Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tällä hetkellä valtavaa kiinnostusta kehittää anti-syöpähoitojen kohdistaminen soluun signalointipolkujen tärkeää sekä syövän solujen aineenvaihduntaa ja kasvua. Useat epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että diabeetikoilla metformiinia on vähentynyt ilmaantuvuus haimasyöpä. Tämä on saanut pyrkimyksiä arvioida metformiini, huumeiden kanssa vähäinen myrkyllisyys, koska hoitomuoto haimasyövän. Prekliiniset tutkimukset solulinjassa ksenografteissa ja yksi tutkimuksen potilaasta johdettujen ksenografti (PDX) mallit olivat lupaavia, kun taas julkaisi äskettäin kliinisissä kokeissa ei osoittanut hyötyä lisäämällä metformiinin yhdistelmähoitoon hoito paikallisesti kehittyneitä ja metastasoituneen haimasyövän. PDX malleja, joissa potilaan kasvaimet suoraan Siirto tehty immuunipuutteisiin hiiriin on osoitettu olevan erinomainen prekliinisissä ja biomarkkereiden löytö ja terapeuttisen kehittämisen. Arvioimme vaste neljä PDX kasvainlinjojen lisääminen metformiiniin ja totesi, että kaikki neljä meidän PDX linjat olivat resistenttejä metformiinia. Huomasimme, että resistenssin voi tapahtua puute jatkuvan aktivoitumisen adenosiinimonofosfaatin-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) tai alavirtaan aktivoituminen nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR). Lisäksi yhdistettynä metformiinin ja mTOR-inhibiittorit ole parantaneet vastauksia solulinjoissa, mikä edelleen osoittaa, että metformiini yksinään tai yhdessä mTOR-inhibiittorit ovat tehottomia potilailla, ja että vastustuskyvyn metformiini voi tapahtua useita reittejä. Lisätutkimuksia tarvitaan paremmin ymmärtämään näitä mekanismeja vastarinnan ja ilmoitettava mahdollisille yhdistelmähoidot metformiinin ja olemassa olevien tai uusien terapeuttisten.

Citation: Lipner MB, Marayati R, Deng Y, Wang X, Raftery L, O’Neil BH, et ai. (2016) metformiinin Hoito ei estä kasvu haimasyövän potilaasta peräisin ksenoqraftit. PLoS ONE 11 (1): e0147113. doi: 10,1371 /journal.pone.0147113

Editor: Marie-Josée Boucher, Université de Sherbrooke, Kanada

vastaanotettu: 25 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 29 joulukuu 2015; Julkaistu: 13 tammikuu 2016

Copyright: © 2016 Lipner et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tukee Lineberger Kattava Cancer Center (BHO) ja CA140424 ja CA193650 (JJY) National Cancer Institute.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on yksi aggressiivinen ja tappava pahanlaatuisia kasvaimia, ja 80% potilailla, joilla on paikallisesti levinnyt tai etäpesäkkeitä että ennakoi 6-12 kuukautta mediaanielinajassa ja synkkä 6% viiden vuoden pysyvyys [1]. Kemoterapia aiheuttaa vain pientä parannuksia selviytymisen, ja uusia hoitoja tarvitaan epätoivoisesti parantaa hoitomahdollisuuksia tämän suuren potilasryhmälle [2]. Tällä hetkellä valtava kiinnostus kehittää anti-syöpähoitojen että kohdesolusuhteella signalointireiteissä tärkeitä sekä solujen aineenvaihduntaa ja solujen kasvua [3]. 5’adenosiinimonofosfaatille aktivoituvan proteiinikinaasi (AMPK) reitin on saanut yhä enemmän kiinnostusta, koska AMPK fysiologisesti estää nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) ylläpitää homeostaasiin olosuhteissa laski olevien matkapuhelinverkkojen energialähteitä [4, 5]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että mTOR signalointi soittaa keskeinen rooli selviytymisen ja pahanlaatuisten solujen uudiskasvun [6, 7]. Siten AMPK aktivaattoreita ovat tuottaneet huomattavaa merkitystä mahdollisina syöpälääkkeet, jotka toimivat muuttamalla aineenvaihduntaa ja estämällä mTOR-reitin [3].

Metformiini on ensilinjan aine hoidettaessa tyypin 2 diabetes. Metformiini estää mitokondrion oksidatiivinen fosforylaatio, mikä lisää suhde AMP ATP [8, 9]. Korkea AMP aktivoida AMPK, joka sitten estää energiaa kuluttavia reittejä kuten proteiinisynteesiä, osittain vähen- tämisessä mTOR signalointi suoraan fosforylaatio tuumorisuppressorigeenin TSC2 ja mTOR sitovan kumppanin Raptor [9-13]. Tila energiansäästö aiheuttama metformiinin on ehdotettu selittämään sytostaattinen vaikutus metformiinin syövän [9] ja näennäinen suojaava vaikutus havaittiin saavilla diabeetikoilla metformiinia jotka myöhemmin kehittävät haimasyöpä [14].

useat epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että potilailla, joilla on diabetes metformiinia on vähentynyt ilmaantuvuus haimasyövän [14-17]. Tämä on saanut paljon jännitystä arvioimaan metformiinin, yleisesti käytetty lääke, jolla vähäinen myrkyllisyys, koska hoitomuoto haimasyövän. Tällä hetkellä 3 kliinisestä tutkimuksesta metformiini yhdessä eri solunsalpaajahoitojen haimasyövän (cancer.gov/clinicaltrials). Prekliiniset tutkimukset solulinjassa ksenografteissa ja yksi tuoreessa tutkimuksessa potilaasta johdettujen ksenografti (PDX) mallit ovat osoittautuneet lupaaviksi [18-22].

PDX malleja, joissa potilas kasvaimet suoraan Siirto tehty osaksi immuunipuolustus hiirillä on osoitettu Yhteenvetona primaarikasvaimen arkkitehtuuri ja geneettisiä ominaisuuksia, jopa sen jälkeen viemällä ja laajentamalla kasvainten sukupolvet hiirien [23, 24]. Lisäksi PDX mallit ovat parempia kuin perinteiset solulinjan ksenografteja, jotka on mukautettu in vitro kasvua ja puuttuu heterogeenisuus potilaan kasvaimia, voidaan arvioida vastauksia hoitojen ja uusien biomarkkereiden [23-27]. Viime aikoihin asti on ollut hyvin vähän tutkimuksia PDX vastauksia moniin ehdotettujen onkologian aineita, ja tulokset metabolisen hoitoja kuten metformiini edelleen huutava pula [27]. Siten Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida vaste haimasyövän PDX malleja metformiinin ja tutkimaan metformiinin n vaikutusmekanismi ja korvaavien vastus polkuja.

Materiaalit ja menetelmät

Lääkkeet ja reagenssit

Metformiinihydrokloridi (Spectrum, New Brunswick, NJ, USA) liuotettiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS), sekä in vitro ja in vivo tutkimuksissa. Rapamysiini (LC Laboratories, Woburn, MA, USA) ja BEZ235 (Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, UNC Eshelman School of Pharmacy, Chapel Hill, NC, USA) liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) in vitro yhdistelmähoidossa tutkimukset . Vasta-aineita fosforyloidun AMPKα (Thr172), AMPKα, AMPKα1, AMPKα2, fosforyloidun mTOR (Ser2448), mTOR, fosforyloidun p70S6K (Thr389), p70S6K, fosforyloitu 4E-BP1 (Thr37 /46), ja 4E-BP1 olivat Cell Signaling (Beverly , MA, USA). Anti-glyseraldehydi fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) ja piparjuuren peroksidaasiin konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Pierce® ECL Western-blottaus Substraatti oli Thermo Scientific (Rockford, IL, USA). Apo-ONE homogeeninen kaspaasi-3/7 iinianalyysikitissä oli Promega (Madison, WI, USA).

Soluviljely ja transduktion lentiviruksen

Haimasyöpä solulinjoissa Capan-2, CFPAC- 1, HPAF-II, ja SW1990 saatiin American Type Culture Collection (ATCC), todennettu kautta lyhyen tandem repeat (STR) profilointi (Genetica, Burlington, NC, USA), ja testattu negatiivisiksi mykoplasman epäsuoralla värjäystä. Solulinjoja viljeltiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) 37 ° C: ssa kostutetussa 5% CO2- ilmapiiri.

puromysiinin verkkotunnus AMPKα1-859 pLKO.1 reportteriplasmidilla (anteliaasti lahjoittanut laboratorion Channing Der, FT The University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) korvattiin blastisidiinia verkkotunnuksen restriktioentsyymidigestiolla BamHI: llä ja KpmI. Toisen sukupolven replikaatiokyvyttömäksi lentivirus tuotettiin 293T-solujen neljän plasmidin järjestelmä: reportteriplasmidilla, pMDL gag /pol RRE, pRSV-Rev ja pCMV VSV-G. Transduktioon kanssa lentiviruksen, 1 x 10

6 CFPAC-1 ja HPAF-II-solut ympättiin 100 mm: n maljoille, joissa lentiviruksen ja lopullinen polybreeniä pitoisuus 8 ug /ml. 24 tunnin kuluttua elatusaine korvattiin, ja soluja viljeltiin vielä 4 päivää 2 ug /ml puromysiiniä tai 10 päivää 10 ug /ml blastisidiinia. Solut trypsinoitiin ja analysoitiin western-blottauksella määrittää geenin pudotus.

ekspressiovektori myc-mTOR ohimenevä yli-ilmentyminen saatiin Addgene (plasmidi 1861, Cambridge, MA, USA). Transfektio 5×10

5 CFPAC-1 tai HPAF-II-soluissa suoritettiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) käyttäen valmistajan ohjeita. Seuraavat 24 tunnin inkubaation transfektoituja soluja käsiteltiin 5 mM metformiinin vielä 24 tuntia, jossa vaiheessa solut pestiin PBS: llä, kerättiin kaapimalla, ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes proteiinien eristämiseksi.

MTT määritys soluproliferaation

solujen elinvoimaisuuden määrittämiseen seuraavan lääkehoidot, 5×10

3-solut maljattiin neljänä 96-kuoppaisille levyille 200 ul: ssa RPMI 1640 -alustaa, ja viljeltiin yön yli. Sitten väliaine korvattiin tuoreella kasvualustalla, joka sisälsi joko PBS ajoneuvon ohjaus, metformiini (0-5 mM), tai metformiini sekä joko rapamysiini (0-80 uM) tai BEZ235 (0-1 uM). Vielä 48 tunnin inkuboinnin 50 ui 5 mg /ml 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) liuotettuna PBS: ään pH: ssa 7,4, lisättiin kuhunkin kuoppaan. Seuraavat 1 tunnin inkubaation jälkeen viljelyalusta ja MTT-reagenssia imettiin pois ja 200 ui dimetyylisulfoksidia lisättiin kuhunkin kuoppaan ja sekoitetaan huolellisesti. Absorbanssi OD560 nm: ssä mitattiin käyttäen Synergy 2 levylukijalla (BioTek, Winooski, VT, USA). Suhteellinen proliferaatio jokaisen lääkeaineen konsentraatio laskettiin seuraavan kaavan mukaan: 100% * (kokeellinen OD560 /ajoneuvon OD560). Tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA Dunnettin monivertailuja testi. Yhdistelmähoitoa varten tutkimuksia, synergia arvioitiin käyttäen Compusyn ohjelmistoa käyttämällä Chou-Talalay mediaanivaikutus periaate (ComboSyn, Inc. Paramus, NJ, USA). Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.

Western blot olosuhteissa

jälkeen ilmoitettuina ajankohtina inkuboinnin metformiinin kanssa, solut pestiin PBS: llä, otettiin talteen kaapimalla ja sen jälkeen lyysattiin 200 ui RIPA-puskuria, joka sisälsi 50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X, 1 mM NaF, ja 0,25% Na-deoksikolaattia ja proteaasi-inhibiittorit. Proteiini uutteet (30 ug) suoritettiin elektroforeesi 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja sähköllä polyvinylideenidifluoridi (PVDF). Määrittämiseksi knockdovvn AMPKα1 ja AMPKα2, kalvot estettiin 5% rasvatonta maitojauhetta Tris-puskuroidulla suolaliuoksella ja inkuboitiin sitten yön yli 4 ° C: 1: 1000 laimennosta anti-AMPKα1, anti-AMPKα2, ja anti- AMPKα vasta-aineita. Solujen ja kudosten lysaatit eristettiin metformiinin hoitoja, membraaneja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli 1: 1000 laimennosta anti-fosfo-mTOR, anti-mTOR, anti-fosfo-p70S6K, anti-p70S6K, anti-fosfo-4E- BP1, anti-4E-BP1, anti-fosfo-AMPKα, ja anti-AMPK-vasta-aineita. Sitten membraanit pestiin ja inkuboitiin 1: 5000 laimennos piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua vuohen anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Immunoreaktiivisia vyöhykkeet havaittiin kemiluminesenssin avulla Pierce® ECL Western blotting Alustan. Intensiteetti kunkin immunoreaktiivisen kaistan kvantifioitiin densitometrialla käyttämällä Image J ohjelmisto (NIH, Bethesda, Maryland, USA), ja ilmaistu suhteessa PBS: llä käsiteltyjä soluja tai hiirillä. GAPDH käytettiin varmistamaan vastaavaa proteiinia lastaus. Tilastollinen merkittävyys määritettiin Studentin

t

-testaukset kahden näytteen vertailussa ja yksisuuntainen ANOVA Dunnettin monivertailuja testi kolmen tai useamman näytteen vertailuja.

PDX kohortti laajennus

haiman adenokarsinooma kudosta de-tunnistaa potilaat paikallisluonteisia haimasyöpä, joille tehtiin parantava kirurginen resektio saatiin University of North Carolina Institutional Review Board (IRB) hyväksytyn kudostenhankintaryhmällä Facility jälkeen IRB hyväksynnän (08-1153). Kasvainkudosta Siirto tehty ihonalaisesti kylkiin NSG /NOD-hiiristä, laajennettu, ja siirrostettiin ajan, kuten aiemmin on kuvattu [28, 29]. 7-8 viikkoa vanhojen nu /nu-hiiriä, joiden keskimääräinen paino on 18-20 g, käytettiin kaikissa kokeissa. Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaisesti Yhdysvaltain National Institutes of Health (NIH) Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals pöytäkirjojen mukaisesti hyväksymien University of North Carolina Institutional Animal Care ja Käytä komitea (12-314).

metformiinia hoitoon PDX kohortin

käsittely aloitettiin jälkeen Siirto tehty kasvaimia kasvoi mediaani kasvaimen kokoa 108 mm

3. Ainakin viisi hiiriä sisältyi kummassakin hoitoryhmässä kullekin PDX kasvainlinjaan. Hiiriä hoidettiin metformiinia (200 tai 400 mg /kg) tai PBS: ää (20 ul /g) kerran päivässä suun kautta letkulla. Ensimmäinen päivä hoidon nimettiin päivä 0 ja hoitoa jatkettiin 28 päivän ajan. Kasvaimen tilavuus (V) mitattiin kahdesti viikossa käyttäen jarrusatulat, ja lasketaan (pituus x leveys

2) /2. Eläimen kehon paino mitattiin kerran viikossa. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA Dunnettin monivertailuja testi. Kasvainkudoksessa kerättiin kaksi tuntia viimeisen hoidon ja leikkaa kahteen osaan: yksi osa oli snap-jäädytettiin nestetypessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes proteiinien eristämiseksi, kun taas toinen osa kiinnitettiin 10% formaliinilla ja parafiiniin upotettuja ( FFPE). FFPE kudosblokeista leikeltiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla histopatologista arviointia.

Tulokset

Metformiini ei estä kasvua PDX kasvainten

Arvioimme vastetta neljän haimasyöpä PDX tuumorilinjoja metformiinin (200 ja 400 mg /kg) 28 päivän ajan. Nämä annokset valittiin suuremmat annokset on osoitettu olevan tarpeen hiirillä tuottaa verensokerin aleneminen diabeettisissa eläimissä [19, 30, 31]. Lisäksi suuremman annoksen metformiinia (0,1% w /w) on osoitettu lisäävän pitkäikäisyys hiirillä [32]. Ei kasvaimen kasvun inhibitiota tai taantumista todettiin tahansa neljästä PDX tuumorilinjoja tahansa kohtaan mitattiin (kuvio 1). Ei muutosta kehon painon tapahtui aikana tutkimuksen ja kasvaimen arkkitehtuuri pysyi selvästi jälkeen ennallaan 28 päivän hoidon arvioimana hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäytymistä (S1 Kuva).

Ei merkittävää kasvun estämistä havaittiin neljässä eri haimasyöpä PDX tuumorilinjoja milloin tahansa vaiheessa 28 päivän hoitojakso 200 mg /kg tai 400 mg /kg metformiinia hallinnoi päivittäin letkulla suun kautta.

aktivointi AMPK ja eston p70S6K fosforylaation PDX kasvaimia ei jatketaan sen jälkeen 28 päivän metformiinin

Voit selvittää metformiiniin muuttunut AMPK ja mTOR signalointi, arvioimme kaikki neljä PDX tuumorilinjoja fosforylaatioon AMPK (Thr172) ja p70S6K (Thr389) klo lopussa 28 päivän jälkeen (kuvio 2A ja 2B ja S2 kuvassa). Tässä pitkäaikaista hoitoa kohortti, ei muutosta fosforylaatioon AMPK ja p70S6K näkyi metformiinia verrattuna vehikkelillä hoidettuihin kasvaimia. Sitten arvioitiin metformiinin vaikutusten kaksi PDX kasvaimia kuluttua vain 3 hoitopäivän. Toisin kuin pitkäaikaishoidossa kasvaimia, lyhytaikainen hoito kasvainten oli kohonnut fosforylaatioon AMPK ja laski fosforylaatiota p70S6K (kuvio 2C ja 2D).

fosforylaatio AMPKα ja p70S6K (A) P505 ja (B) P710 PDX kasvaimia 28. päivän jälkeen hoito 400 mg /kg metformiinia. Fosforylaatiota AMPKα ja p70S6K in (C) P505 ja (D) P710 PDX kasvaimia jälkeen 3 päivää hoidon 400 mg /kg metformiinia (* p 0,05).

Metformiini estää kasvua ja muuttaa AMPK ja mTOR signalointi haimasyövän solulinjoissa

Koska puute pysyvä vaste meidän PDX malleissa oli yllättävää, me seuraavaksi tutkinut, mitä vaikutuksia metformiinin proliferaatioon neljä haimasyövän solulinjoissa (Capan-2, CFPAC-1 , HPAF-II, ja SW1990). Metformiini inhiboi solujen proliferaatiota annoksesta riippuvalla tavalla kaikissa neljässä solulinjoissa (kuvio 3A). Metformiiniin aktivoitu AMPK määritettynä fosforylaatio AMPK on Thr (172) kaikissa testatuissa solulinjoissa, jonka huippu aktivointi esiintyvä 4-8 tuntia hoidon jälkeen (kuvio 3B). Koska AMPK aktivaation tiedetään estävän mTOR, me edelleen analysoineet vaikutuksia metformiinin hoidon fosforylaatiota asemasta mTOR ja sen loppupään tavoitteet p70S6K ja 4E-BP1. Mielenkiintoista, havaitsimme viivästynyttä mTOR ja loppupään kohde fosforylaatio, nadiiriarvon havaittujen fosforylaation p70S6K ja 4E-BP1 esiintyvien 48 tuntia molemmissa CFPAC-1 ja HPAF-II-soluissa (kuvio 3C ja 3D).

(A) Solut maljattiin neljänä 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 5×10

3 per kuoppa, inkuboitiin yön yli, ja käsiteltiin sitten väliainetta, joka sisälsi joko PBS: ää kuin ajoneuvon ohjaus- tai erilaisia ​​pitoisuuksia metformiinin (0 -5 mM). 48 tunnin jälkeen, proliferaatio indeksit määritettiin käyttäen MTT-määritystä, ja normalisoitu kuin ajoneuvon käsiteltyjä soluja. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena. (B) fosforylaatio AMPKα ja yhteensä AMPKα eri ajankohtina hoidon jälkeen 5 mM metformiinin. Hoito aloitettiin 0 tuntia (h). (C) fosforylaatio mTOR, p70S6K, ja 4E-BP1 eri ajankohtina hoidon jälkeen 5 mM metformiinin. (D) Densitometria fosforyloitua AMPKα, mTOR, p70S6K, ja 4E-BP1 suhteessa kokonais-tasot on esitetty (B) ja (C).

AMPK on vain osittain tarvitaan anti-proliferatiivinen vaikutus metformiinin

antiproliferatiivista vaikutusta metformiinin on pääasiassa johtuvan sen kyvystä aktivoida AMPK reitin. Oletimme, että puute jatkuva AMPK aktivaation nähdä kaikissa neljässä PDX tuumorilinjoja voi selittää puute kasvaimen kasvua vasteen. Näin ollen suoritimme shRNA aiheuttama pudotus yhden tai molempien katalyyttisen alayksikön AMPK haimasyövän solulinjoissa, onko anti-proliferatiiviset vaikutukset metformiinin vaikuttaisi. Olemme havainneet, että pudotus on AMPK α1 ja /tai AMPK α2 osittain, mutta ei täysin päinvastainen metformiinin kyky inhiboida solujen lisääntymistä (kuvio 4A ja 4B).

(A) shRNA knockdovvn AMPKα alayksiköiden CFPAC-1 ja HPAF -II solulinjat. (B) leviämisen CFPAC-1 ja HPAF-II-solulinjat, joilla on stabiili knockdovvn AMPKα alayksiköiden käsittelyn jälkeen eri pitoisuuksilla metformiinin (0-5 mM). (C) fosforylaatio mTOR ja p70S6K in CFPAC-1 ja HPAF-II solulinjoissa vakaa knockdovvn AMPKα alayksiköistä.

metformiinin näyttää vaikuttavan mTOR käytettäessä AMPK-riippumattomalla tavalla

tutkimme seuraavaksi puute jatkuva p70S6K esto nähty P710 PDX kasvainlinjaan huolimatta näyttöä joidenkin jatkuvia AMPK aktivointi voi olla takia AMPK-riippumaton mekanismi. Arvioimme metformiinin vaikutusten fosforylaatioon mTOR ja p70S6K seuraava knockdovvn AMPK α1 ja /tai AMPK α2. CFPAC-1 ja HPAF-II-solulinjat, joilla on stabiili pudotus NS, AMPK α1 ja /tai AMPK α2 (kuvio 4A), käsiteltiin 5 mM metformiinin (kuvio 4B ja 4C). Molemmissa solulinjoissa, pudotus yhden tai molemmat alayksiköt eivät pelastaa kykyä metformiinin estää kasvua tai fosforylaatio mTOR ja p70S6K, mikä viittaa siihen, että kyky metformiinin estää mTOR ja p70S6K on ainakin osittain riippumaton AMPK aktivaation näissä solussa linjat.

mTOR yliekspressio on riittävä voittamaan antiproliferatiivisia vaikutuksia metformiinin, mutta kombinatorisista metformiinin ja mTOR-inhibiittorit ei tuota synergiaa

Koska metformiini ei yllä estämällä mTOR-reitin mitattuna p70S6K fosforylaatiota pitkän aikavälin metformiini käsitelty PDX kasvaimia, ja siksi meidän havainnot että metformiini aiheuttama mTOR esto oli ainakin osittain AMPK-riippumattomia, seuraavaksi määritetään, onko mTOR aktivointi yksinään oli riittävä kumoamaan vaikutuksia metformiinin. Olemme havainneet, että yli-ilmentyminen mTOR käyttäen myc-mTOR-konstrukti oli riittävä tuottamaan täydellinen resistenssi kasvun inhibition ja rajoittaa lasku p70S6K fosforylaatio metformiiniin (kuvio 5A ja 5B). Sen määrittämiseksi, onko yhdistäminen metformiinin kanssa kohdennettuja mTOR-inhibiittorit voivat olla looginen terapeuttinen strategia, käsittelimme solulinjat vakio-suhde annokset metformiinin ja joko allosteerinen mTOR-estäjä rapamysiini tai katalyyttinen mTOR-estäjä BEZ235, joiden tiedetään estävän haimasyöpä solulinja kasvu. Kasvun estäminen ei lisääntynyt missään annosyhdistelmä suhteessa yhteen lääkehoitoa, eikä synergian metformiinin ja joko mTOR-estäjä laskettiin millään annoksella käyttäen Chou-Talalay mediaanivaikutus yhtälö (kuvio 5C ja 5D).

(a): n fosforylaatio p70S6K ja (B) proliferaation HPAF-II-solujen käsittelyn jälkeen 5 mM metformiinin seuraavat ohimenevän ilmentymisen transfektoiduissa myc-mTOR-konstrukti. Käyttämällä mediaanivaikutusyhtälöstä yhtälö laskenta yhdistelmä indeksi (CI) Seuraavat kolme päivää hoidon vakio-suhde annokset metformiinin ja joko (C) nämä allosteric mTOR-estäjä rapamysiinin tai (D) katalyyttinen mTOR-estäjä BEZ235 onnistunut tuottamaan synergiaa (CI 1 ) milloin tahansa annoksen yhdistelmän. Cl-arvot 50%: n kasvun esto (C) CFPAC-1 1,54, HPAF-II 1,43; (D) CFPAC-1 1,30, HPAF-II 1,29. (* P 0,050, ** p 0,005, *** p 0,001).

Keskustelu

epidemiologiset tutkimukset diabeetikoilla ovat havainneet, että potilailla, joita hoidettiin metformiinilla on väheni toistuvien syöpien, kuten haimasyövän [14-17]. Useissa prekliinisissä tutkimuksissa metformiinin syövän terapeuttista ovat olleet lupaavia, joka osoittaa vaikuttavan kasvaimen kasvun inhibitiota [20, 22, 33] ja apoptoosin [34] haimasyövän solulinjoissa. Kuitenkin solulinja ksenografteissa ollut yleisesti epäluotettavia ennustavat lääkevasteita ihmisillä. Lonardo et ai. arvioitiin metformiinin vaikutusten neljästä haimasyöpä PDX tuumorilinjoja ja edellisiin solulinjaan ksenografti tutkimuksissa havaittu merkittävää kasvun estäminen [21]. Sen sijaan kehittyvillä kliinisissä kokeissa metformiini haimasyövän ovat karkaistua optimismi luoman prekliinisen työtä. Kaksoissokkoutetussa, satunnaistetussa, lumekontrolloidussa vaiheen II tutkimuksessa, joissa arvioitiin metformiini yhdessä gemsitabiinin ja erlotinibin potilailla, joilla on edennyt haimasyöpä havaittu eroa tulos seurauksena metformiiniin [35]. Toinen vaihe II tutkimuksessa yhdistyvät metformiinin kanssa paklitakselin gemsitabiiniryhmässä tulenkestävä tauti laiminlyönyt primaarivasteen taudin tarkastusmäärään [36].

Tässä tutkimuksessa havaitsimme yhtenäinen puute vastaus metformiinin vuonna neljä PDX tuumorilinjoja että arvioimme. Useita mahdollisia syitä, kuinka erilaisia ​​tuloksia kuin aikaisemmat prekliinisten työtä verrattuna tutkimuksemme ja viime kliinisissä kokeissa. Ensinnäkin, PDX kasvaimet ovat luonnostaan ​​hyvin erilaisia, koska PDX kasvaimia siirrostetaan irtotavarana ja edustavat ”koepaloja” samalla tavoin heterogeenisen lähteen potilaan kasvaimia. Toiseksi, vaikka annostusta tutkimuksessamme päällekkäinen aikaisempien tutkimusten, metformiinin oton ovat vielä epäselviä [37]. Kasvain microenvironment ja strooman sisältöä näyttävät vaikuttavan metformiinin pääsyä kasvaimen soluihin, mikä voi johtaa erilaisiin tuloksiin tutkimusten välillä [21]. Kolmanneksi kasvaimen tilavuus, jossa hoito aloitettiin vaihtelee tutkimuksia, jotka voivat vaikuttaa kasvain koostumukseen, erityisesti syövän kantasolujen taakka. Lonardo et ai. ja muut ovat osoittaneet, että vain tämä kantasolujen alaryhmästä läpikäy apoptoosin seurauksena metformiiniin, kun taas suurin osa kasvainsolujen kokea palautuva kasvun pysähtymisen [18, 21]. Mielenkiintoista on, että vaikka Lonardo et ai. todettiin, että metformiini pystyi aluksi hidastaa PDX kasvaimen kasvua, he totesivat, että kaikki PDX kasvaimia lopulta eteni hoidon [21], mikä viittaa siihen, että metformiinia ei ole tehokasta potilailla.

saadaan käsitys mahdollinen mekanismeja vastus, me arvioida edelleen kaksi meidän neljästä PDX linjat ja totesi, että vastustuskyky metformiini voi olla monitekijäinen ja kasvaimen riippuvaista. Esimerkiksi P505, AMPK aktivoituminen ei jatkunut taas P710, jatkoi kasvaimen kasvu tapahtui huolimatta jatkuvia AMPK aktivointia. Meidän seuraavat tulokset solulinjoissa viittaavat siihen, että tämä voi olla kahdesta syystä. Ensinnäkin metformiinin vaikutusten soluproliferaatioon näyttää olevan vain osittain AMPK-riippuvainen. Toiseksi kyky metformiinin estää mTOR väylän haimasyövän myös näyttää olevan vain osittain AMPK-riippuvainen. Across syöpätyyppejä, missä määrin metformiinin vetoaa AMPK aktivoinnin estävän kasvua ja muuttavat mTOR /p70S6K signalointi on epäselvä ja todennäköisesti riippuvaista solutyypistä. Inhibitio AMPK ilmaisun kautta hiljentäminen katalyyttisen AMPK α-alayksikköä käyttämällä erityisiä inhibiittorit AMPK tai tyrmäys LKB1, alkupään signaali AMPK aktivoinnin päinvastaiseksi antiproliferatiivisia vaikutuksia metformiinin rinta- ja munasarjasyövän solujen [38-40]. Toisaalta, Ben Sahra et ai. osoittivat, että downregulation AMPK ollut vaikutusta metformiinin kykyyn estää eturauhasen syöpäsolun kasvua ja mTOR signalointi [41]. Sen sijaan he huomasivat, että metformiini johti mTOR esto ja solusyklin pidätyksen aktivoimalla mTORC1 estäjä REDD1 [42]. Muut tutkimukset rinta- ja munasarjasyövän solulinjoissa ovat myös todenneet, että vaikutukset metformiinin voi olla vain osittain riippuvainen AMPK aktivointi [43, 44]. Anti-proliferatiivista vaikutusta metformiinin säilyi munasarjasyövän A2780 huolimatta siRNA hiljentäminen AMPKα1. Lisäksi metformiinin hoito pystyi vaimentamaan leviämisen molemmat AMPKα1 /2 villityypin ja AMPKα1 /2 puutteellisia hiiren alkion fibroblasteja (MEF), vaikka AMPKα1 /2 puutteellinen MEF olivat hieman vähemmän herkkiä metformiinin [43]. Rintasyövän solulinjoissa, inhibitio HER2 metformiinin havaittiin olevan täysin AMPK-riippumaton [44]. Viimeaikaiset tutkimukset haimasyövän solulinjoissa havaittu, että metformiini voi estää kasvua riippumatta AMPK kautta ylössäätely miR-26a [45], kun taas metformiini vaikutuksista haimasyöpä kantasoluja voidaan välittyvän reexpression erityisiä miRNA [18]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että modulaatio miRNA ilmentyminen voi olla vielä toinen tärkeä mekanismi taustalla biologisia vaikutuksia metformiinin.

Yhdessä edellä tutkimusten tuloksemme että knockdovvn AMPK alayksiköiden ei pelastaa estäviä vaikutuksia metformiinin mTOR /p70S6K fosforylaation mutta mTOR reexpression pystyi kääntämään antiproliferatiivisia vaikutuksia metformiinin, viittaavat siihen, että aktivointi AMPK ja inhibition mTOR /p70S6K-reitin metformiini ovat riippumattomia tapahtumia, jotka voivat molemmat edistää syöpäsolujen kasvun estäminen. Lisäksi sääntely AMPK metformiinin voi olla solutyypin riippuvaisia ​​ja haimasyöpä, antiproliferatiivista vaikutusta metformiinin voi olla osittain tai suurelta osin AMPK-riippumaton.

Kaiken Tutkimuksemme osoittaa, että vaikka metformiini estää haiman tasyöpäsolulinja lisääntymistä, sen vaikutus potilaan kasvaimia todennäköisesti ohimenevää ja paljon monimutkaisempi. Vaikka resistenssimekanismeja todennäköisesti liittyy mTOR-reitin aktivaatio, samanaikaisesti metformiinin ja mTOR estäjät voivat tehdä vähän parantaa tehoa joko hoidon. Lisätutkimuksia tarvitaan, jotta voidaan määrittää, onko metformiinin voi joskus antaa etua haimasyövän potilaille hyödyntämällä sen monimutkaisen aineenvaihdunnan ja signalointi vaikutukset yhdessä kemoterapeuttisten tai kohdennettuja hoitoja.

tukeminen Information

S1 Kuva. Pitkäaikainen metformiiniin ei vaikuta hiiren painoa tai kasvainhistologiaa.

(A) painot hiirillä 28 päivän hoitojakso joko 200 mg /kg tai 400 mg /kg metformiinia esitetään suhteessa lähtötilanteeseen painoja. Hematoksyliinillä ja eosiinilla (B) P505 ja (C) P710 potilaasta peräisin ksenograftikasvaimissa seuraavat 28 päivää vehikkelillä (vasemmanpuoleiset paneelit) tai 400 mg /kg metformiinia (oikea paneeli) osoittaa eroa kasvaimen arkkitehtuuri, duktaalinen muodostumista, tai strooman sisältöä. Mittaviivat ovat 300 um.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0147113.s001

(TIF)

S2 Kuva. Aktivointi AMPK ja eston p70S6K fosforylaation PDX kasvaimia ei jatketaan sen jälkeen 28 päivän metformiiniin.

Fosforylaatio AMPKα ja p70S6K (A) P722 ja (B) PT4 PDX kasvaimia 28. päivän jälkeen hoito 400 mg /kg metformiini.

doi: 10,1371 /journal.pone.0147113.s002

(TIF) B

Kiitokset

kirjoittajat kiitos Charlene M. Santos at University of North Carolina (UNC ) Lineberger Kattava Cancer Center Animal Studies Core, UNC PDX Program, UNC kudoksen Facility, ja UNC Translational patologian laboratoriossa tekniseen tukeen.