitiin PRL-TK-Renilla lusiferaasi-plasmidia (normalisointi vektori, 5 ng /kuoppa), pSG5RXRα ja pSG5LXRα (400 ng /kuoppa), 4xDR4Δ56cfos pGL3 (reportterigeenin vektori, 500 ng /kuoppa ) käyttäen PolyJet ™ in vitro DNA-transfektioreagenssia (SigmaGen Laboratories, Rockville, MD, USA). 24 tunnin kuluttua transfektiosta solut käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla triolia tai T0901317. Kun oli kulunut vielä 24 tuntia, solut hajotettiin 100 pl passiivista hajotuspuskuria (Promega, Madison, WI, USA) ja lusiferaasin aktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual-Luciferase kit (Promega) on 20/20

n luminometrillä Turner Biosystems .

Western-blottaus-analyysi

Solut näytteet hajotettiin SDS-hajotuspuskuriin (240 mM Tris-asetaatti, 1% SDS: ää, 1% glyserolia, 5 mM EDTA, pH 8,0, 0,1 mM ditiotreitoli), joka sisälsi proteaasi-inhibiittorit 1 mM 4- (2-aminoetyyli) bentseenisulfonyyli (AEBSF), 0,8 uM aprotiniinia, 40 uM bestatiinia, 14 uM E-64, 20 uM leupeptiiniä, 15 uM pepstatiini A: ta (Sigma-Aldrich, P8340) ja fosfataasi inhibiittorit cantharidin, bromotetramisole ja mikrokystiini- LR (Sigma-Aldrich, P2850). Kudokset näytteet on valmistettu kudoksesta, homogenoidaan 2 x Laemmli-puskuria, kuten on aiemmin kuvattu [7], [21] – [24]. Expression proteiinien kuten Akt1, Skp2, fosfo-Akt Ser473, fosfo-Akt Thr308, PDK1, fosfori-p44 /42 MAPK Thr202 /Tyr204, CDK2, CDK6, rasvahappojen syntaasia (FASN), GSK-3α, GSK-3β, Rb , sykliini B1, sykliini D1, fosfo-p38 MAPK Thr180 /Tyr182, fosfo-PDK1 Ser241, fosfo-Rb Ser780, FAK, ja MMP-9 detektoitiin käyttämällä vasta-aineita, Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). E-kadheriinin, N-kadheriinin, ja p27

Kip1-aineet olivat peräisin BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Vasta-aineita havaita c-Myc, kaspaasi 3, kaspaasi 8, kaspaasi 9, PTEN olivat Epitomics (Burlingame, CA, USA). Slug-vasta-aine hankittiin Abgent (San Diego, CA, USA). Vimentiinista vasta-aine oli peräisin Thermo (Waltham, Massachusetts, USA). Vasta-aineet Akt1, Akt2, Akt3, Bcl-2, P53, Cdk4, NF-KB: n, sykliini A, sykliini E1, sykliini E2, E2F-1, fosfo-GSK-3α Ser21, fosfo-GSK-3β Ser9, fosfo- c-Myc Thr58 /Ser62, fosfo-PTEN Ser385, fosfo-FAK Ser722, fosfo-FAK Tyr861, ja α-tubuliinin olivat Milliporelta (Bedford, MA, USA). Vasta-aineet havaitaan α-tubuliinin, β-aktiinin ja GAPDH ostettiin Novus (Littleton, CO, USA). Vasta-aineet Skp2, p21

Cip, ja p27

Kip oli Santa Cruz (Dallas, TX, USA). Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kani-anti-hiiri-IgG-vasta-aineita olivat Santa Cruz. Signaali piparjuuriperoksidaasilla leimattuja sekundaarisia vasta-aineita detektoitiin tehostetun kemoluminesenssin reaktio (ECL Western Blotting havaitseminen kit) (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). GAPDH, α-tubuliinin, ja β-aktiini käytettiin lastaus valvontaa.

Micro-Western Arrays

CDXR-3 ja DU-145-soluja käsiteltiin vehikkelillä (DMSO) tai 10 uM trioli 48 tuntia. Micro-Western Array suoritettiin mittaamaan proteiinin ilmentymisen ja muutos aikaisemmin kuvatulla [17], [18], [20], [24].

Skp2 yli-ilmentyminen in PC-3 solujen

ektooppinen ilmentyminen Skp2 saavutettiin infektoimalla PC-3-solut, joissa on retroviruksen syntyvät LPCX plasmidi, joka sisälsi villin tyypin ihmisen Skp2 cDNA, kuten on kuvattu [10]. Puromysiiniresistenttiä pesäkkeet laajennettiin ja seulottiin lisääntynyt Skp2 proteiinin ekspression Western blot-analyysi. PC-3-soluja infektoitiin tyhjä LPCX retrovirus käytettiin verrokkeina [10]. Solut hajotettiin Laemmli-puskurissa ilman bromofenolisininen väriainetta.

reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio

RNA eristettiin PC-3 ja DU-145-solut käsiteltiin 0, 10, ja 20 uM trioli 48 tunnin ajan käyttäen RNeasy Minikit (kat. nro 74104, Qiagen, Venlo, Alankomaat) seuraten valmistajan ohjeita. Genominen DNA poistettiin DNaasi vs. sarake hoidon mukana mini kit. RNA-pitoisuus määritettiin spektrofotometrisesti 260 nm: ssä. Yhtä suuret määrät RNA: ta käytettiin cDNA-synteesin reaktiot käyttäen Käänteistranskriptio SystemRevertAid ™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas /Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [7], [8], [21] – [23], [28] käyttämällä SYBR Green järjestelmä /’reagenssit optisessa 96-kuoppalevylle ja sykliolosuhteita, joka koostuu 2 min 50 ° C: ssa, 10 min st 95 ° C, 40 sykliä, joissa 15 sekuntia 95 ° C: ssa, ja 60 s 60 ° C: ABI Prism-järjestelmän (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sekvenssit alukkeiden ATP-sitova kasetti kuljettaja A1 (ABCA1) oli TGTCCAGTCCAGTAATGGTTC (eteenpäin) ja AAGCGAGATATGGTCCGGATT (reverse). Otteen taso ABCA1 määritettiin PC-3 ja DU-145-solujen hoidon jälkeen 0, 10, ja 20 uM trioli 48 tuntia ja normalisoitiin GAPDH tasolle kussakin näytteessä.

TranswellTM migraatiokokeessa

Migration määrityksiä PC-3-soluja suoritettiin siirtokuoppaan Kitin BD Bioscience (luettelonumero 353097). PC-3, DU-145, ja CDXR-3-soluja käsiteltiin 0, 10 ja 20 uM trioli 48 tuntia. Sitten solut poistettiin kudosviljelylevyiltä trypsiinillä, ja pestiin kahdesti PBS: llä. Trioli-käsitellyt solut (1 x 10

4) 250 ul: ssa DMEM ilman seerumia sijoitettiin ylempään hyökkäyksen kammion ja alempi osasto oli ladattu DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää. Solujen liike- kammio on työntää alempaan osastoon ja inkuboitiin joko 6 (PC-3, DU-145) tai 24 (CDXR-3) tunnin ajan 37 ° C: ssa. Solujen yläpuolisen suodattimen poistettiin pumpulipuikolla. Kiinnittyneiden solujen suodatin kiinnitettiin sitten metanolin kanssa 10 min. Kiinnittyneiden solujen suodattimen värjättiin sitten Giemsa-värjäys (5%) 1 tunnin ajan. Suodattimia de-värjättiin pesemällä vedellä ja solujen määrän kiinnitetty suodatin kvantitoitiin sitten laskemalla solujen valokuvia värjättyä suodattimia.

TranswellTM invaasiomääritys

invaasiomääritys kanssa PC-3-solujen suoritettiin Growth Factor Alennettu BD BioCoat matrigeelin invaasiota kammiot (BD Biosciences) mukaan valmistajan ohjeiden. PC-3-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla triolia 48 tuntia. Sitten solut trypsinoitiin ja pestiin kahdesti PBS: llä. Soluja kullekin tilalle ympättiin 4 x 10

4 solua kuoppaa kohden seerumittomassa DMEM ylemmässä osastossa, ja DMEM-elatusainetta, jossa oli 10% FBS: ää, pantiin alempaan osastoon kammion kuin Chemo-houkutinta. 24 tunnin kuluttua inkubaation, ei-tunkeutuvat soluihin yläosassa kammion poistettiin, ja kalvot kiinnitettiin metanolilla, pestiin, ja värjättiin Giemsa-liuoksella. Invasiivisuus arvioitiin laskemalla tunkeutuvat solut valomikroskoopilla. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena.

haavan paraneminen Pitoisuus

CDXR-3-soluja esikäsitelty 0, 10, ja 20 uM trioli 24 tuntia. Sitten solut poistettiin kudosviljelylevyiltä trypsiinillä, ja pestiin kahdesti PBS: llä. Solut ympättiin konsentraatiolla 3,5 x 10

4 solua /kuoppa 12-kuoppalevyille. 24 tunnin kuluttua, haavan paranemista määritys suoritettiin raaputtamalla solut 200 pl pipetin kärjen. Solut havaittiin 0, 8, ja 24 tunnin kuluttua kaapimalla ja valokuvattiin elävällä kuvantamisen mikroskooppi (Leica AF 6000 LX, Leica, Wetzlar, Saksa). Vaellusetäisyydet oli mitataan automaattisesti ohjelman sisällä eläviä kuvantaminen mikroskoopilla.

konfokaalimikroskopia

CDXR-3 ja DU-145-soluja käsiteltiin 0 tai 10pM trioli 24 tuntia. Sitten solut pestiin 3 kertaa PBS-puskurilla 5 minuuttia per pesu huoneenlämpötilassa (RT), kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 min ajan huoneenlämpötilassa, ja huuhdeltiin PBS: lla 3 kertaa 5 minuutin ajan per pesu ja läpäiseviksi 10 minuutin ajan RT: 0,1% Triton X-100 PBS: ssä. Solut blokattiin ei-spesifistä proteiinia sitova 2% naudan seerumin albumiinia PBS: ssä 30 minuutin ajan, huuhdeltiin PBS: lla kolme kertaa 5 min kukin. Soluja inkuboitiin β-aktiini tai α-tubuliinin vasta-aineen yhden tunnin ajan. Pesun jälkeen soluja inkuboitiin sekundäärisen FITC-konjugoidun vasta-aineen kanssa yhden tunnin ajan. Pesun jälkeen solut lasin alle dioja ja sinetöity Permount-peitinlaseilla. Kuvia soluja havaittiin Olympus -konfokaalimikroskoopilla 400 × (silmän linssin 10 ×; objektiivilinssi 40 ×) (FV300, Olympus, Tokio, Japani).

Data Analysis

Data ovat esitetään keskiarvona +/- SD vähintään kolmen kokeen tai ne edustavat kokeita toistettiin ainakin kolme kertaa. Studentin t-testi (two-tailed, parittomia) käytettiin arvioimaan tilastollinen merkitsevyys tulokset proliferaatiomäärityksessä kokeissa. Microsoft Excel-apuohjelma ED50V10 käytettiin laskettaessa puoleen maksimaalisesta tehokkaan pitoisuuden (EY

50).

Tulokset

Triol tukahdutti leviämisen ihmisen eturauhassyöpäsolujen

ensin pyrittiin määrittämään vaikutuksen trioli hoidon elinkelpoisuus ja lisääntyminen kolme yleisesti käytetty ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa (Fig. 1). LNCaP CDXR-3-solut androgeenireseptoria (AR) -positiivinen, uusiutunut, androgeenistä riippumaton peräisin olevia soluja vanhempien AR-positiivisia androgeeniriippuvaisen LNCaP 104-S-soluissa [27]. DU-145 ja PC-3 molemmat ovat AR-negatiivisia androgeenin herkkä solujen perustettu aivo- [30] ja luu- [31] peräisin etäpesäke, vastaavasti. MTT-määritys ja Hoechst väripohjaisia ​​proliferaatiomäärityksillä osoitti, että trioli tukahdutti sekä solujen elinkelpoisuutta ja soluproliferaatiota (Fig. 1). Inhiboiva vaikutus proliferaatioon oli annoksesta riippuvainen ja kasvanut ajan myötä (kuvio. 1, taulukko S1). N

50 trioli MTT määrityksessä oli samanlainen kuin EY

50 mitattuna Hoechst väripohjaisia ​​runsaudenmäärityksessä (taulukko S1), mikä viittaa siihen, että inhibitio soluproliferaatiota vastaa vähentämistä elävien solujen aiheuttamaa trioli hoitoon kaikissa kolmessa ihmisen edennyt eturauhassyöpä solulinjoissa.

LNCaP CDXR-3, DU-145, ja PC-3 eturauhasen syövän soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla triolia 48 tuntia (A) (C) tai 96 tuntia (B) (D). Suhteellinen elinkelpoisuus ja solujen suhteellinen lukumäärä eturauhassyöpäsolujen määritettiin MTT (3,4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2-5-difenyylitetratsoliumbromidi) 96-määrityksen (A) (B) ja Hoechst dye 33258- joka perustuu 96-kuoppaisen proliferaatiomäärityksellä (C) (D), tässä järjestyksessä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Solujen lukumäärät normalisoitiin valvoa (dimetyylisulfoksidi) kunkin solulinjan. Tähdellä (*, **, ***) edustaa tilastollisesti merkitsevää eroa (

p

0,05,

p

0,01,

p

0,001) välillä käsitellyn ryhmän ja kontrolliryhmän.

Triol Treatment Inhibioitu Colony muodostaminen PC-3 ja CDXR-3 solut Soft Agar

hoito PC-3 ja LNCaP CDXR-3 solut 25 uM ja 50 uM trioli merkittävästi inhiboi PC-3 ja LNCaP CDXR-3 pesäkkeitä pehmeässä agarissa, vahvistaa syövän aktiivisuutta triolia. DU-145-solut kasvoivat liian hitaasti pehmeässä agarissa havaita riittävän pesäkkeitä lisäanalyysiä (Fig. 2).

PC-3 (A) ja LNCaP CDXR-3 (B) käsiteltyjä soluja 0, 10, tai 20 uM trioli 14 ja 17 päivää, vastaavasti. Kuva on edustava seurausta kolmen biologisen rinnakkaisnäytettä.

Triol hoito Retarded kasvu androgeenisesti-herkkä Eturauhassyöpä nude-hiirissä

Sen määrittämiseksi, trioli voisi tukahduttaa kasvaimen kasvua

in vivo

, suoritimme esitutkimuksessa DU-145 nude-hiirissä. Intraperitoneaalinen (i.p.) 1 mg (50 mg /kg) triolia päivässä 14 päivän ajan aiheutti 36% vähennys keskimääräinen tilavuus DU-145 ksenograftien kasvava nude-hiirissä (Fig. S1). Trioli hoito 14 päivää ei vaikuttanut painon hiirten (tuloksia ei ole esitetty). Sen määrittämiseksi, pienempi suun kautta annoksia trioli voisi estää kasvun PC-3 eturauhasen ksenografteissa. me oraalisesti trioli 20 mg /kg viisi kertaa viikossa. Suun kautta otetun 20 mg /kg trioli (5 kertaa viikossa) päässä 3

rd 6

th viikko aiheutti 65% vähennys kasvaimen keskimääräinen tilavuus (p = 0,0002) hoitoryhmässä verrattuna kasvaimen ajoneuvossa kontrolliryhmässä (Fig. 3A). Ruumiinpaino sekä ajoneuvojen ja trioli-käsiteltyjen ryhmien alennetaan asteittain (Fig. 3B). Tämä voi johtua cachetic vaikutuksia PC-3-ksenografteissa. Nämä havainnot vahvistivat, että suun kautta trioli voisi hidastaa kasvua eturauhasen kasvaimia

in vivo

.

Male Balb /c nu /nu hiirille, iältään 6-8 viikkoa, injektoitiin ihon alle molempiin kylkiin 5 x 10

5 PC-3-solut suspendoitiin 0,5 ml: aan Matrigel. Kasvaimet mitattiin päivittäin käyttäen jarrusatulat ja tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa tilavuus = pituus x leveys x korkeus x 0,52. Seuranta kasvaimen kasvun aloitettiin viikkoa tuumorin istuttamisen jälkeen. Hiiret erotettiin ja kontrolliryhmiin. Kontrolliryhmässä oli 5 hiirtä kuljettaa 10 kasvaimia ja hoitoryhmässä oli 5 hiirtä kuljettaa 8 kasvaimia. Kolmen viikon kuluttua alku rokotuksesta, hoitoryhmässä oli oraalisesti trioli päivittäin annoksella 20 mg /kg, 5 päivää /viikko. Hiiret kontrolliryhmässä oli letkulla ajoneuvon vain. Hoito aloitettiin päivänä 22 ja päättyi päivänä 42 tuumorin istuttamisen jälkeen. Kasvaintilavuudet näytetään keskimääräisenä ± keskivirhe (A), kun taas hiirten kehon painon näkyi keskiarvo ± keskihajonta (B).

Triol hoito aiheutti G1 solukierron pysähtymisen eturauhassyöpäsoluissa

seuraavan suoritettiin virtaussytometria-analyysi sen määrittämiseksi, onko solusyklin etenemisen eturauhasen syöpäsolujen vaikuttivat trioli. Käsittely 10 uM trioli 48 tuntia aiheutti lisääntymisen G1 vaiheeseen solupopulaation ja lasku S ja G2 /M-vaiheen populaatiot LNCaP CDXR-3 ja DU-145-syöpäsolujen (Fig. 4A, 4B). Trioli 10 uM ei ollut vaikutusta solusyklin etenemistä PC-3-soluja. Kuitenkin 20 uM trioli aiheutti merkittävän kasvun G1 ja lasku S ja G2 /M-populaatiot PC-3-solut (Fig. 4C). Siksi hoito 10-20 uM trioli aiheuttama G1 solusyklin pysähtymisen LNCaP, DU-145, ja PC-3-solut. Emme havainneet mitään kasvua Saharan G1 ovat näissä kolmessa eturauhassyövän solulinjoissa. Sen määrittämiseksi, onko suurempia pitoisuuksia trioli tulee lisätä solujen populaatio osa-G1, käsittelimme DU-145-soluja, joissa on 0, 20, ja 40 uM trioli (Fig. 4D). Vähentäminen S-vaiheeseen väestön ja induktio G1 vaiheen väestöstä DU-145-soluissa oli vielä merkittävämpi hoidon jälkeen 40 uM trioli. Kuitenkin, ei ollut merkittävää kasvua solujen osa-G1 väestöstä.

LNCaP CDXR-3 (A) ja DU-145-soluja (B) käsiteltiin 0 tai 10 uM trioli 48 tuntia. PC-3-solut (C) käsiteltiin 0, 10, tai 20 uM trioli 48 tuntia. (D) DU-145-soluja käsiteltiin 0, 20 ja 40 uM trioli 48 tuntia. Solusyklin jakautuminen määritettiin virtaussytometrialla. Tähdellä (*, **, ***) edustaa tilastollisesti merkitsevää eroa (

p

0,05,

p

0,01 ja

p

0,001, vastaavasti) välillä käsitellyn ryhmän ja kontrolliryhmän.

hoito korkea pitoisuus Triol aiheuttaman apoptoosin eturauhassyöpäsoluissa

Kuten propidiumjodidivärjäys virtaussytometrianalyysin ei ole luotettava menetelmä apoptoosin havaitsemiseen, käytimme TUNEL sen määrittämiseksi, jos trioli hoito suuremmilla pitoisuuksilla aiheuttaman apoptoosin eturauhassyöpäsoluissa. Käsittelimme CDXR-3, DU-145, ja PC-3-solujen kanssa 0, 20, ja 40 uM trioli 48 tai 96 tuntia. Yhdenmukainen virtaussytometriseen analyysiin tietojen käsittely trioli 48 tuntia tuotetaan ainoastaan ​​pieni populaatio apoptoottisten solujen kaikissa näissä solulinjoissa (tietoja ei esitetty). Hoidon trioli 96 tuntia annosriippuvaisesti johti lisääntyneeseen väestön apoptoottisten solujen kaikissa kolmessa eturauhassyöpäsolulinjoissa (Fig. 5). Vaikka hoito 20pM trioli 96 tuntia lisäsi vain hieman apoptoottisen väestön hoito 40 uM trioli johti merkittävään kasvuun apoptoosin kaikissa kolmessa eturauhassyövän solulinjoissa.

LNCaP CDXR-3, DU-145 ja PC-3-soluja käsiteltiin 0, 20 ja 40 uM trioli 48 tuntia. Solujen morfologia määritettiin valomikroskoopilla. TUNEL-määritys suoritettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät määrittää apoptoottisen solupopulaation. Green loisteputki osoitti apoptoottiset solut värjättiin TUNEL määrityksessä. Kuvat näytettiin 200 × Olympus -konfokaalimikroskoopilla.

Micro-Western Array paljastui viestintäproteiinit sairastumatta Triol Treatment

Oletimme, että trioli voi vähentää solujen elinkykyä, sillä se vaikuttaa proteiinin signalointi verkot. Sen määrittämiseksi, mitä signalointi proteiineja saattaa vaikuttaa trioli hoito, käytimme Micro-Länsi Array (MWAs), suurikapasiteettisten Western blotting-määritys [17] – [20], [24], seulomiseksi viestintäproteiinit vaikuttaa käsittely 10pM trioli in CDXR-3 ja DU-145-soluja. PTEN usein poistetaan eturauhassyövässä, mikä aktivoituminen PI3K /Akt signalointi [32]. PI3K /Akt signaloinnin tärkeä rooli eloonjäämisen ja etenemisen eturauhasen syöpäsolujen [32], [33]. Up-regulation PI3K /Akt aktiivisuus liittyy huono kliininen tulos eturauhassyövän [34]. Käytimme 48 vasta-aineita, jotka pystyvät havaitsemaan proteiineja säädellään solusyklin etenemisen, solun eloonjäämisen ja apoptoosin, Akt liittyvät signalointireittien, ja useita epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) merkkiaineet (kuvio S2, taulukko S2) varten seulonnan osa meidän MWA tutkimus (Fig. 6). Erot proteiinin ilmentymisen profiili poissa ja läsnä ollessa 20 uM trioli on esitetty kuviossa. 7. Kukin kolmesta solulinjojen oli ainutlaatuinen proteiinin ekspressio vasteena trioli hoitoon. Proteiini profiilit CDXR-3 ja PC-3-solujen käsittelyn jälkeen 20 uM trioli olivat keskenään samanlaisia ​​kuin DU-145-soluja.