Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli määrittää sytotoksisia ja apoptoottinen vaikutus erythrocarpine E (CEB4), joka on limonoidi- uutettu

Chisocheton erythrocarpus

ihmisen suun okasolusyöpä. Alustavien dimetyyli-2-tiatsolyyli-2,5-difenyyli-2H-tetratsoliumbromidia (MTT) määritykset, CEB4 käsitelty HSC-4-solut osoittivat sytotoksisen vaikutuksen ja esti solujen lisääntymistä ajassa ja annoksesta riippuvaisella tavalla IC

50-arvo 4,0 ± 1,9 uM 24 tunnin kuluessa hoidon. CEB4 todettiin myös olevan minimaalinen sytotoksisia vaikutuksia normaali solulinja, NHBE solujen elinkelpoisuuden tasoa ylläpidetään yli 80%, kun käsittelyä. Anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC), poly-ADP riboosi-polymeraasi (PARP) pilkkominen ja DNA: n fragmentoituminen määrityksen tulokset osoittivat, että CEB4 indusoi apoptoosia välittämän solukuoleman. Western blotting tulokset osoittivat, että apoptoosin induktio CEB4 näytti välittyvän säätelemällä p53-signalointireitin koska ei ollut kasvua p53 fosforylaation tasoja. CEB4 havaittiin myös säätää ylös pro-apoptoottisen proteiinin, Bax, kun taas alaspäin säätäminen anti-apoptoottisen proteiinin, Bcl-2, mikä viittaa siihen, että luontainen mitokondrioiden kautta. Alentuneita initiaattorin prokaspaasi-9 ja executioner kaspaasi-3: n tsymogeeni havaittiin myös seuraavat CEB4 altistuksen siten osoittaa osallistumista sytokromi c: n välittämää apoptoosia. Nämä tulokset osoittavat sytotoksista ja apoptoottisten kyky erythrocarpine E, ja ehdottaa sen mahdollinen kehittyminen syövän chemopreventive ainetta.

Citation: Nagoor NH, Shah Jehan Muttiah N, Soon Lim C, In LLA, Mohammad K, Awang K (2011) asetus Apoptotic tehosteiden Erythrocarpine E, sytotoksisen limonoidi- iältään

Chisocheton erythrocarpus

HSC-4 Human Oral Cancer Cells. PLoS ONE 6 (8): e23661. doi: 10,1371 /journal.pone.0023661

Editor: Paul C. Driscoll, MRC National Institute for Medical Research, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 toukokuu 2011; Hyväksytty: 22 heinäkuu 2011; Julkaistu: 17 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Nagoor et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Malayan yliopisto jatko Research Grant (PPP) (PS166-2008B), tiede, teknologia ja innovaatio (MOSTI) eScience Fund (12-02-03-2022), University of Malaya Research Grant (UMRG ) (RG0008 /09BIO), ja keskuksen Natural Product Research and Drug Discovery (CENAR) Grant (4911274). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Various luonnollinen phytocompounds on seulottu ja tutkittu laajasti mahdollisina syöpälääkkeet. Noin 74% huumeiden, jotka oli hyväksytty syövän hoitoon on uutettu luonnollisista lähteistä, joko luonut rakenteellisen muutoksen tai synteettisesti ja suunniteltu perustuen luonnon yhdisteitä mallina [1]. Useimmat luonnon syöpälääkkeet käytettävissä tähän mennessä on saatu kasveista, eläimistä, merieliöiden ja mikro-organismeja. Joitakin käytetään nykyisin esimerkkejä kasviperäisiä yhdisteitä syöpää torjuvia toiminta 1’S-1’acetoxyeugenol asetaatti ja 1’S-1′-acetoxychavicol asetaatti [2], vinkristiini, irinotekaani, etoposidi ja paklitakseli, vaikka bleomysiinin ja doksorubisiini ovat mikrobien peräisin olevat yhdisteet, ja citarabine johdettu meren lähteistä [3].

alaryhmä luonnollisia yhdisteitä tunnetaan limonoids, ovat erittäin happipitoista tetrasyklisiä triterpene johdannaisia ​​ja on tunnustettu omaavan mielenkiintoisia biologisia vaikutuksia. Tähän mennessä monet limonoids on eristetty monia biologisia vaikutuksia, mukaan lukien hyönteisten anti-feedant, kasvua inhiboivat ominaisuudet ja anti-inflammatoriset aineet [4]. Useat sitrushedelmien limonoidi- Aglykonit kuten limonin, nomilin, obacunone, isoobacunoic happo ja ichangin äskettäin joutuneet syöpälääkkeen seulontamenetelmät, ja todettiin aiheuttavan merkittäviä glutationi-S-transferaasi (GST) ja kiniini reduktaasi (QR) aktiivisuus maksan ja suoliston limakalvon hiirillä ja rotilla vastaavasti [5] – [6]. Muut raportit sisältävät viitteitä siitä, että seokset limonoidi- Aglykonien kanssa limonoidiglukosiideja oli yhtä tehokas kuin tamoksifeeni estämään leviämisen ER rintasyövän soluja, ja vieläkin suurempi teho vastaan ​​estrogeenista riippumaton rintasyöpä solut [7]. Limonoids alkaen Etanolisuodos uutetta

neempuu

(neem kuori, lehdet ja siemenet öljy) havaittiin myös aiheuttavan solukuolemaa eturauhassyöpäsolujen (PC-3) indusoimalla apoptoosin supistamalla Bcl-2: n ilmentymisen tasoilla vastaava kasvu Bax tasoilla [8].

tällä hetkellä prosessi apoptoosin ja sen merkitys syövän edullisena tila kuoleman takia tehokas puhdistumaan apoptoottisten solujen aiheuttamatta tulehdusta on tullut yksi prioriteettialoilla syöpätutkimuksessa [9]. Viimeaikaiset tutkimukset suoritettiin limonoids uutettu

Citrus aurantifolia

osoitti, että esiintyminen apoptoosin välittämän indusoimalla kaspaasi-3 vetämänä luontainen polku ja vapauttamaan sytokromi-c ihmisen haimasyövän soluja [10 ]. Luonnollinen limonoidi-, erythrocarpine E (CEB4), joka käytettiin tässä tutkimuksessa, on A, B, D-seco heptacyclic limonoidi- kanssa sinnamoyyli ryhmä sivuketjussa C-3 uutetaan kuori

Chisocheton erythrocarpus

Hiern päässä MELIACEAE perhe, joka tunnetaan yleisesti nimellä ”Rongga” Malesiassa. Äskettäin on osoitettu, että CEB4 indusoi sytotoksinen vaikutus P-388 hiiren leukemiasoluja IC

50 16,0 ug /ml [11]. Tässä tutkimuksessa CEB4 tutkittiin sen pystyy aiheuttamaan apoptoosin HSC-4 ihmisen suun levyepiteelisyöpä (SCC).

Materiaalit ja menetelmät

Kasviaines

Chisocheton erythrocarpus

Hiern kerättiin Hutan Simpan Terenas, Kedah, Malesia. Näyte tunnistettiin Mr. Teoh Leng Eng päässä Dept. of Chemistry, Faculty of Science, University of Malaya. Tosite näyte (KL 4863) oli talletettu kemian Kasvimuseo, Malayan yliopisto.

reagenssit

Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM) ja Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI- 1640) ja 4,5 g glukoosia /l, 300 mg /l L-glutamiinia, 2,5% (v /v) trypsiinillä modifioitu Hankin tasapainotettua suolaliuosta (HBSS) ilman kalsiumin tai magnesiumin, naudan sikiön seerumia (FBS), ja kaikki antibiootit ostettiin Lonza Inc., USA. Dimetyyli-2-tiatsolyyli-2,5-difenyyli-2H-tetratsoliumbromidia (MTT) reagenssi, anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) apoptoosin detektioreagenssipakkaus, propidiumjodidi (PI), RNaasi ja SuicideTrack ™ DNA Ladder eristäminen kit hankittiin Calbiochem (CA, USA).

Extraction ja eristäminen luonnollinen yhdiste

Kuivattu maahan kuori (1,3 kg)

Chisocheton erythrocarpus

uutettiin peräkkäin heksaanilla, dikloorimetaanin ja metanolin. Kukin uute kuivattiin sitten

tyhjiössä

. Kuivattu dikloorimetaani uute (4,0 g) altistettiin fraktiointi silikageelipylväskromatografialla käyttäen liuottimena seosta heksaani-etyyliasetaatti. Napaisuus liikkuva faasi kasvoi vähitellen 100%: iin etyyliasetaattia. Fraktio, joka eluoitui 30%: lla etyyliasetaattia, joka sisälsi kohdeyhdisteen, erotettiin preparatiivisella ohutkerroskromatografialla (TLC) ja heksaani-etyyliasetaatilla (7: 3), jolloin saatiin erythrocarpine E (4,7 mg).

solulinjat ja viljelyolosuhteet

, viiden ihmisen kasvainsolulinjojen käytettiin tässä tutkimuksessa, joka käsittää HSC-4, HSC-2 suun kasvainsolulinjoja ja Ca Ski kohdunkaulan tuumorisolulinja saatu Cancer Research aloitteen Foundation (CARIF, Malesia), MCF-7 rinta-adenokarsinooma, ja HepG2-hepatokarsinooma, jotka on saatu yliopiston malaya Medical Center (UMMC), ja normaaleihin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (NHBE) (Lonza Inc., USA) käytetään normaalia solujen valvontaa. Rutiinihuollon HSC-4, HSC-2, Ca Ski ja HepG2-soluja viljeltiin DMEM: ssä ja MCF-7-solut viljeltiin RPMI-1640, sekä medioille täydennetty 10% (v /v) FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. NHBE soluja viljeltiin keuhkoputkien epiteelin ruselatusaineeseen (BEBM) 10% (v /v) FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja kasvatettiin yksikerrosviljelminä 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2/95% ilmaa.

MTT solunelinkykyisyysmääritys

sytotoksisia vaikutuksia CEB4 kaikissa solulinjoissa määritettiin käyttäen MTT-määritystä menetelmällä. CEB4 liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) siten, että lopullinen konsentraatio on 10 mM. Lyhyesti 1,0 x 10

4 solua 100 ui elatusainetta ympättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevylle, kun läsnä tai poissa CEB4 loppupitoisuuksina 5 uM 40 uM jopa 24 tuntia. MTT (5 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan (10 ul /kuoppa) ja levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 tuntia. Inkubaation jälkeen elatusaine korvattiin 200 ul DMSO: ta ja absorbanssi mitattiin 570 nm: ssä kuhunkin kuoppaan käyttämällä mikrolevyn lukijaa (Tecan Sunrise®, Sveitsi).

anneksiini V-FITC /PI-analyysi

havaitseminen apoptoosin tehtiin käyttämällä anneksiini V-FITC /PI apoptoosin havaitsemiseen mukainen pakkaus valmistajan protokollaa. Lyhyesti, sekä CEB4 käsitellyn ja käsittelemättömän HSC-4 ja NHBE solut kerättiin trypsinisaatiolla, pestiin 1 x PBS: llä ja värjättiin anneksiini V-FITC-konjugaatilla ja PI. Sitten solut analysoitiin virtaussytometrialla (BD FACSCalibur ™, USA) käyttäen BD CellQuest- hankinnan ja analyysin ohjelmisto.

DNA Fragmentation Pitoisuus

Yhteensä DNA uutettiin sekä käsittelemättömien ja käsiteltyjen solujen kanssa CEB4 varten 12 ja 24 h käyttäen SuicideTrack ™ DNA Isolation Kit valmistajan ohjeiden mukaisesti protokollaa. Eristetty DNA analysoitiin 1% (paino /tilavuus) agaroosigeelillä elektroforeesilla ja värjättiin etidiumbromidilla. Pirstoutuminen DNA havaittiin UV-valaisun käyttämällä geeliä asiakirjat järjestelmään (Alpha Inotech, USA).

Western-blottaus

CEB4 käsiteltiin HSC-4-soluja kasvatettiin solutiheyteen 80-90 % konfluenssiin, pestiin jääkylmällä 1 x PBS: lla ja proteiinit eristettiin käyttäen NE-PER® ydin- ja Sytoplasmiset Extraction Kit (Pierce, USA). Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttäen Bio-Rad DC-proteiinin määritys (Bio-Rad Laboratories, USA). Yhtä suuret määrät proteiinia tehtiin 12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Kalvot jälkeen inkuboitiin yhdeksällä ensisijainen vasta-aineita β-aktiini, poly-ADP riboosi-polymeraasi (PARP), p53, fosfo-p53, hiiren kaksinkertainen minuutti 2 (MDM2), Bax, Bcl-2, prokaspaasi-3 ja prokaspaasi-9 . Pesun jälkeen Tris-puskuroidulla suolaliuoksella ja Tween-20 (TBST) puskuri, piparjuuriperoksidaasi (HRP) -sidoksellisia sekundaariset vasta-aineet lisättiin ja sitoutuneet proteiinit havaittiin lisäämällä kemiluminesenssin signaaleja käyttäen x-ray elokuvia. Suhteelliset intensiteetit kaikista kvantitoitiin käyttäen kuva-analyysiä ohjelmiston (NIH ImageJ v1.43, National Institutes of Health, USA).

Tilastollinen analyysi

Kaikki tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D. saatujen tietojen kolmen erillisen kokeen. Tilastollista merkitsevyyttä eri ryhmien määritettiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA. Merkittäviä eroja pidettiin p≤0.05.

Tulokset

eristäminen ja karakterisointi Erythrocarpine E (CEB4) B

CEB4 (erythrocarpin E) eristettiin valkoisena amorfisena jauheena. Molekyylikaava oli C

36H

40o

10, joka määritettiin [M + H]

+ piikin kohdassa m /z 633,2703, että korkean resoluution nopeasti atomipommitusmassaspektrometria (HRFABMS) . Infrapuna-absorptiot 3413 cm

-1 ja 1700-1730 cm

-1 osoitti, että läsnä hydroksyyli- ja eri karbonyyliryhmiä. Vuonna

1H NMR-spektri, tyypillinen liittyvien piikkien limonoidi- luuranko tunnistettiin. Furaani sivuketju δ 7,64 (

s

), δ 6,29 (

br s

), ja δ 7,30 (

d

, J = 1,5 Hz), syyksi H-21, H-22 ja H-23, vastaavasti. Signaalit, jotka johtuvat happipitoista Metin protonien H-3 klo δ 4,91 (

d

, J = 10,2 Hz) ja H-17 δ 5,46 (

s

) olivat helposti eriytetty ja siirrettiin perustuu signaali moninaisuus. Toisaalta, esiintyminen happisillan joka yhdistää C-1 C-29 pidettiin harvinaista [11]. Eristetty diasterotopic metyleeniprotonit H

2-29 havaittiin kuin dublettipari δ 3,46 ja δ 3,88, ja kytkentävakio on 9,3 Hz. Tällä allyylialkoholi alusrakenteen olefiininen signaali löydettiin δ 5,53 (dd, J = 1,7, 7,1 Hz). Cinnamate sivuketjun C-3 varmistettiin läsnä viisi aromaattista protonia alueella δ 7,10-δ 7,20 ja ominaisuus dubletti signaalit H-2 ’ja H-3’ at δ 6,25 (

d

, J = 16,0 Hz) ja δ 7,58 (

d

, J = 15,7 Hz). Suhteellinen stereorakenne erythrocarpin E perustettiin läpi ydin- Overhauser- vaikutus spektroskopia (NOESY). Kemiallinen rakenne CEB4 on esitetty kuviossa 1.

CEB4 estää proliferaatiota HSC-4 Cells

MTT testit suoritettiin arvioimaan sytotoksisia ominaisuuksia ja estävä pitoisuus (IC

50) arvot CEB4 viiden ihmisen kasvaimen ja NHBE normaali solulinjoissa. Tulokset osoittivat, että CEB4 indusoi sytotoksisuutta annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla yli 40,0 uM hoito-ohjelma ja 24 tunnin altistumisen (Fig. 2A ja 2B). Vähäinen sytotoksisia vaikutuksia havaittiin NHBE soluihin, joissa on noin 20,0% tappaminen havaittiin samanlaisissa hoito olosuhteissa, kun taas 95% tappaminen HSC-4 solujen pienin IC

50-arvo kirjataan 4,0 ± 1,9 uM kaikkien solujen linjat testataan (taulukko 1). Solujen elinkelpoisuus käsiteltiin DMSO: ilman CEB4 ovat merkityksettömällä vaikutti ( 1,0%) (Fig. 2A ja 2B) siten sulkea pois osallistumista liuottimen aiheuttama sytotoksisuuden. Sekä aikaa ja annoksesta riippuva määritykset tukevat tarvetta tutkia apoptoottisen vaikutukset CEB4 ja sen mahdollinen anti-kasvain huumeiden hoitoon suun syöpä. Kaikki seuraavat kokeet suoritettiin perustuen IC

50-arvot, joka saadaan nykyisen MTT tietoja, ja ne on esitetty yhteenvetona taulukossa 1.

(A) Annos riippuu MTT-määritystä kuvaaja, kun 24 h CEB4 valotus. (B) Aika riippuvainen MTT-määritystä kuvaajan käsittelemällä 40,0 uM CEB4. Kaikki tulokset ilmaistiin yhteensä prosentteina elävien solujen keskiarvo ± SD kolmesta riippumattomasta määrityksestä. Liuottimien ohjauksista DMSO suoritettiin HSC-4 solujen edustajana kaikkia muita solulinjoja.

CEB4 indusoi apoptoosia solukuolema HSC-4 Cells

seuraavaksi selvitettävä, CEB4 sytotoksisia vaikutuksia välittämän apoptoosin kautta. Kasvu solujen värjäystä FITC-konjugoidulla anneksiini-V toimii varhaisen merkki apoptoosin. Solut samanaikaisesti värjättiin PI tutkia menetykseen solukalvon eheyden. Tämä kaksinkertainen värjäys menettely erottaa alkuvaiheen apoptoottisia soluja (anneksiini V-positiivisia) alkaen myöhään apoptoottisia soluja (anneksiini V-positiivisia, PI positiivinen). Hoito HSC-4 solujen IC

50 pitoisuuksien CEB4 havaittiin indusoivan apoptoottisen solukuoleman kautta havainto muutos elävien solujen väestön aikaista myöhäisessä vaiheessa apoptoosin, jota seurasi sekundaarinen kuolion (Fig. 3B). Prosenttiosuus elävien solujen väheni 99%: sta 51%, kun taas varhaisen ja myöhäisen vaiheen apoptoottiset solut kasvoivat 21% ja 45% vastaavasti. Kokonaisprosenttiosuus apoptoottisten HSC-4-soluissa oli 63% 12 tunnin kuluttua. Ei väestön siirtymisen havaittu NHBE soluissa sen jälkeen, kun vastaavia CEB4 hoidon (Fig. 3A).

Käsittelemättömät solut (ylempi paneeli) ja käsiteltiin soluja (alempi paneeli) jälkeen CEB4 hoito IC

50 pitoisuudet 12 h. Quadrants suunniteltiin seuraavasti, I: ei-värjättyjen solujen osoittaa eläviä soluja; II: anneksiini V-FITC värjättyjen solujen osoittaa aikaisin apoptoosin; III: anneksiini V-FITC ja PI värjätyistä soluista osoittaa myöhään apoptoosin; ja IV: PI värjätyistä soluista osoittaa toissijainen kuolion. Kaikki dot tontit ovat edustus yhtä solupopulaatioiden (n = 10000).

CEB4 indusoi Endonuclease- ja kaspaasivälitteinen lohkaisu DNA ja PARP Vastaavasti

Koska monipuolisesti ja tunnusmerkkejä, jossa prosessi apoptoosin voivat ilmetä, tutkimme myös apoptoosin HSC-4-soluja kautta esiintyminen DNA: n fragmentoituminen ja pilkkominen PARP-proteiinien. Havaitsimme, että DNA: ta käsittelemättömän HSC-4-soluja ei havaittu pirstoutumista, kun taas DNA CEB4-käsiteltyjen HSC-4-soluja (12 ja 24 h) osoitti DNA tikapuunmuodostuksen noin 200 bp: n välein, oletettavasti seurauksena endonukleaasi toimia sivustoja nukleosomien välissä (Fig. 4A). Epäillyn osallistuminen kaspaasi-3-aktivaation CEB4 indusoiman apoptoosin myös validoitu ilmaisun ja hajoamista tumaproteiini, PARP. Proteolyyttisen täyspitkä PARP 116-kDa: n polypeptidiä 85-kDa: n fragmentti on tyypillinen markkeri apoptoosin alkaminen, ja havaittiin ajasta riippuvalla tavalla HSC-4-soluja käsiteltiin CEB4 (Fig. 4B). Siksi apoptoosin indusoiva vaikutus CEB4 on HSC-4-soluissa varmistettiin.

kuitenkaan ole erillistä sirpaloitumista havaittiin kaista 1 osoittaa puuttuessa apoptoosin vastakohtana kaistat 2 (12 h) ja 3 ( 24 h). (B) PARP hajoamista havaittiin eri CEB4 itämisaika. Yhtä suuret määrät solu-proteiinien SDS-PAGE, ja PARP hajoaminen sen luonnollisessa muodossaan (116 kDa) on katkaistun muodon (89 kDa) havaittiin Western blot -analyysillä.

p53- ja muut p53-Samankaltaisia ​​apoptoottiset proteiinit

Western blotting-analyysi CEB4 käsiteltiin HSC-4-soluja suoritettiin tutkimaan tila p53 ja p53 liittyvät apoptoottisia proteiineja. Tulokset osoittivat, että kun CEB4 hoito, fosforyloitu p53 kohonnut, kun taas taso p53-inhibiittorin, MDM2, väheni yli 12 h (Fig. 5A). Yhteenlaskettu p53 taso oli johdonmukaisesti HSC-4-solut ja pysyi ennallaan, kun CEB4 altistumista. Proteiinin ekspressiotasot pro-apoptoottisen Bax-proteiinin lisääntynyt sen jälkeen, kun 12 h CEB4 hoitoon. Toisaalta taso anti-apoptoottisten Bcl-2-proteiinin havaittiin vähenevän samanaikaisesti muutoksen Bax (Fig. 5B). Tutkimme myös loppupään caspases, ja totesi, että initiaattorin määrä prokaspaasi-9 ja pyöveli kaspaasi-3 tsymogeenillä väheni samanaikaisesti kun CEB4 altistuksen, viitaten aktivoidut pilkkominen prokaspaasi-9 ja kaspaasi-3 tsymogeeni (Fig. 5C).

Soluja inkuboitiin CEB4 6 ja 12 h, korjattu lyysipuskuria ja alistettiin SDS-PAGE: lla. Proteiinin ekspressiotasoja tutkittiin Western blot analyysi ja mittaamaan ImageJ ohjelmistoa käyttävät β-aktiini kuin normalisointia ohjaus. (A) analyysi p53 ja MDM2 estäjä tasolla. (B) analyysi anti-apoptoottisten Bcl-2 ja pro-apoptoottista Bax-proteiinin tasoja. (C) analyysi initiaattoria prokaspaasi-9 ja efektori kaspaasi-3 tsymogeeni tasoa. Kvantifiointi normalisoitu proteiinipitoisuuden vastaan ​​β-aktiini näkyvät oikealla paneelit.

Keskustelu

Prosessi apoptoosin on tullut haluttu reitti syöpäsolujen kuolemaan, ja on yleensä ominaista morfologiset ja biokemialliset muutokset, kuten kalvo kupliminen, solu kutistuminen, kromatiinin tiivistyminen, aktivointi kaskadeja proteaasien kuten caspases ja endonukleaaseilla pilkkoutuminen PARP [12] ja pirstoutuminen genomista DNA [13]. Apoptoottisen solukuoleman suositaan, koska se ei liity äkillistä vapautumista proinflammatoristen välittäjäaineiden, kuten parhaillaan kuolion [14]. Apoptoosin induktio ja inhibitio syöpäsolujen lisääntymistä on käytetty vertailukohtana arvioinnissa phytochemical syövän toimintaa, jossa aiemmin monissa kemoterapeuttisten aineiden on havaittu aikaan häiriön solusyklin etenemisen tai apoptoosin induktio kasvainsoluissa [15].

tässä tutkimuksessa todisteita MTT-pohjainen solujen elävyyden testit osoittivat, että erythrocarpine E (CEB4) indusoi sekä ajasta ja annoksesta riippuva sytotoksinen vaikutukset kaikkiin kasvainsolulinjoilla testattu, jossa tehokkuus on suurin HSC-4-soluissa. Tämä havainto kutsuu lisätutkimuksia apoptoottisen vaikutusten CEB4 ja sen mahdollinen anti-kasvain huumeiden hoitoon suun syöpien. Tässä vaiheessa, epiteelin kaltainen alkuperä NHBE joka omistaa yhtäläisyyksiä HSC-4 on ainoastaan ​​alustavana

in vitro

valvonta lääkeseulontatarkoituksiin, vaikka itse fysiologiset sivuvaikutukset CEB4 voidaan arvioida vasta kautta

in vivo

tutkimuksissa. Minimaalinen sytotoksisia vaikutuksia CEB4 on NHBE soluissa (jos solujen elävyys pysyivät yli 80%, kun hoito) antaa alustavan turvallisuusarvion osoitus sen kehittämiseksi edelleen niin kemoterapeuttinen aine. Kolmenlaista määritykset suoritettiin myös vahvistamaan solukuoleman mekanismia CEB4 on HSC-4-solut: anneksiini V-FITC, PARP pilkkominen ja DNA: n fragmentoituminen määrityksissä. Yhdistetty Näiden kokeiden tulokset osoittavat, että sytotoksisuus aiheuttama CEB4 tuloksia apoptoosin.

Seuraava olennainen kysymys olisi määritellä miten CEB4 riippuvaisen apoptoosin välittämän molekyylitasolla? Kaksi suurta reitit ohjelmoidun solukuoleman voidaan erottaa: ulkoista ja luontainen polkuja. Toiminnan p53 on välillisesti luontaisia ​​solukuolemareittiin jossa se stimuloi laajan verkoston signaaleja joka toimii osittain läpi Bcl-2-perheen signalointiryöpyn [16]. Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että mutaatiot p53 on keskeinen rooli syövän aloittamisen ja ovat hyvin näkyvästi sen yhteydet syöpien, kuten koolon-, keuhko-, ruokatorven, rinta, maksa, aivot, retikulo kudosten ja hematopoieettisten kudosten [17].

Western blotting tulokset osoittavat kasvua tason fosforyloidun p53 ja vähentää sen estäjä, MDM2 viittaa siihen, että tila apoptoosin induktio CEB4 välittyy sisäisen reaktiotien. Tämä vahvistaa vielä huomautuksia mitokondrion proteiinit, joissa kasvua pro-apoptoottisen proteiinin tasot, Bax ja vähentää anti-apoptoottisen proteiinin tasot, Bcl-2 havaittiin. Suhde Bcl-2: n ja Bax säännelty apoptoosin induktio dimeroivalla toistensa kanssa, mikä johti vapautuminen sytokromi c: n päässä mitokondrioiden [18] – [19]. Lisäksi CEB4, muita luonnollisia yhdisteitä, jotka ovat osoittaneet vaikutuksia induktion p53-välitteisen apoptoosin olivat curcumin, resveratroli, antosyaniineja ja kapsaisiini [20]. Aikaisemmat tutkimukset limonoidi–pohjainen yhdisteiden

Citrus aurantifolia

on myös osoitettu indusoivan apoptoosia p53 inaktivaation [10], [20].

vaikutusmekanismi sytotoksisten aineiden ei pelkästään sisältää ominaisuuksia, kuten solun kutistuminen ja DNA: n fragmentoituminen, mutta myös aktivointi p53 signalointimolekyylien johtaa aktivointi cascade kaspaasi toimintaa [21]. Caspase kaskadeja voidaan laukaista läpi kaksi suurta haarat, joko solun pinnan TNF-superperheen kuolemareseptorien ja kääntyvä adapteri proteiinin Fas aktivoitu kuolindomeeniin (FADD) johtaa kaspaasi-8 ja lopulta kaspaasi 3 tai vapautumisen kautta sytokromi c (Cytc) alkaen mitokondrioita johtaa kaspaasi-9 toimintaa ja myöhemmät kaspaasi-3 toimintaa. Kaspaasi 3, edustaa lähentyminen pisteen välillä kaksi reittiä, ja vuorostaan ​​aiheuttaa PARP pilkkominen, kromosomi-DNA taukoja ja lopulta jakautuminen solun apoptoottisten kappaleiden [22]. Tuloksemme viittaavat siihen, että CEB4 kykenee sen apoptoottinen vaikutus vaikuttamalla caspases-9 ja -3, jossa taso täyspitkä prokaspaasi-9 ja kaspaasi-3 tsymogeeninä on vähentynyt kun CEB4 altistumista, jolloin pilkottu, aktivoituja muotoja kaspaasi-9 ( 37 kDa ja 10 kDa) kaspaasi-3 (17 kDa ja 12 kDa). Kuitenkin apoptoottinen signaalitransduktion liittyy kuolema reseptorin signalointi johtaa aktivoitu aloitteentekijä kaspaasin 8, joka puolestaan ​​aktivoi tsymogeeninä kaspaasi-3 ei voida sulkea pois. Sovittelu solukuoleman tätä kautta voisi selittää havainnon varhaisen vähennys ( 6 h) prokaspaasi-3 tasoa ennen muutoksia Bcl-2: n ja Bax, joka esiintyy 12 h (Fig. 5B ja 5C). Tämä voi myös tarkoittaa, että niiden sisäisen reaktiotien toimii monistusvaiheena kohti alkuperäistä kuoleman signalointi kautta ulkoinen tie kun CEB4 altistumista.

Olemme päätellä, että CEB4 indusoi sytotoksisuus läpi apoptoottisen solukuoleman HSC-4 suusyövän solut, ja että apoptoosin induktio saadaan aikaan aktivoimalla p53, joka käynnistää sisäisen reaktiotien kautta Bcl-2: n ja Bax, ja lopulta kaspaasi-9 ja -3 aktivointi. Tuloksemme viittaa mahdolliseen kehittämiseen CEB4 uutena potentiaalinen syöpälääkettä ihmisen suusyövän, vaikka jatkokäsittelyssä

in vivo

turvallisuusvaikutuksia ja farmakokinetiikkaa tarvitaan ennen CEB4 voidaan täysin arvioitiin kliinisessä asetusta.

Kiitokset

Haluamme ilmoittaa Datuk Dr. A. Hamid A. Hadi keskuksesta Natural Product Research and Drug Discovery, Malayan yliopisto hänen edistänyt löytö CEB4 yhdistettä. Myös Ms Norahayu Othman ja Ms Yap Seow Hui Institute of Biological Sciences, University of Malaya näiden panoksesta aikana sytotoksisuus seulonta ja koulutusjakson analyysi tässä tutkimuksessa.