Krooninen sairaus

tiivistelmä

-immunoterapialähestymistavat käyttäen tarkistuspisteen saarto, yksin tai yhdessä tuumoriantigeenillä rokotuksen tai otto- solu siirto, ovat nousemassa lupaavia lähestymistapoja hoitoon ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Valmisteltaessa tulevista yhdistetyn -immunoterapialähestymistavat NSCLC, täällä, olemme arvioineet spontaani immuunivasteita XAGE-1b, kasvain antigeeni of Cancer Kivesten antigeeni ryhmä, joka on aikaisemmin raportoitu olevan spontaanisti immunogeeninen Japanin väestön kohortissa valkoihoisia potilaita NSCLC. Löysimme spontaani serologisen vastauksia XAGE-1b 9%: lla potilaista. Mikä tärkeintä, nämä vastaukset rajoittuvat, ja edusti 13%, potilailla, joilla adenokarsinooma kasvaimia, yleisin histologinen alatyyppi, jolle -immunoterapialähestymistavat ovat kehitteillä. Käyttämällä päällekkäisten peptidien ulottuu koko XAGE-1b-proteiinia, ja tueksi serologisten tietojen havaitsimme merkittävää XAGE-1b CD4

+ T-solu vasteita kaikissa XAGE-1b seropositiivisilla potilailla ja havaittiin useita CD4

+ T-soluepitooppeja. Kaikkiaan tuloksemme tukevat merkitystä XAGE-1b-antigeenin kaukasialaisissa NSCLC potilailla, joilla adenokarsinooma, ja täytäntöönpano tulevaisuudessa immunoterapioiden hyödyntämällä korkea antigeenin immunogeenisyyttä tässä potilasryhmässä.

Citation: Saito K, Nakayama E, VALMORI D (2016) Immuunivasteet Cancer Kivesten antigeeni XAGE-1b Non pienisoluinen keuhkosyöpä valkoihoinen Potilaat. PLoS ONE 11 (3): e0150623. doi: 10,1371 /journal.pone.0150623

Editor: Takuma Kato, Mie University Graduate School of Medicine, JAPAN

vastaanotettu 11 joulukuuta 2015 Hyväksytty: 17 helmikuu 2016; Julkaistu: 03 maaliskuu 2016

Copyright: © 2016 Saito et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Ludwig Institute for Cancer Research (USA), Cancer Research Institute (USA), Ligue contre le Cancer (Ranska) ja LabeX IGO (Ranska) . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolleisuus kaikkialla maailmassa, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus on noin 85% kaikista keuhkosyöpää [1]. Huolimatta viimeaikaisista parannuksista hoitostrategioita, NSCLC muodostaa siis yksi suurimmista kansanterveyden ongelmia. Useimmissa tapauksissa oireet ilmaantuvat yleensä jo edenneet vaiheeseen taudin, Metastasoituneessa tai paikallisesti edenneessä vaiheessa, jolloin hoito vaikea [2]. Alkuvaiheen diagnoosin, tarkka lavastus on ratkaiseva määritettäessä asianmukaista hoitoa. Kirurginen resektio kasvain on edelleen tavanomaista hoitoa, mutta valitettavasti se on sovellettavissa ja sitä voidaan pitää johdonmukainen ja onnistunut vaihtoehto parannuskeinoa, vain potilaille, joilla kokoisen kasvaimia ja siedät resektio. Kuitenkin noin 70% keuhkosyöpä potilailla esiintyy paikallisesti edennyt tai etäpesäkkeitä aikaan diagnoosi [2]. Näille potilaille, ensimmäinen rivi hoito on platinapohjaisen kemoterapian, joka on osoittautunut hyödylliseksi palliation ja edustaa tavanomaista hoitoa. Sädehoidon on myös usein käytetään ensilinjan hoidon NSCLC ja hallinnon samanaikaisten kemoterapiaa ja säteily on tarkoitettu vaiheen III keuhkosyöpään [2]. Kuitenkin, vaikka nämä hoidot, yleinen eloonjäämisluvut NSCLC potilaat ovat edelleen hälyttävän alhaisia, keskimäärin 5 vuoden pysyvyys 17% potilailla, joilla on varhainen taudin ja 4% potilailla etäpesäkkeitä [3]. Siksi on kiireesti tarpeen kehittää uusia hoitostrategioita aiheuttaa tehokkaampia kliiniset vasteet ja pidentää eloonjäämisaste tässä potilaiden populaation. Viime vuosikymmenen aikana, uuden tiedon syöpäbiologian on avannut uusia mahdollisia terapeuttisia lähestymistapoja, kuten kohdennettua hoitomuotojen ja immunoterapioiden. Kohdennettu hoitojen, kuten ne, joissa käytetään angiogeneesin inhibiittorit, epidermaalisen kasvutekijän reseptorin salpaajat (EGFRi) tai tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) voidaan yhdistää tärkeimmät hoitotavat potilailla, spesifisiä mutaatioita [4-6]. Kuitenkin potilaiden osuus ilmentävien näistä mutaatioista on suhteellisen pieni (esimerkiksi vain 10-15% NSCLC satama EGFR mutaatioita). Lisäksi kliinisiä vaikutuksia nämä hoidot ovat usein ole kestäviä, koska resistenssin kehittyminen [7,8].

Toisaalta, immunoterapeuttisen strategioissa on potentiaalia vahvistaa potilaan immuunivasteen, aiheuttavan vakaa kliininen vaste ja laajentaa selviytymisen [1]. Kehittyvät immuuniterapeuttista strategiat, joissa käytetään tarkistuspiste saarto spesifisiä vasta-aineita, jotka ovat osoittaneet kliinistä tehoa potilaiden alaryhmässä. Viimeaikaiset tulokset viittaavat siihen, että nämä vastaaja potilaat ovat ne, jotka satama spontaani immuunivasteita autologisten kasvain. Muut immuuniperäisiä strategioita NSCLC ovat syöpä rokotukset lähestyy käyttämällä Cancer /kivesantigeenien (CTA) [1,9], geenien koodaamien proteiinien normaalisti ilmaistu sukusolujen kiveksissä ja sikiön munasarja ja joissakin tapauksissa istukan trofoblastit, vaiennetaan vuonna normaalin aikuisen kudoksissa, mutta poikkeavasti uudelleen ilmaistaan ​​erityyppisiä syöpiä [10,11]. CTA ovat pitkälti ilmaistu syövissä eri histologisia alatyyppejä, ovat usein erittäin immunogeenisiä, ja niitä pidetään kaikkein houkuttelevia kohteita syövän kehittymistä rokotteiden [11]. Syöpä rokotteet monoterapiana niitä arvioidaan parhaillaan NSCLC ja se voisi olla tehokas potilailla, joilla minimaalinen jäljellä tauti [9]. Vaikka ensimmäinen kliinisten kokeiden soveltamalla tämäntyyppistä strategiaa eivät ole saavuttaneet kliinisen päätepisteen [12], yhdistelmä rokotuksen tarkistuspiste saarto hoidot ovat erittäin lupaavia [1]. Kuitenkin käyttää näitä strategioita vaatii tunnistamista kasvaimen antigeenejä ilmaistaan ​​merkittävä osa NSCLC, sekä ominaisuuksista ilmentäviä kasvaimia niitä. Eri CTA on osoitettu ilmaistaan ​​NSCLC. XAGE-1b koodaa XAGE-1-geenin, joka sijaitsee Xp11.22 alueella X-kromosomi [13,14]. Neljä transkriptivariantissa, XAGE-1a d, on tunnistettu [14-16]. Yksi transkripti ilmaistuna kasvainten, XAGE-1b, koodaa 81 aminohappoa pitkää proteiinia [14,17]. XAGE-1b ilmoitettiin olevan vallalla transkripti ilmaistu NSCLC. XAGE-1b ilmentymistä havaittiin 45% adenokarsinoomat Japani potilaista [18]. XAGE-1b osoitettu aiheuttavan vasta-aine- ja T-soluvasteita Japani pienisoluista keuhkosyöpää. Taajuus vasta-ainevaste oli raportoitu olevan suurempi adenokarsinooma potilailla (14%) kuin SCC potilailla (2%) [19]. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli laajentaa näitä havainnoistaan ​​valkoihoinen väestö, arvioida mahdollisuuksia XAGE-1b-immunoterapian valkoihoisista.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat näytteitä ja solujen puhdistus

Perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) kerättiin kohortin 141 NSCLC potilaiden (Institut de Cancérologie de l’Ouest (ICO), Saint-Herblain, Ranska) hyväksynnän jälkeen Institutional Review Board n ICO. PBMC 60 terveistä luovuttajista saatiin Etablissement Français du Sang (EFS) Loiren hyväksynnän jälkeen Institutional Review Board on Etablissement Français du Sang Pays de la Loire (Nantes, Ranska). Allekirjoitettu tietoisen suostumuksen muoto saatiin kaikki rahoittajat osallistuvat tutkimukseen. Kohortti mukana 91 adenokarsinoomat, 40 levyepiteelikarsinoomien (SCC) ja 10 NSCLC kasvaimia muihin alatyyppeihin. PBMC: t eristettiin tiheysgradienttisentrifugaatiolla. CD4

+ ja CD8

+ T-solut rikastettiin PBMC magneettiset solulajittelussa käyttäen mikrohelmiä (MACS Cell erottaminen Technology, Miltenyi Biotec).

proteiinit ja peptidit

Sarjassa 17 16-mer XAGE-1b päällekkäisiä peptidejä (OLP, taulukko 1) syntetisoitiin Multiple Peptide Synthesizer, AMS422, ABINED Okayama yliopistossa. Rekombinantti NY-ESO-1-proteiinia tuotettiin

Escherichia coli

kuten aiemmin on kuvattu [20]. XAGE-1b (GAGED2a) proteiinia (81 aminohappoa pitkä), syntetisoitiin käyttäen peptidisyntetisaattoria GL Biochemistry.

stimulointi in vitro CD4

+ ja CD8

+ T-solut

Puhdistettu CD4

+ ja CD8

+ T-soluja stimuloitiin säteilytetyillä autologisilla antigeeniä esittelevät solut (APC: t), kun läsnä on seosta, jossa oli 17 16-meeri päällekkäisiä peptidejä (OLP, 2 uM ) (taulukko 1), joka käsittää koko aminohapposekvenssi on XAGE-1b-proteiinia, rhIL-2 (50 IU /ml), ja rhIL-7 (10 ng /ml). Soluja viljeltiin 96-kuoppaisilla viljelylevyillä 37 ° C: ssa (CO

2 5%) Iscoven muunnettuun Dulbeccon alustaan ​​(IMDM, Gibco), jota oli täydennetty 8% lämpöinaktivoitua ihmisen seerumia (HS), GlutaMAX (Gibco), HEPES (Gibco), ei-välttämättömiä aminohappoja (MEM NEAA, Gibco), Ciprofloxacine ja penisilliiniä /streptomysiiniä.

Solunsisäinen sytokiinien värjäytymistä (ICS) B

jälkeen

in vitro

stimulaatio CD4

+ ja CD8

+ T-soluja viljeltiin 14 päivää, ja sitten arvioitiin XAGE-1b-spesifisiä T-soluvasteita. Viljelmät kerättiin ja stimuloitiin, kun läsnä tai puuttuessa XAGE-1b peptidi-allas (2 uM) ja testattiin standardi 4 tuntia solunsisäisen sytokiinin värjäystä (ICS), käyttäen fluoresoivaa konjugoitua sytokiini-spesifisten vasta-aineiden αCD4 (BD Biosciences), αCD8 (BD Biosciences), αIL-17A (eBioscience) ja αIFN-γ (BD Biosciences). Sytokiini mentymisprofiili arvioitiin sitten virtaussytometrillä (FACSAria II, BD Biosciences).

IFN-γ kaapata määritys ja perustamalla CD4

+ ja CD8

+ T-solukloonien

CD4

+ ja CD8

+ T-solulinjoja kerättiin ja stimuloitiin, kun läsnä tai poissa ollessa XAGE-1b-peptidi-allas (2 uM). Stimuloidut näytteitä inkuboitiin bi-spesifinen CD45: n ja IFN-γ-vasta-ainetta (IFN-γ saalis reagenssi, Miltenyi Biotec) ja inkuboitiin 5 minuuttia jäällä. Solut sijoitettiin sitten hitaasti pyörivä laite (Miltenyi Biotec) 45 minuutin ajan 37 ° C: ssa, jotta sytokiinieritystä. Tämän jälkeen solut pestiin kylmällä puskurilla ja inkuboitiin APC-konjugoidun IFN-γ detektioreagenssi (Miltenyi Biotec) 15 minuutin ajan jäissä, kun läsnä on αCD4 (FITC-konjugoitu) sytokiini-spesifistä vasta-ainetta. Solut vielä pestiin kylmällä puskurilla ja analysoitiin FACS: llä. CD4

+ T-solut erittävät IFN-γ erityisesti vasteena XAGE-1b-peptidi- lajiteltiin virtaussytometrialla solu, käyttäen FACSAria II. Eristetty CD4

+ IFN-γ tuottavat T-solut kloonattiin rajoittavan laimennuksen olosuhteissa, 96-kuoppalevyillä, stimuloimalla fytohemagglutiniinilla (PHA-L, 1 ug /ml), kun läsnä on säteilytettyjä allogeenisia PBMC: tä ja EBV: solu linjat (EBV-HV, EBV-LAZ) ja rhIL-2 (150 IU /ml). CD4

+ T-solujen klooneja pidettiin IMDM täydennetty 8% HS uudelleen stimulaation 2-3 viikon välein.

Arvio serologisen vasteen

Serologiset vasteet arvioitiin ELISA, käyttämällä 96-kuoppalevyillä, jotka oli päällystetty XAGE-1b-proteiinia (2 ng /ml) tai NY-ESO-1-proteiinia (1 ug /ml) yön yli 4 ° C: ssa. Seerumit arvioitiin eri laimennokset 1/100 1/100000. Vasta-ainetiitterit laskettiin, kuten seerumin laimennos, joka vastaa 50% maksimaalisesta optinen tiheys vasteen.

arviointi IFN-γ tuotantoa ELISA

arvioimiseksi antigeenispesifisen IFN-γ tuotantoa, XAGE- 1b erityiset kloonit stimuloitiin läsnä ollessa tai poissa ollessa peptidin allas (50 x 10

3 per kuoppa, 96-kuoppaisille pyöreäpohjaisessa kulttuuri levyt). IFN-γ mitattiin ELISA: lla 24 h viljelmäsupernatanteissa käyttämällä Nunc Maxisorp tasapohjaisille 96-kuoppaisille levyille. Sakon spesifisyysmääritys, soluja (50 x 10

3 per kuoppa) stimuloitiin in läsnä ollessa tai puuttuessa XAGE-1b yhdessä peptidien (300 uM), ja IFN-γ pitoisuus mitattiin kuten edellä. Vasta-aineen esto kokeita, αDP (1 ug /ml), αDQ (1 ug /ml), αDR (1 ug /ml) ja αDR52b (askites, 1:10 laimennos) vasta-aineita lisättiin määritykseen kulttuuriin. HLA-DR rajoittavia alleelit samalla arvioitiin IFN-y-ELISA käyttäen molekyylirakennetta määritelty APC. LDR1, ystävällisesti Dr. Hassan M. Zarour (University of Pittsburgh, USA), pidettiin täydellisessä RPMI ja tarkastetaan HLA-DR ilme. EBV149 ja EBV156, (Epstein-Barrin virus transformoituja lymfoblastisolulinjoissa) olivat peräisin potilaista ilmentävät HLA-DRB1 * 13.

Tulokset

Serologiset vasteet XAGE-1b ja NY-ESO-1 NSCLC potilaat

Seuloimme kohortin 141 NSCLC potilaiden serologista vastauksia XAGE-1b ja NY-ESO-1, kuten sisäisen valvonnan, ELISA. Tulokset seulonnasta on koottu kuvioon 1. Ensin arvioitiin potilaiden seerumeista kanssa kuin 60 terveen luovuttajan laimennoksena 1: 100. Olemme havainneet merkittäviä serologisen vastauksia XAGE-1b 12 potilaalla (kuvio 1A). Sitä vastoin vasta-ainevasteet NY-ESO-1 havaittiin 9 potilaalla. Sitten arvioitiin seerumeista 12 XAGE-1b seropositiivisten potilaiden titrauskäyrään ja lasketaan vasta-ainetiitteri, joka määritellään seerumin laimennus antaa 50% maksimaalisesta vasteesta. Tiitterit saadut vaihtelivat joukossa seropositiivisten potilaiden ja vaihtelivat 1: 250 1: 40000 (kuvio 1 B).

(A) Yhteenveto ELISA 141 pienisoluista keuhkosyöpää ja 60 terveen luovuttajan (HD). Optinen tiheys (OD) katkaisun välillä vastanneiden ja vastetta määritettiin keskiarvo OD saatiin seerumeista 60 HD + 5 standardipoikkeamaa (SD) (katkoviiva). (B) Sera titraus päässä 12 XAGE-1b seropositiivisten potilaiden ja 1 HD suoritettiin eri laimennoksia, 1/100 1/100000. Vasta-ainetiitterit määritettiin seerumilaimennoksen, joka vastaa 50% maksimaalisesta OD vasteen.

kohortin, 91 kasvaimet olivat adenokarsinoomat, 40 olivat levyepiteelikarsinoomien (SCC) ja 10 kuului muihin alatyyppeihin . XAGE-1b seropositiivisilla potilailla olivat yksinomaan löytyi adenokarsinooma alaryhmä, ja edusti 13%: a alaryhmä (taulukko 2). Sen sijaan, NY-ESO-1 seropositiivisilla potilailla kuului lähinnä SCC alaryhmä, ja edusti 13%: a alaryhmä taas vain 3%: n adenokarsinooma potilailla oli merkittävästi serologisen vastauksia NY-ESO-1 (taulukko 2). Niinpä vahvisti, että XAGE-1b on spontaanisti immunogeeninen NSCLC, lähinnä adenokarsinoomat, ja osoitti, että näin on paitsi Japanin väestöstä kuten aiemmin on kuvattu, vaan myös valkoihoisilla. Korrelaatio serologisen vastauksia XAGE-1b ja adenokarsinooma histologinen alatyyppi oli tilastollisesti merkitsevä (Fisherin tarkka testi, P = 0,0176). Sen sijaan meidän tulokset osoittavat, että vasta-ainevasteet NY-ESO-1 ovat yleisempiä SCC potilailla, joilla data lähelle, mutta ei vielä saavuttaa tilastollista merkitystä (Fisherin tarkka testi, P = 0,0563). Nämä tulokset ovat linjassa aiemmin julkaistujen tietojen että seropositiivisuus NY-ESO-1 havaittiin 29% ja 15% SCC ja adenokarsinooma potilaista [21].

Arvio XAGE-1b erityisiä CD4

+ ja CD8

+ T-soluvasteiden

tulosten perusteella serologisen seulonnan, arvioimme 12 vasta-responder potilaiden CD4

+ ja CD8

+ T-solujen vasteet XAGE-1b. Tätä varten me rikastettu CD4

+ ja CD8

+ T-solut PBMC potilaista Magneetti- solujen lajittelu ja kannustanut niitä läsnäollessa pooli 17 16-mer päällekkäisiä peptidejä, jotka kattavat koko 81 aminohapon happosekvenssi XAGE-1b-proteiinia (taulukko 1) ja viljeltiin niitä 14 päivää, kun läsnä on säteilytettyjä autologisia APC, rhIL-2 ja rhIL-7. Lopussa viljelmän aikana, olemme stimuloi eriä viljelmistä peräisin kunkin potilaan puuttuessa tai läsnä ollessa XAGE-1b-peptidi- ja arvioidaan vastata XAGE-1b on 4 tuntia standardin solunsisäisen sytokiinin värjäystä määrityksen, käyttäen vasta-aineita spesifinen IFN-γ: n ja IL-17. Analysoimme näytteet virtaussytometrialla (kuvio 2A ja 2C) ja verrattiin osuus IFN-γ tuottavat solut saadaan jokaisesta viljelmästä suhteessa se oma perustason vastetta (ilman peptidiä) vahvistaa antigeenispesifisen vasteen. CD4

+ T-soluvasteiden pidettiin merkittävinä, kun osuus CD4

+ T-solut tuottavat IFN-γ: n läsnä ollessa peptidin allas oli vähintään 3 kertaa suurempi kuin on havaittu lähtötilanteessa. Näiden kriteerien perusteella, havaitsimme merkittävää CD4

+ T-solu vasteita XAGE-1b kaikissa seropositiivisilla potilailla (kuvio 2B), sitä vastoin vain kun kyseessä on 1 potilas, huomasimme XAGE-1b CD8

+ T-soluvasteen (kuvio 2D). Kuitenkin emme onnistuneet havaitsemaan tiettyjä IL-17 vastauksena XAGE-1b johonkin viljelmien.

(A, C) läsnäolo XAGE-1b CD4

+ (A) ja CD8

+ (C) T-soluvasteita, arvioitiin peptidi pool stimuloiduissa viljelmissä solunsisäisen sytokiinin värjäystä, sytokiinin spesifisten vasta-aineiden αIFN-γ ja αIL-17, stimulaation jälkeen puuttuessa tai läsnä ollessa XAGE-1b-peptidin allas. Prosenttiosuudet IFN-γ tuottavat solut näkyvät vasemmassa yläkulmassa neljänneksessä kunkin pistekuvaajana, joka esittää lisääntynyt IFN-γ tuotannon peptidi stimuloi näytteissä. Esitetyt tiedot ovat esimerkki CD4

+ ja CD8

+ T-solu vasteen potilaalle. (B, D) Yhteenveto CD4

+ ja CD8

+ T-soluvasteiden näkyvät kaikille 12 seropositiivisilla potilailla. Kuten esitetään (B), CD4

+ vasteita havaitaan kaikille seropositiivisilla potilailla, kun taas merkittävä CD8

+ vaste tunnistettiin vain 1 potilas, NA703 (D). Arvot on vähintään 3 kertaa suurempi kuin lähtötilanteessa (ei peptidiä) pidettiin merkittävinä.

Generation CD4

+ T-solujen klooneja, arviointi aktiivisten peptidien ja HLA rajoitus

Me eristetty XAGE-1b reaktiivisia CD4

+ T-soluja yhdestä XAGE-1b-seropositiivisten potilaiden NA555, rikastamalla osa soluista, jotka eritetään IFN-γ erityisesti vasteena XAGE-1b-peptidi-, Miltenyi IFN-γ capture-määrityksellä (kuvio 3A). Saada erityisiä klooneja, me viljellään eristettyjä soluja rajoittavan laimennuksen olosuhteissa, laajennettu niitä ja sitten arvioitiin niiden puuttuessa tai läsnä ollessa XAGE-1b-peptidi- (kuvio 3B). Saimme 14 XAGE-1b CD4

+ T-solukloonien, että me tunnettu heidän hienospesifisyyttä arvioimalla reaktiivisuus 17 päällekkäisten single peptidejä säveltää XAGE-1b peptidipooli. Alussa testattiin yhden peptidejä alapoolista 3 peptidiä, ja määritetään, että reaktiiviset peptidit lokalisoitu ensimmäisen 2 alapoolista mukaan lukien peptidit C1-C3 ja C4-C6-(taulukko 1). Sitten arvioi vastauksena yhden peptidien mukana kyseisillä alueilla. Kuvio 3C (vasen paneeli) esittää esimerkkiä tämän analyysin varten XAGE-1b reaktiivisia CD4

+ T-solujen klooni (klooni A8C7), joka tunnisti peptidin C3. Yhteenveto hienospesifisyyttä arviointi 14 CD4

+ T-solukloonien esitetään kuviossa 3C (oikea paneeli). 10/14 kloonit olivat reaktiivisia peptidin C3, 1 klooni tunnustettu peptidejä C3 ja C4, 1 klooni tunnustettu peptidi C4, ja 2 kloonit tunnustettu peptidi C5. Kaikkiaan löydettiin 4 eri hieno erityispiirteet. Tämän perusteella reaktiivisuus, päätimme luokan II MHC-molekyylien rajoitetaan antigeenitunnistuksessa yksittäisten kloonien edustavan 4 sakon erityispiirteet. Tätä varten meidän arvioida antigeenin tunnistus- läsnä ollessa αDP, αDQ, αDR ja αDR52b spesifisiä vasta-aineita, yhteydessä IFN-γ erityksen määritys, jossa kukin klooni testattiin läsnä ollessa tai puuttuessa reaktiivisen peptidin. Kuviossa 4A on esitetty esimerkki luokan II MHC-rajoitus määritys suoritettiin CD4-T-solujen klooni B2F8, joka tunnustetaan peptidi C3. Kuten on esitetty, olemme todenneet, että antigeenitunnistuksessa klooni spesifisesti inhiboi αDR vasta-aineella, kun taas mitään inhibitiota havaittiin αDP ja αDQ estäviä vasta-aineita, mikä osoittaa, että tämä klooni oli rajoitettu HLA-DR. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin muiden kloonien. Sitten pyritään tunnistamaan HLA-DR rajoittava alleeli. HLA-DR molekyylityypitysmenetelmän paljasti, että NA555 ilmaissut DRB1 * 01 ja DRB1 * 13 alleelit. Sen määrittämiseksi, mitkä näistä molekyyleistä oli rajoittaa alleeli, me stimuloi CD4

+ T-solukloonien läsnä ollessa LDR1 soluja (hiiren fibroblasteissa, jotka on transfektoitu HLA-DR1) tai EBV-transformoituja B-solulinjoja (EBV 149, EBV 156), joka ilmaisee DR13-alleeli. Me esi-inkuboidaan APC kanssa reaktiivisen peptidien ja arvioidaan niiden kykyä esittää vastaavaa XAGE-1b peptidi CD4 T-solujen klooneja. Vasteet määritettiin mittaamalla määrä, IFN-γ 24 tunnin viljelmäsupernatanteista, ELISA: lla. Kaikki kloonit, olemme havainneet peptidi tunnustamista läsnä ollessa EBV-B-solulinjat (EBV 149, EBV 156) ilmennetään DRB1 * 13, mutta ei ole läsnä ollessa LDR1-soluissa (kuvio 4B).

(A ) XAGE-1b CD4

+ T-solut eristettiin IFN-γ capture-määrityksellä. Numerot merkitty oikeaan yläkulmaan alueen pistekuvioita osoittavat prosenttiosuudet IFN-γ tuottavien solujen joukossa CD4

+ T-solujen stimulaation jälkeen puuttuessa tai läsnä ollessa peptidin allas. IFN-γ tuottavat solut lajitellaan ja kloonattiin rajoittavan laimennuksen olosuhteissa. (B) CD4

+ T-solujen klooneja saatiin ja seulottiin arvioida reaktiivisuus XAGE-1b. Kloonit stimuloitiin in läsnä ollessa tai ilman peptidin allas ja spesifisyys XAGE-1b määritettiin ELISA: lla. Vastaukset pidettiin merkittävinä, kun määrä IFN-γ havaittiin peptidin läsnä ollessa oli vähintään 3 kertaa suurempi kuin havaitaan peptidin puuttuessa. (C) Alikvootit XAGE-1b-CD4

+ T-solujen kloonit stimuloitiin puuttuessa tai peptidin läsnä ollessa altaan tai yksittäisten yhden peptidien määrä ja IFN-γ mitattiin 24 tunnin viljelmäsupernatanteista ELISA. (D) reaktiivisuus XAGE-1b single peptidejä arvioitiin 14 klooneja ja 4 hieno erityispiirteisiin tunnistettiin.

(A) tunnistaminen MHC II rajoittamalla molekyylien. Vasemmassa paneelissa näyttää esimerkin HLA-II rajoitus määritys klooni, B2F8. Peptidi tunnustamista arvioitiin ELISA: lla, inkuboimalla XAGE-1b CD4

+ T-solujen klooneja, joilla kullakin 4 sakon erityispiirteet joko puuttuessa tai läsnä ollessa αDP, αDQ, αDR ja αDR52b spesifisiä vasta-aineita. Peptidi tunnustamista rajoittivat HLA-DR kaikissa tapauksissa, kuten yhteenveto B. HLA-DR rajoittava alleeli tunnistettiin inkuboimalla XAGE-1b CD4

+ T-solukloonien kanssa eri APC lukien transfektoimattomissa (3T3) tai DR1 -transfected hiiren fibroblasti (LDR1) ja DR13-ilmentävät EBV-solulinjoja (EBV149, EBV 156). Kukin APC oli esi-inkuboitiin reaktiivisen peptidien ja rajoittamalla alleeli määritettiin arvioimalla niiden kyky esitellä peptidien vastaavaan CD4

+ T-solujen klooneja. Peptidi tunnustamista arvioitiin mittaamalla IFN-γ erityksen viljelmän supernatanteissa, kun läsnä on kunkin APC. Kuten tiivistää, huomasimme, että peptidi tunnustamista rajoittivat HLA-DR13 kaikissa tapauksissa.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa selvitettiin spontaanin vasta-aine- ja T-solujen vasteita CTA XAGE -1 b kohortin 141 valkoihoinen NSCLC potilaat. Meidän havainnot osoittavat, että serologista vastauksia XAGE-1b rajoittuvat suuresti adenokarsinooman koska ne esiintyvät noin 13% niistä, mutta ei havaittu SCC. Ottaen huomioon, että XAGE-1b on raportoitu ekspressoituvan noin 45% adenokarsinoomien [18] (mutta vain 7% SCC), serologiset vasteet näyttävät melko usein tässä potilasryhmässä, on löydetty noin kolmasosa heistä . Nämä tulokset ovat linjassa aiemmin julkaistu tietoja Japanin väestöstä, raportointi serologisia vasteita XAGE-1b 14% adenokarsinoomia mutta vain 2% SCC potilaista [19]. Tuloksemme osoittavat myös, että serologista vastauksia NY-ESO-1 ovat sen sijaan yleisempiä SCC kuin adenokarsinooma, koska ne löytyvät 13% SCC mutta vain 3%: adenokarsinoomia peräisin valkoihoisilla. Jälleen tämä on sopusoinnussa tulosten aikaisemmista tutkimuksista, jotka ovat raportoineet useammin spontaani serologisen vastauksia NY-ESO-1 in SCC kuin adenokarsinooma [21]. Samanlainen NY-ESO-1, olemme hiljattain raportoitu, että MAGE-A-antigeenejä, jotka myös kuuluvat CTA ryhmään, olivat useammin ilmaistaan ​​SCC, verrattuna adenokarsinooma [22]. Yhdessä meidän havainnot vahvistavat XAGE-1b immunogeenisuus keuhkoadenokarsinooma, jossa korostetaan tämän CTA kuin lupaava kohde immunoterapiaa vastaan ​​kasvain alatyypin.

Tutkimuksessamme havaitsimme merkittävää XAGE-1b-CD4

+ T-solu vasteita kaikissa seropositiivisilla potilailla, sekin on aiempien tietojen Japanin väestöstä [19]. Perustimme klonaalisia populaatioita korkea responder selvitetty, että reaktiivisuus klooneista kohti sekvenssit sijaitsevat peptidien C3-C5, jotka vastaavat 9-32 aminohapon proteiinin alueelle, ja tunnistettiin 4 hieno erityispiirteet antigeenitunnistukseen. Osoitimme, että kaikki ohuet erityispiirteet, peptidi tunnustamista rajoitti HLA-DR. Arvioimalla antigeenin esitys käyttäen APC, jotka jakavat yhden HLA-DR-alleelit kanssa potilaan totesimme, että antigeenitunnistuksessa klooneista rajoittaa DRB1 * 13-alleeli. On huomattava, että, kun taas muut XAGE-1b-MHC-luokan II epitooppeja rajoittaa muiden alleelien on raportoitu [19,23,24], DRB1 * 13 rajoittaa epitooppi on kuvattu tässä ei ole aikaisemmin raportoitu.

Jotkut tuloksemme ovat ristiriidassa kyseisten raportoitu kirjallisuudessa [19,25]. Toisaalta, sekä tutkimuksemme ja aiemmissa tutkimuksissa kirjallisuudessa [19] XAGE-1b CD4

+ T-solujen vasteita havaittiin lähes kaikissa NSCLC XAGE-1b seropositiivisilla potilailla. Kuitenkin ristiriidassa tulokset raportoi äskettäin tutkimuksen [25] tutkimuksessamme, XAGE-1b CD4

+ T-solut tuottivat IFN-γ mutta ei IL-17, ja näin nähtiin selvää Th1 profiilin. Lisäksi olemme havainneet huomattavan CD8

+ T-solujen vaste vain yksi 12 seropositiivisten potilaiden, joka on paljon harvinaisempaa kuin taajuus 6/9 seropositiivisten potilaiden aiemmin raportoitu Japanin kohortin [19]. Tämä ristiriita voitaisiin ainakin osittain selittää eri menetelmiä käyttää, jotka voivat merkittävästi eroavat herkkyys ja spesifisyys havaitsemiseen. Todellakin, kun taas arvioimme CD8

+ T-solu vasteita 4hr standardin solunsisäisen sytokiinin värjäytymistä (ICS) määritys, että japanilainen tutkimus, CD8

+ T-solu vasteita XAGE-1b arvioitiin IFN-γ eritys kaapata määritys [19]. Siten joko taajuus XAGE-1b CD8

+ T-solu vasteita seropositiivisilla potilailla on aliarvioitu tutkimuksessamme, koska alemman herkkyyden käytetyn menetelmän tai yliarvioi vaikutus tutkimukseen Ohue Y et al. koska alemman spesifisyyden IFN-γ kaapata määritys, kummastakaan, jotka eivät ole toisiaan poissulkevia. Kuitenkin hyväksi yli-arvio määrästä todellisen XAGE-1b CD8

+ T-solu vasteita japanilainen tutkimus, on se, että IFN-γ sekreetiotasot saadut että tutkimuksessa suurin osa CD8

+ T soluviljelmissä stimuloitaessa XAGE-1b peptidit oli hyvin alhainen, lähellä taustan tasolle [19].

Yhteenvetona kokonaan, tuloksemme tukevat merkitystä XAGE-1b antigeenin valkoihoisilla keuhkojen adenokarsinooma ja edistettävä tulevaisuuden immunoterapioiden hyödyntämällä korkea immunogeeniset tämän antigeenin tässä potilaiden väestöstä.

lisäksi on huomattava, että koska ilmaisu XAGE1b tiedetään säänneltävä DNA: n metylaatio, DNA metyylitransferaasi estäjät saattaa lisätä potilasryhmässä oikeutettuja XAGE-1b suunnattu immunoterapioiden, kuten aiemmin raportoitu, kun kyseessä on NY-ESO-1 [26]. Exploring tämä mahdollisuus voisi olla aiheena tulevaisuudessa tutkimuksissa.