Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä soluliikkuvuus on keskeinen ilmiö säätelevä ja metastaasit. Focal tarttuvuus kinaasi (FAK) on merkittävä rooli soluadheesion ja etäpesäkkeiden eri syöpiä. Suhde lisäravinteena kalsiumin ja paksusuolen syöpä on tutkittu laajasti. Kuitenkin vaikutus kalsiumin (Ca

2 +) lisäravinteen calpain-FAK-motiliteettiin ei ole ymmärretty. Me pyrittiin selvittämään mekanismia FAK pilkkominen kautta Ca

2+ sidottu laktaattia (Cala), sen alavirran signalointia ja rooli motiliteettia ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Olemme havainneet, että hoidettaessa HCT116 ja HT-29-solujen kanssa Cala välittömästi lisäsi solunsisäistä Ca

2+ (iCa

2 +) tasot pitkäksi aikaa. Ca

2+ virtaa indusoitu pilkkomisen FAK tulee N-terminaalisen FAK (FERM domain) annoksesta riippuvalla tavalla. Fosforyloitua FAK (p-FAK) myös pilkkoutuu sen p-N-terminaalista FAK. Cala lisääntynyt paksusuolen syöpäsoluja liikkuvuutta. Calpeptin, joka on kalpaiini estäjä, käänteinen vaikutukset Cala on FAK ja pFAK pilkkominen sekä syöpäsolun linjat. Katkaistun FAK translokoituu tumaan ja säätelee p53 vakautta MDM2 liittyvää ubikitinaation. Cala aiheuttama Ca

2+ tulva lisäsi motiliteettia paksusuolen syövän solujen välittämä calpain aktiivisuuden kautta FAK ja pFAK proteiinia epävakautta. Yhteenvetona nämä tulokset viittaavat siihen, että huolellinen voidaan harkita päätettäessä ruokavalion Ca

2+ lisäravinteen hoidettavalla potilaalla metastaattinen.

Citation: Sundaramoorthy P, Sim JJ, Jang YS, Mishra SK, Jeong KY, Mander P, et ai. (2015) Modulation solunsisäisen kalsiumin tasot mukaan kalsiumlaktaatti Vaikuttaa Colon Cancer soluliikkuvuus kautta Kalsium-Dependent Calpain. PLoS ONE 10 (1): e0116984. doi: 10,1371 /journal.pone.0116984

Academic Editor: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 31 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 17 joulukuu 2014; Julkaistu: 28 tammikuu 2015

Copyright: © 2015 Sundaramoorthy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Gachon Institute of Pharmaceutical Sciences Research Fund 2013 Gachon University, Korean tasavalta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat julistaa ole kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

Colon syöpä on kolmanneksi suurin syy syöpään liittyvien kuolleisuus kaikkialla maailmassa, osuus on yli 600000 kuolemantapausta vuosittain yhä esiintyvyys. Karsinogeenisia induktio paksusuolen tapahtuu läpi tapahtumaketju johtaa etäpesäkkeiden mukana eri onkogeenisten proteiineja. Focal tarttuvuus kinaasi (FAK) on keskeisessä asemassa paksusuolensyöpä etenemiseen ja on tärkeä onkogeenisen proteiini osallistuu solujen lisääntymistä, eloonjääntiä ja liikkuvuus [1,2]. Calpain on hyvin säilynyt kysteiiniproteaasiin aktivoidaan lisäämällä solunsisäistä Ca

2+ (iCa

2 +). Se paikantuu fokaalisen adheesion, ja mahdollisesti aiheuttaa pilkkominen fokaalisen adheesion proteiineja. Verraten, etäpesäkkeitä olla korkeampia calpain kuin ei-etäpesäkkeitä. Calpain välittämä FAK hajoamisen on kriittinen potevilla ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa [3]. Näyttää siltä, ​​että toiminta calpain solun tarttumiseen ja liikkuvuus rajoittaa niiden kyky katkaista osien polttoväli komplekseja, mikä puolestaan ​​voi lisätä tarttuvuutta liikevaihdon ja toiminnallisesti merkittävää kasvaimen etenemiseen [4,5].

ICA

2+ ioni on tärkeä signalointi molekyyli, joka moduloi lukuisten soluprosessien syövän fysiologiaan, mukaan lukien solun liikkuvuus. ICA

2 + pidetään matalina pitoisuuksina (~ 100 nM) verrattuna solunulkoiseen vapaa Ca

2+ (1,2 mM) [6,7]. Alhainen soluliman Ca

2 + ylläpidetään aktiivista ulosvirtausta soluista kautta solukalvon Ca

2 + -ATPaasi pumppu, kun taas sarcoendoplasmic reticular Ca

2 + -ATPaasi poistaa Ca

2+ protoni vaihto . Muut Ca

2+ läpäisevä kanavia kuten tallennettu kalsiumkanavissa, ohimenevä reseptorin potentiaali (TRP) kanavat ja kalsiumin vapautuminen aktivoitu kanava (CRAC) proteiini 1 osallistuvat myös ICA

2 + homeostaasiin. Remontin tai vapautuminen iCa

2 + homeostaasiin syöpäsoluissa aiheuttaa muutoksia syövän etenemisessä [8]. Lisäravinteena Ca

2+ tiedettiin vähentävän paksusuolen adenoomia ja syöpä [9]. Kuitenkin vaikutus Ca

2+ lisäravinteena on tuntematon syövän etäpesäkkeitä.

Normaalit solut on alhainen pitoisuus solunulkoisen laktaatin vaihtelee 0,5 ja 2 mM, mutta pitoisuus syöpäsolut voivat olla yhtä peräti 30-40 mM [10]. Syöpäsolun eloonjääminen edellyttää emäksinen solunsisäinen ympäristö ja hapan solunulkoiseen ympäristöön [11,12]. Monokarboksylaatti kuljettajat (MCT) ensisijaisesti liikkumisen valvomiseksi solun sisäinen ja ulkoinen maitohappo [13]. Kohonneita MCT1 on havaittu rinta-, paksusuoli-, maha-, ja kohdunkaulan syövät. MCT4 ilmentyminen on erittäin kohonnut munuaisten, kohdunkaulan ja eturauhassyövät [14]. MCT4 vapauttaa laktaattia vastauksena hypoksia, kun taas laktaatti ottoa happipitoista kasvainsolujen kautta tapahtuvaa MCT1 [15,16]. Lactate toimii substraattina oksidatiivisen aineenvaihdunnan happipitoista kasvainsoluissa.

Perustuen tiedot Ca

2+ lisäravinteena metastaattisessa syövän, tutkimme motiliteettia koolonkarsinoomasoluissa suoralla altistuminen Ca

2+ sidottu laktaattia (CALA). Olemme keskittyneet calpain-FAK-cell koulutusjakson ymmärtämään taustalla molekyylitason mekanismeja ihmisen paksusuolen syövän solun liikkuvuus.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät

Kaikki solulinjat olivat hankittiin American Type Culture Collection (Manassa, Va). Ihmisen paksusuolen syövän solulinjat HCT116, HT-29, ja DLD1were viljeltiin RPMI1640. Normaali koolonsolulinjassa CCD-18Co oli viljeltiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini-streptomysiiniä kostutetussa atmosfäärissä 37 ° C: ssa, joka sisälsi 5% CO

2.

Reagenssit ja vasta

Cala, FAK-estäjä (TAE226), kalpaiinin estäjä (Calpeptin), flunssan 3AM ostettiin Sigma (St. Louis, Mo). Primaaristen vasta-aineiden, joita käytetään western blot-analyysi (FAK, pFAK, kalpaiinin-2, p53, MDM2, pMDM2, α-tubuliinin, Lamin B, GADPH) ja vastaavat sekundääriset vasta-aineet hankittiin valmistajalta Cell Signaling Technology (USA).

termodynamiikka kaksiarvoisen metalli-ionin sitoutumista maitohapon

mittaamiseksi sitovat isotermit vuorovaikutusta kaksiarvoisen metalli-ionin Ca

2+ maitohappo, isoterminen titraus kalorimetriaa (ITC) kokeet suoritettiin käyttäen Microcal 200 isoterminen titraus microcalorimeter (Microcal, Inc., Northampton, MA). Tietojen kerääminen, analysointi ja piirtämistä suoritettiin käyttäen Windows-pohjainen ohjelmisto Alkuperä (versio 7.0; toimittamia Microcalin). Titraava microcalorimeter sisälsi näytteen ja viite soluja pidettiin adiabaattinen koteloon. Viittaus kenno täytetään tislatulla vedellä. Tyypillisiä titrauksessa mukana suonensisäisten 1,5 ui 5 mM Ca

2 + ioni (käyttäen tietokoneohjattua suutin) näytteeseen soluun (täytetään 0,5 mM maitohappoa pH 7,0). Näytteet injektoitiin 2 minuutin välein, jotta varmistetaan, että titrauskäyrät oli palannut perustasolle ennen seuraavaa injektiota. Ruiskua sekoitusnopeuden asetettiin 1000 rpm. Imeytyminen tai vapautuminen lämmön aikana kunkin injektion mitattiin käyttämällä kalorimetrissä. Titraus Isotermien Kirjansidontasektorin vuorovaikutusten käsitti ero lämpövirroista eri injektioita. Nämä arvot integroidaan sitten määrittämään entalpian muutos liittyy jokaisen injektion. Lämmön aiheuttamia muutoksia injektion kunkin metalli-ionin tislattuun veteen oli vähäistä. Laimennus data vähennettiin näytedatan ja huonoja datapistettä poistettiin. Aineisto sovitus suoritettiin käyttäen Alkuperä ohjelmistoa (versio 7.0) ja sovitusprosessia titrattiin kunnes parhaiten määritetään chi-neliö minimointi menetelmällä saatiin. Sovittamalla sitova isotermien tällä tavoin tarjotaan tietoja sitoutumisvakio (Ka), muutos entalpia (AH), ja stoikiometria sitovien (n). Sitova Gibbsin vapaa energia (AG-) laskettiin entalpian muutos (AH) ja sitova vakio (Ka) kaavalla: AG-= RTlnKa = ΔHTΔS, missä R on kaasuvakio ja T on absoluuttinen lämpötila Kelvin-asteina [17]. Samaan aikaan stoikiometria n (n) eri vuorovaikutusten määritettiin yhdet Sites malleja.

mittaus iCa

2+ pitoisuus

Sytosoliset vapaa Ca

2+ ion mitattiin käyttäen konfokaali Laser-skannaus mikroskooppi (Leica, Heidelberg, Saksa). Viljellyt HCT116 ja HT-29-soluja ladattiin 10 uM Fluo-3 /AM ja 1 ui 25% Pluronic F-127 (liuotettuna DMSO: hon), ja inkuboitiin 30 minuuttia 37 ° C: ssa. Lataamisen jälkeen fluoresenssikoetinta, 2,5 mM Cala lisättiin ja kuva otettiin. Fluo-3 /AM viritettiin 488 nm: ssä ja pääsee fluoresenssi mitattiin 515 nm: ssä. Solunsisäiset Ca

2 + tasot ilmaistaan ​​F /F0 suhteet, missä F0 on ensimmäinen fluoresenssin intensiteetti (Image J ohjelmisto analyysi).

Haavan paranemista määritys

haavan määritystä, ibidi viljelyinsertistä koostuu kahdesta altaiden erotettu 500 pm paksu muuri käytettiin. Solut ympättiin kahteen kammion (100 ui 4 x 10

5 solua /ml) ibidi viljelyinsertistä. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen, kammio poistettiin varovasti luoda rako ~ 500 um. Sitten solut annetaan kulkeutua paljasti alueet 6 tuntia. Elävien solujen kuvantaminen tehtiin käyttäen Juli Br, elävien solujen analysaattori (NanoEnTek Inc, Etelä-Korea).

Western blot-analyysi

Solulysaatit valmistettiin ja yhtä suuri määrä proteiinia erotettiin SDS-PAGE ja siirrettiin edelleen polyvinylideenifluoridia (PVDF) kuten aiemmin on kuvattu [18,19,20]. Erityiset ensisijainen vasta-aineiden ja sen jälkeen HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta käytettiin spesifisten proteiinien käyttäen ECL-järjestelmää (AbClon) signaalin havaitsemiseksi.

Immunofluoresenssianalyysi

HCT116 ja HT-29-soluja käsiteltiin CALA 12 tuntia. Solut kiinnitettiin 100% kylmää etanolia 20-30 minuutin ajan -20 ° C: ssa, tehtiin läpäiseviksi 0,3% Triton X100 PBS: ssä 15 minuuttia huoneen lämpötilassa, ja pestiin sarjaan PBS: ssä. Solut blokattiin 3% hevosen seerumilla PBS: ssä 1 h huoneen lämpötilassa ja pestiin PBS: llä. Sitten soluja inkuboitiin FAK-vasta-ainetta (1: 800), 3% hevosen seerumilla PBS: ssä 4 ° C: ssa yön yli. Solut pestiin PBS: llä ja sen jälkeen inkuboitiin Alexa-488 konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 h huoneenlämmössä. Sitten solut suljettiin asennusainetta sisältävät DAPI (Vectashield, Vector Laboratories). Kuvat otettiin käyttäen CLSM (CLSM, Nikon A1 +, Japani).

Tilastolliset analyysit

Kaikki tiedot esitettiin keskiarvona ± keskihajonta (SD). Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin käyttämällä Studentin t-testiä ja

P

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Maitohappo sitoutuu kalsiumioneja suurella affiniteetilla

Analysoimme termodynaamisten ominaisuuksien Cala ja sitova vuorovaikutukset Ca

2+ ja maitohappoa isoterminen titrauksella kalorimetria (ITC). Edustavia ITC koskevat tiedot sitoutumisen maitohapon Ca

2+ pH: ssa 7,0 on esitetty kuviossa. 1. Lisätietoja myös laskettu yhdistys vakiot ja entalpia ja entropia yhdistysten on lueteltu taulukossa 1. Tulokset osoittavat, että maitohappo sitoutuu Ca

2 + K

d 6,2 × 10

-5 M, termodynaamisesti asianmukaisessa kunnossa muodostaa CALA suolaa. Meidän termodynaamiset laskelmat osoittivat, että yksi laktaatti molekyyli sitoutuu 0,361 Ca

2 + ioneja, vaikka kahden laktaatti molekyyli sitoutuu yhteen Ca

2 + ioneja teoriassa. ITC data osoittaa mahdollisuutta, että solunulkoisen maitohapon muodossa laktaatin voi muodostaa Cala suolan, joka voi esiintyä liukoisen muodon mukaisesti vesiliukoisuuden raja-pitoisuus (7,9 g /100 ml). Nämä tiedot viittaavat myös siihen, että Cala voidaan käyttää antamaan solunsisäisen kalsiumin, joka voi erottaa muuttujaan miljöö.

kolme edustavaa Isotermien on esitetty, joka kuvaa sitova pH: n funktiona 37 ° C: ssa. Ylempi ja alempi paneelit osoittavat tulokset kalorimetrisestä titrauksen 1,5 ui 5 mM Ca

2+ ja 0,5 mM maitohappoa seokseen 5 mM Tris-HCI pH: ssa 7,0. Kunkin titrauksen, raakadatan esitetään yläpaneeli ja integroidut lämmön tiedot esitetään alemmassa paneelissa.

Cala hallinto lisääntynyt iCa

2 + tasoilla

Arvioimme vaikutusta Cala hallinnon koolonkarsinoomasoluissa ja analysoidaan tasot liukenevat iCa

2+. HCT116 ja HT-29-soluja käsiteltiin 2,5 mM Cala, että oli merkittävä ero on 0 ja 600 sekuntia molemmissa solulinjoissa. Kokeellinen validointi tehtiin käyttämällä ionomysiini, ionoforin käytetään nostamaan iCa

2+ tasoilla. Ionomysiiniä (10 uM) voimakkaasti kohonneet iCa

2 + ensimmäisten sekunnin, jonka jälkeen vähitellen laski sekä solulinjoissa (Fig. 2). Vaikka ionomysiini nosti iCa

2 + tasoilla, nämä tulokset viittaavat siihen, että ionomysiini ei ole stabiili koolonsyöpäsolulinjaa. Kuitenkin HCT116-soluissa, Cala vähitellen lisääntynyt iCa

2+ sen enimmäismäärä on 480 sekuntia ja sitten tasaantui (Fig. 2A). HT-29-solujen saavutettu maksimi iCa

2+ pitoisuus välillä 50 ja 100 sekuntia, ja sitten tasaantui (Fig. 2B). Nämä tulokset viittaavat siihen, Cala lisääntynyt iCa

2+ tasoa ja ylläpitää näillä tasoilla pitkäksi aikaa.

Viljellyt HCT116 (A) ja HT-29 (B) Soluja käsiteltiin Fluo-3AM fluoresenssi koettimia, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin 2,5 mM Cala ja 10pM Ionomycin DMSO (kontrolli). Kuva otettiin ajanhetkellä 0 sekuntia alku- ja 600 sekuntia maksimi konfokaali Laser-skannaus mikroskooppi (Leica, Heidelberg, Saksa). Ca

2+ fluoresenssikuvan muutettiin fluoresenssin intensiteetti ja piirrettiin ilmoitettu F /F0 (Image J ohjelmisto analyysi). F0 on ensimmäinen fluoresenssi-intensiteetti.

Cala moduloidun FAK vakauden

Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että yli-ilmentyminen onkogeenin FAK liittyy karsinogeneesi erilaisten ihmisen syöpäsoluja [21,22]. ICA

2+ aktivoi kalpaiinia, mikä huonontaa FAK ja parantaa liikkuvuutta syöpäsolujen [3,4,5,9]. Koska havaittiin, että Cala lisää iCa

2 + tasoilla koolonsyöpäsolulinjaa, tutkimme vaikutus Cala on FAK vakautta näissä soluissa. Olemme tutkineet ilmaus FAK ja pFAK normaalissa paksusuolessa (CCD-18Co) ja paksusuolen syövän solulinjat (Fig. 3A). Tulokset osoittivat, että CCD-18Co-soluissa on nimellinen ilmentymisen FAK ja siten alhaisempi pFAK verrattuna paksusuolen syöpä, jotka ilmentävät suuria määriä FAK ja pFAK. Kukin koolonisyöpäsolulinja osoittivat eri ekspressiotasoja FAK ja pFAK. CCD-18Co-soluissa osoitti normaalia pFAK. HT-29 ja DLD-1-solut osoittivat korkeampaa pFAK verrattuna HCT116. Siksi olemme keskittyneet HCT116 ja HT-29 solulinjojen lisätutkimusten liittyvät FAK-proteiinia vakautta. Lisäksi, suoritimme annoksesta riippuvan analyysi vaikutusten Cala on HCT116 ja HT-29-solut (Fig. 3B). Soluja käsiteltiin eri pitoisuus Cala 12 h, ja FAK pilkkominen arvioitiin. Koko pituus FAK ja pFAK on 125 kDa. Cala pilkkoa FAK osaksi 90 kDa: n proteiinin N-FAK (FERM domain) kasvavien pitoisuuksien jolla on korkein aktiivisuus 2,5 mM. Vastaavasti, pFAK lohkaistiin sen p-N-FAK annoksesta riippuvaisella tavalla optimaalinen aktiivisuus 2,5 mM Cala (Fig. 3B). Nämä tulokset osoittavat, että Cala horjuttaa FAK ja pFAK ja aiheuttaa pilkkominen sekä proteiinien koolonkarsinoomasoluissa.

(A) FAK ilmaisuja analysoitiin normaalissa paksusuolen epiteelisolujen line CCD-18Co ja eri koolonsyöpäsolulinjoissa ( HCT116, HT-29 ja DLD1). HCT116 ja HT-29 (B) käsiteltiin eri pitoisuuksilla Cala 12 tuntia. Western blotting suoritettiin solulysaateista osoittaa, että Cala indusoi FAK ja pFAK pilkkominen annoksesta riippuvalla tavalla.

FAK epävakautta kautta CAPLAIN aktiivisuutta Cala

Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että FAK ja sen fosforyloitua muotoa ovat tärkeitä fokaalisen adheesion liikevaihdon. FAK pilkkoo kalpaiinia, Ca

2+ riippuvainen proteaasi, joka on keskeisessä asemassa fokaalisen adheesion dynamiikka liikkuvia soluissa [4]. Calpain on mukana useita tärkeitä näkökohtia syöpäsolujen tarttuvuus, muuttoliike, ja etäpesäkkeiden [23]. Koska Cala lisääntynyt Ca

2+ virtaa ja pilkotaan FAK, joten määritimme vaikutuksia Cala on kalpaiinia vuonna HCT116 ja HT-29-solut (Fig. 4). Tulokset osoittavat, että Cala aiheutti ajasta riippuva lohkaisu FAK ja pFAK proteiineja, mutta ei ollut vaikutusta tasoilla calpain-2 molemmissa solulinjoissa. Tulosten varmistamiseksi käytimme calpeptin, rho kinaasi aktivaattori ja estäjä calpain joka on osa perheen kalsiumista riippuvan kysteiiniproteaaseista. Calpeptin (20 uM) käänteinen vaikutuksia Cala on FAK ja pFAK pilkkominen molemmissa solulinjoissa mutta ei vaikuttanut calpain-2-proteiinin tasot (Fig. 4). Nämä tiedot viittaavat siihen, että Cala lisääntynyt Ca

2+ virtaa ja calpain aktiivisuutta, mutta ei sen proteiinipitoisuuden. On tunnettua, että katkaistun FAK välittää hajoamista p53 kautta tumaansiirtymiseen N-FAK. Solut käsiteltiin Cala osoittivat alentuneita tasoja p53, joka purettiin calpeptin. Calpeptin esti calpain-2, jotka estävät sitä pilkkomaan FAK, vaimentaa p53 hajoamista. Nämä tulokset osoittivat, että Cala aiheuttama FAK pilkkominen parannettu p53 hajoamista ja calpain-2 aktiivisuutta, mutta ilman vaikutusta calpain proteiinipitoisuuden.

HCT116 ja HT-29-soluja käsiteltiin 2,5 mM cala yhdessä calpain estäjän ( calpetin 20 uM) osoitettuun ajasta riippuvaisella tavalla. Western blot tulokset osoittavat, että kalpaiinia estäjä, calpeptin, vähensi FAK ja pFAK pilkkominen sekä p53 hajoamista.

Pilkottua FAK translokoituu osaksi tumaan

Tutkimukset osoittivat, että translokaatio ydin- FAK edistetään solujen selviytymistä vahvistamalla p53 hajoamisen olosuhteissa solustressiä [24,25]. Cala indusoi pilkkominen FAK osaksi 90 kDa: n proteiinin, joka on translokaatio tumaan. Kuva. 5 esittää Western blot analyysi koko, sytoplasminen ja ydinvoiman jakeet käsiteltyjen solujen Cala, ja niiden immunosytokemia. Kokosolulysaatissa ja sytoplasminen osa molemmissa solulinjoissa käsiteltiin Cala osoitti FAK ja pilkottiin FAK. Nuclear jakeet käsittelemättömien solujen oli alhainen FAK mutta hoidon Cala lisääntynyt FAK ja halkaistut FAK tasolla ydin- jakeet (Kuva. 5A). Ydin- translokaatioita N-FAK in HCT116 ja HT-29 (Fig. 5 B ja C), visualisoitiin inkuboinnin jälkeen anti-FAK primaarisen vasta-aineen, mitä seurasi värjäys Alexa-488 konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. Konfokaalimikroskopia valvonnan soluista osoitti DAPI värjätään ytimet ilman Alexa-488-värjätään FAK. Kuitenkin konfokaali kuvantaminen Cala käsiteltyjä soluja osoitti translokaatio Alexa-488 petsattu N-FAK osaksi DAPI värjätään ytimeksi. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että 2,5 mM Cala lohkaista täyspitkä FAK että translokaatio tumaan.

translokaatio N-FAK analysoitiin western blot (A) ja immunosytokemia (B-C). HCT116 ja HT-29-solut olivat siemen on 8-kuoppaisille kammioon ja käsiteltiin 2,5 mM Cala 12 tuntia. Translokaatio analysoitiin konfokaalimikroskopialla. WE, kokosolu louhinta; CE, sytoplasmisen louhinta; NE, ydinaseiden louhinta; siirtämisellä N-FAK on merkitty nuolella. Mitta-asteikko: 2,5 uM.

Cala lisäsi motiliteettia koolonkarsinoomasoluissa

Koska FAK tiedetään olevan keskeinen rooli tarttuvuus, muuttoliike, lisääntymisen ja erilaistumisen syöpäsoluissa [ ,,,0],1,2], tutkimme vaikutuksia Cala näihin solujen ominaisuuksia koolonkarsinoomasoluissa. Me suoritetaan haavan paranemista määritys HCT116-soluja käsiteltiin Cala yksin tai yhdessä calpeptin (Fig. 6). Tulokset osoittavat, että CALA (2,5 mM) kasvoi motiliteettia HCT116-soluja. Calpeptin yksinään ei ollut muuttaa liikkuvuutta. Mielenkiintoista on, että on osoitettu, että soveltaminen calpeptin (20 uM) yhdessä Cala vähentää vaikutusta Cala ja inhiboi solumigraatiota (Fig. 6 A-B). Lisäksi havaitsimme, että TAE226 (FAK-estäjä) vähensi solun liikkuvuus. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Ca

2 + tulva sovittelee FAK hajoaminen kautta kalpaiinia aktiivisuutta. TAE226 osoitti anti-kasvain vaikutuksia paksusuolen syöpäsoluissa. Se pienensi levittää kasvaimia ja pidentynyt eloonjääminen tuumoria kantavissa hiirissä [26]. Jotta voitaisiin vahvistaa havaintomme, suoritimme vertaileva analyysi FAK ja pFAK tasoilla HCT116 ja HT-29 käyttäen TAE226 (Fig. 6C). TAE226 (2,5 uM) esti pFAK ilmentymistä ajan riippuvalla tavalla ei inhiboinut yhteensä FAK. Cala aiheuttama FAK ja pFAK pilkkominen lisääntynyt liikkuvuus verrattuna TAE226, joka tukahdutti pFAK aktiivisuus ja vähentynyt syövän solun liikkuvuus.

Haavan paranemista Määritys suoritettiin HCT116-soluissa. Soluja käsiteltiin Cala, ja haavan paranemista omaisuus analysoitiin 0-6 h kuluttua haavan (A), ja keskiarvot haavan alueen analysoitiin käyttämällä useita viivakaavio (B). HCT116 ja HT-29-soluja käsiteltiin 2,5 mM Cala aika-riippuvaisella tavalla indusoitua FAK ja pFAK pilkkominen (C). pFAK estäjä (TAE226 2,5 uM) vähensi pFAK tasot havaittuna western blot.

lohkaista-FAK välittämän p53 hajoamisen kautta MDM2-riippuvaisen ubikinaa-

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että rakenteen FERM -FAK voi siirtävät osaksi tumaan ja moduloida p53-proteiinin vakautta MDM2 [25]. Siksi tutkimme mekanismi p53 alas sääntelyn CALA. Cala yksin indusoi lohkaisu FAK ja pFAK. Hoito MG132 kanssa Cala paradoksaalisesti talteen FAK ja pFAK pilkkominen (Kuva. 7). Solujen käsittely Cala esti p53-tasot, kun taas MG132 talteen tasot p53. Hoito MG132 yhdistettynä Cala talteen vaikutus Cala p53 proteosomal hajoamista. Lisäksi havaitsimme, että MDM2 ja PMDM2 proteiinin tasot eivät muuttuneet käsittelyjen kanssa Cala, MG132 tai molempia. Näin ollen, nämä tulokset viittaavat siihen, että MG132 talteen p53 Cala kautta MDM2-liittyvä ubikinaation.

HCT116 ja HT-29-soluja käsiteltiin 2,5 mM cala yhdessä proteasomaalisten inhibiittorin (MG132 10 uM) 10 tuntia. Western blot suoritettiin solulysaateista ja proteiinit havaittiin, kuten on kuvattu menetelmissä.

Keskustelu

Tämä tutkimus osoittaa, että kalsiumlaktaatti aiheuttama Ca

2+ virtaa lisää liikkuvuutta paksusuolen syöpäsoluissa epävakauttamalla FAK ja pFAK proteiineja. Tämä tutkimus osoittaa vaikutusta iCa

2+ on calpain-FAK-solun liikkuvuus reitin. Cala -välitteisen pilkkomisen FAK ja pFAK on sovitellaan kautta kalpaiini aktiivisuutta, joka lisäsi motiliteettia paksusuolen syöpäsoluja. Katkennut FAK siirtämisellä tumaan ja parannettu p53 hajoamista sekä kalpaiinia toimintaa. Vaikutus solunulkoisen laktaatin oli raportoitu useissa tutkimuksissa noin motiliteettia syöpäsoluja. Yksi merkittävä ero tässä tutkimuksessa ja aikaisemmat tutkimukset laktaatti on kemiallinen kokonaisuus.

monokarboksylaatti kuljettajat (MCT) yleensä välittäjänä laktaatti virtaa ja ulosvirtaus ja että kohonneet MCT1 on havaittu monissa syövissä, kuten paksusuolen syöpä [16]. Lactate vapautumista hypoksisiin soluissa välittyy MCT4, kun taas laktaatti sisäänottoa happipitoista kasvainsoluihin välittyy kautta MCT1 [15,16]. Näyttää siltä, ​​että Cala itse kuljetetaan sytoplasmaan, lisäten siten iCa

2+ ja laktaatin pitoisuudet coincidently noudatetaan. Kuitenkin spesifinen kuljetus mekanismi on tuntematon. Esillä olevat tulokset osoittivat, että alhainen pitoisuus Cala välitti FAK-riippuvaisen potevilla koolonkarsinoomasoluissa. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että natriumlaktaatti käytettiin pitoisuuksina niinkin korkea kuin 20 mM [10]. Tämä korkea alue havaittiin pahanlaatuisten ja etäpesäkkeitä Big koon. Korkeat pitoisuudet laktaatin kasvainten korreloivat esiintyy paljon etäinen etäpesäke ja muut pahanlaatuiset käyttäytymistä syöpäsolujen [27]. Siksi käytimme pieninä pitoisuuksina laktaatin välttää syövän etäpesäkkeiden. Käsittelemällä soluja pieninä pitoisuuksina Cala, Ca

2+ tulva nousi ja ylläpidetään pitkän aikaa, mikä lisäsi kalpaiini aktiivisuutta. Solunsisäinen tioliproteaasi calpain katalysoi rajoitettu proteolyysi eri polttovälin tarttuvuus rakenteellisia proteiineja ja signalointi entsyymien tarttuneet solut. Kalpaiinien ovat mukana useissa keskeisiä näkökohtia muuttoliikkeen, kuten tarttuvuus ja leviäminen. Farmakologinen esto kalpaiinien vähensi integriinin välittämä solujen muuttoliike [23]. Viimeaikaiset tutkimukset antavat lisätukea calpain tärkeänä säätelijä soluliikkuvuus kautta sen kyky säädellä fokaalisen adheesion dynamiikkaa. Calpain välittämä FAK hajoamisen on kriittinen potevilla ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa [3]. Korkea FAK ilmaisun on liittynyt lisääntynyt invasiivisuus on pahanlaatuisia kasvaimia. Kuitenkin mekanismit FAK aktivointi, pilkkominen, ja sääntelyn purkaminen liikkuvuus, eivät ole selkeitä. Signalointi tapahtumia alavirtaan FAK aktivointi ja lohkaisu voi osaltaan motiliteettia ihmisen paksusuolen karsinoomasoluja.

Cala voivat moduloida vaeltavien potentiaalia hapetettujen kasvainsolujen, joita on noin tuumoriverisuoniin. Kasvainkudoksessa, verisuonikkuudesta rajoittui happea ja ravintoaineita, kuten glukoosi ja glutamiini. Hypoksinen kasvaimet näyttävät huonosti eriytetty mutta hypoksia näyttelee suora rooli ylläpito syövän kantasolujen [29]. Hypoksinen kasvaimet pyrkivät tuottamaan laktaattia gradientti, jota käytetään happipitoista kasvainsolujen kautta MCT1 välittämä kuljetus, joten hypoksisia kasvainsoluja voidaan käyttää glukoosia. Tätä ilmiötä kutsutaan solujen väliseen laktaatti shuttle. Näin ollen voidaan olettaa, että solunulkoisessa ympäröivään hypoksinen solut vähitellen kertyy laktaattia vapaassa muodossaan. Kuitenkin happipitoista solut toimitti kalsium- kautta verenkiertoa, laktaatti tuotiin kautta MCT1, alentamalla solunulkoisen laktaattipitoisuus ja sen mikroympäristölle sisältää vähemmän laktaatti ja useimmiten sidottu kalsiumin [31]. Tuloksemme tarkoita, että happipitoista solut ovat vähemmän liikkuvia verrattuna hypoksisia soluja ja että etäpesäke liittyy hypoksinen solujen sijasta happipitoista soluja. Olemassaolo ja määrä Calan ekstrasellulaarisen kasvain mikroympäristön voisi olla ratkaiseva tekijä etäpesäke moduloimalla FAK. Lisäksi Cala mahdollisesti ohjata solun liikkuvuus ja energia-aineenvaihduntaa. Kasvain vaimennin proteiini p53 estää syövän etenemisen lukuisten mekanismien kuten apoptoosin ja solusyklin pysähtymiseen. Hyvin tunnettu välillä on yhteys aineenvaihduntaa ja geneettisen säätelyn p53, jossa p53 säätelee solujen energia tasapaino Glykolyysivaiheen ja oksidatiivisen fosforylaation [30,31]. Vastaavasti meidän tuloksemme osoittavat, että Cala voi aiheuttaa proteosomal hajoamista p53 (Fig. 4) kautta tumaansiirtymiseen FERM-FAK ja MDM2-välitteisen ubikinaation (Fig. 7).

Nykyinen tutkimus tutki vaikutusta täydentäviä Ca

2+ molekyylimekanismeihin metastaattinen paksusuolen syövän. Tärkeys Cala modulaatioon paksusuolisyöpäsolulinjassa fysiologia ei rajoitu perusopinnot vaan myös vaikuttaa kliinisten ravintovalmisteiden lopputulokseen. Ca

2+ pelaa eri tehtävissä syövän etenemiseen sekä lisäämään apoptoosin tai proliferaation paksusuolessa. Lisäksi Ca

2+ sitoutumalla sappihappojen lisääntynyt runsaasti rasvaa ruokavalion, on liittynyt paksusuolen syövän synnyn [28]. Cala aiheuttama FAK pilkkominen ja parannettu soluliikkuvuus of HCT116-solujen luo oletus, että metastaattinen paksusuolen syöpä potilaat tarvitsevat enemmän varovainen, kun otetaan huomioon Ca

2 + lisäravinteena. Koska ekstrasellulaarinen kalsium voidaan ionisoitu laktaatti, se johtaa Ca

2 + tulva aiheuttaa lisääntynyt FAK pilkkominen ja syövän solun liikkuvuus.

Johtopäätökset

Tämä tutkimus valottaa että Cala lisääntynyt motiliteettia koolonkarsinoomasoluissa by calpain aktiivisuuden kautta destabilizations FAK ja pFAK proteiineja. Pitoisuus ja kemiallinen kokonaisuus Cala saattaa olla osasyynä paksusuolen syövän solun liikkuvuus. Siksi tulokset viittaavat siihen, että liikkuvuus vaikuttaa paksusuolen syöpä voi liittyä käyttöön Ca

2 + lisäravinteena. Jopa pieni pitoisuus Ca

2+ saattaa lisätä solun liikkuvuus.