Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Honokiol, pieni molekyylipaino luonnollinen tuote, on osoitettu olevan voimakkaita anti-neoplastisia ja antiangiogeenisiä ominaisuuksia. Sen molekyylitason mekanismeja ja testataan anti-mahasyövän ole tiedossa. On osoitettu, että anti-apoptoottisen toiminnon glukoosin säätelemä proteiinit (GRP) ennustaa, että niiden induktio neoplastisissa soluissa voi johtaa syövän etenemisessä ja lääkeresistenssin. Olemme tutkineet vaikutuksia honokiol sääntelystä bruttopeittoon ja apoptoosin ihmisen mahasyövän solujen ja kasvaimen kasvua.

Menetelmät ja tärkeimmät havainnot

hoito eri ihmisen mahasyövän soluja honokiol johti induktio GRP94 pilkkominen, mutta ei vaikuttanut GRP78. Hiljentäminen GRP94 mukaan Sirna (siRNA) voivat aiheuttaa apoptoosin. Solujen käsittely honokiol tai kemoterapia-aineen etoposidi tehosti apoptoosin lisääntyminen ja GRP94 hajoamista. Kalpaiinia aktiivisuus ja calpain-II (m-kalpaiini) proteiini (mutta ei kalpaiinin-I (μ-kalpaiini)) tasoa voitaisiin myös korottaa honokiol. Honokiol aiheuttama GRP94 alassäätöä ja apoptoosin mahasyövässä soluissa voitaisiin kumota siRNA kohdentamalla kalpaiinia-II ja calpain estäjiä. Lisäksi tulokset immunofluoresenssivärjäyksen ja immunosaostus paljasti spesifisen vuorovaikutuksen GRP94 kanssa calpain-II soluissa honokiol hoitoon. Seuraavaksi me havaittu, että kasvaimen GRP94 yli-ilmentyminen, ja kasvaimen kasvu BALB /c-nude-hiiriin, jotka ympättiin ihmisen mahalaukun syöpäsoluja MKN45, on merkittävästi vähentynyt honokiol hoitoon.

Johtopäätökset ja merkitys

Nämä tulokset ovat ensimmäinen näyttö siitä, että honokiol aiheuttama calpain-II-välitteisen GRP94 pilkkominen aiheuttaa ihmisen mahasyövän solujen apoptoosin. Olemme lisäksi viittaa siihen, että honokiol voi olla mahdollista terapeuttinen aine parantaa kliininen tulos mahasyöpä.

Citation: Sheu ML, Liu SH, Lan KH (2007) Honokiol indusoi Calpain-välitteistä glukoosin säätelemä proteiini-94 lohkaisu ja apoptoosi ihmisen mahasyöpä Syöpäsolut ja vähentää kasvaimen kasvua. PLoS ONE 2 (10): E1096. doi: 10,1371 /journal.pone.0001096

Academic Editor: Hany El-Shemy, Kairon yliopisto, Egypti

vastaanotettu: 26 kesäkuu 2007; Hyväksytty: 10 lokakuu 2007; Julkaistu: 31 lokakuu 2007

Copyright © 2007 Sheu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimusmäärärahat National Science neuvoston Taiwan (NSC95-2320-B040-005). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on toiseksi yleisin syy syövän kuoleman maailmassa [1]. Lähes kaksi kolmasosaa tapauksista tapahtuu kehitysmaissa ja 42% yksin Kiinassa [1], [2]. Molekyylitason tavoitteet ja mekanismit huono ennuste ei ymmärretä hyvin. Hoito paikallisesti edennyt mahasyöpä edelleen suuri haaste. Huolimatta viimeaikaisista edistysaskeleet Hoidon kliininen tulos mahasyövän potilaille on edelleen heikko. Sen lisäksi leikkaus, roolista adjuvanttihoito ei ole osoitettu [2], [3]. Siten tarvetta tunnistaa mahdollisia uusia terapeuttisia ja kemopreventiivisiä aineita on ilmeinen.

Honokiol, aktiivinen komponentti eristetään ja puhdistetaan

Magnolia officinalis

, on osoitettu olevan vaikutuksia antioksidanttina [4], vastaan ​​lipidiperoksidaatio [5] ja tulehdusta

in vitro

ja

in vivo

[6], [7]. Honokiol on myös osoitettu olevan systeemisesti käytettävissä ja myrkytön angiogeneesin estäjä [8]. Viimeaikaiset tutkimukset raportoitu, että honokiol indusoi kaspaasiriippuvaisen apoptoosia krooninen lymfaattinen leukemia solut ja voitetaan tavanomaisten lääkeresistenssin ihmisen multippelin myelooman indusoimalla kaspaasiriippuvaisen ja riippumattaman apoptoosin [9], [10]. Vaikka täydellinen arviointi kliinisen potentiaalin yhdisteiden ei ole vielä mahdollista, farmakokinetiikkaan honokiol on tutkittu perusteellisesti, paljastaen että honokiol on saatavana kliinisiä syövän hoidossa. Muita luonnollisia tuotteita, jotka sisältävät erilaisia ​​terapeuttisia yhdisteitä hyödyllistä estää pahanlaatuisten kasvainten kehittymiseen edelleen havaita; kuitenkin hyvin vähän tiedetään niiden taustalla vaikutusmekanismeja tai niiden molekyylikohteena.

glukoosin säätelemä proteiini (GRP) 94 on runsain glykoproteiini Endoplasmakalvosto (ER) ja vain tunnistettava selkärankaisten. Yli-ilmentymisen antisense ja ribotsyymi lähestymistapoja kudoksissa kulttuuri järjestelmissä suoraan osoitettu, että GRP78 ja GRP94 voisi suojata soluja kuoleman [11] – [13]. Suojaava toiminta bruttopeittoon on havaittu myös Säteilynsietotestin kohdunkaulan syövän [14]. Anti-apoptoottisen toiminnon GRP ennustaa myös, että niiden induktio neoplastisissa soluissa voi johtaa syövän etenemisessä ja lääkeresistenssin [15] – [18]. Patologisia tiloja, kuten kasvaimen kasvun ja pahanlaatuisuuteen on ehdotettu korreloivan soluja suojaava proteiini GRP94 yli-ilmentyminen [19]. Vuonna etäpesäkkeistä syöpää mallissa, on merkittävä teho GRP94-pohjainen geenin /immunoterapian strategia on esitetty, kun se yhdistettiin sädehoidon [20]. ER soittaa suoraan rooli aktivoinnissa osajoukko kaspaasin aktivoinnin aikana apoptoosin, joka tapahtuu ER stressin [21]. Toisaalta, kalpaiinien ovat perheen Ca

2 +: sta riippuvainen solunsisäisiä kysteiiniproteaaseista. Ekspressoituvat calpain-I (μ-kalpaiini) ja calpain-II (m-kalpaiini) proteaasit sekaantuneet kehittämiseen apoptoosin. Tuore tutkimus on osoittanut, että kaikkialla kalpaiinien edistävät kaspaasi-12 ja JNK aktivoinnin aikana ER stressin aiheuttama apoptoosin [22]. On myös esitetty, että GRP94 Ca

2 + sitovan kohdan ja anti-apoptoottisen ominaisuudet on proteolyyttinen tavoite calpain aikana etoposidi-indusoidun apoptoosin [23]. Lisäksi useissa kokeellisissa malleissa apoptoosin, on osoitettu, että aminopään calpain inhiboiva yksikkö calpastatin voidaan lohkaista kaspaasien, mikä viittaa pilkkominen on välttämätön asetuksen kalpaiinin aktiivisuuden solukuoleman aikana [24] – [28] . Kaspaasi 7, joka on rekrytoitu ER korosti soluissa, voi myös katkaisevat ja aktivoimaan kaspaasi-12 [29] – [31]. Vaikutukset honokiol on bruttopeittoon liittyvistä signalointi ja apoptoosin vielä tuntematon. Tässä tutkimuksessa selvitimme molekyylimekanismeihin honokiol ihmisen mahasyövän apoptoosia ja kasvaimen kasvua

in vitro

ja

in vivo

. Yllättäen olemme huomanneet, että GRP94 saa erillisen proteolyyttisen pilkkomisen calpain aikana honokiol: n indusoiman apoptoosin. Nämä havainnot voivat antaa todisteita siitä, että honokiol on mahdollista terapeuttinen aine parantaa kliininen tulos mahasyöpä.

Tulokset

kinetiikka GRP94 proteolyyttistä hajoamista ihmisen mahasyövän solulinjoja käsiteltiin honokiol

ensin tarkasteltiin vaikutuksia honokiol sen ilmentymiä GRP94 ja GRP78 erilaisissa ihmisen mahasyövän solulinjoissa. Honokiol merkittävästi vähentää tasot GRP94 annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla, mutta GRP78 tasot eivät vaikuta (kuviot. 1 ja 2). Kinetics of honokiol aiheuttaman GRP94 pilkkominen eri ihmisen mahasyövän soluja kuvassa. 2. MKN45 tai SCM-1-solut olivat resistenttejä honokiol aiheuttama vasteita kuin AGS tai N87-solut; tasot GRP94 alennettiin noin 50% kaksi kertaa niin paljon aikaa. Tasot GRP78 proteiinien pysyä ennallaan kaikissa neljässä mahasyövässä solulinjoissa. Lisäksi on olemassa vain vähän GRP94 proteiinia ilmaisuja normaaleissa hiiren mahalaukun epiteelin kudosten ja ihmisen endoteelisolujen verrattuna mahalaukun syöpäsolujen (Fig. 1 C).

(A) Western blot analyysit GRP94 ja GRP78 in MKN45 käsitellyissä soluissa jossa honokiol 8 tuntia annosvasteellisella tavalla. (B) Western blot analyysit GRP94 ja GRP78 in MKN45 soluissa käsitelty honokiol (a, 20 uM, b, 40 uM) on aika-vaste tavalla. (C) Vertailu GRP94-proteiinin ilmentymisen joukossa ihmisen mahasyövän solulinjoissa (SCM-1, AGS, N87, ja MKN45), kasvaimen eristetty MKN45 solut siirrostettiin hiirillä (T), hiiren normaali mahan epiteelikudosta (N), ja ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC). Kaikki tulokset ovat edustavia vähintään neljän itsenäisen kokeen.

Western blot analyysit GRP94 ja GRP78 soluissa (N87 (A), AGS (B), MKN45 (C) ja SCM-1 ( D)) käsiteltiin 40 uM honokiol eri ajanjaksojen kuten. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (n = 5).

Honokiol indusoi GRP94 pilkkominen liittyvä apoptoottisen vasteen

Kuten kuviossa. 3, honokiol lisäsi poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) pilkkominen ja DNA-vaurioita geenin, CHOP /GADD153 (proteiini on tunnistettu välittävän ER stressin aiheuttaman apoptoosin) tasoja MKN45 soluissa annoksesta ja ajasta riippuvaa tavalla. Honokiol 20 ja 40 M myös laukaisi ilmaisuja pilkkoa kaspaasi-12 ja kaspaasi-7 (P20), jonka suuruus kasvoi suhteessa ajoitus (Fig. 3B). Lisäksi ymmärtää, onko GRP94 pilkkominen oli mukana ihmisen mahasyövän solujen apoptoosin, apoptoosin havaittiin GRP94-siRNA-transfektoiduissa soluissa. Hiljentäminen GRP94 siRNA indusoi apoptoosia (Fig. 4A) ja vähenivät GRP94 proteiinin ilmentymisen (Fig. 4B-a). Olemme myös verrattiin honokiol apoptoosiin ja GRP94 hajoamista ihmisen mahasyövän solujen kemoterapia-aineen etoposidia. Tulokset osoittivat, että solujen käsittely honokiol tai etoposidin parannettu apoptoosin lisääntyminen (Fig. 4A) ja GRP94 hajoaminen (Fig. 4B-b). Kun soluja samanaikaisesti käsiteltiin 40 M etoposidin ja 20 M honokiol, suurempi kasvu GRP94 hajoamista kuin he osoitettiin (Fig. 4B-b); nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdistäminen honokiol muiden syöpälääkkeiden, voi olla mahdollinen terapeuttinen strategia.

(A) Western blot analyysit PARP ja GADD153 in MKN45 käsitellyissä soluissa honokiol 8 tuntia annos-vaste tavalla . (B) ajan funktiona vastauksia PARP, GADD153, kaspaasi 7 ja kaspaasi 12 MKN45 käsitellyissä soluissa honokiol (20 uM). Esitetyt tulokset edustavat vähintään neljän itsenäisen kokeen.

(A) apoptoosi GRP94-siRNA-transfektoiduissa MKN45 soluista analysoitiin anneksiini V /PI-värjäyksellä, kuten on kuvattu alla Materiaalit ja menetelmät, jota verrattiin soluilla käsitelty honokiol (40 uM) tai etoposidi (40 uM). (B-a) GRP94-proteiinia tasot havaittiin Western blot -analyysillä valvonta- ja GRP94-siRNA-transfektoiduissa MKN45 soluissa. (B-b) Honokiol ja etoposidi aiheuttaa GRP94 lohkaisu MKN45 soluissa. Soluja käsiteltiin 20 uM honokiol ja 40 uM etoposidi (Etopo.), Kuten 4 tuntia. Esitetyt tulokset edustavat vähintään neljän itsenäisen kokeen.

Calpain vaaditaan honokiol välittämiä solun apoptoosin

vieressä ratkaistava, onko toiminnan calpain (kalsiumista riippuvan tioliproteaaseja) olisi indusoida honokiol neljän mahasyövässä solulinjoissa. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, honokiol 20 M lisääntynyt calpain toimintaa ajasta riippuva tavalla, joka alkoi kasvaa 15 min, ja saavutti 60 min, ja sitten putosi alas alemmalle tasolle 4 tuntia. Solut pysyivät kiinnittynyt ajan myötä tietenkin ilman elinkelpoisuuden menetys, (tietoja ei ole esitetty). Kuviossa. 5B, tulokset osoittivat, että kasvu kalpaiinin aktiivisuuden vastauksena honokiol (20 ja 40 M) 60 min neljän mahasyövässä solulinjoissa. Lisäksi kalpaiinin inhibiittorit, N-asetyyli-leu-leu-norleukinaalina (ALLN), N-asetyyli-leu-leu-methioninal (ALLM), ja Z-Leu-Leu-CHO, joka esti kasvua calpain indusoimaa honokiol in N87 ja SCM-1-soluissa (kuvio. 5C).

calpain aktiivisuus mitattiin fluoresoivan calpain alustan Suc-LLVY-AMC N87, AGS, MKN45 ja SCM-1-soluissa. (A) aika kurssi vastauksia honokiol (20 uM) hoitoon. Tiedot ilmaistaan ​​kertainen valvonnan olosuhteissa. (B) Honokiol (20 ja 40 uM) kasvaa calpain aktiivisuus 60 min hoitoon. (C) Calpain inhibiittorit ALLN, ALLM, ja Z-Leu-Leu-CHO; 25 ja 50 uM) ehkäisi merkittävästi honokiol-lisääntynyt calpain aktiivisuutta. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (n = 4).

lisäksi testata onko laski calpain toiminta voisi vaarantaa kykyä honokiol on apoptoosin induktioon. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, honokiol (40 M) indusoi apoptoosia in SCM-1 solu, joka voidaan kumota kalpaiinin inhibiittorit (ALLN tai ALLM). Lisäksi honokiol parannettu kalpaiinin-II proteiinin mutta ei kalpaiinin-I-proteiinin ilmaisuja SCM-1-solut (Fig. 7A). Käyttämällä siRNA lähestymistapa pudotus calpain-II aktiivisuus johtanut merkittävään vähentämisen honokiol (20 M) aiheuttaman apoptoosin ihmisen mahasyövän solujen 4 h hoidon (Fig. 6B). SiRNA-calpain-I ei vaikuttanut honokiol indusoiman apoptoosin (Fig. 6B).

Ihmisen mahalaukun syövän solut analysoitiin apoptoosi anneksiini V /PI-värjäyksen kuten on kuvattu kohdassa Materiaalit ja menetelmät. (A) SCM-1-soluja käsiteltiin honokiol (HK, 40 uM) 4 h: n läsnä tai poissa ollessa kalpaiinin estäjien (ALLN ja ALLM, 50 uM). (B) AGS-solut transfektoitiin siRNA-calpain-I- tai siRNA-calpain-II käsiteltiin honokiol (HK, 20 uM) 4 tunnin ajan. Esitetyt tulokset edustavat vähintään neljän itsenäisen kokeen.

lokalisointi ja vuorovaikutusta kalpaiini-II ja GRP94 seuraava honokiol hoidon

Seuraava vaihe oli valaista rooli calpain-II in honokiol aiheuttama GRP94 hajoamista. Laser confocal mikroskooppinen tutkimus, lokalisoinnin calpain-II proteiinin määritettiin vihreän fluoresenssin, kun taas lokalisoinnin GRP94 määritettiin punaisen fluoresenssin. Kuten on esitetty kuviossa. 7B, molemmat kalpaiini-II ja GRP94 havaittiin solulimassa kanssa yhteistyössä lokalisointi ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Fluoresenssi calpain-II nostettiin vähitellen, mutta fluoresenssi GRP94 vähitellen pienentynyt ihmisen mahasyövän soluja honokiol hoitoa. Edelleen vahvistavat tulokset immunosytokemiallisen värjäyksen että calpain-II on vuorovaikutuksessa GRP94, testeistä samanaikainen immunosaostus ja Western blotting mahasyövän soluissa tehtiin. Kuten on esitetty kuviossa. 7C, kalpaiinin-II jotka liittyvät erityisesti GRP94 eri mahasyövän solujen läsnä honokiol (20 ja 40 M) verrattuna IgG-kontrolli. Lisäksi testasimme, onko proteolyyttistä toimintaa kaspaasi, proteasomin tai katepsiini olivat mukana pilkkominen GRP94. Tuloksemme osoittivat, että solujen käsittely kaspaasi-inhibiittorit (Ac-DEVD-CHO, Z-VAD-FMK ja Z-DEVD-FMK, 50 M) suurena annoksena osittain estetty lohkaisu GRP94 aikana honokiol indusoiman apoptoosin (Fig. 8A ) verrattuna kalpaiinin inhibiittori ALLM 25 M, joka voi täysin estää GRP94 pilkkominen. Solujen esikäsittely katepsiini B estäjä CA-074-Me 25 ja 50 M ja katepsiini L estäjä katepsiini L estäjä II 25 ja 50 M ja proteasomin estäjä MG132 0,1-10 M kyennyt estämään GRP94 pilkkominen (kuviot. 8B ja 8C) . Lisäksi pilkkoutumista GRP94 by kalpaiini voitiin havaita käyttäen solulysaateista valmistettiin ihmisen mahan syöpäsolujen (tuloksia ei ole esitetty).

Soluja käsiteltiin honokiol (20-60 uM) eri ajanjaksojen kuten . (A) Calpain-I ja II-proteiinin tasot, havaittiin Western blot analyysi honokiol saaneilla SCM-1-soluissa. (B) Ensisijainen vasta-kalpaiini-II ja GRP94 levitettiin solut (MKN45 ja SCM-1), jota seurasi sekundaarisia vasta-aineita yhdessä FITC-konjugoitua tai TRITC-konjugoitu, vastaavasti. Kolokalisaation kaksi leimattua antigeenejä havaittiin yhtenä kuvana, kun kuvat molemmista kanavista peitettiin. (C) vuorovaikutus kalpaiinia ja GRP94 havaittiin N87, AGS, MKN45 ja SCM-1-soluissa. Immunosaostettiin proteiinit kerättiin ja alistettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus-anti-calpain-II tai anti-GRP94-vasta-aineita. Esitetyt tulokset edustavat vähintään neljästä itsenäisestä kokeesta.

Soluja ei joko käsitelty tai esikäsitelty estäjien 1 h, mitä seurasi 40 uM honokiol hoitoa vielä 24 tuntia. (A) kaspaasiestäjä (Z-VAD-FMK, 25 ja 50 uM) tai calpain estäjä (ALLN, 25 uM); (B) katepsiini B: n estäjä (CA-074-Me, 25 ja 50 uM) tai katepsiini L estäjä (katepsiini L estäjä II, 25 ja 50 uM); (C) proteasomin inhibiittoria (MG132, 0,1-10 uM) tai kalpaiinin inhibiittori (ALLN, 25 uM). Esitetyt tulokset edustavat vähintään neljästä itsenäisestä kokeesta.

tutkimme seuraavaksi, onko calpain aktivoitumista tarvitaan honokiol indusoiman apoptoosin. Kuviossa. 9, korotukset calpain-II proteiinin ilmentymisen ja GRP94 hajoamista ja kaspaasi-7 ja kaspaasi 12 aktivaation indusoiman honokiol (40 M) estettiin antamalla farmakologisen kalpaiinia inhibiittorit ja lyhytaikaista transfektiota siRNA-calpain-II SCM-1-soluissa.

Western blotting määrittämiseksi GRP94 hajoamisen ja kalpaiini-I: n ja II ilmentyminen ja kaspaasi-7, ja kaspaasi-12 SCM-1-soluissa 24 tunnin kuluttua honokiol (40 uM) hoidon läsnä ollessa tai puuttuessa kalpaiinin estäjät (ALLN ja ALLM, 25 ja 50 uM) havaittiin. Joissakin kokeissa, SCM-1-solut transfektoitiin calpain-II-siRNA tai kontrolli-siRNA. Esitetyt tulokset edustavat vähintään neljän itsenäisen kokeen.

Honokiol vaimentaa kasvaimen GRP94 yli-ilmentyminen ja kasvaimen kasvua nude-hiirissä

Nude hiiret inokuloitiin 4 × 10

6 eriytymättömiä adenokarsinoomasoluja MKN45 ja käsitelty honokiol 0,5 ja 1,5 mg /kg tai ajoneuvoon, kun kasvain tuli selväksi. Immunohistologisia ja Western blotting -analyysi osoitti, että GRP94 yli-ilmentyminen ja kertynyt kasvaimen alueella, mutta ei normaalissa mahalaukun kudoksesta (kuviot. 10A-a ja 10A-b). Honokiol merkittävästi vähentynyt kertyminen GRP94 tuumoreissa verrattuna vehikkelikontrolliin (kuviot. 10A-a ja 10A-b). Ilmentyminen GRP78 ei ollut vaikutusta (tuloksia ei ole esitetty). Sen määrittämiseksi, onko honokiol voi tukahduttaa kasvaimen kasvua

in vivo

kiinteät kasvaimet perustettiin hiirissä ja anti-kasvain vaikutus toistuvasti ruiskutetaan honokiol tutkittiin. Kuten on esitetty kuviossa. 10B, hallinnon honokiol 0,5 ja 1,5 mg /kg osoitti merkittävää tuumorin vastaista aktiivisuutta.

kasvaimia nude-hiiriä vahvistettiin 14 päivää sen jälkeen, kun MKN45 solujen injektiota ja sen jälkeen käsittelemällä 0,5 ja 1,5 mg /kg honokiol päivittäin 10 päivää. (A-a) GRP94 ilmaisuja kasvaimissa tai normaaleissa maha kudoksista määritettiin immunohistokemiallisesti. Leikkeet värjättiin GRP94-vasta-aine, kuten on kuvattu kohdassa Materiaalit ja menetelmät. Ilmaukset GRP94 proteiinien sytoplasmassa värjättiin osaksi tummanruskea. (A-b) Western blot määrittämiseen GRP94 proteiinien kasvaimissa tai ilman honokiol hoitoa havaittiin. (A-c) havaitseminen GRP94-proteiinin ekspression Western-blottauksella on MKN45 solujen kanssa tai ilman honokiol (40 uM) hoitoon tai normaalilta mahan kudoksissa on esitetty. Esitetyt tulokset edustavat vähintään neljästä itsenäisestä kokeesta. (B) Kasvaimen tilavuus arvioitiin. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (n = 7).

Keskustelu

raportoitu täällä ensimmäistä kertaa, että kalpaiinia, joka on nonlysosomal Ca

2 + aktivoitujen kysteiini proteaasi, erityisesti kalpaiinin-II, on keskeinen rooli pilkkomista GRP94, mutta GRP78 ei vaikuta, ja säätelyssä indusoiman apoptoosin honokiol ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Erityisesti olemme jos toiminnallinen todisteita siitä, että lohkaisu GRP94 kun honokiol hoito toimii terapeuttista hyötyä, tuumorikasvun estämiseen hiirimallissa ihmisen mahalaukun syöpä. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti osoittaa, että honokiol voivat manipuloida calpain-indusoituvan kaperoniproteiinina GRP94 hajoamisen ollessa kohteena apoptoosin aikana.

Tutkimukset useista laboratorioista viittasivat ER tavoitteeksi osastoon terapeuttisia aineita sekaantunut apoptoosin suorittamisen. Sytosoliset Ca

2 + on liitetty toisena sanansaattajana proapoptosis mukana sekä liipaisu apoptoosin ja säännellä caspases tai kalpaiinien [32] – [34]. Tuore tutkimus on osoittanut, että calpain on tärkeä välittäjä resveratrolin (luonnollinen kasvien polyfenolien) aiheuttaman apoptoosin rintasyövän [35]. He havaitsivat, että resveratroli voi aiheuttaa solunsisäisen Ca

2+, ja aktivoi kalpaiinin-välitteisen apoptoosin, mikä hajoaminen solukalvon Ca

2 + -ATPaasin isoformin 1 ja fodrin in kaspaasi-3 puutteellisia MCF- 7-soluissa. Honokiol on myös raportoitu aiheuttavan Ca

2 + mobilisointi rotan aivokuoren neuronien ja ihmisen neuroblastooma SH-SY5Y soluissa, oletettavasti aktivoitumisen kautta fosfolipaasi C ja IP

3-reseptorien [36]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että honokiol kykenee lisäämään kalpaiini aktiivisuutta ja kalpaiini-II-proteiinin ilmentymistä, mutta ei kalpaiinin-I aikana honokiol aiheuttaman mahalaukun syöpäsolujen apoptoosia. Lisäksi kalpaiinin inhibiittorit ja vaiennettu calpain-II siRNA merkittävästi päinvastaiseksi honokiol indusoiman apoptoosin. Nämä havainnot merkitsevät sitä, että Ca

2 + -triggered calpain-II aktivaatio voi olla mahdollista asemaa honokiol aiheuttaman apoptoosin.

GRP94 /gp96 on ER asuva jäsen HSP90 perheen. GRP94 tärkeä rooli ylläpitää solujen homeostaasin. Tämä tavanomainen käsite GRP94 kuin proteiinilaskostumisen kaperonina päivitetään löytöjä että GRPS edistävät kasvaimen leviäminen, etäpesäkkeiden, lääkeresistenssin ja immunoterapia, joilla on merkittäviä kliinisiä vaikutuksia ennustetta ja syövän [3]. GRP94 on osoitettu liittyvän kasvainten muodostumiseen syöpäsolulinjoissa, jyrsijöiden kasvainmuodoista ja ihmisen syövän koepaloja [37] – [39]. Tämä on sopusoinnussa havaintojen että induktio bruttopeittoon aiheuttaa suojaava toiminto kuin selviytymisen vastaukset ravinteiden nälkään, asidoosi, ja hypoksiaolosuhteisiin, jotka ovat yleisiä huonosti vascularized kiinteitä kasvaimia [11], [40]. On myös ilmennyt, että suurin osa GRP tuumorisoluissa on mukana useita kaperoni- komplekseja, kun se ei ole normaalien solujen [41]. Hiirten rokottaminen kasvain- stressiproteiineja, GRP94, voi saada aikaan kasvaimen vastaisen immuunivasteen, jolloin saatiin huomattavasti kasvaimen kasvun estoa ja etäpesäkkeiden. Aktiivisuus Hsp90 estäjien on hyvin validoitu prekliinisissä rintasyövän malleja sekä yhden aineen tutkimuksia ja yhdistelmänä tavanomaisten kemoterapia [41]. Lisäksi on ehdotettu, että GRP94 on fysiologinen substraatti kalpaiini [23]. Kalpaiinin on osoitettu olevan aktivoituna ER kalvo, jossa se on vuorovaikutuksessa GRP94, jolloin sen erityinen proteolyyttisellä katkaisulla, koska solujen apoptoosiin laukaisee etoposidi [23]. Nykyisissä tutkimuksessa, huomasimme, että honokiol aiheuttama GRP94 pilkkominen ja apoptoosin ihmisen mahasyövän solut voidaan täysin kumota kalpaiinin inhibiittorit ja vaiennettu calpain-II siRNA. Kaspaasi-inhibiittorit suurella annoksella osittain päinvastaiseksi honokiol aiheuttama GRP94 pilkkominen. Solujen esikäsittely katepsiini B ja L-inhibiittorit ja proteasomin inhibiittoria kyennyt estämään honokiol aiheuttama GRP94 pilkkominen. Olemme myös osoittaneet, että hiljentäminen on GRP94 siRNA voi aiheuttaa mahasyövässä apoptoosin. Lisäksi tulokset immunosytokemiallisen värjäyksen ja immunosaostus paljasti spesifisen vuorovaikutuksen GRP94 kanssa calpain-II mahasyövän soluissa honokiol hoitoon. Erityiset pilkkominen GRP94 mukaan kalpaiini voitaisiin myös havaita käyttäen solulysaateista valmistettiin ihmisen mahan syöpäsoluja. Nämä havainnot viittaavat siten siihen, että kalpaiinin-II-välitteinen GRP94 pilkkominen on tärkeä rooli honokiol laukeavan mahasyövän apoptoosia.

kalpaiinien ja kaspaasit ovat kahden perheen kysteiiniproteaasien, että ne ovat osallisina patologisten solujen kuoleman [22], [31]. Nämä proteaasit jakaa useita kuolemaan liittyviä alustoilla caspases itse, solun tukirangan proteiinit, Bax, ja Bid [42]. Calpain välittämän proteolyysin etenee rajoitetusti, mutta ei vaadi erityistä aminohappotähteellä kuten että kaspaasien. Vaikka sekä kalpaiinia ja kaspaasi on ehdotettu tärkeitä rooleja patologisten solukuoleman, vuorovaikutukset näiden kahden perheen proteaasien alle patologisia tiloja eivät ole selkeitä. Esillä olevassa tutkimuksessa, knockdown ja farmakologiset inhibiittorit lähestymistavat ovat vaikuttaneet merkittävästi tietämystämme kalpaiini biologian, erityisesti suhteessa sen tietyn toiminnon solujen apoptoosin, mikä on mahdollista, että caspases 7 ja 12 ovat alavirtaan calpain välittämisessä honokiol aiheuttama mahasyövän apoptoosia.

Luonnontuote lääkkeitä on ehdotettu pelata hallitseva rooli lääkehoidon [43]. Luonnontuotteet ovat yksi tärkeä potentiaaliset syövän kemoterapeuttisten ja kemopreventiivisten aineet [43]. Honokiol on laajalti käytetty perinteisen kiinalaisen ja japanilaisen lääketieteen useita tuhansia vuosia, pääasiassa hoidettaessa anti-thrombocytic, anti-bakteeri, anti-inflammatoriset, ja anksiolyyttisiä vaikutuksia. Edellinen raportit ovat osoittaneet, että honokiol on myös hallussaan voimakas anti-neoplastisia ja antiangiogeenisiä ominaisuuksia [6], [19], [38]. Kuitenkin tarkka molekyylimekanismi osoittivat kasvaimen vastaisen aktiivisuuden honokiol ei ole hyvin ymmärretty. Siten tämän tutkimuksen tulokset tarjoavat todisteita, että kasvaimen vastainen aktiivisuus honokiol mahasyövän, ja mikä vielä tärkeämpää, molekyylitason perustan sen vaikutus. Huomasimme, että honokiol indusoi aktivointi calpain, GRP94 pilkkominen, ja apoptoosin ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Lisäksi annon jälkeen honokiol nude mukava istutettu MKN45 mahakasvaimen solut osoittivat merkittävää tuumorin vastaista aktiivisuutta. Tämä prekliiniset tutkimukset voivat toimia kehyksenä ja edustaa lupaava uusi kohdennettua lähestymistapaa. Lisäksi luonnollisten yhdisteiden on osoitettu yhdistää tavanomaisten sytotoksisten aineiden voi olla kliinistä hyötyä syövän vastaisten lääkkeiden kanssa. Tämä etu plus syntymässä todisteita sen kasvaimen vastaisen menettelyjen avulla honokiol käynnissä kliininen sovellus on tehokas ja turvallinen syöpälääkkeen.

Materiaalit ja menetelmät

Solut, viljelyolosuhteet ja reagenssit

Ihmisen solulinjojen valkoihoinen mahasyövän solulinjoissa (AGS, kohtalaisen huonosti eriytetty adenokarsinoomasolulinjasta ja N87, hyvin eriytetty masolulinjassa) ja Aasian mahasyövän solulinjoissa (MKN45 ja SCM-1 eriytymättömiä adenokarsinoomasoluja) saatiin solusta pankin syövän keskustassa Taipei Veterans General hospital (Taiwan). Soluja ylläpidettiin RPMI 1640 -elatusaineessa, joka sisälsi 10% lämmöllä inaktivoitua FCS: ää (Life Technologies) ja streptomysiiniä /penisilliini (Life Technologies) kostutetussa 5% CO

2-ilmakehässä. Honokiol saatiin Wako Chemical Company (Japani), ja sen puhtaus määritettiin olevan vähintään 99% korkean suorituskyvyn nestekromatografialla.

Western Blot-analyysi ja Immunosaostukset

Koko solulysaateista valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [44]. Proteiinit erotettiin pre-cast 8-20% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, ja sitten siirrettiin elektroforeettisesti geelistä päälle polyvinylideenidifluoridi kalvoja. Blokkauksen jälkeen blotteja inkuboitiin anti-GRP94, anti-GRP78, anti-kaspaasi-12, anti-kaspaasi-7, anti-PARP, anti-GADD153 (Santa Cruz Biotechnology), anti-kalpaiinin-I (μ-kalpaiini), anti-calpain-II (m-kalpaiini) (Santa Cruz Biotechnology), ja anti-β-aktiini (Sigma) -vasta-aineita PBS: ssä alueella 0,1% Tween 20: ssa 1 h, mitä seurasi kolme 10 minuutin pesua PBS: ssä, kuuluvat 0,1% Tween 20 sitten kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita 60 min. In immunosaostusta, proteiinit (500 g) inkuboitiin spesifisten vasta-aineiden ja immobilisoitu proteiini-A-Sepharose-helmiä. Helmet pestiin perusteellisesti Bacco n immunoprecipitative puskuri, keitetty, ja mikrosentrifugoitiin. Tulo 10% solulysaattia IP ja 50 g proteiinit analysoitiin Western-blottauksella. Detection suoritettiin Western blotting reagenssilla ECL (Amersham), ja kemiluminesenssi paljastamat Kodak X-Omat-filmejä.

Calpain -aktiivisuusmäärityksiä

Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC on kalpaiinin proteaasisubstraattia. Kvantitointi 7-amino-4-metyylikumariini (AMC) fluoresenssin mahdollistaa seurannan entsyymihydrolyysin peptidi-AMC-konjugaattia, ja sitä voidaan käyttää mittaamaan entsyymin aktiivisuutta. Solut valmistettiin ja käsiteltiin 24 kuopan Corning /Costar levyt. Ennen kuin lisättiin estäjien solut ladattiin 40 M Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Biomol) ja käsiteltiin honokiol varten osoitetun ajoituksen 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa. Proteolyysin fluoresoiva koetin seurattiin käyttäen -fluoresenssinlukijaa luentajärjestelmä (HTS-7000 Plus Series BioAssay, Perkin Elmer) ja suodattimien 360 ± 20 nm: n viritykseen ja 460 ± 20 nm: n päästöjä.

siRNA ja transfektiokokeissa

siRNA dupleksoi spesifinen inhibitio calpain-I (μ-kalpaiini) ja kalpaiini-II (m-kalpaiini) ilmaisuja ihmisen solut saatiin Santa Cruz Biotechnology: kalpaiini-I, luettelonro . sc-29885, pooli 3 kohdespesifisen 20-25 nt siRNA: t; calpain-II, luettelonro. sc-41459, kohdespesifinen 20-25 nt siRNA. Ohjaus siRNA (luettelonro. Sc-37007) on ei-suunnattu 20-25 nt siRNA suunniteltu negatiivisena kontrollina. Lisäksi siRNA dupleksoi spesifinen esto GRP94 ilmentymisen syntetisoitiin kaupallisesti MWG Biotech (Saksa). Merkityksessä (ylhäällä) ja antisense (alhaalla) sekvenssit GRP94 siRNA duplex olivat seuraavat: 5′-GAAGAAGCAUCUGAUUACCTT-3 ’; 3’-TTCUUCUUCGUAGACUAAUGG-5 ’. Kuten epäspesifinen kontrolli, NC siRNA duplex satunnaisjono suunniteltiin seuraavasti: 5’-AGUUCAACGAGUAUCAGCATT-3 ’; 3’-TTUCAAGUUGCUCAUAGUCGU-5 ’. SiRNA: t käytettiin pitoisuutena 100-200 nM ohimenevä solujen transfektio Lipofectin (Invitrogen) kuoppaa kohti 6-kuoppalevyn tuoretta väliainetta. 24 tunnin kuluttua alkuperäisestä transfektiosta ja 24-36 h hoito, solut tai solujen lysaatit kerättiin ja analysoitiin apoptoosin tai proteiinin ilmentymisen, vastaavasti.

Immunofluorescence ja Laser Scanning konfokaalimikroskopialla

Soluja pestiin kahdesti PBS: llä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 30 minuutin ajan ja sitten blokattiin 1% naudan seerumin albumiinia PBS: ssä. Primaaristen vasta-aineiden kuten levitettiin objektilasien laimennoksena 1:500 ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Näytteet käsiteltiin FITC-konjugoitua tai TRITC-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (Sigma).