Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

On kiistelty siitä microRNA-126 on kasvain tukahduttava tai onkogeenisten miRNA. Enemmän kokeita sen selvittämiseksi, ovatko microRNA-126 liittyy ei-pienisoluinen keuhkosyöpä riskiä ja ennustetta.

Methods

Yli-ilmentyminen mikroRNA-126 tehtiin arvioimaan soluinvaasiota ja kasvaimen kasvua ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjojen ja paljaan hiiren ksenograftimallissa. Gain-of-function kokeita ja lusiferaasin analyysit suoritettiin paljastaa suhdetta microRNA-126 ja PI3K-Akt-signaalin väylän A549-soluja. Analysoimme yhdistysten mikroRNA-126 ilmaisun välillä geneettisiä variantteja sisällä microRNA-126 ja kliiniset tiedot, mukaan lukien tupakointi, sukupuoli, ikä, ja histologinen tyyppi ja kasvaimen vaiheessa.

Tulokset

Yli -ilmaisu on mikroRNA-126 NSCLC solulinjoissa laski proliferaatiota in vitro ja kasvaimen kasvua nude-hiiret ksenograftimallissa. Ja microRNA-126 tukahdutettu myötä PI3K-Akt-reitin kohdistamalla sitoutumiskohdat 3′-alueen PI3KR2 mRNA. Ilmaisu taso mikroRNA-126 aleni NSCLC linjat ja tuumorikudoksia. Potilaat, joilla on alhainen microRNA-126 ilmaisu oli merkittävästi huonompi elinaika kuin ne, joilla on korkea microRNA-126 lauseke (välineet elinaika (kk): 24,392 ± 1,055 vs. 29,282 ± 1,140, ​​

P

= 0,005). Kuitenkin, ei ollut merkittävää eroa genotyyppi ja alleeli taajuuksilla mikroRNA-126 variantti (G A, rs4636297) tapausten ja kontrollien välillä (

P

= 0,366). Lisäksi ei ollut yhdistyksen välillä SNP rs4636297 ja elinaika NSCLC potilailla (

P

= 0,992). Ja microRNA-126 ilmaisu ei ollut merkittävää eroa kolmen genotyyppiryhmien (

P

= 0,972).

Johtopäätökset

tulokset osoittavat, että microRNA-126 on kasvain- vaimennin geeni NSCLC ja matalan microRNA-126 ilmaisu on epäedullinen ennustetekijä pienisoluista keuhkosyöpää. Kuitenkin sääntelyn mekanismi mikroRNA-126 on vielä selvittämättä eri normaaleissa ja pahanlaatuinen kudosten. Siksi tarvitaan lisätutkimuksia tutkia kasvain tukahduttava toimintoja mikroRNA-126 in NSCLC.

Citation: Yang J, Lan H, Huang X, Liu B, Tong Y (2012) MicroRNA-126 Estää Kasvainsolun kasvu ja sen ekspressiotaso korreloi Poor Survival in Non-pienisoluinen keuhkosyöpä Potilaat. PLoS ONE 7 (8): e42978. doi: 10,1371 /journal.pone.0042978

Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong

vastaanotettu: 07 helmikuu 2012; Hyväksytty: 16 heinäkuu 2012; Julkaistu: 10 elokuu 2012

Copyright: © Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (lupanumeroon 30800633) ja Sichuan Science and Technology Foundation for Nuoret (lupanumeroon 09ZQ026-034). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on edelleen johtava syy syöpään liittyvien kuolemien maailmassa sekä Kiinassa [1]. Paljon geenien osalliseksi NSCLC kasvainten synnyssä kuten

p53

,

Rb

, ja

Ras

[2]. Tutkimus osoittaa, että 98 186 MikroRNA ovat syöpään liittyvän genomialuetta tai hauras sivustoja [3]. Esimerkiksi miR-99a, let-7, miR-125b-2 sijaitsevat homotsygoottinen poisto alueilla ilman tunnettua tuumorisuppressorigeeneille keuhkosyövässä [3]. Useat MikroRNA sijaitsevat lähellä murtuessa alueilla, mukaan lukien miR-142 50 nukleotidiä t (8, 17) tauko kromosomijaksosta 17 ja MYC [3]. Tämä osoittaa, että MikroRNA saattaa olla ratkaiseva rooli kasvainten synnyssä ja syövän etenemistä [3]. Lisäksi, microRNA ilmentymisen profilointi on tyypilliset allekirjoituksia monia kasvaintyypeissä ja on biomarkkeri kasvaimen luokittelu, ennuste, ja hoitotulokseen [4] – [8].

MicroRNA-126 on kartoitettu kromosomiin 9q34.3 vastaanottavassa koodaavan geenin kasvutekijän kuten-7 (

EGFL-7

). MicroRNA-126 ilmentyy voimakkaasti keuhkojen ja sydämen kudoksissa, mutta myös ilmaistu alemmilla aivoissa, maksassa ja munuaisissa [9]. Korkea ekspressiotasot mikroRNA-126 ekspressio tunnistetaan endoteelisoluilla, mikä on tärkeä rooli säätelyssä angiogeneesiä ja verisuonten eheyden estämällä VEGF kautta. Knockdovvn mikroRNA-126 johti menetykseen verisuonten eheyden ja verenvuoto alkionkehityksen aikana seeprakalan [10] – [13]. Lisäksi jotkut tutkimukset osoittivat, että microRNA-126 tukahdutettu apoptoosia akuutin myelooisen leukemian soluja ja parannettu pesäkkeitä muodostavaa kykyä hiiren luuytimen kantasoluja kohdistamalla Polo kaltainen kinaasi 2 (

PLK2

) [14]. Päinvastoin, muut tutkimukset osoittivat, että microRNA-126 viitataan usein tuumorisuppressorigeenin erilaisissa syövissä [15] – [21]. Mahasyövän, yli-ilmentyminen mikroRNA-126 merkittävästi parannettu ankkurointi riippuvia ja kiinnittymisestä riippumattoman solujen kasvun kohdistamalla

Sox2

[16]. Paksusuolen syöpä, microRNA-126 estää syöpäsolujen kasvua kohdistamalla fosfatidyyli-3-kinaasi-säätelyalayksikkö beta (p85β) [19]. Jotkut tutkimukset osoittavat myös, että microRNA-126 voi estää hyökkäyksen ja lisääntymistä säätelemällä

Crk

,

VEGF

, ja

EGFL7

NSCLC [15], [21], [ ,,,0],22]. Siten nykyinen todisteita näyttävät tukevan läheinen suhde microRNA-126 ja kasvaimen kasvua. Lisäksi verrattuna potilailla, jotka eivät reagoi ensimmäinen rivi kapesitabiinihoidon ja oksaliplatiinia, microRNA-126 ilmentymisen taso oli merkitsevästi suurempi potilailla, jotka vastasivat kapesitabiinihoidon ja oksaliplatiinin [23]. Lisäksi suhde mikroRNA-126 /microRNA-152 käytössä havaitsemiseksi urothelial virtsarakon syöpä (BCA) virtsasta, jonka spesifisyys 82% ja herkkyys on 72% [24]. Edellä esitetyn perusteella raportteja, microRNA-126 voi olla mahdollista ennustava ja diagnostinen arvo syöpiä.

On kiistelty siitä microRNA-126 on kasvain tukahduttava tai onkogeenisten miRNA. Ja sääntelyn mekanismi mikroRNA-126 on vielä selvittämättä eri normaaleissa ja pahanlaatuisten kudosten [25]. Tällä hetkellä, lisää kokeita sen selvittämiseksi, ovatko microRNA-126 on liitetty ei-pienisoluinen keuhkosyöpä riski ja ennuste. Tässä tutkimuksessa tutkimme rooli mikroRNA-126 NSCLC ja osoittaa, että se on tuumorisuppressorigeeniä ja sen ilmentymistason korreloi huonon selviytymisen pienisoluista keuhkosyöpää.

Tulokset

MicroRNA- 126 Estää Cell invaasiomääritys ja tuumorikasvun

suoritetaan solun invaasiomääritys että A549- ja SK-MES-1-solut PE-Mir126 vektorin tai PE-CMV vektorin transfektiolla. Verrattuna kontrolliryhmään, yli-ilmentyminen mikroRNA-126 heikentynyt soluinvaasiota, joka koostui aikaisempien raporttien kanssa (kuvio 1A). Solujen lisääntyminen väheni 47,91% (

P

= 0,0006) ja 36.36% (

P

= 0,0018), kun vastaavasti A549- ja SK-MES-1-soluja vastaavasti käsiteltiin microRNA-126 yli-ilmentyminen 72 tuntia (kuvio 1 B). Tutkimaan edelleen vaikutusta mikroRNA-126 syöpäkasvainten kasvuun, tutkimme kyky mikroRNA-126 tukahduttaa kasvaimen kasvua

in vivo

kasvaimensisäisiä ruiskuttamalla PE-Mir126 vektorin A549 ja SK-MES-1 ksenografteja mallien nude-hiirten. Kuten kuviossa 1C on esitetty, tuumorien kasvua havaittiin 1-25 päivää viimeisen injektion jälkeen. Keskimääräinen kasvaimen painoa käsitellyillä hiirillä PE-Mir126 vektori päivänä 25 sen jälkeen, kun viimeisestä injektiosta oli vain noin puolet kasvaimen paino hiirissä, joita käsiteltiin PBS: llä yksin tai PE-CMV pelkästään vektorilla (kuvio 1 D). Kaikki kasvaimet kasvu hiirissä, joita käsiteltiin PE-Mir126 vektori oli suppressoi merkittävästi verrattuna PBS-käsitellyn ja pE-Mir126 vektori hoidetuissa hiirissä.

(A) Overe-Xpression of mikroRNA-126 estää soluinvaasion A549 ja SK-MES-1-soluissa. Verrattuna kontrolliryhmään, yli-ilmentyminen mikroRNA-126 impaires soluinvaasiota. (B) MicroRNA-126 heikentää solujen lisääntymiseen A549 ja SK-MES-1-soluissa. Solujen proliferaatiota merkittävästi pienentynyt sen jälkeen, kun soluja käsiteltiin microRNA-126 yli-ilmentymisen 72 tunnin ajan. (C) Kasvaimen kasvukäyrä

in vivo

kasvaimensisäisiä injektio microRNA-126. Kasvainten kasvua havaittiin 1-25 päivää viimeisen injektion jälkeen. (D) MicroRNA-126 inhiboi A549 ja SK-MES-1-soluissa in vivo. Keskimääräinen kasvaimen vain noin puolet kasvainten paino hoidetuilla hiirillä PBS tai PE-CMV pelkällä vektorilla.

MicroRNA-126 Estää kasvainsoluproliferaation vaikka PI3K-Akt Pathway in NSCLC

tutkia molekyylitason mekanismi mikroRNA-126 antiproliferatiivinen vaikutus NSCLC, käytimme kaksi avointa pääsyä ohjelmiin (TargetScan ja miRBase) ennustaa tavoitteita mikroRNA-126. Ennustettu sitoutumiskohdat 3’UTR

PIK3R2

varten microRNA-126 on esitetty kuviossa 2A. Lusiferaasireportterigeenin määritys osoitti, että aktiivisuutta reportteri, joka sisältää 3’UTR

PIK3R2

geenin vähentynyt kotransfektion jälkeen PE-Mir126 vektori (100,67 ± 4,51 vs.31.33 ± 5,86,

P

0,0001), kun taas aktiivisuus mutageneesillä reportteri sisältävän 3’UTR

PIK3R2

geeni ei ilmeisesti muuttunut (104,00 ± 8,54 vs. 98,33 ± 10,12,

P

= 0,484) (kuvio 2B). Lisäksi, Western blot-analyysi osoitti, että ekspressio PIK3R2 oli heikentynyt käsittelemällä PE-Mir126 vektori A549 (0,97 ± 0,14 vs.0.31 ± 0,07, P = 0,002) ja SK-MES-1-soluja (0,94 ± 0,13 vs. 0,45 ± 0,08,

P

= 0,005) (kuvio 2C). Lisäksi transfektio pE-Mir126 vektori sijaan PE-CMV vektori merkittävästi tukahdutettu Akt-fosforylaation muuttamatta ekspressiotasot yhteensä Akt-proteiinia (A549-soluja, 0,89 ± 0,10 vs.0.41 ± 0,04, P = 0,002. SK-MES-1-soluja 0,88 ± 0,08 vs.0.47 ± 0,05

P

= 0,002) (kuvio 2C).

(A) Otaksutuista microRNA-126 kohdistaminen sivusto 3’UTR PIK3R2. Mutaatio syntyy 3’UTR PIK3R2 sekvenssin täydentävässä sivuston siemenen alueen mikroRNA-126 esitetyllä. (B) MicroRNA-126 sitoutumiskohta 3’UTR PIK3R2 arvioitiin käyttämällä lusiferaasireportterigeenin määritys. Havaittu lusiferaasiaktiivisuutta luminometrillä kotransfektion jälkeen 48 tunnin ajan. Lusiferaasin kunkin näytteen aktiivisuus normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus. (C) MicroRNA-126 estää PIK3R2 ilmaisun ja Akt fosforylaation A549 ja SK-MES-1-soluissa. Yhteensä proteiini eristettiin soluista, käsiteltiin PE-Mir126 vektorin tai PE-CMV-vektori 48 tuntia. PIK3R2 ilmaisun ja Akt fosfory- analysoitiin western-blottauksella käyttämällä vasta-ainetta P85β ja fosfo-Akt (Ser473). (D) PIK3R2 ekspressiotasot ja Akt-fosforylaation NSCLC kudoksissa. Asteikko bar, 10 mikrometriä. a. Immunohistokemiallinen värjäys negatiivinen valvonta PIK3R2 NSCLC kudoksessa. b. Immunohistokemiallinen värjäys negatiivinen kontrolli p-Akt (Ser473) in NSCLC kudoksessa. c. Immunohistokemiallinen värjäys PIK3R2 NSCLC kudosten alhaisen microRNA-126 ekspressiotasot. d. Immunohistokemiallinen värjäys p-Akt (Ser473) NSCLC kudosten alhaisen microRNA-126 ekspressiotasot. e. Immunohistokemiallinen värjäys PIK3R2 NSCLC kudoksessa korkean microRNA-126 ekspressiotasot. f. Immunohistokemiallinen värjäys p-Akt (Ser473) NSCLC kudoksessa korkean microRNA-126 ekspressiotasot. (E) Ilmaisu tasot PIK3R2 ja Akt-fosforylaation NSCLC kudoksissa käänteisesti korreloi microRNA-126 ekspressiotasot (PIK3R2, Spearman r = -0,276,

P

0,0001, Akt, Spearman r = -0,164,

P

= 0,0013). (F) Käsittely Akt-MYR tilastollisesti merkitsevä pelastamisen A549 ja SK-MES-1 soluproliferaation transfektoimalla PE-Mir126 vektori. Yhteensä proteiini eristettiin soluista, käsiteltiin Akt-myr, uE-Mir126 vektorin tai vastaavan valvonnan 48 tuntia. Akt-fosforylaation analysoitiin western-blottauksella käyttämällä vasta-ainetta fosfo-Akt (Ser473). Sen jälkeen, kun solut transfektoitiin Akt-myr, uE-Mir126 vektorin tai vastaavan valvonnan 72 tunnin ajan 96-kuoppaisella levyllä, soluproliferaatiota hinnat määritettiin MTT-määritystä.

edelleen arvioida suhdetta microRNA-126 ja

PIK3R2

NSCLC, havaitsimme ilmentymistasojen mikroRNA-126, PIK3R2 ja Akt-fosforylaation 381 kliinisissä näytteissä kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR (qRT-PCR) ja immunosytokemia (IHC) vastaavasti. Ilmentymistasojen PIK3R2 ja Akt: n fosforylaation tuumorikudoksissa korreloi käänteisesti kanssa microRNA-126 ekspressiotasot (PIK3R2, Spearman r = -0,276,

P

0,0001, Akt, Spearman r = -0,164,

P

= 0,0013, kuviossa 2D 0,0001) .

tasot mikroRNA-126 Expression korreloivat Huono selviytyminen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Potilaat

verrattuna kuolemattomaksi keuhkoputken epiteelin NL20, microRNA-126 ilmentymistasot ilmeisesti väheni NSCLC solulinjoissa, kuten A549, H358, H1703, H460 ja SK-MES-1 (kuvio 3A). Ilmaisu taso mikroRNA-126 tutkittiin myös kohortin koostuu 168 paria NSCLC kasvain kudosten ja sovitettu viereisten noncancerous kudoksiin (kuvio 3B). Sen ilme taso oli paljon alhaisempi kasvainkudoksessa kuin että noncancerous kudoksissa (0,905 ± 0.171vs.0.683 ± 0,308,

P

0,0001).

(A) Ilmaus tasot microRNA -126 vähenevät NSCLC solulinjoissa. Expression of mikroRNA-126 tutkittiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR NL20 solulinjoissa ja NSCLC solulinjat. (B) Ilmaisulla tasot mikroRNA-126 pienenevät Human NSCLC yksilöitä. Expression of mikroRNA-126 määritettiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR kasvainkudoksissa ja potilaan sovitettu viereisen keuhkojen kudoksiin. Verrattuna vastaavan viereisen keuhkojen kudoksia, microRNA-126 ilmentyminen oli selvästi alassäädetty kasvainkudoksissa (

P

0,0001). (C) Matala microRNA-126 ilmaisu korreloi huonon säilymisen NSCLC potilaiden. Potilaat jaettiin kahteen ryhmään niiden microRNA-126 ekspressiotasot: ne, joissa on vähemmän kuin mediaani mikroRNA-126 ekspressiotasot ja ne, joissa on enemmän tai yhtä suuri kuin mediaani mikroRNA-126 ekspressiotasot (mediaani: 0,654). Potilaat, joilla on alhainen microRNA-126 ilmaisu oli merkittävästi huono elinaika verrattuna korkean microRNA-126 lauseke (välineet elinaika (kk): 24,392 ± 1,055 vs. 29,282 ± 1,140, ​​

P

= 0,005) .

Kuten on kuvattu taulukossa 2, havaittiin, että ekspressiotasot mikroRNA-126 ei korreloinut sukupuolen, iän, histologinen tyyppi, tai vaihe kasvaimen kohortin 442 NSCLC tapauksissa . Potilaat jaettiin kahteen ryhmään niiden microRNA-126 ekspressiotasot: ne, joissa on vähemmän kuin mediaani mikroRNA-126 ekspressiotasot ja ne, joissa on enemmän tai yhtä suuri kuin mediaani mikroRNA-126 ekspressiotasot (mediaani: 0,654). Kuitenkin Kaplan-Meier selviytymisen analyysi osoitti, että potilailla, joilla on alhainen microRNA-126 ekspressiotaso oli merkittävästi huono elossaoloaika verrattuna korkean microRNA-126 ekspressiotason (välineet elinaika (kk): 24,392 ± 1,055 vs. 29,282 ± 1,140

P

= 0,005) (kuvio 3C). Coxin monimuuttuja suhteellinen vaara regressioanalyysi osoitti myös, että alhainen microRNA-126 ekspressiotasot olivat merkittävästi epäsuotuisa ennustetekijä (riskisuhde 0,782; 95% CI, 0,647 0,945) (taulukko 3).

Geneettinen Variant sisällä MicroRNA-126 ei liity syöpäriski ja Survival Time pienisoluista keuhkosyöpää

sekvensoitiin genomi-DNA-segmenttejä, mukaan lukien pre-miR-126 ja sen vastaavan reunustavat alueet (± 200 emäsparia) in 442 pienisoluista keuhkosyöpää ja 543 verrokkiin. Kolme SNP, kuten rs78242242, rs4636297and rs1140713, tarkastettiin segmenteille. Esillä olevassa tutkimuksessa, rs78242242 ja rs1140713 ei analysoitiin tilastollisesti erittäin alhaisen taajuuden (tuloksia ei ole esitetty). Genotyyppi jakautuminen SNP (G A, rs4636297) kontrolleissa oli myönnetään Hardyn-Weinberg tasapaino (

P

= 0,336), eikä ollut mitään yleistä eroa genotyyppi jakaumia tapausten välillä ja kontrolleina (taulukko 4). Kaplan-Meier eloonjäämisennusteet osoitti, ettei ollut yhdistyksen välillä rs4636297 ja elinaika in NSCLC potilailla (

P

= 0,992) (kuvio 4A). Coxin monimuuttuja suhteellinen vaara regressioanalyysi osoitti myös, että rs4636297 ei liittynyt eloonjäämisaste NSCLC potilaiden (riskisuhde 0,995; 95% CI, 0,836-1,184) (taulukko 3). Olemme myös arvioineet, onko rs4636297 polymorfismi liittyi microRNA-126 ilmentymistä NSCLC ja tulokset osoittivat, että ei ollut merkittävää eroa kolmen genotyyppiryhmien (

P

= 0,972) (kuvio 4B).

(A) Genetic varianttia microRNA-126 ei ole liitetty selviytymistä kertaa. Kaplan-Meier selviytymisen arviot osoittavat, että ei ole yhdistyksen välillä SNP rs4636297 ja elinaika in NSCLC potilailla (

P

= 0,992). (B). Ekspressiotasot mikroRNA-126 NSCLC kudoksissa kolme genotyyppiä ovat samankaltaisia. MicroRNA-126-ekspressio määritettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä. Ei ollut merkittävää eroa kolmen genotyyppiryhmien (

P

= 0,972).

Keskustelu

Viime vuosina on havaittu, että poikkeava ilmauksia MikroRNA tärkeä rooli kasvaimen muodostumisessa ja kehittämiseen [26] – [28]. Tuumorigeneesiin ekspressiotasot joidenkin MikroRNA vähenevät syöpäkudoksissa. Tämäntyyppiset MikroRNA pidetään tuumorisuppressorigeeneille. Kasvain vaimennin MikroRNA yleensä ehkäisevät oncogenesis negatiivisesti säätelemällä onkogeenien tai geenejä, jotka ohjaavat solujen lisääntymistä, erilaistumista, muuttoliike ja apoptoosin [29], [30]. Tällä hetkellä, microRNA-126 ekspressiotaso vähentää merkittävästi eri tuumorikudoksissa, mukaan lukien NSCLC, paksusuolen syöpä, rintasyöpä ja mahasyövän [16] – [22], [31]. Näin ollen, microRNA-126 pidetään tuumorisuppressorigeeneille.

tiedot osoittivat, että yli-ilmentyminen mikroRNA-126 heikentynyt NSCLC-solujen lisääntymisen ja kasvaimen kasvu ksenografteissa malli nude-hiirissä. On yleisesti hyväksytty, että miRNA saavat aikaan toiminto vähen- tämisessä ilmentymistä niiden alavirran kohdegeenien. Aktivointi PI3K reitti johtaa solujen kasvua ja selviytymistä, joka edistää kasvaimen kasvua, metastasoitunut ja hoito vastarinnan NSCLC [32]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että PI3K-Akt-reitin keskeinen kasvaimia synnyttävän rooli asiakkuutta solujen lisääntymisen ja kasvainten kehittymiseen [33], [34]. Tämä reitti on näin ollen houkutteleva kohde varten syövän vastaisia ​​aineita. Perustuu bioinformatiikan analyysin ennustamiseen tavoitteiden mikroRNA-126,

PIK3R2

geeni valittiin mahdollisia kohteita mikroRNA-126. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että

PIK3R2

geeni oli välittömänä kohteena mikroRNA-126. Lisäksi microRNA-126 ilmentymistä sekä NSCLC solulinjoissa ja tuumorikudokset selvästi vähenivät verrattuna noncancerous soluja ja kudoksia. Tuloksemme aslo osoittivat, että yli-ilmentyminen mikroRNA-126 heikentynyt NSCLC-solujen lisääntymisen ja kasvaimen kasvu A549 ksenografteissa malli nude-hiirten vaikka sääntely PI3K-Akt signalointireitin. Nämä tiedot osoittivat, että menetys mikroRNA-126 ilmaisu voi käsittää kehittymistä ja etenemistä NSCLC. Yhdenmukainen näiden viimeisten havaintojen [22], tuloksemme osoittivat myös, että ekspressiotasot mikroRNA-126 ilmaisu korreloivat huono selviytyminen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaita.

Genetic variantit esiaste microRNA (pre-miRNA) tai miRNA kohdesivustot on osoitettu liittyvän riskin eri syöpiä. Jotkut tutkimukset osoittavat, että SNP pre-miRNA ollut tärkeä rooli ennustamiseen NSCLC selviytymisen ja alttius [35], [36]. Esimerkiksi miR-196a2 variantti homozygoottien oli 1,76-kertainen kohonnut riskisuhde (HR) epäsuotuisa eloonjäämisaste NSCLC [36]. Ei kuitenkaan polymorfismit havaittiin ennustetun sitoutumiskohdat 3’UTR on PIK3R2 varten mikroRNA-126. Niinpä teimme geneettistä yhdistys analyysi tutkia mahdollisia yhteyksiä SNP: iden sisällä mikroRNA-126 pelastautumiskoulutukseen ja herkkyydestä NSCLC. Tässä tutkimuksessa, huomasimme, että genotyyppi ja alleeli taajuuksilla mikroRNA-126 (G A, rs4636297) SNP: tä ei liittynyt riskiä ja eloonjäämisaste NSCLC. Aiemmissa raportissa assosiaatio rs4636297 ja rintasyövän riskiä ei ole havaittu [37]. Tuore tutkimus osoittaa, että rs4636297GG genotyyppi merkittävästi estää käsittelyn pri-miRNA ennalta miRNA, jolloin vähentää merkittävästi kypsän microRNA-126 ilmentymistä [38]. Vastaavasti, verrattuna villin tyypin G-alleelin, A-muunnos rs4636297 ei ole vaikutusta toisen rakenteen ennalta miR-126, vaan se vaikuttaa sekundaarirakenteen reunustavan alueen. Samaan aikaan vapaan energian AG-kasvatetaan A-alleelin variantti [37]. Kuitenkin microRNA-126 taso ei ollut merkittävää eroa kolmen genotyyppiryhmien meidän kohortissa 442 NSCLC tapauksissa. Tulokset osoittavat, että gremlins variantit microRNA-126 ei ole vaikutusta microRNA tasosta kasvain kudosten pienisoluista keuhkosyöpää. Vaikka tutkimuksessa havaittiin, että Ets-1 ja Ets-2 voi säädellä ilmentymistä mikroRNA-126 kohdistamalla ETS sitova tekijä genomialuetta ylävirtaan mikroRNA-126 ja

EGFL7

geenin endoteelisoluissa [39] , lisätutkimukset ovat tarpeen määritellä, ovatko edellä mekanismi edellyttää, että säätely alaspäin mikroRNA-126 in NSCLC.

Yhteenvetona tietomme osoittavat, että microRNA-126 on kasvain-vaimennin geeni NSCLC ja matalan microRNA-126 ilme on huomattavasti epäedullinen ennustetekijä pienisoluista keuhkosyöpää. Kuitenkin geneettiset variantit mikroRNA-126 ei liity NSCLC riskiä ja ennustetta. Lisäksi sääntelyn mekanismi mikroRNA-126 on vielä selvittämättä eri normaaleissa ja pahanlaatuinen kudosten. Siksi tarvitaan lisätutkimuksia tutkia kasvain tukahduttava toimintoja mikroRNA-126 in NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture, Study väestö- ja kirurgisista näytteistä

A549, H358, H1703, H460 ja SK-MES-1-ihmisen NSCLC linjat, normaali ihmisen keuhkoputken epiteelisolulinja (NL-20), saatiin American Type Culture Collection. Ihmisen NSCLC näytteet olivat peräisin 442 potilasta Chengdu Army General Hospital ja Sichuanin maakunnan Kansan sairaalan vuodesta 2008 ja 2010. Of 442 yksilöitä, 76 saatiin biopsialla 43 tapauksia vaiheen IV ja 33 tapausta vaiheen III, ja loput on saatu leikkaus. On 168 vieressä noncancerous keuhkojen kudosten 442 yksilöitä. Näyttämö on NSCLC perustuu American sekakomitean Cancer (AJCC) TNM System. Cancer-vapaa ohjaimet olivat kohortin 543 yksilöitä, joilla ei ollut ollut syöpä ja sovitettiin tapauksiin iän ja sukupuolen. Tutkimus hyväksyi Institutional Review Board Sichuan Academy of Medical Sciences Sichuanin maakunnan Kansan sairaalan West China Second University Hospital, Sichuanin yliopiston Chengdu Army General Hospital. Allekirjoitettu suostumus saatiin kaikki osallistujat tai potilaiden edustajia jos suoraa suostumusta ei saatu. Kukaan potilaista ei ollut saanut mitään hoitoa keuhkosyöpään ennen leikkausta. Tutkimus osallistujat tehtiin henkilökohtainen haastattelu saada tietoa demografiset piirteet ja elämäntapaan liittyvien tekijöiden, kuten tupakan käyttöä.

RNA ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia. Kokonais-RNA (100 ng) kutakin näytettä käytettiin cDNA-synteesin käyttäen käänteistranskriptioalukkeita varten microRNA-126 ja pieni nukleaarinen U6-RNA: ta. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen SYBR® Esisekoite Ex Taq ™ (TaKaRa Biotech Co.). qPCR Primer setti microRNA-126 (Cat.no.MQP-0101) ja U6 pieni ydin- RNA (Cat.no.MQP-0201) olivat Ribobio Co. MicroRNA-126 ja U6 pieni ydin- RNA vastaavasti määrällisesti käyttäen standardikäyrän ja tehdään kolme kertaa. U6 pieni ydin- RNA käytettiin normalisointia. Suhteellinen ekspressio laskettiin käyttäen yhtälöä: kappaletta (miR-126) /: sta (U6).

Cell Invasion määritys

transwell soluviljelykammion (Millipore, Bedford, MA, USA) päällystettiin Matrigel, kuivataan ja liuotetaan kasvualustalla 37 ° C: ssa. Solut jaettiin kolmeen ryhmään: kontrolliryhmään, PE-CMV ryhmän ja PE-Mir126 ryhmä. Transfektoidut solut PE-CMV tai PE-Mir126 nälkiinnytettiin seerumittomassa elatusaineessa ja suspendoitiin 1 x 10

6 /ml RMPI1640 väliaineessa 24 tunnin ajan ennen määritystä. 300 ui solususpensiota pantiin ylempään kammioon ja sen annettiin kulkeutua 24 tuntia 37 ° C: ssa. Suspendoituneen Media alemmassa kammiossa poistettiin. Solut, jotka olivat tunkeutuneet alapuolen suodattimen kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin Gimsa ratkaisu. Solujen lukumäärä, jotka läpäisivät huokosten läpi alempaan kammioon laskettiin alle faasikontrastimikroskoopissa.

soluproliferaatiomääritykset

Solut ympättiin 96-kuoppaisen levyn RMPI1640 10% FBS: ää ja 100 ug /ml penisilliiniä /streptomysiiniä ja 72 tuntia. Soluproliferaatiota hinnat määritettiin 3- (4, 5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT).

Vector konstruktit

fragmentti 398 bp pitkä joka sisältää 3’UTR

PIK3R2

monistettiin PCR: llä ja kloonattiin PMD-18T-vektoriin (Takara) käyttäen seuraavia alukkeita: eteenpäin, 5’ACTAGTTGCAGATTCAGGGCTTCTCT -3 ’, ja kääntää, 5’-AAGCTTCCTGTATGACCTTGGGCACT -3 ”. Sitten fragmentti alakloonattiin Spe I ja Hind III -kohdat alavirtaan lusiferaasin geenin pMIR-REPORT plasmidi (Ambion) tuottaa pMIR- PIK3R2-REPORT WT-plasmidi. Käyttämällä pMIR- PIK3R2-SELVITYS WT plasmidia templaattina, pMIR- PIK3R2-REPORT MT plasmidi, joka kantoi mutatoitunut

PIK3R2

3′-sekvenssin, täydentävässä sivuston siemenen alueen mikroRNA-126, oli generoidaan KOD -Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo, Japani) mukaan valmistajan protokollaa. Seuraavia alukkeita käytettiin: eteenpäin, 5′-TGCCATGCTTGTTATTGATATGATATAAAACATC -3 ’, kääntää, 5′-ACAAAACCTGCCTCCCAGCTCGTGGGGC -3’. Kaikki konstruktit varmistettiin sekvensoimalla.

Luciferase Reporter Gene Assay

A549-soluja viljeltiin 96-kuoppalevyillä, ja kotransfektoitiin pMIR- PIK3R2-REPORT WT-plasmidi (tai pMIR- PIK3R2-REPORT MT plasmidi), ja pE-Mir126 vektori (GeneSil Biotechnology Co., Ltd, Kiina) käyttäen lipofektamiinia 2000. Firefly ja Renilla lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin 48 tuntia transfektion jälkeen käyttäen Dual Luciferase Reporter Assay kit (Promega, USA) valmistajan protokollan. Kokeet suoritettiin kahtena rinnakkaisena ja toistettiin kolme kertaa.

Western Blot

Solut hajotettiin käyttäen RIPA-puskuria. Kokonaisproteiinista (20 ug) ajettiin 12% SDS-PAGE ja sen jälkeen siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) membraanille. Membraani blokattiin tris-puskuroidussa suolaliuoksessa Tween-20 (TBS-T), jossa on 3% BSA: ssa tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Sitten ne inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa ja sen jälkeen inkuboimalla HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita, yksi tunti huoneenlämpötilassa. Immunoreaktiivisia vyöhykkeitä tunnistettiin käyttämällä SuperSingal länteen pico kemiluminesenssisubstraatilla ja altistettiin X-säteet elokuvia.

Immunosytokemia

immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin 5 mm: n osa parafinoidut NSCLC kudoksissa ekspression määrittämiseksi of PIK3R2 ja Akt fosforylaation. Lyhyesti, estämiseksi ja endogeenisen peroksidaasin, kalvot inkuboitiin 10 min 3% H

2O

2, pestiin PBS: llä 5 minuutin ajan, ja sitten 30 minuutin ajan 3% vuohen seerumilla PBS: ssä. Levyjä inkuboitiin PIK3R2 ja fosfo-Akt (Ser473) -vasta-ainetta (1:250, Cell signaali teknologia) yön yli 4 ° C: ssa. Myöhemmät vaiheet tehtiin käyttämällä EnVision ™ Systems (DAKO). Värjäytyminen voimakkuudet pisteytetään ja edustettuina seuraavasti: Tulos 0: täysin negatiivinen näytteitä; Pisteet 1: valmistetaan enintään 10% positiivisista soluista; Pisteet 2: valmistetaan 11-50% on positiivisia soluja; Pisteet 3: valmistetaan 50% positiivisia soluja.

Nude Mouse ksenograftimallia

BALB /c nu /nu hiirille (4-5 viikon ikäisiä) hankittiin Institute of Experimental Animals, Sichuanin maakunnan Academy of Medical Sciences (Chengdu, Kiina). A549-soluja (1 x 10

6) suspensoitiin 100 ui PBS: ää ja injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen alueelle nude-hiirten. Jälkeen 10 päivää, tuumorit saavutti 5-10 mm halkaisijaltaan, ja hiiret jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään (5 hiirtä ryhmää kohti), Eläimet saivat kasvaimeen injektioita pE-Mir126 vektori, uE-CMV-vektori tai vastaavasti PBS: llä neljä kertaa päivinä 1, 3, 5 ja 7, joissa kokonaisannos 3 x 10

10 plaqueforming yksikköä (pfu) per kasvain. Kasvaimen mitat mitattiin 2 kertaa 5 päivän välein lineaarisella paksuus. Kasvaimen tilavuus (mm

3) laskettiin seuraavan kaavan mukaisesti: pituus x leveys

2/2. Kaikki hiiret lopetettiin humaanisti kolmantenakymmenentenä päivänä hoidon jälkeen, ja resektoitua kasvaimet punnittiin.

genotyypin

Variant rs2297882 genotyypitettiin sekvensoimalla. MicroRNA-126, mukaan lukien pre-miRNA monistettiin PCR: llä, Seuraavia alukkeita käytettiin monistamaan tuote: eteenpäin, 5’ATTGCCGTGTGGCTGTTAG-3 ’; käänteinen, 5’CATTGCACTGTCCACTCCTG -3 ”. PCR-tuotteet sekvensoitiin molempiin suuntiin koskevasta ABI3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Alukkeet PCR käytettiin myös sekvenssointialukkeiden.

Tilastot Analysis

taso mikroRNA-126 eri ryhmissä arvioitiin T-testillä. Liitot välinen NSCLC riskin ja SNP genotyyppiä arvioitiin monimuuttujasäätöjen logistinen regressio analyysejä. Survival laskettiin alkaen alustavan diagnoosin ja päättyy joko kuoleman tai Viimeisimmässä seurannassa. Eloon jäämisestä analysoitiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmällä, ja erot jakelun arvioitiin avulla log-rank-testi.