Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on merkittävä kuolinsyy syöpään liittyvät ihmisen kuoleman. Sen terapeuttinen interventio vaatii parasta tehokasta molekyyli (t), koska se usein tulee vastustuskykyinen esittää kemoterapiaa vaihtoehtoja. Kirjoittajat raportoivat, että höyry on haihtuvaa öljyä yhdisteitä, saatu

Litsea cubeba

siemenet tappoi ihmisen NSCLC-solut, A549, läpi apoptoosin ja solusyklin pysähtymisen. Vapor syntyvät yhdistetyn öljyt (VCO) deaktivoitu Akt, keskeinen toimija syöpäsolun selviytymistä ja proliferaatiota. Mielenkiintoista VCO defosforyloitiin Akt molemmissa Pa

473 ja Thr

308; kautta tukahduttaminen mTOR ja pPDK1 vastaavasti. Seurauksena tästä, vähentynyt fosforylaatio Bad tapahtui yhdessä vähentynyt Bcl-xL ilmentymistä. Tämä myöhemmin parannettu Bax tasot sallii vapautumisen mitokondrioiden sytokromi c sytosoliin johon samanaikaisesti aktivoitu kaspaasi 9 ja kaspaasi 3 tuloksena apoptoottisen solukuoleman. Alentuminen Akt aktivoitumisen VCO samalla pois MDM2 että toteutettu yliekspressio p53 mikä puolestaan ​​voimistunut p21 ilme. Tämä aiheuttaa parannettu p21 sitoutumisesta sykliini D1 joka pysähtyi G1 S-vaiheessa etenemistä. Yhdessä VCO tuottaa kaksi piikki vaikutuksia keuhkosyöpään solujen, se indusoi apoptoosia ja estää syöpäsolujen lisääntymistä, sekä johtunut deaktivoitumisen Akt. Lisäksi se on toinen ratkaiseva etu: VCO voitiin toimitettava suoraan keuhkosyöpään kudosten hengitettynä.

Citation: Seal S, Chatterjee P, Bhattacharya S, Pal D, Dasgupta S, Kundu R, et al. (2012) Vapor haihtuvien Öljyt välillä

Litsea cubeba

Seed indusoi apoptoosia ja aiheuttaa solukierron pysähtymisen Lung Cancer Cells. PLoS ONE 7 (10): e47014. doi: 10,1371 /journal.pone.0047014

Editor: Gobardhan Das, International Center for Genetic Engineering and Biotechnology, Intia

vastaanotettu: 28 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 11 syyskuu 2012; Julkaistu: 16 lokakuu 2012

Copyright: © Seal et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus työ tukee taloudellisesti avustusta CSIR-Neep Project (HCP-005). Kirjoittajat SS ja PC ovat kiitollisia Department of Science Technology, Govt. Intian New Delhi; Sushmita Bhattacharya, DP ja RK kiitollisuudenvelassa neuvoston tieteellisen ja teollisen tutkimuksen (CSIR), New Delhi, myöntämiseksi Research Yhteisöt. SD on kiitollinen UGC Dr. D. S. Kotharin PDF CSIR-Neist varten QHF; ja Samir Bhattacharya Intian National Science Academy hänen INSA Tutkija asentoon. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tällä toinen kirjoittaja professori Samir Bhattacharya on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä syövistä ja merkittävä syy maailmanlaajuisesti syövän liittyvän kuolema noin 1,4 miljoonaa potilasta vuodessa [1]. Joukossa keuhkosyöpä, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) koostuu -80% ja jonka sisällä adenokarsinoomassa on huomattavan suuri esiintyminen ja kuolleisuus [2]. Kemoterapia ja /tai säteilytys tavallisesti epäonnistuu, koska NSCLC-solut ovat luonnostaan ​​vastustuskykyisiä tällaisia ​​hoitoja, lisäksi ennusteen NSCLC on erityisesti huono [3], [4]. Kaikki nämä vaikuttavat erittäin rajallinen hoitovaihtoehto keuhkosyöpään. Tämän vuoksi on ratkaisevan tärkeää tarvetta kehittää kohde erityinen kemiallis-interventio hidastamaan syövän leviämiseen tai apoptoosin tai molemmat hoitaa ongelman NSCLC.

käsitellä NSCLC: n hälyttävä tilanne, useat yritykset ovat olleet tehty etsiä sopivia molekyylikohteista puuttua syöpäsolujen etenemistä ja apoptoosin. NSCLC-solut, Akt /PKB on konstitutiivisesti aktiivinen kinaasi joka edistää solujen eloonjäämistä [5]. Aktivointi Akt tapahtuu, kun se on värvätty solukalvon läpi sen PH domain ja fosforyloitiin niiden Thr

308 ja Ser

473 välityksellä of PDK1 (fosfoinositidi riippuvainen kinaasi 1) ja mTOR (nisäkkään rapamysiinin kohde) vastaavasti [6], [7]. Mielenkiintoista on, että poikkeava Akt aktivointi edistää suuresti keuhkojen karsinogeneesi [8]. Fosforyloidun Akt (Pakt) on tehokas promoottori solujen eloonjäämisen koska se pitää tämän reitin hengissä suojaamalla Bcl-xL: n ja vastavaikuttamalla eri osien apoptoottisten laskeutuu [9]. Vaikka apoptoottista johtuvasta eston Akt on havaittu vaihtelevassa määrin useita syöpiä [10], [11] voisi olla ratkaiseva keuhkosyöpä, koska tehostetun fosforyloitua muotoa Akt tapahtuu alati [12].

Akt säätelee p53, joka on tuumorisuppressoriproteiinia, joka ohjaa solusyklin etenemistä, kautta MDM2 (hiiren kaksinkertainen mutantti-2), ubikitiinin ligaasia. MDM2 on substraatti Akt, fosforylaation mdm2 mukaan Akt vaikutuksia ubikitinaation ja proteasomaalisten hajoaminen p53 [13]. Aktivoidut Akt siis poistaa merkittävä este syöpäsolun etenemisen. Toinen tärkeä ulottuvuus Akt on sen estävä vaikutus apoptoottisen reitin. Bad, jäsen Bcl

2 perhe on todettu olevan ensimmäinen proteiini, joka käynnistää apoptoosin syrjäyttämällä Bcl

2 tai Bcl-x, joka mahdollistaa Bax oligomeroitavan ja luoda huokosiin mitokondrion kalvon vapauttamaan sytokromi c kielelle sytosolissa [14], [15]. Aktivoidut Akt fosforyloi Bad at Ser136 aiheuttaa sen irtoavan Bcl-x L mitokondrion kalvon ja yhdistää sovittimen proteiini 14-3-3 tuloksena Bad sitomisen sytosoliin [16], [17]. Target perustuva parannus peräisin NSCLC solun etenemistä tai hävittämistä vielä käytettävissä ja koska Akt on konstitutiivisesti aktiivinen täällä ja hyvin tunnettu kinaasi tiedetään tukevan syöpäsolun selviytymistä ja etenemisen, sen deaktivointi olisi paras valinta käsitellä NSCLC.

tässä raportissa osoitetaan, että haihtuvat yhdisteet öljystä uutettu ja puhdistettu siemenistä

Litsea cubeba

(Lour.) Pers. (Lauraceae), kasvi laajalti saatavilla koillisalueiden Intian tuhoaa keuhkosyövän soluihin deaktivoitumisen Akt. Mielenkiintoista on, se on höyryn öljyjen, joka indusoi apoptoosia ja estää soluproliferaatiota NSCLC tuottamalla vikoja Akt-fosforylaation. Höyry öljyjen osoitti kaksi piikki vaikutusta, ts induktio apoptoottisen kuoleman ja hidastuminen solusyklin etenemisen, sekä tapahtuu kautta deaktivoitumisen Akt. Tässä raportissa siten odottaa erityinen vetovoima höyrynä aiheuttama tuhoutuminen keuhkosyövän solujen olisi merkittävä ulottuvuus suhteessa toimitettavaksi kohdekudokseen.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Kaikki soluviljelmässä materiaalit saatiin Gibco-BRL, Life Technologies Inc., Gaithersburg, USA. Ensisijainen vasta-aineita Pakt (Thr308, sc-135650), pAkt1 /2/3 (Ser473, sc-7985-R), Akt 1/2/3 (sc-8312), pPDK1 (Ser241, sc-101775), Bcl -XL (sc-7195), pBAD (Ser136, sc-7999), Bad (sc-7869), pMdm2 (Ser166, sc-293105), p53 (sc-6243), p21 (sc-756), sykliini D1 ( sc-753), poly [ADP-ribosyl] polymeraasin toi- (PARP) (sc-7150), sytokromi c (SC- 7159) ja β-aktiini (sc-130657) ostettiin Santa Cruz Biotechnology Inc., Kalifornia, USA ja mTOR (# 2983) hankittiin Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA. Alkalisen fosfataasin ja FITC konjugoitua sekundaarista vasta-aineita, anneksiini V-Cy3 apoptoosin detektioreagenssipakkaus, proteiini-A-agaroosin ja CHAPS ostettiin Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA. MTT iinianalyysikitissä hankittiin Millipore, Temecula, CA, USA. Kaspaasi Glo ™ 3/7 iinianalyysikitissä hankittiin Promega Corporation, Madison, WI, USA. Mitotracker hankittiin Molecular Probes, MD, USA, JC-1 mitokondrion kalvon potentiaalia iinianalyysikitissä hankittiin Cayman Chemical Company (Ann Harbor, MI, USA). Apoptotic DNA tikkaat kit ja BrdU -leimauskittiä hankittiin Roche Diagnostics (GmbH, Saksa).

eristäminen ja puhdistaminen tärkeät rasvat

Litsea cubeba

siemenet

Noin 250 g tuore kypsä siemenet

Litsea cubeba

kerätyt välisenä aikana elokuu-lokakuu 2009-2011 peräisin CSIR-Neist koetila, Jorhat, Assam liotettiin tislatussa vedessä ja uutetaan käyttämällä Clavenger laitetta 6 tuntia. Eteerinen öljy talletetaan edellä vesikerros erotettiin käyttäen erotussuppiloon ja kuivattiin vedettömällä natriumsulfaatilla (neutraali) ja suodatettiin, jolloin saatiin öljy (6,25 g, 2,5% saanto). Ohutkerroskromatografian raakaöljyn osoitti, että läsnä on neljä erillistä kohdetta. Raaka öljy (1 g) kohdistettiin kromatografinen puhdistus silikageeli (20 g, 100-200 mesh, Rankem) sarakkeessa (1 tuuman halkaisija 50 cm pituus) pakattuna heksaanissa. 30 ml: n fraktioita kerättiin seuraavassa järjestyksessä: fraktiot 1-10 (heksaani), 11-20 (1% etyyliasetaattia heksaanissa), 21-35 (2% etyyliasetaattia heksaanissa), 36-60 (3% etyyliasetaatti heksaanissa), ja osa 61, kunnes täydellinen eluutio yhdisteiden (4% etyyliasetaattia heksaanissa). Fraktiot 11-20 sisältävät 1 (tästä lähtien viitataan nimellä yhdiste 1 tai C1) (TLC) yhdistettiin ja konsentroitiin pyöröhaihduttimella, jolloin saatiin öljy (100 mg), ja tämä tunnistettiin sitronellaali vertailusta alkuperäisen materiaalin kanssa (TLC, IR, NMR, MS). Fraktiot 23-35, jotka sisältävät 2 (tästä lähtien viitataan nimellä yhdiste 2 tai C2) (TLC) yhdistettiin ja väkevöitiin pyöröhaihduttimessa, jolloin saatiin öljymäistä ainetta (86 mg), ja tunnistettiin neo-isopulegol vertaamalla sen

1 H NMR-spektri, joka on raportoitu kirjallisuudessa [18]. Fraktiot 40-60, jotka sisältävät yhdistettä 3 (tästä lähtien viitataan nimellä yhdiste 3 tai C3) (TLC) yhdistettiin ja konsentroitiin pyöröhaihduttimella, kuten edellä on selitetty, jolloin saatiin öljymäinen jäännös (120 mg), ja tämä tunnistettiin isopulegol suoraan verrattuna

1H-NMR-spektrin, joka on raportoitu kirjallisuudessa [18]. Fraktiot 64-76, jotka sisältävät yhdistettä 4 (tästä lähtien viitataan nimellä yhdiste 4 tai C4) (TLC) yhdistettiin ja väkevöitiin, jolloin saatiin paksua öljyä (55 mg), joka tunnistettiin sitronelloli vertailusta sen

1H-NMR-spektri, jossa autenttinen näyte .

yhdistettä 1 (C1):

IR (CHCl

3): υ 2925, 1724, 1457, 1437, 1219, 1040, 772 cm

-1;

1H-NMR (CDCI

3, 300 MHz): δ 0,96 (d,

J

= 6,6 Hz, 3H, -CH

Me

), 1,30-138 (m , 2 H, -CHMeC

H

2

CH

2), 1,68 (s, 3H, = C

Me

), 1,98 (s, 3H, = C

Me

), 1,98-2,06 9m, 3H, = C

CH

2

– -C

H

Me-), 2,24 (dd,

J

= 7,9, 2,6 Hz, 1 H, -C

H

HCHO), 2,37 (dd,

J

= 5,4, 1,6 Hz, 1 H, -CH

H

CHO), 5,06 (t,

J

= 7,0 Hz, 1 H, -C

H

= CMe

2), 9,75 (s, 1 H, -C

H

O). MS (ESI): 155 (M

++ 1); kp 206 ° C (kirj 207 ° C).

Yhdistettä 2 (C2):

IR (CHCl

3): υ 2925, 1722, 1643, 1455, 1445, 1375, 1219, 1024, 889, 772 cm

-1;

1H-NMR (CDCI

3, 300 MHz): δ 0,87 (d,

J

= 6,6 Hz, 3H, -CH

Me

), ,92-+0,95 (m , 1H), 1,08-1,12 (t,

J

= 6,6 Hz, 1 H), 1,47-1,54 (m, 1H), 1,68-1,75 (m, 3H), 1,79 (s, 3H,

Me

C = CH

2), 1,95-1,99 (m, 2H), 3,98 (m, 1 H, C

H

OH), 4,78 (s, 1 H, = C

H

2), 4,95 (s, 1 H, = C

H

2); MS (ESI): 154 (M

+).

Yhdistettä 3 (C3):

IR (CHCl

3): υ 2923, 1645, 1455, 1448, 1375, 1219, 1095, 1051, 1027, 886, 772 cm

-1;

1H-NMR (CDCI

3, 300 MHz): δ 0,90-1,03 (m, 2H), 0,95 (d,

J

= 6,6 Hz, 3H, -CH

Me

), 1,30-1,35 (m, 1H), 1,47-1,54 (m, 1H), 1,63-1,65 (m, 1 H), 1,69 (d,

J

= 1,5 Hz, 3H,

Me

C = CH

2), 1,87-1,89 (m, 1H), 2,03-2,06 (m, 2H), 3,50 (dt, 1 H,

J

= 10,4, 4,2 Hz , C

H

OH), 4,85 (s, 1 H, = C

H

2), 4,89 (s, 1 H, = C

H

2); MS (ESI): 154 (M

+); kp 213 ° C (kirj 212 ° C).

Yhdistettä 4 (C4):

IR (CHCl

3): υ 3338, 2925, 1452, 1377, 1219, 1058, 1010, 738 cm

-1;

1H-NMR (CDCI

3, 300 MHz): δ 0,91 (d,

J

= 6,6 Hz, 3H, -CH

Me

), 1,15-129 (m , 2 H, -CHMeC

H

2

CH

2), 1,33-1,45 (m, 2 H, -C

H

2

CH

2OH ), 1,51-1,53 (m, 1 H, -C

H

Me-), 1,60 (s, 3H, = C

Me

), 1,68 (s, 3H, = C

Me

), 1,96-2,01 (m, 3H, = C

CH

2

– O

H

), 3,61-3,74 (m, 2 H, – C

H

2OH), 5,07 (t,

J

= 7,0 Hz, 1H, -C

H

= CMe

2); MS (ESI): 157 (M

++ 1); kp 223 ° C (kirj 222 ° C).

Soluviljely ja hoitoja

keuhkosyövän A549, oli ystävällinen lahjoitus tri Partha P. Banerjee (Georgetown University Medical Centre, Washington DC, USA), jossa hän on saatu American Type Culture Collection (ATCC), USA. Soluja viljeltiin DMEM: ssä, joka sisälsi Earlen suoloja ja ei-välttämättömiä aminohappoja täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia, penisilliiniä (100 U /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml), kosteutetussa 95% O

2/5% CO

2 ilmakehässä 37 ° C: ssa. Konfluentit solut osa-viljelty trypsinisaatiolla ja sen jälkeen ympättiin 6-kuoppaisille viljelymaljoille, jotka sisältävät DMEM välttämätöntä täydentää.

Solut ympättiin kuudella kuoppalevyllä pitää olla hyvin puuttuu soluja. Kun konfluenssiin saavutettu, raakaöljyn tai kunkin yksittäisen yhdisteen tai VCO laimennettiin DMEM ja sovellettu tyhjän levyn kuoppaan pohjustetaan hoitoon. VCO, joka sisältää väliaine täydennettiin joka 24 h ajaksi kokeen. Soluja inkuboitiin eri aikoina useita laimennoksilla VCO kuin mainitut luvut. Ohjaus soluja pidettiin erillisessä inkubaattorissa vältetään altistuminen VCO. Lopussa Inkubaation jälkeen solut hajotettiin, sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 10000 g: llä 4 ° C: ssa ja supernatantti otettiin talteen. Proteiinipitoisuus supernatantissa määritettiin seuraten menetelmää, jonka Lowry et ai. [19]. Salattu tai p53 siRNA tai Sp1 siRNA transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

MTT solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTT-määritystä kit (Millipore, Temecula, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solut maljattiin 96-kuoppalevyille ja altistettiin vaihtelevia laimennoksia raakaöljyn tai höyryä öljyt 72 h tai VCO eri ajanjaksoilla. 10 ui 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2-5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Liuottamisen jälkeen 100 ui 1 (N) isopropanoli /0,04 (N) HCl: lla, absorbanssi luettiin 595 nm: ssä mikrolevylukijalla (Thermo Electron Corporation, MA, USA).

anneksiiniV-Cy3 detektiomäärityksen

anneksiiniV-Cy3 apoptoosin havaitseminen pakki, ostettu Sigma Aldrich, St. Louis MO, USA käytettiin erottamaan eläviä (vihreä fluoresenssi), nekroottinen (punainen fluoresenssi) ja apoptoottisten solujen (vihreä ja punainen fluoresenssi). A549-soluja inkuboitiin ilman tai VCO laimennus (2 x 10

3) 36 tunnin ajan pestiin perusteellisesti PBS: llä, korjattu ja 50 ui solususpensiota täpliksi poly-L-lysiinillä päällystetty lasilevyllä. Sitten solut pestiin kolme kertaa sitoutumispuskurilla ja värjättiin kaksinkertainen merkintä värjäysliuosta (anneksiini V-Cy3 ja 6 karboksi fluoreskeiini Di-asetaattia (CFDA) 10 minuutin ajan. Ylimäärä merkintöjä oli poistettu pesemällä solut kolme kertaa sitomispuskurilla ja soluja tarkasteltiin fluoresenssimikroskoopilla (Zeiss Axio laajuus A1, Carl Zeiss, Göttingen, Saksa).

JC-1 mitokondrion kalvon Mahdolliset Pitoisuus

JC-1 värjäys suoritettiin käyttäen JC- 1 mitokondrioiden kalvojännite iinianalyysikitissä, Cayman Chemical Company, (Ann Arbor, MI, USA) kohti valmistajan protokollaa. Lyhyesti, ohjaus ja VCO (2 x 10

3 laimennus) käsitellyt solut altistettiin JC-1 tahra (10 ug /ml) 20 minuutin ajan 37 ° C: ssa. siirtyminen fluoresenssin vuoksi VCO hoidon tarkasteltiin fluoresenssimikroskoopilla (Zeiss Axio laajuus A1, Carl Zeiss, Göttingen, Saksa).

DNA: n fragmentoituminen määrityksessä

Matalan molekyylipainon DNA uutettiin 1 x 10

6 ohjaus tai VCO (2 x 10

3dilution) käsitellyissä soluissa käyttämällä Apoptotic DNA tikkaiden Kitin Roche Diagnostics, (GmbH, Saksa) jälkeen valmistajan ohjeita. Eluoitu DNA-näytteet lastattiin etidiumbromidilla värjätty 1,5% agaroosigeelillä ja kuva otettiin Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, USA käyttäen Image Lab ohjelmistoa.

Elektroforeesi ja immunoblottaus

60 ug proteiinia valvonnan tai käsitelty solu- lysaatit eroteltiin 10% tai 12,5% SDS-PAGE ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Millipore, Bedford, MA) avulla Semi-Dry trans blot laite (TE77 Semi-Dry Transfer Unit, GE Healthcare, CA, USA). Membraanit inkuboitiin ensin yön yli 4 ° C: ssa eri primaaristen vasta-aineiden on 1:500 laimennoksina seuraa vastaavien alkalisella fosfataasilla konjugoitu sekundäärisen vasta-aineiden 1:2000 laimennoksilla huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Proteiinin vyöhykkeet havaittiin käyttäen 5-bromro 4-kloori 3-indolyylifosfaatti /nitrosinitetratsoliumia (BCIP /NBT). Vyöhykkeiden voimakkuuden arvioitiin Image Lab ohjelmisto (Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, USA).

Immunofluoresenssikoe tutkimus sytokromi c

A549-soluja viljeltiin steriilejä päällystämättömän lasipeitelevyihin. Sekä ohjaus- ja VCO: n (2 x 10

3-laimennos) käsitellyt solut värjättiin Mitotracker (Molecular Probes, MD, USA) 1:10,000 laimennoksia (DMEM), 15 minuutin ajan. Solut pestiin edelleen DMEM ja käsitellään kiinnittämiseen. Kiinnityksen jälkeen soluja inkuboitiin anti-sytokromi-c-vasta-ainetta (1:100) 2 h, mitä seurasi inkubointi FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (1:50) vielä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Solut laskuri värjättiin ja asentaa DAPI kiinnitysväliaine ja tarkasteltiin fluoresenssimikroskoopilla (Zeiss Axio Scope A1, Carl Zeiss, Göttingen, Saksa).

kaspaasi-Glo 3/7 määritys

A549-soluja ympättiin 96 kuoppaviljelylevyillä ja inkuboitiin ilman tai VCO laimennus (2 x 10

3) eri ajanjaksoilla. Päättyessä Inkubaatioiden kaspaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä kaspaasi-Glo ™ 3/7, Promega Corporation, Madison, WI, USA mukaan valmistajan protokollaa. Luminesenssi mitattiin DTX-800 multimode ilmaisin (Beckman Coulter, CA, USA).

BrdU

DNA-synteesiä seurattiin mittaamalla tymidiinin analoginen 5-bromi-2 ’ deoksiuridiinista (BrdU) kasvavilla syöpäsolujen käyttämällä BrdU merkintöjä ja havaitseminen pakki. Ohjaus ja VCO (2 x 10

3 laimennus) käsiteltyjen A549-soluja rentoutuu täydelliseen alustaan, joka sisälsi BrdU leimausreagenssia ja inkuboitiin 1 tunnin. Solut pestiin sitten perusteellisesti pesupuskurilla ja kiinteän etanolilla kiinnitysainetta 20 minuutin ajan -20 ° C: ssa. Kiinnitetyt solut pestiin ja inkuboitiin anti-BrdU-vasta-aineen liuosta, minkä jälkeen anti-hiiri-lg fluoreseiini ratkaisu. Sitten solut asetettiin lasilevyille ja tarkasteltiin fluoresenssimikroskoopilla (Zeiss Axio Scope A1, Carl Zeiss, Göttingen, Saksa).

Kromatiini immunosaostuksella (chip) määritys

ChIP määritys suoritettiin käyttäen sirun assay kit (Upstate, Temecula, CA, USA) noudattaen valmistajan protokollaa käyttäen anti-p53-vasta-ainetta. Alukkeita käytettiin monistamaan tunnettuja p53-vaste-elementti on p21-promoottorin ja ne ovat – RE1: eteenpäin: 5′-CAGGCTGTGGCTCTGATTGG-3’and reverse: 5′-TTCAGAGTAACAGGCTAAGG -3 ’; RE2: eteenpäin: 5’-GGTCTGCTACTGTGTCCTCC-3 ’ja reverse: 5′-CATCTGAACAGAAATCCCAC-3’ [20] ja PCR-tuotteet erotettiin etidiumbromidilla värjätty 2% agaroosigeelillä ja kuva otettiin Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, USA Image Lab ohjelmistoa.

Co-immunosaostus (Co-IP) määritys

200 ug proteiinia valvonnan tai VCO käsiteltyjä soluja inkuboitiin yön yli 2 ug anti-p21 ja anti β-aktiini-vasta-ainetta 4 ° C: ssa jatkuvasti sekoittaen. Proteiini A-agaroosi lisättiin sitten ja inkuboitiin 4 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Antigeeni-vasta-kompleksit kerättiin sentrifugoimalla 10000 rpm: ssä 2 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Pelletti pestiin 3 kertaa poistamiseksi sitoutumattoman proteiinin ja keitetään 4 x näytepuskuria 5 minuutin ajan kiehuvassa vesihauteessa. Näyte sentrifugoitiin ja supernatantti ladattiin 10% SDS-PAGE ja sen jälkeen immunoblottauksella anti-sykliini D1 tai anti-β-aktiini-vasta-aineita.

Flow-sytometrinen analyysi

solusyklin analysointi, ohjaus ja VCO (2 x 10

3dilution) käsiteltyjen A549-solut trypsinoitiin, pestiin kahdesti PBS: llä, ja sitten kiinnitettiin 70% etanolilla 24 tuntia ennen DNA-analyyseissä. Poistamisen jälkeen etanoli sentrifugoimalla, solut pestiin kahdesti PBS: llä. Sitten soluja inkuboitiin RNaasi (100 ug /ml) 30 minuutin ajan ja värjättiin sitten propidiumjodidilla (PI-5 ug /ml) 15 minuuttia. Fluoresenssi PI käsiteltyjen solujen mitattiin virtaussytometrillä (BD FACSAria ™ II). Prosenttiosuudet G1, S ja G2-M-solut määritettiin käyttäen FACS Diva Software.

primaariviljelmä normaalien keuhkojen solut

Normaali keuhko- solut eristettiin Sprague Dawley rottien Phan et ai. [21], lyhyesti, terveillä rotat nukutettiin ja keuhkot valutettiin sitten steriilillä fosfaatti- puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) läpi oikeaan kammioon kunnes ne olivat vaalean. Sitten keuhkot poistettiin, jauhettu ja hajotettiin PBS: ssä, joka sisälsi 0,5% trypsiiniä 45 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Digestoidut solut erotettiin pilkkomattomalla kudosten ja roskat suodattamalla nailonverkon läpi. Sitten solut pestiin PBS: llä, sitten DMEM, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ja antibiootteja, ja suspendoidaan lopuksi uudelleen elatusaineeseen. Sitten solut maljattiin kuuden kuoppalevyllä pitää olla hyvin vailla solujen ja inkuboitiin kosteutetussa 95% O

2/5% CO

2 ilmakehässä 37 ° C: ssa. 1 tunnin kuluttua soluja inkuboitiin 2 x 10

3 laimentaminen C2 tai C3 tai C4 tai VCO: ssa 12 tuntia. Ohjaus soluja pidettiin erillisessä inkubaattorissa välttää höyryä. Lopussa Inkubaation jälkeen solut hajotettiin, sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 10000 g: llä 4 ° C: ssa ja supernatantti otettiin talteen. Proteiinipitoisuus supernatantissa määritettiin seuraten menetelmää, jonka Lowry et ai. [19].

Tilastollinen analyysi

Data on saatu vähintään kolmen erillisen kokeen ja analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA), jossa F-arvo ilmoitettu merkitys, avulla verrattiin post hoc useita erilaisia ​​testi. Kaikki arvot olivat keskiarvoja ± SEM.

Tulokset

bioaktiivisuus opastettu eristämistä ja puhdistamista öljyt siemenestä

Litsea cubeba

uutettu raakaöljy höyry alkaen

Litsea cubeba

siemeniä tutkittiin syövän vastaista aktiivisuutta A549 keuhkosyövän soluja. Useita laimennoksia raakaöljystä valmistettiin ja kutakin laimennosta lisättiin yhdessä 6 kuoppa viljelymaljoille, kun taas muut 5 sisälsivät A549 NSCLC-soluja. Höyry tuotetaan kutakin laimennusta odotetaan leviävän koko levyn ja saavuttaa syöpäsoluja. Annosriippuvainen altistuminen höyryn laski elinkelpoisuuden A549-solut merkittävästi 72 h [10

3] ja [10

2] laimennosta taas saakka [10

4] laimennoksia höyry ei ollut selvää vaikutusta selviytymiskyvyn solujen (Fig. 1A). Kromatografinen puhdistus

Litsea cubeba

siemenistä eteeriset öljyt aiheutti neljän tyyppisiä yhdisteitä, tunnistettu Massa ja

1 H-NMR-spektrin aitoja yhdisteet ja niiden kemiallisen luonteen havaittiin seuraavasti – C1: Sitronellaali; C2: neo-isopulegol; C3: isopulegol ja C4: sitronelloli (Fig. 1 B), joista kukin on erikseen lisättiin laimennoksena [2 x 10

3] yhdessä 6 kuoppaiselle viljelylevylle, muut 5 sisälsivät A549-soluja. Höyryt tuotetaan lisäämisen jälkeen öljyä hyvin altistettiin soluja 72 tuntia. Se voidaan nähdä kuviosta. 1C, että C1 oli huono toiminta, C2 ja C3 näytteillä 3-kertaa korkeampi aktiivisuus verrattuna C1, kun taas C4 oli korkein aktiviteetti, sikäli solujen kuolleisuuden osalta.

(A) Solujen elinkelpoisuus A549 keuhkosyöpäsoluissa mitattiin kun höyryjen eri laimennoksia (10

6-10

2) raakaöljyä 72 h käyttämällä MTT-määritystä ja data ilmaistiin% solun selviytymiskykyä suhteessa kontrolliin. (B) Kemialliset rakenteet neljän eniten saatavilla olevia yhdisteitä (C1 Sitronellaali; C2 neo-isopulegol, C3 isopulegol, C4 sitronellolia) eristettiin

Litsea cubeba

siemenistä eteerinen öljy. (C) Suhteellinen solukuolemaa havaittiin, kun A549-solut altistettiin erikseen näiden yhdisteiden kanssa 72 tuntia. (D) vaikutus VCO (C2:C3:C4 kuten 01:01:01) ja C4 solukuolemaa 72 tunnin havaittiin MTT: llä, joka tehtiin näkyväksi mikroskooppikuvia. (E) Cell elinkelpoisuus mitattiin eri aikavälein (24, 48, 72 h), jossa VCO altistumisen A549-soluja. (F) Western blot Akt fosforylaation Thr

308, Ser

473 ja koko Akt A549-soluissa hoitaa ilman (Con) C1, C2, C3, C4 ja VCO 36 tuntia. β-aktiini toimi sisäisen kuormituksen valvonta. Arvot ovat keskiarvoja ± SEM 3 yksittäisten kokeiden. * P 0,05, ** p 0,01 vs. kontrolli ja # p 0,05 versus C4.

Yhdistimme C2, C3 ja C4 klo 01:01:01 suhde tarkkailla, onko höyryä ulos nämä yhdistelmät voivat tuottaa lisä- tai synergistinen vaikutus solujen kuolemasta C4. Höyrystä yhdistetyn öljyt (VCO) oli merkitsevästi (p 0,05) suurempi aktiivisuus tappaa A549-soluja verrattuna höyryn C4 yksinään (Fig. 1 D) osoittaa, että C2 ja C3 tuottaa muita vaikutuksia C4. Siksi käytetään höyryn näiden yhteenlaskettu öljyistä so VCO. Kun VCO paljastui eri aikaväleillä, solujen kuolema tapahtui lineaarisesti ajan suhteen (Kuva. 1 E), joka osoittaa mahdollisuus apoptoosin induktion VCO. Olemme suorittaneet kokeita tutkia potentiaali C1, C2, C3, C4 yhdisteen inhibition määrittämiseksi Akt aktivointi. Koska A549 keuhkosyöpäsoluissa Pakt ilmentyy, Akt fosfory- otettiin merkki arvioida syövän vastainen vaikutus. C4 osoittivat suurempi inhiboiva vaikutus verrattuna muihin yhdisteisiin (C1, C2, C3,), mutta VCO, joka on yhdistelmä C2, C3 ja C4 merkitsevästi suurempi estävä vaikutus verrattuna C4 (Fig. 1 F). Tässä vaiheessa, onko VCO tuottaa sytotoksista vaikutusta normaaleihin keuhkojen soluihin olisi relevantti kysymys. Noudattaa tätä, höyry C2, C3, C4 yksilöllisesti ja VCO altistui primaariviljelmää keuhkojen soluja valmistettiin rotan. Höyry öljyt ja VCO ei tuottanut mitään haitallista vaikutusta solun morfologia verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Lisäksi olemme myös määrittää esto Pakt vuoksi VCO normaaleissa keuhkojen soluihin, ja todettiin, että ei ollut muutosta Pakt (Fig. S1A ja B). Kaikki nämä viittaavat siihen, että tällä annoksella VCO, normaalit keuhkot soluja ei vaikuta taas sama annos toteutettu huomattava kuolleisuus keuhkosyöpään solujen.

VCO indusoi apoptoosia keuhkosyöpäsoluissa

tarkastella VCO vaikutus A549 keuhkosyöpään solukuoleman, käytimme kaksinkertainen fluoresenssivärjäyksellä 6-CFDA ja anneksiini V-Cy3 eriyttämisestä live, apoptoottisten, ja nekroottiset solut. VCO aiheuttama fosfatidyyliseriinin translokaation sisemmästä ulompaan seloste solukalvon tunnustettiin fosfatidyyliseriini sitovan proteiinin anneksiini V konjugoitu Cy3. 36 h, ohjaus A549-solut osoittivat värjäyksen vain 6-CFDA (vihreä) taas käsittely VCO lisäsi anneksiini V-Cy3 (punainen) ja 6-CFDA (vihreä) double-värjäytyneiden solujen (Fig. 2A) ja tämän lisääntyi ajan osoittaa parannuksen apoptoottisten solujen (Fig. 2B). Laajentaa havainto lisäksi käytimme JC-1 fluoresoivan tutkimiseen mitokondrion kalvon potentiaalia. Elävissä soluissa, johtuen fysiologisen membraanipotentiaalia, JC-1, joka liittyy mitokondrion kalvon ja muotoa J-aggregaattien, jotka lähettävät punaista fluoresenssia, kun taas depolaroiduissa mitokondrion kalvon apoptoottisten solujen sisälsi monomeerisiä JC-1, että fluoresoivat vihreinä. Se voidaan nähdä kuviosta. 2C että A549-solut emittoivat punaista fluoresenssia taas VCO inkuboidaan solut merkitty vihreällä fluoresenssi osoittaa solujen apoptoosin. VCO indusoi apoptoottisen solukuoleman keuhkosyövän soluissa oli myös ilmeistä DNA tikkaat takia oligonukleosomaalisiksi hajanaisuutta kromatiinin (Fig. 2D). Nämä tulokset osoittavat, että VCO indusoi apoptoosia vain keuhkosyövän soluja.

(A) anneksiini-Cy3 (punainen) ja 6-CFDA (vihreä) kaksinkertainen värjäys apoptoottisten solujen tutkittiin fluoresenssimikroskopialla, jossa VCO käsiteltyjen A549-soluja osoittivat sekä vihreä ja punainen tahrat ja ohjaus (käsittelemättömät) solut värjätään vihreä vain. (B) prosenttiosuus apoptoottisten A549-solut mitattiin eri ajankohtina (0 h, 12 h, 24 h, 36 h), jossa VCO hoitoja. (C) Mitokondrioiden kalvon potentiaali havaittiin ohjaus ja VCO alttiina (36 h) A549 keuhkosyöpään solujen JC-1 värjäystä määrityksessä. (D) apoptoottinen DNA: n fragmentoituminen havaittiin VCO käsitellylle A-549-solut on 1,5% agaroosigeelielektroforeesilla. Data esitetään keskiarvoina ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** p 0,01 versus kontrolli (0 h). Palkki edustaa 20 um.

esto Akt fosfory- VCO vaikuttaa haitallisesti alavirran signalointia solun eloonjäämisen

Kun useimmissa syöpäsoluja, Akt on ensisijainen valinta hoitointerventio vuodesta se on keskeinen rooli kuolemattomuuteen ja syöpäsolujen lisääntymistä. Fosforylaatiota Akt at Thr

308 ja Ser

473 voimme pitää nämä kaksi tärkeää ominaisuuksia. VCO hoito dramaattisesti vähentynyt Akt fosforylaation Thr

308 ja Ser

473 ilman merkittäviä muuttamista koko Akt proteiinin taso A549 syöpäsoluissa (Fig. 3A, B ylempi paneeli). 36 h VCO vähensi Pakt Thr

308 tasolla 70% ja Pakt Pa

473 tasolle 95% verrattuna 0 h eli ohjaus syöpäsoluja (Fig. 3A, B alempi paneeli). Tämä osoittaa, että VCO voimakkaasti deaktivoi Akt, joka sallii apoptoottista polku edetä. Aktivointi Akt säätelee kaksi erillistä kinases- mTOR ja PDK1, entinen vastaa Akt fosforylaatio Ser

473, kun taas jälkimmäinen fosforyloip at Thr

308. Siksi tutkittiin PDK1 fosforylaatiota ja mTOR ilmaisun vastauksena VCO. Oli merkittävää laskua PDK1 fosforylaation ja mTOR ilmaisun A549-solut johtuu VCO altistumisesta (Fig. 3C, D). Koska Akt välittää sen vaikutus apoptoosin kautta Bad, deaktivointi Akt johtuu VCO voisi vakavasti vaarantaa kanssa aktivointi Bad. Oli merkittävä väheneminen Bad fosforylaation VCO klo 36 h, joka on odotettu tulos pienentynyt Akt-fosforylaation (kuvio. 4A ylempi ja alempi paneeli).