Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Monet miehet kehittää nouseva PSA jälkeen ensimmäisestä hoidosta eturauhassyövän. Vaikka jotkut näistä miehistä kehittyy paikallisen tai metastaattinen uusiutumisen joka oikeuttaa edelleen terapiassa, toiset ei ole näyttöä taudin etenemisestä. Oletimme, että ilmaus biomarkkereiden paneeli voi ennustaa, mitkä miehet nousevalla PSA hyötyisi edelleen terapiassa.

Menetelmät /Principal Havainnot

A case-control muotoilu käytettiin testaamaan yhdistyksen geenin lausekkeen tulos. Systeeminen (SYS) eteneminen tapaukset olivat miehiä jälkeisen eturauhasen joille kehittyi systeemisiä etenemistä 5 vuoden kuluttua PSA toistumisen. PSA etenemistä kontrollit sovitettu miesten post-prostatektomia PSA toistumisen mutta ei näyttöä kliiniseen etenemiseen 5 vuoden kuluessa. Käyttäen ilmaisua paneelit optimoitu parafinoidut kudoksen RNA, 1021 syöpään liittyvien geenien arvioitiin-lukien 570 geenit eturauhassyövässä etenemiseen. Geenit 8 aiemmin raportoitu markkeripaneelit olivat mukana. Systeemistä eteneminen malli, joka sisältää 17 geenit kehitettiin. Tämä malli tuotti AUC 0,88 (95% CI: +0,84-0,92). Samanlaisia ​​AUC luotiin käyttäen 3 aiemmin raportoitu paneelit. Vuonna toissijainen analyyseissä, malli ennusti päätepisteet eturauhassyövän kuolema (in SYS tapausta) ja systeemisen etenemistä 5 vuoden kuluttua (PSA tarkastuksiin) riskisuhteita 2,5 ja 4,7, vastaavasti (log-rank p-arvot 0,0007 ja 0,0005). Geenit kartoitettu 8q24 merkittävästi rikastettu mallissa.

Johtopäätökset /merkitys

Erityisiä geeniekspressiomalleja liittyvät merkittävästi systeemisiä etenemisen jälkeen PSA uusiutumisen. Mittaus geeniekspressiomalli voivat olla hyödyllisiä mitkä miehet voivat hyötyä lisähoitoa jälkeen PSA toistumisen.

Citation: Nakagawa T, Kollmeyer TM, Morlan BW, Anderson SK, Bergstralh EJ, Davis BJ, et al . (2008) kudoksen biomarkkereiden Panel ennustaminen systeeminen Eteneminen jälkeen PSA uusiutuminen Post-Lopulliset Eturauhassyöpä Therapy. PLoS ONE 3 (5): E2318. doi: 10,1371 /journal.pone.0002318

Editor: Anja-Katrin Bielinsky, University of Minnesota, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 joulukuu 2007; Hyväksytty: 12 maaliskuu 2008; Julkaistu: toukokuu 28, 2008

Copyright: © 2008 Nakagawa et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat P50 CA91956 Mayo Eturauhassyöpä SPORE avustusta NIH, ja Richard M. Schulze Family Foundation. Se tukee myös Minnesotan TE- valtion lainsäädäntö- määräraha Minnesota Partnership for Biotechnology ja Medical Genomics. Tooru Nakagawa tukivat osittain Grant-in-tuki kolmannen Term Kattava 10-Year strategia Cancer Control terveysministeriön, Labour and Welfare of Japan.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet että ei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

suurin osa miesten eturauhassyövän nyt diagnosoitu syöpiä, jotka on alhainen riski aiheuttaa kuolleisuutta [1]. Nämä miehet hoidetaan yleensä radikaalin retropubic eturauhasen (RRP), ulkoinen säde sädehoidon tai interstitiaalinen brakyhoidoksi ja sitten seuraa säännöllisesti seerumin PSA arviointeja. Seuraavan 5-10 vuotta ajanjakson, 15-30% näistä miehistä kehittyy nouseva PSA [2] – [6], jossa määritellään nopeasti kasvavan väestön suurten kliinisten ja kansanterveydellistä merkitystä. Tästä PSA uusiutumisen ryhmä jotkut miehet on paikallisen uusiutumisen tai on kliinisesti havaittavissa etäpesäke, mutta monet ei ole muuta todistetta uusiutuvasta eturauhassyöpää kuin nouseva PSA. PSA ”kaksinkertaistaa aika” on todettu mahdollinen korvike syy aiheuttamaa kuolleisuutta, ja jota jotkin lääkärit mitkä miesten PSA uusiutumisen ansaitsevat adjuvantti hormonaalista ablaatio, paikallinen sädehoito, tai yksinkertainen havainto [4] – [6 ]. Ennakoivia biomarkkereita, mikä näistä miehistä hyötyisi mahdollisista lisähoitoa tarvitaan.

Laajamittaiset geeniekspressiotutkimuksissa prostatasyövistä eri luokan ja vaiheen on suorittanut useat ryhmät [7] – [16]. Nämä ilme tutkimuksissa on käytetty matriisia sisältävä anturi sarjaa jopa 35000 geenejä. Vaikka nämä tutkimukset ovat tärkeitä biomarkkereiden löytö, useita ongelmia estä niiden käännös clincial ympäristössä. Ensimmäinen, on todennäköistä, että pienemmät paneelit käytetään kliinisesti. Toiseksi, koska aiemmat tutkimukset vaaditaan jäädytetty materiaali, määrä näytteitä analysoidaan oli rajallinen. Kolmanneksi, koska kliinisiä haittatapahtumia eturauhassyöpäpotilailla vaativat pitkiä seurannassa, testausmenetelmien on voitava soveltaa arkistointia parafinoidut materiaalia. Lopuksi, mikään edellisistä tutkimuksista keskittyi kehittämään biomarkkereiden paneelin ennustaa eturauhassyövän systeemistä etenemistä asettaminen PSA toistumisen.

Käyttämällä Mayo Clinic Radical Retropubic prostatektomia (RRP) rekisteri, suunnittelimme sisäkkäisiä tapauskontrollitutkimuksessa testata hypoteesia, että vain joitakin RNA ilmaisun biomarkkereiden voi ennustaa, mitkä miehet nousevalla PSA jälkeinen OVH voisi saada lisää kliinisiä intervention. Illumina DASL ™ ekspressio microarray alustan valittiin biomarkkerina mittausmenetelmä, koska se mittaa ilmentymistä geenin tavoitteet käyttäen parafiiniin kudoksissa [17] – [19]. Käyttämällä ekspressiotietojen kirjallisuudesta ja johdettu oman tutkimusohjelman kehitimme rajoitettua ilmaisun markkereita, jotka todennäköisesti muuttua yhdessä eturauhassyövän etenemiseen. Paneeli myös ilmaisua biomerkkiaineissa useita muita aiemmin julkaistu paneelit, jotka liittyvät korvikkeita (korkea Gleason Pisteet, korkea pathologic vaiheessa tai etäpesäkkeitä) eturauhassyövän aggressiivisuuden [12] – [16].

Raportoimme että array-pohjainen mittaukset osoittivat erinomaista korrelaatiota kvantitatiivinen RT-PCR mittaukset parafiinin johdettujen RNA: iden. Raportoimme myös erinomainen sisäinen array muun-array ja sisällä geenin toistettavuus. Sitten kuvataan testaus ja validointi geenin ekspressiokudos biomarkkereiden paneeli ennustamiseen eturauhassyövän systeemisen etenemisen jälkeen nouseva PSA jälkeen eturauhasen. Me vertailla meidän paneelin muiden aiemmin julkaistu paneelit. Lopuksi osoitamme, että yli-ilmentyminen geenien kartoitettiin kromosomiin bändi 8q24 liittyy eturauhassyöpään systeemistä etenemiseen.

Methods

Gene valinta ja Array Design for DASL ™ Assay

Kaksi Illumina DASL ilmaisun mikrosiruja hyödynnettiin kokeissa.

standardi kaupallisesti saatavilla Illumina DASL ilmaisun microarray (Cancer Panel ™ v1), joka sisältää 502 onkogeenien, kasvainten synnyssä ja geenien niihin liittyvät väyliä. Seitsemänkymmentäkahdeksan tavoitteista kaupalliseen array on liittynyt eturauhassyövän etenemiseen.

Custom Illumina DASL ™ ilmaisun microarray sisältävän 526 geenikohteet varten RNA: t, mukaan lukien geenit, joiden ilmentymistä on muuttunut yhdessä eturauhassyövän etenemiseen . Koettimet mukautetun DASL® paneeli suunniteltiin ja syntetisoitiin Illumina, Inc. (San Diego, CA).

neljä erilaista eturauhassyövän aggressiivisuuden geenit mukana tutkimuksessa (jos geenit eivät harjoittaneet Cancer Panel v1 array, ne sisältyivät suunnittelussa mukautetun array):

Merkit eturauhassyövän aggressiivisuuden tunnistetaan Mayo /University of Minnesota Partnership [20]: ilmaisu profiilit 100 laser-capture mikropaloitelluista eturauhassyöpä vaurioita ja vastaaviin normaaleihin ja BPH ohjaus vauriot analysoitiin Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 mikrosiruja. Sijalla luettelot merkittävästi yli- ja ilmaisi geenien verrattiin 10 Gleason 5 ja 7 etäpesäkeleesioita 31 Gleason 3 syöpä vaurioita syntyi. Top 500 geenit tähän luetteloon verrattiin luetteloita syntyy ennen ilmaisun microarray tutkimuksia ja muuta merkki tutkimukset eturauhassyövän (katso 2-4 seuraava). Tämän analyysin jälkeen oli tilaa 204 uusia kohteita mahdollisten yhdessä aggressiivinen eturauhassyöpä mukautetun array.

Merkit liittyy eturauhassyöpään aggressiivisuus julkisesti saatavilla ilmaisun microarray aineistot (esim EZH2, AMACR, hepsiinin, PRLz, PRL3): Kun suunnittelimme jono riittävän suuria aineistoja 9 ennen microarray tutkimuksia eturauhassyövän vaihtelevia laadut ja metastaattista potentiaalia [7] – [15] oli saatavilla Oncomine internet-sivuston [21], [22], www.oncomine .org. Vuodesta määräsi luettelot näiden tietojen valitsimme 32 geenit sisällytettäväksi jono.

Aiemmin julkaistut merkkiaineita, jotka liittyvät eturauhasen syöpään aggressiivisuus (esim PSMA, PSCA, Cav-1): Expression microarray data on myös julkaistu. Tämä kirjallisuus arvioitiin kudoksiin biomarkkereita. Esimerkiksi ajankohtana array suunnittelu pystyimme tunnistamaan 13 laadukkaita ilmaisun microarray tutkimuksia eturauhassyövän aggressiivisuuden (Katso taulukot S1 ja S2 täydellinen viite luettelo). Lisäksi joukossa 13 raportteja, 5 esitelmät 8 lauseke biomarkkereiden paneelit ennustaa eturauhassyövän aggressiivisuuden [12] – [16]. Kun sopiva koettimia sopiva DASL kemian voitaisiin suunnitella näille kentille ne sisältyivät mukautetun array. Havaitsimme myös 12 artikkeleita tarkastellaan liittyvien geenien eturauhassyöpään. Nämä kriteerit tuloksena valittiin 150 geenien.

Merkit johdettu Mayo SPORE tutkimus (mukaan lukien geenit ja EST kartoitettu 8q24). Ninety-kolme ylimääräistä biomarkkerit todettiin (katso taulukot S1 ja S2).

Custom array myös koetin sarjat 45 geenejä, joita ei odoteta eroa tapauksessa ja kontrolliryhmien perustuvat Mayo /University Minnesotan Partnership tietoja. Kolmekymmentäkahdeksan näistä geeneistä oli myös läsnä kaupallinen array (katso taulukot S1 ja S2).

Kun luetellaan mahdollisesti eturauhassyöpä asiaa geenien kaupallisesti saatavilla syöpä paneeli 570 mahdollisesti eturauhassyöpä asiaa geenien ja 451 muut syöpään liittyvien geenien arvioitiin sekä kautta paneelit.

suunnittelu sisäkkäisiä tapauskontrollitutkimuksessa

tässä tutkimuksessa otokseen yksilöitä Mayo Clinic OVH Registry. Rekisterin koostuu väestöstä miehiä, jotka saivat eturauhasen ensimmäiseksi hoito eturauhasen syöpä Mayo Clinic (Tämänhetkinen kuvaus ja käyttö rekisterin; katso viite [23]). Koska systeeminen eteneminen on suhteellisen harvinaista, suunnittelimme tapauskontrollitutkimuksessa sisäkkäin kohortin miesten nouseva PSA. Vuosina 1987-2001, osallisuutta, 9989 aiemmin hoitamattomien miesten oli RRP Mayo. Seurannasta, 2131 kehitti nouseva PSA ( 30 päivän kuluttua RRP) ilman samanaikaista kliinisen toistumisen. PSA nousua määriteltiin seurantaa PSA = 0,20 ng /ml, ja seuraavaksi PSA vähintään 0,05 ng /ml suurempi tai hoidon aloittamista varten PSA toistumisen (potilaille, joiden seuranta PSA oli riittävän korkea kattamaan hoitoon). Tämä ryhmä 2131 miesten käsittää taustalla kohortti josta SYS tapauksissa ja PSA valvonta valittiin.

5 vuoden kuluessa PSA nousu, 213 miestä kehitti systeeminen etenemistä (SYS tapausta), määritellään positiivisena luukuvaus tai CT skannata. Näistä 100 miestä sortunut Eturauhassyöpätutkimuksessa-erityisiä kuoleman, 37 kuoli muista syistä ja 76 pysyvät vaarassa.

PSA toistumisen ehkäiseminen (213) on valittu niistä miehillä systeemistä etenemistä 5 vuoden kuluttua PSA nousu ja sovitettiin (1: 1) syntymävuosi, kalenterivuosi PSA nousu ja alustava diagnostisia patologinen Gleason ( = 6, 7 +). Kaksikymmentä näistä miehistä kehittyi systeemisiä etenemiseen yli 5 vuoden kuluttua alkuperäisen PSA nousu ja 9 sortunut Eturauhassyöpätutkimuksessa-erityisiä kuolema.

Joukko 213 mitään tautiin (NED) Progression kontrollit myös valittu Mayo Clinic OVH rekisteri 9989 miesten ja käyttää joitakin vertailuja. Nämä tarkastukset oli OVH iältään 1987-1998 ilman näyttöä PSA nousta sisällä 7 vuotta RRP. Mediaani (25

th, 75

persentiili) seuranta päässä OVH oli 11,3 (9,3, 13,8) vuotta. Ned kontrollit sovitettu systeemisen etenemistä tapauksissa syntymän vuoden, kalenterivuoden RRP ja alkuperäisen diagnostisia Gleason pisteet. Automaattisia optimaalinen sovitus toteutettiin minimoida toimintaan ”matkalla” tapausten ja kontrollien välillä kannalta summa absoluuttinen ero matching tekijät [24].

Nykyinen tutkimus hyväksyi Institutional Review Board of Mayo Clinic.

Block tunnistaminen, RNA: n eristäminen, ja Expression Analysis

luettelo 639 tapausten ja kontrollien oli satunnaistettu. Yritettiin tunnistamaan kaikki käytettävissä lohkojen (kuten ilmeisesti normaalin ja epänormaalin imusolmukkeiden) päässä satunnaistettiin luettelosta 639 oikeutettuja tapauksissa ja valvontaa. Ylläpito satunnaistamista, kukin käytettävissä lohko arvioitiin kudoksen sisältöä patologia lue ja lohko sisältää dominoivan Gleason kuvio syöpä valittiin RNA: n eristämistä.

neljä juuri leikattu 10 um osia FFPE kudosta poistettiin parafiini ja Gleason hallitseva syöpä painopiste oli macrodissected. RNA uutettiin käyttäen High Pure RNA Parafiini Kit Roche (Indianapolis, IN). RNA kvantitoitiin käyttäen ND-1000 spektrofotometrillä peräisin NanoDrop Technologies (Wilmington, DE). RNA: t, mukaan lukien sisäiset levy ja muun levyn replikaatissa, jaettiin 96-kuoppalevyille satunnaistetussa jotta DASL analyysiä.

RNA-näytteet käsiteltiin, hybridisoitiin Sentrix Universal 96-Arrays, skannata BeadArray lukija, ja data aluksi käsitellään BeadStudio mukaan valmistajan ohjeiden. Microarray data on saatavilla GEO tietokannasta (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/hakunumero GSE10645).

arvioimiseksi tarkkuutta geeniekspressiotasot määrittelemän DASL teknologian teimme kvantitatiivinen SYBR Green RT-PCR-reaktioissa 9 valittu ”tavoite” geenejä (CDH1, MUC1, VEGF, IGFBP3, ERG, TPD52, YWHAZ, FAM13C1, ja Sivu4) ja 4 yleisesti käytettyjä Endogeenisen ohjaus geenien (GAPDH, B2M, PPIA ja RPL13a) 384-kuoppalevyille, joissa käytetään Prism 7900HT välineiden (Applied Biosystems, Foster City, CA). 210 RNA-näytteet runsaasti RNA ryhmästä koko 639 potilasta analysoitiin. Koska RNA pulaa, vain 77 näytettä analysoitiin Sivu4. mRNA käänteistranskriboitiin Superscript III First Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen, Carlsbad, CA) käyttäen sattumanvaraisia ​​heksameerejä. Kullekin yhdeksästä geenien tutkittu, syklin kynnys (Ct) määritettiin kolmena kappaleena ja ilmaisun normalisoitiin suhteessa Neljä viite geenien.

Patologian Review

Gleason pisteet Mayo Clinic OVH Registry määriteltiin alkuperäisessä Gleason pisteet. Koska on tapahtunut muutoksia patologisen tulkinnassa Gleason ajan, yksi patologi (JCC) tarkisti Gleason pisteet kunkin lohkon valittu ilmentymisanalyysiä. Tämä kliininen muuttuja määriteltiin tarkistetussa Gleason pisteet.

Statistical Methodology

kerääminen geenien ilmentyminen tietojen yritettiin varten 623 potilasta kuvatulla tulokset. Näistä oli 596 (n

SYS = 200, n

PSA = 201, n

NED = 195) potilailla, joille tiedot on kerätty, loput on jättänyt yhden tai molempien ilmentymisen paneelien kuvatulla tulokset. Varmistaa valinnan samanlaista koulutusta ja validointi sarjaa, 100 tapaus-verrokki-ohjaus kohortteja koostuu 133 satunnaisesti valitun SYS potilaat (kaksi kolmasosaa 200 koulutus) sekä niiden Hyväksytty PSA ja NED valvonta valittiin ehdotettu koulutus asetettu. Loput tapaukset ja verrokit käsitellään ehdotetun validointi asetettu. Kliiniset muuttujat testattiin riippumattomia toisistaan ​​tarjotun koulutuksen ja validointi asettaa erikseen SYS tapauksissa ja PSA valvontaa. Diskreetti kliiniset tekijät (sairauden vaihe, hormonihoito adjuvantti RRP, sädehoitoa adjuvantti RRP, hormonihoidon adjuvantti PSA toistumisen, ja sädehoidon liitännäishoitona PSA toistumisen) testattiin käyttämällä Chi-square analyysi. Jatkuva kliininen muuttujat (Gleason (uudistettu), ikä PSA toistumisen, ensimmäinen nouseva PSA-arvo, toinen nousu PSA-arvo, ja PSA kaltevuus) testattiin käyttämällä Wilcoxonin summaa. Kuusi sata satunnaisesti näytteitä sarjaa ole osoittanut riippuvuutta minkään kliinisen muuttujan on 0,2 tasolla, ja ensimmäinen näistä valittiin opetusjoukolla: 391 potilasta (n

SYS = 133, n

PSA = 133, n

NED = 125). Tämä varattu 205 potilasta validoimiseksi set (n

SYS = 67, n

PSA = 68, n

NED = 70).

Raakadataa BeadStudio normalisoitiin käyttäen syklistä lössi (fastlo) [25].

koulutus analysoitiin käyttämällä satunnaisia ​​metsien [26] käyttäen R versio 2.3.1 (https://www.r-project.org) ja randomForest versio 4,5-16 ( https://stat-www.berkeley.edu/users/breiman/RandomForests). Aineisto analysoitiin paneeli (Cancer, Custom ja fuusio, jossa Yhdistetty oli Syöpä ja Custom tiedot käsitellään yhtenä array). Testaamalla

ntree

parametrin randomForest funktion olemme todenneet, että 4000 satunnaisesti metsät oli riittävä tuottamaan vakaa luettelo markkereita. Top markkereita lajitellaan merkitys joita randomForest ohjelma yhdistettiin eri yhdistelmiä kliinisten muuttujien logistisen regressiomallin R-ohjelman (glm () perheen = binary (logistisen malli), jossa glm viittaa yleistynyt lineaarinen malli). Tuloksena pisteytyksen toiminto sitten analysoitiin Receiver Operating Characteristic (ROC) menetelmät ja cut-off valittiin sen on oletettu yhtä rangaistus vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia. Katsaus mallien sallitun osajoukko markkereita voidaan tunnistaa, ja osajoukko tukevat kliinisten tietojen tunnistettu. Useita ominaisuuksia mallissa määritettiin loman 1/3 ulos Monte Carlo Cross Validation (MCCV) käyttäen 100 toistojen. Useita ominaisuuksia valittiin maksimoimaan AUC ja minimoida satunnaisvaihtelun mallissa. Lopullinen mallia sovellettiin sitten 391 potilaalle opetusjoukolla ja varattu 205 potilasta validointi asetettu. Vertailun vuoksi muut aiemmin raportoitu geeniekspression malleja testattiin myös koulutusta ja validointi sarjaa [12] – [16].

Vertasimme aiemmin raportoitu malleja niiden luokittelu potilaiden kohdalla tunnetut PSA toistumisen ohjaus ja SYS etenemisen tapauksessa ryhmiä. Käytimme Cramerin V-tilaston [27] vertailla malleja.

Tulokset

Tutkimusasetelma /parafiiniblokkiin Recovery /RNA: n eristäminen ja Expression Panel Success

Lyhyesti, sisäkkäisiä tapauskontrollitutkimuksessa suoritettiin käyttäen suurta, hyvin määritelty kohortin miesten nousevan PSA seuraavien OVH (kuva S1). SYS tapaukset olivat 213 miestä, joille kehittyi systeemisiä eteneminen on vähintään 90 päivää ja 5,0 vuoden kuluttua PSA nousun. PSA kontrollit olivat satunnaisotannalla 213 miestä, jotka olivat 5 vuotta post-RRP PSA toistumisen mutta ilman näyttöä lisää kliinistä etenemistä. NED kontrollit olivat satunnaisotannalla 213 miestä, jotka olivat 7 vuotta jälkeistä OVH ilman PSA nousu (vertailemista PSA säätimet NED ohjaa-esitellään seuraavassa paperi). SYS tapauksissa ja PSA kontrollit sovitettu (1: 1) ja syntymävuosi, kalenterivuosi PSA nousua, ja alustava patologinen Gleason ( = 6 vs. = 7). Luettelo tukikelpoisten tapausten ja kontrollien oli randomizeed sokeille toteamiseen lohkojen eristys RNA ja suorituskyvyn ilmaisun array kokeita.

Taulukko 1 on yhteenveto jakautuminen kliinisten parametrien välillä SYS tapauksissa ja PSA ja NED kontrolliryhmiin. Ei ollut merkitsevää eroa ryhmien välillä matching muuttujien (ei ollut merkittävää eroa alkuperäisen diagnostisten Gleason kun = 6 ja 7 ryhmien-matching kriteerit-verrattiin). Vertailu alkuperäisen diagnostisten Gleason pisteet tarkistetun Gleason tulokset paljastivat, että Gleason tulokset ovat kasvaneet ajan myötä. Lisäksi osuus Gleason 8-10 kasvainten lisääntynyt vertaamalla NED ohjaa PSA valvontaa, ja PSA ohjaimia SYS tapauksiin. Tarkistettu Gleason pisteet käytettiin kaikissa biomarkkerin mallinnus.

Kaikki parafinoidut korttelin päässä oikeutettuja miehiä tunnistettiin ja kunkin lohkon kartoitettiin kudosten läsnä (ensisijainen ja toissijainen Gleason syöpä alueilla, normaali ja metastaattinen imusolmukkeiden, jne.). Me macrodissected hallitseva Gleason malli alue ja yrittivät eristää RNA. Illumina Syöpä Panel ™ ja mukautettuja eturauhassyövän paneeli DASL array analyysit suoritetaan sitten RNA näytteitä. Menetelmät-osiossa ja taulukot S1 S2 kuvaavat koostumusta syövän paneelin ja suunnittelu mukautetun paneelin.

Taulukossa 2 on yhteenveto lopullista lohko saatavuus, RNA eristys onnistumisprosentti ja onnistumisastetta ilmaisun array analyysit. Niistä 639 sopivaa potilasta, lohkot olivat saatavilla 623 (97,5%). RNA eristettiin ja DASL määritykset onnistuneesti suoritettu suuri osa potilaista /yksilöt käyttökelpoinen RNA valmistettiin kaikista 623 lohkot ja Cancer Panel ja mukautettuja paneeli DASL paneelit olivat molemmat onnistuneita (toistettuasi jotkut yksilöt-katso alla) on 596 RNA yksilöt (95,7% RNA: iden, 93,3% suunnittelun potilaista). Vain 9 (1,4%) RNA näytteistä ei molemmat paneelit. Ensisijainen syy näihin epäonnistumisiin oli huono RNA laatu-mitattuna qRT-PCR on RPL13a geeniekspression [19]. Niistä 1246 alkuperäistä näytteet toimivat sekä paneelien, 87 (7,0%) yksilöitä epäonnistui. Nämä yksilöt, joille oli jäljellä RNA toistettiin onnistumisprosentti on 77,2% (61 79 näytettä).

Expression Analysis toistettavuus

Samanlaiset analyysitulokset (kuva S2), RT-PCR vertailuja (kuva S3) ja yksilöiden välisiä ja paneeli geeniekspression vertailuja kuvataan tulokset S1.

erityisiä Gene Expression tulokset Vertaamalla systeeminen Progression Kohorteissa PSA uusiutuminen eikä näyttöä Progression Kohorteissa

Univariate analyysit geenin.

Koska DASL määrityksessä esiintyi tuottaa tarkkoja ja toistettavia tuloksia, array data tutkittiin geenejä, joiden ekspressio on muuttunut merkittävästi, kun SYS tapauksissa verrattiin PSA valvontaa . Tämän alustavan analyysin DASL geenin ilmentyminen määritettiin olevan keskimäärin ajan kolme koettimia kunkin geenin kunkin matriisin. Kun univariate analyysi (kaksisuuntainen t-testi) anturin keskimääräisiä ja fastlo normalisoitu data [25], 68 geenit olivat erittäin merkitsevästi ali- tai ilmaistu SYS tapauksissa versus PSA (p 9,73 x 10

-7, Bonferronin korjaus p 0,001) (taulukko 3). Sata kaksikymmentäkuusi geenit olivat merkitsevästi ali- tai ilmaistu SYS tapauksissa verrattuna PSA (p 4,86 ​​x 10

-5, Bonferronin korjaus p 0,05). Taulukossa S3 tarjoaa täydellisen geenin mukaan järjestettyä listaa p-arvo. Kuvio 1 esittää yhdeksän geenit huomattavasti eri ilmaisua SYS tapauksissa ja PSA valvontaa.

P-arvot (t-testi) varten SYS asia /PSA-ohjaus vertailu on esitetty. Kontrollit ilman näyttöä taudin uusiutumisen (NED) ovat myös mukana.

systeeminen Progression Prediction Malli kehittäminen ja testaaminen on Training joukko.

tilastollinen malli ennustaa systeeminen etenemistä (ja ilman kliinisiä muuttujat) käyttäen koeryhmä kehitettiin käyttämällä satunnaisia ​​metsien [21] ja logistinen regressio menetelmät kuvatulla tavalla. Koulutuksen tulokset analysoitiin paneeli (syöpä, mukautettu ja sulautuneen), jonka geeni (keskiarvo lauseke kaikkien geenien koettimia), ja yksittäisten koettimia. Taulukossa 4 15 geenit ja 2 yksittäiset koettimet valittiin lopulliseen malliin.

Taulukko 5 ja kuvio 2A yhteenveto alueilla käyrän (AUC) kolme kliinisissä malleissa, lopullinen 17 geeniä /koetin malli ja kliinisten anturi malleja. Muuttujat kliinisissä malleissa (taulukko 6) perustuivat saatavilla kliinistä tietoa. Kliiniset malli A sisältyi tarkistettu Gleason ja patologinen vaiheessa (tiedot saatavilla heti RRP). Lisääminen diagnostisten PSA ja ikä leikkausta ei merkittävästi lisätä AUC ja jätettiin pois tämän mallin (tietoja ei esitetty). Kliiniset malli B lisättiin ikä leikkauksen, ennen leikkausta PSA-arvo, ja mikä tahansa adjuvanttia tai hormonihoito 90 päivän kuluessa OVH (tietojen jälkeen OVH mutta ennen PSA toistumisen). Kliiniset malli C lisättiin ikä PSA toistumisen, toinen PSA taso heti PSA toistumisen, ja PSA kaltevuus (tiedot aikaan PSA uusiutumisen).

. Koulutuksen asetettu AUC kolmen kliinisissä malleissa, lopullinen 17 geenin /sondimalli ja kliinisten /17 geenin /sondimalli. B. validointi asetettu AUC kolmen kliinisissä malleissa, lopullinen 17 geenin /sondimalli ja kliinisten /17 geenin /sondimalli. C. koulutus asetettu AUC 4 aiemmin raportoitu geeniekspression malleja eturauhassyövän aggressiivisuuden verrattuna kliiniseen malli C yksin ja 17 geenin /sondimalli. D. validointi asetettu AUC 4 aiemmin raportoitu geeniekspression malleja eturauhassyövän aggressiivisuuden verrattuna kliiniseen malli C yksin ja 17 geenin /sondimalli. Jotta selitys kliinisissä malleissa katso taulukko 6. (E ja F) vertailu koulutus ja validointi asettaa AUC kullekin mallin. E. AUC on kunkin geenin /anturi malleja yksin. F. AUC kunkin geenin /anturi malleja, kun mukaan kliinisen mallin C.

Käyttämällä training set kliiniset mallit A, B ja C yksin oli AUC-arvot 0,74 (95% CI 0,68-0,80), 0,76 (95% CI ,70-+0,82) ja 0,78 (95% CI 0,73-0,84), vastaavasti. 17-geeni /sondimalli yksin oli AUC 0,85 (95% CI +0,81-,90). Yhdistettynä 17 geenin /sondimalli, kliininen mallit A, B ja C oli AUC 0,86 (95% CI 0,81-0,90), 0,87 (95%: n luottamusväli 0,83-0,91) ja 0,88 (95% CI 0,84-0,92) vastaavasti. Testasimme myös 19 geenin mallin, joka lisätään TOP2A ja surviviinista (BIRC5) ja the17 geeni /sondimalli. Kun lisäksi näiden kahden geenin ei parantanut ennustamista systeemisen etenemisen harjoitussarjassa (tuloksia ei ole esitetty).

paneelit valittiin sisältämään koetinsarjojen useiden aiemmin julkaistu eturauhasen aggressiivisuus mallit [12] – [ ,,,0],16]. Taulukossa 5 on yhteenveto AUC array ilmaisun tulokset näiden biomarkkereiden malleissa. Kuvio 2C havainnollistaa AUC neljä näistä malleista sopivan vertailu kliinisen malli C ja 17 geenin /sondimalli. Jokainen näistä malleista syntyy AUC, jotka olivat pienempiä kuin mallissa olemme kehittäneet. Kuitenkin useat malleja syntyy AUC (esim Lapointe ym. 2004 toistuminen, Yu ym. 2004, ja Singh et al. 2002 malleissa), jotka olivat sisällä tai lähellä 95% luotettavuusrajat meidän AUC opetusjoukolla arvioihin.

mallien testaaminen on Validation Set.

sitten soveltanut 17 geenin /sondimalli ja toinen aiemmin julkaistu mallien varattu 205 potilasta validointi setti (kuviot 2B ja 2D). Kuvio 2E vertaa opetusjoukolla ja validointi asettaa AUC: n kunkin geenin /anturi malleja. Kanssa lukuun ottamatta Glinsky et al. 2004 Allekirjoitus 1, kaikki geenin /anturi malleissa oli huomattavasti pienempi AUC validointi asetettu verrattuna opetusjoukolla. Kuvio 2F verrataan koulutus ja validointi asettaa AUC kunkin geenin /anturi malleja luettuna kliininen malli C. Kun 17-geeni /sondimalli ja kolme aiemmin julkaistu malleja (jäljempänä LaPointe ym. 2004 toistuminen, Yu ym. 2004 ja Glinsky ym. 2005 malleissa) ylitti kliinisen mallin yksin, oli AUC merkittävästi alhaisemmat validointi asetettu verrattuna opetusjoukolla.

Vertasimme myös malleja niiden luokitteluun potilaita tunnetun PSA toistuminen ohjaus ja SYS etenemisen tapauksessa ryhmiä. Taulukossa S4 yhteenveto Cramerin V-tilaston [27] eri mallit ja sisältää täydellisen ennustajan ( ”totuus”) mallia suoraan arviointiin malleja. Lyhyesti, Cramerin V-tilaston vaihteli 0,38-0,70. Pienin Cramerin V-tilastoa oli välillä todellinen tila (täydellinen ennustaminen) ja Glinsky et al. 2005 malli kliinistä tietoa. Korkeimmat Cramerin V-arvo oli välillä 17 geenin /sondimalli ja Singh et al. 2002 malli, sekä kliinistä tietoa. Suurin osa malleista on luokiteltu samaan potilaita tunnetut ryhmät (esimerkiksi luokittelemalla potilaan PSA kontrolliryhmässä kuin PSA toistumisen ja potilaan SYS tapauksessa ryhmään kuin systeeminen etenemistä). He myös yleensä virheellisesti luokitella samat potilaat (esim luokittelemalla potilaan PSA kontrolliryhmän systeeminen etenemistä ja päinvastoin). 17-geeni /sondimalli luokiteltu oikein 5-15 enemmän potilaita niiden tunnetun luokkaan (PSA valvontaa tai SYS tapausta) verrattuna muihin malleihin (tuloksia ei ole esitetty).

Toissijainen Analyysit

Exploratory Survival tutkimuksissa.

Kuten edellä on mainittu, 17-geeni /koetin mallin ja aiemmin raportoitu mallit kullekin luokitellaan joitakin SYS tapauksista hyvä tulos luokkaan (esim olevan PSA toistuminen, ei systeemisiä progressors) ja jotkut PSA valvonnan huono tulos luokka (esim mennä systeemistä etenemiseen). Olimme uteliaita tietää nämä ilmeisesti vääriä luokituksia ollut mitään biologisia tai kliinistä merkitystä.

seitsemäntoista miesten PSA verrokkiryhmässä (joka oli sekä array ja kliiniset malli C data) jatkoi olla systeemisiä etenemistä 5 vuoden kuluttua aikaan viime seurannan. Näistä 17 potilasta, 9 ennustettiin on huono tulos, jonka 17-geeni /sondimalli. Niistä 179 potilaat, joilla ei ole mitään systeemistä etenemistä, 38 luokiteltiin Huonon lopputuloksen kategorian mallin (p-arvo = 0,0066, Fisherin eksakti testi). Kuvio 3A havainnollistaa systeemistä ilman taudin etenemistä varten hyvän ja huonon lopputuloksen ryhmien PSA valvontaa. PSA säätimet kasvain luokiteltiin huono tulos oli merkittävästi lisääntynyt riski sairastua systeemisen etenemistä 5 vuoden kuluttua (log rank p-arvo = 0,00050) (HR = 4,7, 95% CI: 1,8-12,1).

A) Systeeminen ilman taudin etenemistä potilaiden luokitellaan huonon lopputuloksen luokka ja niille hyvän lopputuloksen luokan PSA kontrolliryhmän-17-geenin /sondimalli. B) Eturauhassyöpä erityisiä eloonjäämisaste potilaiden luokitellaan Huonon lopputuloksen luokka ja niille hyvän lopputuloksen luokka SYS tapauksessa ryhmä-17-geenin /sondimalli.