Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta edistymisestä Paikallista ja systeemiset hoidot, potilaan eloonjäämisen keuhkosyöpään edelleen haaste. Reseptorityrosiinikinaasit usein osallisina keuhkosyöpää synnyssä, ja jotkut tyrosiinikinaasin eston strategiat ovat olleet tehokkaita kliinisesti. EphB4 reseptori tyrosiinikinaasin on viime aikoina tullut mahdollisena kohteena useissa muissa syövissä. Olemme pyrkineet systemaattisesti tutkia roolia EphB4 keuhkosyövässä. Tässä osoitamme, että EphB4 yli-ilmentyy 3-kertaisesti keuhkokasvaimia verrattuna pariksi normaaleissa kudoksissa ja usein esiintyy geenikopiomäärä kasvaa keuhkosyöpä. Osoitamme myös, että yli-ilmentyminen EphB4 edistää solujen lisääntymistä, pesäkkeiden muodostumisen, ja liikkuvuus, kun taas EphB4 inhibitio vähentää solujen elinkelpoisuuden

in vitro

, pysäyttää olevien kasvainten kasvua hiiren ksenograftimalleissa, kun niitä käytetään yhdessä kohde-strategiaa , ja aiheuttaa lähes täydellinen regressio vakiintuneiden kasvainten kun sitä käytetään yhdessä paklitakselin kanssa. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, on tärkeä rooli EphB4 mahdollisena uusia terapeuttisia tavoite keuhkosyöpä. Kliinisiin tutkimuksiin tehoa anti-EphB4 hoitoja sekä yhdistelmähoito joihin EphB4 esto voi olla perusteltua.

Citation: Ferguson BD, Liu R, Rolle CE, Tan Y-HC, Krasnoperov V, Kanteti R, et ai. (2013) EphB4 Reseptorityrosiinikinaasin Edistää Keuhkosyöpä Growth: Mahdolliset uudet terapeuttiset Target. PLoS ONE 8 (7): e67668. doi: 10,1371 /journal.pone.0067668

Editor: Todd W. Miller, Dartmouth, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 helmikuu 2013; Hyväksytty: 21 toukokuu 2013; Julkaistu: 02 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Ferguson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus on tuettu osittain NIH /NICHD T32HD009007 ”Graduate koulutus kasvu ja kehitys” (BDF), ASCO translaatiotutkimus Award (EEV), NIH /NCI R01 CA 129501 05 (RS), ja Janice Lamb McArdle Cancer Research Foundation (RS ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: PSG on perustaja ja johtaja Vasgene Therapeutics, Inc. VK on työntekijä Vasgene Therapeutics, Inc. on patentteja ja tuotteita kehitteillä, mutta ei markkinoida tuotteita julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille. Loput kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka lukuisia lääkekohteita on tutkittu paljon, yleinen selviytyminen keuhkosyöpä on parantunut vain vähän neljän viime vuosikymmeninä [1 ]. Yksi usein ominaista keuhkosyöpä on poikkeama, jossa yksi tai useampi reseptorityrosiinikinaasit (RTK: t), kuten MET, EGFR, ja ALK, ovat yleisesti yli-ilmennetään, vahvistetaan, tai mutatoituja [2] – [4]. Eph perhe on suurin perhe RTK: iden, joka käsittää neljätoista nisäkkään reseptoreja, jotka toimivat vuorovaikutuksessa kahdeksan nisäkkään ligandien tai Efrii-. Ef reseptorit ja efriini ligandit järjestetään toiminnallisesti ja rakenteellisesti osaksi A- ja B-luokkien [5]. Ef reseptorit ovat melko samanlainen eri luokkiin; kuitenkin, membraaniin sitoutuneen efriini-B ligandit ovat ainutlaatuisia, että niillä solunulkoiset domeenit, jotka aktivoivat reseptoreita sekä solunsisäiset domeenit, jotka on ajateltu signaalin alavirtaan viereisen solun [6]. On olemassa jonkin verran vapaita keskuudessa reseptori ja ligandi vuorovaikutusten; yksi erityinen reseptori-ligandi vuorovaikutusten on kuitenkin välillä EphB4 ja efriini-B2 [7].

Klassisen, Ef reseptorit ovat olleet merkittäviä toimijoita kehitysbiologian antaneet roolit aksoniohjauksen, vaskulogeneesi, ja hermoston kehittymistä [8]. Kuitenkin useat Ef reseptorin perheenjäseniä on myös osoitettu olevan rooli syövän. Olemme äskettäin osoittaneet, että EphA2 yliekspressoituu keuhkosyöpä ja suhtautuu voitto-of-function pistemutaatio joissakin okasolukarsinoomia, ja EphA2 esto lisäksi rapamysiinin altistus keuhkosyöpäsoluissa vähentänyt niiden leviäminen

in vitro

[9]. EphB4 on myös raportoitu pelata onkogeenisessä rooli syöpien pään ja kaulan [10], [11], eturauhas- [12], [13], muut urogenitaalinen elinten [14] – [19], rintojen [20], mesothelium [21], ruokatorvi [22], iho [23], ja paksusuoli [24], [25]. EphB4 mutaatioita on myös äskettäin raportoitu keuhkosyövän [26], [27], vaikka niiden merkitys ei tällä hetkellä tiedetä. Kuitenkin, se ei ole systemaattisesti tutkittu keuhkosyöpää ja sen mahdollisen roolin tämän sairauden vuoksi on edelleen tärkeä kysymys.

Tässä osoitamme, että EphB4 on tärkeä terapeuttinen tavoite keuhkosyöpää, koska se on yli-ilmentynyt ja usein osoittaa lisääntynyttä geenin kopio numeroita. Lisäksi knockdown tai esto EphB4 vaimentaa syöpäsolujen kasvua

in vitro

ja

in vivo

, kun taas käyttöönotto villityypin EphB4 tarjoaa voitto funktion kasvainsoluissa. Yhdessä nämä tiedot tunnistaa EphB4 potentiaalisesti tärkeä kuljettaja patogeneesissä keuhkosyöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kasvaimen kudokset dokumentoitiin yhdessä potilasryhmät kun käytettävissä kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen mukaisesti ja University of Chicago Institutional Review Board-hyväksytty protokolla. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin Institutional Animal Care ja Käytä komitean University of Southern California ja suoritettu mukaisesti Eläinsuojelulain määräyksiä.

reagenssit ja vasta-

Kaikki alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer3Plus [28] ja ostetaan Integrated DNA Technologies (Coralville IA). Anti-EphB4 vasta-aineita (# 265 IB ja # 131 IHC), anti-efriini-B2-vasta-aineen (# 2B5), ja ihmisen seerumialbumiini konjugoidulla liukoinen EphB4 (sEphB4-HSA), olivat lähes täynnä antamat Gill Laboratory, University of Southern California. Efriini-B2 /Fc kimeerinen proteiini ostettiin R # 131), jonka konsentraatio on 40 ug /ml, inkuboitiin sitten 30 minuuttia vuohen anti-hiiri-IgG konjugoituna HRP-leimattu polymeeri (Bio SB, Santa Barbara CA). Objektilasit Sitten kehitettiin 5 minuuttia 3-3′-diaminobentsidiini Kromogeenin vastavärjättiin hematoksyliinillä, ja peitettiin. Negatiiviset kontrollit tehtiin korvaamalla primaarinen vasta-aine ei-immuuni hiiren immunoglobuliineja. Paksusuolensyöpä ja aivokudosleikkeiden toimi positiivisina kontrolleina EphB4 värjäystä [25], [29].

Tissue ilmaus kullekin näytteelle kvantitoitiin manuaalinen pisteytys on 0/1 + /2 + /3 + mittakaavassa , sekä Automated Cellular Imaging System (ACIS; Clarient, Aliso Viejo CA), joka kvantitoi värjäytymisen intensiteetti perustuu suhde ruskeasta sinisen pikselin pinta-alayksikköä kohti. ACIS ohjelmisto laskee keskimääräisen intensiteetin kunkin alueen analysoitiin ja laskee integroitu optinen tiheys (IOD), joka on suoraan verrannollinen vasta-aineen pitoisuus sitoutuneiden EphB4 molekyylit mukaan Beer-Lambertin laki [30]. Siksi IOD on proxy antigeenin sisältöä, ja se oli normalisoitu koko mitatun alueen laskemalla IOD /10 pm

2. Kaiken manuaalinen pisteytys ja ACIS analyysiä käytettiin rinnakkain ilmaisun kvantifiointimenetelmät ja havaittiin korrelaatio r

2 = 0,75 (Spearman korrelaatio, p 0,0001; Kuva S1). Koska ilmaisun kehitys oli samanlainen molemmilla menetelmillä, ensisijaisesti ACIS tiedot ilmoitetaan täällä. Ekspressiokuvioiden käyttäen samaa anti-EphB4-vasta-aine olivat samat tuore kudosnäytteiden (kuva S2).

immunoblottauksella

Koko-solulysaateista otettiin talteen käyttäen M-PER nisäkkään proteiinin uutto-reagenssia (Pierce , Rockford IL) täydennettynä 1,8 × proteaasinestäjä (Pierce) ja 1,8 × Halt fosfataasinestäjällä (Pierce). Proteiinipitoisuus arvioitiin käyttäen Nanodrop spektrofotometrillä (Thermo, Wilmington DE) ja 100 ug proteiinia ladattiin 7,5% geeliä ja alistettiin SDS-PAGE 80-120V 1-2 tuntia. Proteiinit siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvoja puolikuivaa siirtolaitetta on 25V: ssa 1 h, pestiin lyhyesti ja kalvot estettiin 5% naudan seerumin albumiinia (BSA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Seuraavat 5 minuutin pesun, kalvot altistettiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa anti- EphB4 primaarinen vasta-aine (anti-hiiri; # 265) tai anti-efriini-B2 primaarinen vasta-aine (anti-hiiri; # 2B5) pitoisuutena 0,5 ug /ml 2,5% BSA /0,05% Tween-20. Membraanit pestiin sitten kolme kertaa 10 minuutin ajan, ja inkuboitiin kuten edellä anti-hiiri-vasta-aine konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin (HRP) kanssa 1:5000 laimennus 1 tunnin ajan. Seuraavat toinen pesu, membraaneja inkuboitiin tiiviimpään kemiluminesenssin liuokseen (Bio-Rad, Hercules CA), ja valokuvattiin käyttäen Bio-Rad QuantityOne kuvantamisjärjestelmä. β-aktiini testattiin samalla tavalla kuin latauskontrollina. Eturauhassyövän solulinja PC3 käytettiin positiivisena kontrollina EphB4 ilmaisun [19].

virtaussytometria

Solut pestiin kerran fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja sitten liukenevat PBS /0,2% EDTA: ta 37 ° C: ssa noin 5 minuuttia. Neutraloinnin jälkeen EDTA elatusaineet, solut sentrifugoitiin 1000 rpm 5 minuuttia. Solut pestiin sitten kylmällä PBS /0,5% BSA: ta, jota seurasi inkubaatio 10% normaalia vuohen seerumia jään päällä 30 m, ja sitten primaaristen vasta-aineiden laimennettu normaalia vuohen seerumia jäällä 1 tunnin ajan. Solut pestiin sen jälkeen kylmällä PBS: llä ja inkuboitiin fluorokromilla konjugoitua sekundaarista vasta-aineiden jään päällä 30 minuuttia. Lopullisen pesun jälkeen kylmällä PBS: llä, solujen tumat värjättiin DAPI ja analysoitiin virtaussytometrillä (LSR II, BD Biosciences, Franklin Lakes NJ).

kvantitatiivinen PCR

Sen määrittämiseksi EPHB4 geenin kopioluku kudosten DNA, reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttäen Applied Biosystems StepOne Plus väline (Foster City CA). Reaktioseokset sisälsivät Fast SYBR Green Master Mix (2X; Applied Biosystems), genominen DNA, eteen ja taakse qPCR alukkeita (esitetty taulukossa S1), ja molekyylibiologia-luokan vettä yhteensä 25 ui reaktiota kohden. qPCR käyttäen LINE-1-alukkeet tehtiin rinnakkain palvelemaan geenin kopioluvun vertailukohtana normalisoida raaka-fluoresenssi-arvot, ja jotka sisälsivät eri laimennosten ohjaus genomista DNA: ta (Promega, Madison WI) käytettiin rakentamaan standardikäyrän ekstrapoloida kudosten DNA pitoisuudet ja tarkistaa, että nämä pitoisuudet laskivat lineaarisella tunnistusalueella instrumentin.

siRNA knockdown

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjat, solut levitettiin käyttäen antibiootti vapaa väliaine 96-kuoppaisille levyille tiheytenä 2,0 x 10

4 solua kuoppaa kohti (solujen elinkelpoisuuden määritykset, kahdeksan tai useampia rinnakkaista koetta kohti) tai 6-kuoppaisille levyille tiheytenä 5,0 x 10

5 solua kuoppaa kohti (ja koko solun lysaatti keräys) ja annettiin kasvaa 30-50% konfluenssiin. Solut transfektoitiin käyttäen Oligofectamine transfektioreagenssia (Life Technologies, Carlsbad CA) standardin mukaisesti protokollaa. FBS lisättiin 10% lopullinen konsentraatio 4 tunnin jälkeen. Transfektoimattomia ja valetransfektoidut solut toimivat vertailuryhmänä. Proteiini pudotus varmistettiin immunoblottauksella (kuvio S3).

pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) solulinjoissa, solut maljattiin käyttäen Opti-MEM median 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 5 x 10

5 solua kuoppaa kohti (kolme toistoa per kunnossa). Solut transfektoitiin 100 nM ei-kohdistuksen ohjaus siRNA tai EPHB4 kohdistamisen siRNA (Santa Cruz) käyttäen Oligofectamine transfektioreagenssia standardin mukaisesti protokollaa. Inkubaation jälkeen yön yli, solut kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen täydelliseen mediaan. Mock-transfektoituja ja ohjaus siRNA-transfektoiduissa soluissa toimivat kontrolleina. Proteiini pudotus vahvistettiin immunoblottauksella.

ilmentäminen EPHB4 konstruktit Cell Lines

villityypin EPHB4 cDNA-klooni on pCMV6-XL6 vektori (Origene, Rockville MD) käytettiin nisäkkään ekspressiovektoriin. Ohimeneviä transfektiota solut maljattiin antibioottia väliaineessa joko 96-kuoppaisille levyille tiheytenä 2,0 x 10

4 solua kuoppaa kohti (solujen elinkelpoisuuden määritykset, kahdeksan rinnakkaista koetta kohti) tai 10 cm: n maljoille tiheys 3,0 x 10

6 solua levyä kohti (kokonaisille-solulysaatista keräys) ja annettiin kasvaa noin 50-75% konfluenssiin (jotta eksponentiaalista kasvua seuraavien 72 tuntia). Solut transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000 transfektioreagenssia (Life Technologies) standardin mukaisesti protokollaa. Kompleksit poistettiin 4-6 tunnin kuluttua ja korvattiin tuoreella antibiootti-väliaineella pesun jälkeen PBS: llä. Transfektoitumattomat ja valetransfektoidun (transfektioreagenssi vain) solut toimivat kontrolleina. Proteiinin ilmentyminen varmistettiin immunoblottauksella (kuva S4).

vakaiden EphB4 ilmentävien solulinjojen

Villityypin täyspitkän EPHB4 cDNA (GenBank NM_004444; Origene, Rockville MD) kloonattiin pcDNA3.1, jossa C-terminaalisen myc-kehyksessä. Tämä vektori ja ohjaus pcDNA3.1 tyhjän vektorin yksilöllisesti transfektoitiin H661-soluihin käyttämällä Biot (Bioland, Paramount CA) valmistajan protokollan. Transfektion jälkeen elatusaine vaihdettiin lopulliseen kasvualustaan ​​(RPMI1640: tä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää), joka sisälsi 300 ug /ml G418: aa. Yksi viikko myöhemmin, elossa solut trypsinoitiin ja maljattiin 96-kuoppalevyille asteittaisella laimennoksilla. Pitoisuus G418 viljelyalustassa alennettiin 200 ug /ml tästä eteenpäin. Yksittäisiä pesäkkeitä syntyi kaksi viikkoa myöhemmin ja seulottiin immunoblottauksella käyttäen anti-Myc-vasta (klooni 9E10, ATCC). Pesäkkeet, joissa eksogeeninen EphB4-Myc ilmentymisen levitettiin sitten.

elinkykyyn määritykset

NSCLC solulinjoja, transfektion jälkeen siRNA: sta tai plasmideista soluihin tai solujen käsittely sEphB4-HSA 96- kuoppalevyillä kuten edellä on kuvattu, solut jätettiin kasvamaan, kunnes haluttu ajankohta, jolloin väliaine poistettiin, solut pestiin kerran PBS: llä, ja 100 ui tuoretta elatusainetta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Sen jälkeen kun oli lisätty 5 ui 0,028%: resatsuriinin natrium- suolaa liuosta (paino /tilavuus; Sigma), inkuboitiin 37 ° C: ssa valolta suojattuna ja 2-5 tunnin ajan, ja fluoresenssi mitattiin käyttämällä fluoresenssilevylukijaa (530/590 nm eksitaatio /emissio). Sillä efriini-B2 /Fc stimulaation määritykset, 5 x 10

4 solua /kuoppa siirrostettiin 24-kuoppalevyille, nälässä yön yli ja stimuloitiin 1 ug /ml efriini-B2 /Fc 0, 24, 48 tai 72 tuntia. Solut pestiin kahdesti 1 x PBS: llä, värjättiin Trypan Blue-liuosta (0,4%, Sigma), ja ne laskettiin manuaalisesti valomikroskoopilla.

SCLC-solulinjat, solut maljattiin kolmena kappaleena tiheydellä 1 x 10

5 solua /kuoppa ja käsiteltiin 0,5 ug /ml efriini-B2 /Fc tai osoitetut pitoisuudet AZ12489875-002. SiRNA-transfektoiduissa soluissa, solut otettiin talteen 24 tuntia transfektion jälkeen, suspendoitiin uudelleen täydelliseen media, maljattiin kolmena kappaleena tiheydellä 1 x 10

5 solua /kuoppa, ja ne jätetään hoitamatta tai hoidettiin 200 nM SN-38 72 tuntia 37 ° C: ssa. Sillä efriini-B2 /Fc stimulaation määritykset, 5 x 10

4 solua /kuoppa siirrostettiin 24-kuoppalevyille, nälässä yön yli ja stimuloitiin 0,5 ug /ml efriini-B2 /Fc: ssa 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin lisäämällä 10 ui 5 ng /ml MTT: tä (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi; Sigma) lopulliseen 2-4 tunnin viljelyn. Liukenematon formatsaaniksi suolat liuotettiin lisäämällä 50 ui on hapatettu isopropanoliliuoksessa. Absorbanssi luettiin 570 nm 15 minuutin kuluessa reaktion pysäyttämisestä käyttäen absorbanssia levynlukijaa.

topoisomeraasi I Activity Assay

H446 ja H526-solut jätettiin stimuloimattomia tai stimuloitu 15 minuuttia 50 ng /ml HGF tai efriini-B2 /Fc, sitten pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä. Tumauutteita valmistettiin, kuten on aiemmin kuvattu [31]. Lyhyesti, solut kerättiin sentrifugoimalla ja pestiin kerran jääkylmällä TEMP (10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 4 mM MgCI

2, 0,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF)). Solut sen jälkeen suspendoitiin 1 ml: aan kylmää TEMP 10 minuuttia ja sentrifugoitiin sitten 1500 x

g

10 minuuttia. Nuclear pelletit resuspendoitiin 20 ul TEP (10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,5 mM PMSF) plus 20 ui 1 M NaCl, sijoitettiin jäille vähintään 30 m, ja sen jälkeen sentrifugoitiin 15000 x

g

15 minuuttia.

TOP1

entsyymiaktiivisuus tumaekstrakteilla mitattiin käyttämällä DNA rentoutumista määritystä (TopoGen, Port Orange FL) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, 100 ng superkierteistä plasmidi-DNA: ta 20 ul reaktioseosta (10 mM Tris-HCl (pH 7,9), 1 mM EDTA, 150 mM NaCI, 0,1% BSA: ta, 0,1 mM spermidiiniä, 5% glyseroli) inkuboitiin 37 ° C ° C: ssa 30 minuuttia siisti ja sarjalaimennetun (01:04) tumaekstrakteilla, puhdistettua rekombinanttista ihmisen

tOP1

(positiivinen kontrolli), tai määritys laimennusainetta (negatiivinen kontrolli). Reaktiot lopetettiin lisäämällä 5 ui 5 x latauspuskuria (5% SDS, 0,3% bromifenolisinistä). Näytteet erotettiin 1% agaroosigeelillä ja kuvattiin kuten edellä.

Soft Agar Colony muodostumisen määritys

arvioimiseksi Tuumorigeenisuustutkimuksissa villityypin EphB4-solut, 1 x 10

4 elävää solua per kuoppa maljattiin pehmeässä agarissa 6-kuoppaisilla levyillä. Lyhyesti, pohjakerros on valmistettu sekoittamalla yhtä suuret tilavuudet steriiliä 1,2% agaria (jäähdytetty 40 ° C) ja 2 x RPMI1640, jotta saadaan lopullinen liuos, jossa oli 0,6% agaria 1 x RPMI 1640-väliaine. Pintakerroksen, agar laimennettiin 0,8% tislattua vettä, jäähdytettiin 40 ° C: seen, ja sekoitetaan sitten yhtä suurina määrinä 2 x RPMI 1640-väliaineessa. Solut lisättiin välittömästi seokseen, jolloin saatiin lopullinen liuos, jossa oli 0,4% agaria 1 x RPMI 1640-väliaine. Solut kasvoivat ja 4 viikkoa 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2, jossa vaiheessa elinkelpoisia pesäkkeet valokuvattiin ja laskettiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa.

Wound Healing määritykset

H661 tyhjä vektori ja villityypin EPHB4 vakaa klooni-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä viljeltiin, kunnes 100% konfluentteja, käsiteltiin sitten 1 ug /ml efriini-B2 /Fc. Suora naarmu tehtiin poikki solukerrokselle käyttäen 1 ml: n pipetin kärki. Sitten solut pestään varovasti 1 x PBS: llä solujätteen poistamiseksi, ja kasvatusliuos korvattiin. Otettiin valokuvia haava- aluetta 0, 4, 7, 23, ja 28 tuntia ja analysoitiin TScratch ohjelmisto (CSELab, ETH Zurich, Sveitsi).

In vivo

Tumor Growth

2 x 10

6 A549 tai H1993 tai 4 x 10

6 H446 solua ruiskutettiin kylkiin 10-12 viikon ikäisten Balb /C kateenkorvattomissa hiirissä (Harlan Laboratories, Placentia CA ) ja voivat perustaa primaarikasvainten noin 75 mm

3 tilavuudessa. Kylki injektiot valittiin yli potilaalle tehdä mallin vuoksi vakiintunutta käyttöä keuhkosyövän tutkimuksissa sekä niiden helppous ei-invasiivisia kasvain mittaukset [32]. Kasvaimen kasvu mitattiin kolmesti viikossa, ja tilavuus laskettiin käyttäen 0,52 × a × b

2 (johdettu tilavuudesta laskettaessa pallomainen, V = 4/3 · π ·

2 · b, jossa on säde pienemmän akselin ja b on säde pääakselin; Ref. 33), jossa on pisin ulottuvuus ja b on lyhin ulottuvuus tuntuvaa massa. Kuusi päivää istuttamisen jälkeen, hiiret A549 ksenografteja jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään (kuusi hiirtä ryhmää kohti), ja hoito aloitettiin: PBS (kontrolli), paklitakselin (20 mg /kg kerran viikossa), sEphB4-HSA (20 mg /kg kolme kertaa viikossa), tai paklitakselia plus sEphB4-HSA. Hiiret, joilla H1993 tai H446 ksenografteja jaettiin kahteen ryhmään (kuusi hiirtä ryhmää kohti), ja hoito aloitettiin: PBS (kontrolli) tai sEphB4-HSA (50 mg /kg kolme kertaa viikossa). Kaikki käsittelyt annettiin intraperitoneaalisesti. Eläimet olivat lopulta tapettiin ja kasvaimet kerättiin lopussa kokeen.

Immunofluoresenssikoe

kudokset kerättiin hiiren A549 ksenografteista jäädytettiin ja upotettiin OCT yhdistettä. 5-10 um: n leikkeet fiksoitiin 4% paraformaldehydi, pestiin PBS: ssä, ja inkuboitiin ensisijainen anti-Ki-67 (BD Biosciences), anti-CD31 (BD Biosciences), anti-fosforyloitu S6 (S235 /S236, Cell Signaling, Danvers MA), anti-fosforyloitu Akt [S473 (Ref. 34); Cell Signaling], tai anti-fosforyloitu Src (Y416; Cell Signaling), vasta-ainetta yli yön 4 ° C: ssa. Immunofluoresenssi-, leikkeet pestiin PBS: ssä ja inkuboitiin Alexa Fluor-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Life Technologies). TdT välittämää dUTP nick-end merkinnät (TUNEL) määritys (Promega, Madison WI) suoritettiin myös arvioida apoptoosin. DAPI käytettiin ydin- vastavärinä ja toimi kontrollina, jota vastaan ​​solujen markkeri intensiteettiä normalisoitiin. Kuvat otettiin Nikon Eclipse 80i fluoresenssimikroskooppiin ja Meta Morph kuvantamisen sarjan järjestelmään. Immunohistokemiaa, inkuboitiin ensin biotiini-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen, jota seurasi HRP-konjugoitu avidiini, sitten 3,3′-diaminobentsidiiniä reagenssi (Vector Labs, Burlingame CA). Hematoksiliini käytettiin ydin- vastavärinä. Kuvat otettiin käyttäen Olympus BX51 mikroskoopilla ja Image-Pro Plus 6.0 järjestelmä.

Tilastot

immunohistokemiallisella värjäyksellä analyysit, log

10 ACIS arvot kasvain verrattuna vastaaviin normaaleihin keuhkojen kudokset verrattiin käyttäen kaksisuuntaista pariksi t-testi yleistä potilaan kohortin sekä yksittäisissä alatyyppejä. Jokainen ACIS intensiteetti pistemäärä keskiarvo enintään kolme rinnakkaista tietyn potilaalle määritetään erillistä kudosta sydämiä samassa kasvain mikrosirulla. Aste samankaltaisuuden ACIS ja manuaalinen patologinen pisteytys määritettiin käyttämällä kaksisuuntaisia ​​Spearmanin korrelaatiota. Survival tiedot esitetään käyttämällä Kaplan-Meier käyrät perustuvat immunohistokemiallista intensiteetti pisteytys (korkea verrattuna matala käyttäen cutoff pisteet 500 on ACIS, joka edustaa mediaani yleistä intensiteetti) ja rotuun nimeämistä.

solujen elinkelpoisuuden määritykset, jäljitellä datapisteitä laskettiin keskiarvo ja verrattiin joko aika-Hyväksytty mock-transfektoituja soluja (siRNA-transfektoiduissa soluissa) tai aika-sovitettua kontrolli soluja (for sEphB4-HSA-käsitellyt solut). Vertailla hoitoja pareittain, opiskelijan t-testiä käytettiin. Muut vertailut kaksi ryhmää tehtiin käyttäen Studentin t-testiä, ja niitä on kolme tai useampia ryhmiä tehtiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA. Arvioida vaihtelua joukon välillä hoidon olosuhteissa useana ajankohtana, kaksisuuntainen ANOVA käytettiin. Ellei toisin ole osoitettu, virhepylväät käytetään näyttämään solujen elinkyvyn tiedot ovat standardin keskivirhe normalisoituna prosenttia ero verrattuna kontrolliarvoihin. Sillä

in vivo

kasvun määrityksiä, tilastollista merkitystä erojen kasvaimen kasvua kunakin ajankohtana kussakin tila määritettiin käyttäen joko opiskelijan t-testi parittomia näytteiden tai yksisuuntainen ANOVA näytteiden joukossa neljässä hoitoryhmässä. Jonka perusteella tilastollinen merkitys muutoksen keskimääräisen kasvaimen tilavuuden yksittäisen hoitoryhmään, opiskelijan t-testiä käytettiin. Kaikki tilastolliset laskelmat suoritettiin käyttämällä Prism ohjelmistoa (GraphPad, La Jolla CA) tai SAS tilastopaketilla (Cary NC).

Tulokset

EphB4 on yli-ilmentynyt ja lisännyt geenikopioluku- numerot Lung Cancer

pairwise analyyseissä 89 vastaaviin normaaleihin ja kasvaimen näytteitä keuhkosyöpäpotilaita, löysimme EphB4 olevan merkittävästi yliekspressoituvan verrattuna pariksi normaaleissa kudoksissa in adenokarsinooma (n = 41; 4,3-kertainen keskimääräinen ero), suuret karsinooma (n = 15; 2,9-kertainen keskimääräinen ero), pienisoluinen karsinooma (n = 13; 2,4-kertainen keskimääräinen ero), ja okasolusyöpä (n = 10; 2,7-kertainen keskimääräinen ero) alatyyppeihin. Kaiken kasvaimet havaittiin ilmentävän EphB4 3,2 kertaa voimakkaammin kuin pariksi normaaleissa kudoksissa (kuvio 1). EphB4 viereisissä normaalissa keuhkokudoksessa on kuvassa S5.

. Edustavia immunohistokemia kuvia EphB4 ilmaisun useille keuhkosyöpä alatyyppejä. Patologinen pisteytys on ilmoitettu edellä sarakkeita; oikeanpuoleisin paneeli on korkeamman tehon näkymä vastaava 3+ kuvien näyttämiseen subsellulaaristen värjäyskuviot. Huomautus lausutaan kalvomainen värjäystä suurissa karsinooma.

B

. EphB4 ekspressiokuvioita eri keuhkosyöpä alatyyppejä rotuun ja vaihe jakelu. Yksittäiset pisteet edustavat keskiarvoa ACIS tulokset yhdessä potilaan vastaavassa normaalissa ja tuumorikudoksissa. Kokonaismäärä potilasta kussakin analyysi alla näkyy kuvaajia. Vain potilaita, pariksi kasvain ja normaaleista kudoksista sisällytettiin analyyseihin. Vaakapalkeilla edustavat keskiarvoa ACIS pisteet kaikilla potilailla annetulle. Rotu ja kliinisessä vaiheessa jakaumat kullekin alatyypin ja yleinen sarja näytetään alla kunkin kaavion.

Havaitsimme myös, NSCLC solulinjan ilmentymistä EphB4 proteiinin välityksellä immunoblot-analyysillä (kuvio 2A). Kuusi kahdeksasta NSCLC solulinjojen (A549, H358, H522, H1703, H1993, SW1573) ilmaistuna EphB4 merkittävässä määrin, yksi (H661) osoittivat alhainen EphB4 ilmaisun, ja yksi (H2170) puuttui EphB4 ilmaisua. EphB4 ligandi efriini-B2 ilmentyi tasaisen pienenä kaikissa testatuissa solulinjoissa. Expression of EphB4 paneelissa kahdeksasta SCLC-solulinjat tutkittiin immunoblottauksella (kuvio 2B) ja virtaussytometria (kuvio 2C). Neljä SCLC solulinjoja (H82, H249, H446, H2171) ilmaisi EphB4 immunoblottausanalyysillä, kun taas H69 ja H526-solut eivät ilmaisseet EphB4. Pinta ilmentymä EphB4 mukaan virtaussytometrianalyysin pitkälti validoitu immunoblot havainnoista.

A-B

. EphB4 proteiinin ilmentymistä paneelit NSCLC ja SCLC solulinjoissa immunoblottauksella. Efriini-B2 ilmentyminen arvioitiin myös NSCLC solulinjoissa. BEAS-2B on kuolemattomaksi, ei-syöpä keuhkosyövän solulinjassa käytetään tässä kontrollina; eturauhassyövän solulinjaa PC3 sisällytettiin positiivisena kontrollina. B-aktiini ja GAPDH käytettiin lastaus valvontaa.

C

. EphB4 ilmentyminen paneelin SCLC-solulinjat arvioitiin virtaussytometrialla käyttäen EphB4-spesifistä vasta-ainetta (punainen). Normaalin hiiren IgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina (sininen). EphB4 positiivisuus ilmaistaan ​​prosentteina koko solujen näkyy oikealla kunkin paneelin.

Määritä EPHB4 geenikopiomäärä kudosnäytteistä, teimme qPCR analyysin ja totesi, että useissa kudoksissa havaittu olevan EPHB4 geeni kopio numeroita. Kuusi, yhdeksän, ja 23 prosenttia adenokarsinooma, pienisoluinen karsinooma, ja okasolusyöpä kudoksiin, vastaavasti, havaittiin sisältävän enemmän kuin kolme EPHB4 geenin kopiota, oli 14% okasolusyöpä kudoksiin, joissa on enemmän kuin 10 kopiota (kuvio S6) . Ei testatuissa solulinjoissa havaittiin osoittaa geenikopiomäärä voittoja.

EphB4 Expression ja ennustettavuutta Lung Cancer

Yhteenveto kliinisistä ominaisuuksista potilaan kudosten Tässä tutkimuksessa käytetty on esitetty taulukossa S2. Potilaan selviytyminen oli vahvasti korreloi positiivisesti kasvain ilmaus EphB4, kuten ne, joilla on korkea EphB4 ilme on eloonjäämismediaani kolminkertaisen pidempään kuin ne, joilla on alhainen ilmaisun (51 kuukautta vs. 17 kuukautta, p = 0,021; Kuva 3A). Valkoihoisiin todettiin myös ilmaista EphB4 huomattavasti voimakkaammin kuin Afrikkalainen Amerikan potilailla (p = 0,019; tuloksia ei ole esitetty); kuitenkaan tämä ei kääntää eroa selviytymisen ositettu rodun (p = 0,92, kuvio 3B). Ei ollut merkittävää yhdistyksen välillä EphB4 ilmaisun ja muut potilasryhmät, kuten sukupuoli, tupakointi ja ikä diagnoosin, joko koko potilaan kohortin tai ositettu keuhkosyöpä alatyypin.

ordinaatta-akselilla kussakin kuvaaja osa elävien potilaiden.

. Survival stratifioitu EphB4 ilme. ACIS vaikeusasteeltaan yli ja alle 500 valittiin kerrostuminen perustuu mediaanipisteet koko kohortin. Nuolet edustavat eloonjäämismediaani (50% asuu potilasta) kuukautta.

B

. Survival stratifioitu rotu.

EphB4 Modulation Vaikuttaa Cell Growth

in vitro

Keuhkosyöpä solut transfektoitiin ohimenevästi EPHB4 suunnatulla siRNA tai käsitelty sEphB4-HSA kulttuuriin onko solujen elinkelpoisuuden kärsisi. sEphB4-HSA on monomeerinen proteiini-fragmentti, joka käsittää solunulkoisen domeenin EphB4 ja konjugoidun ihmisen seerumin albumiinia, joka voi sitoutua efriini-B2-ligandi ja näin ollen antagonisoivat EphB4-reseptorin aktivaation kautta häiriöitä välisen vuorovaikutuksen EphB4-reseptorin ja efriini-B2-ligandin [35], [36]. Vuonna A549-solulinja, elinkelpoisuus altistumisen jälkeen sEphB4-HSA pieneni noin 17% ja pienin pitoisuus ja 40% kanssa korkeimmat pitoisuudet sEphB4-HSA jälkeen 96 tuntia (kuvio 4A). Vuonna H522 solulinjassa, samanlainen vaikutus nähtiin suurin annos 96 tuntia (~58% vähennys), kun taas alempi kaksi pitoisuudet aluksi vähentynyttä elinkykyisyyttä verrattuna kontrolliin soluissa, mutta oli sen vaikutus vähenee myöhempinä ajankohtina (kuvio 4A) .

. A549 ja H522-soluja käsiteltiin liukoisella EphB4 annettuina pitoisuuksina, ja sen vaikutus solujen elinkyky mitattiin yli ajankohtina esitetty käyttäen resatsuriinia fluoresenssia.

B

.

C

.

B

.

C

. Virhe palkit osoittavat SD.

B

.

C

.

B

.